1 ÚVOD CÍL PRÁCE 10 3 SOU

OBSAH 1 ÚVOD……………………………………………………………………………........9 2 CÍL PRÁCE…………………………………………………………………………10 3 SOUČASNÝ STAV ŘEŠENÉ PROBLEMATIKY……………………………….11 3.1 Estery kyseliny ftalové……………………………………………………………12 3.1.1 Chemická struktura………………………………………………………………12 3.1.2 Fyzikální a chemické vlastnosti………………………………………………….13 3.2 Výskyt esterů kyseliny ftalové v životním prostředí…………………………....14 3.2.1 Ovzduší……………………………………………………………………..........14 3.2.2 Voda……………………………………………………………………………...15 3.2.3 Půda……………………………………………………………………………....16 3.3 Degradace esterů kyseliny ftalové………………………………………….........17 3.4 Osud esterů kyseliny ftalové v organismu………………………………………18 3.4.1 Vstřebávání a distribuce esterů kyseliny ftalové………………………………...18 3.4.2 Metabolismus esterů kyseliny ftalové…………………………………………...19 3.5 Nežádoucí účinky esterů kyseliny ftalové………………………………….........20 3.5.1 Toxicita PAE………………………………………………………………..........20 3.5.2 Negativní účinky esterů kyseliny ftalové………………………………………...21 3.6 Expozice lidí vůči esterům kyseliny ftalové………………………………..........22 3.7 Výskyt esterů kyseliny ftalové ve zdravotnických materiálech………………..24 3.7.1 Vystavení účinkům DEHP během léčení………….…………………………….25 3.7.2 Alternativní materiály ve zdravotnictví………………………………………….26 3.8 Výskyt esterů kyseliny ftalové v potravním řetězci…………………………….27 3.8.1 Výskyt esterů kyseliny ftalové v krmivech, potravinách a obalových materiálech…………………………………………………………………………….27 3.9 Metody stanovení esterů kyseliny ftalové………………………………….........29 3.9.1 Plynová chromatografie…………………………………………………….........29 3.9.2 Kapalinová chromatografie……………………………………………………... 30 4. MATERIÁL A METODY ZPRACOVÁNÍ………………………………………34 4.1 Použitý materiál……………………………………………………………..........34 4.2 Metody stanovení esterů kyseliny ftalové……………………………………….35 4.2.1 Příprava vzorku před extrakcí…………………………………………………....36

4.2.2 Extrakce PAE……………………………………………………………………36 4.2.3 Separace PAE od koextraktů metodou GPC……………………………….........36 4.2.4 Čištění koncentrovanou kyselinou sírovou……………………………………...36 4.2.5 HPLC analýza…………………………………………………………………...37 5. VÝSLEDKY A DISKUSE………………………………………………………...39 5.1 Výsledky stanovení PAE u kontrolní skupiny kuřat………………………………39 5.2 Výsledky stanovení PAE u skupiny kuřat krmených krmivem s nízkým obsahem ftalátů………………………………………………………………………………….41 5.3 Výsledky stanovení PAE u skupiny kuřat krmených krmivem s vysokým obsahem ftalátů………………………………………………………………………………….43 5.4 Výsledky stanovení PAE u skupiny kuřat krmených krmivem s přídavkem živočišného tuku…………………………………………………………………........45 5.5 Výsledky stanovení PAE v játrech………………………………………………..47 5.6 Srovnání kumulace PAE v tuku, kůži a játrech mezi jednotlivými skupinami…...48 6 ZÁVĚR……………………………………………………………………………...52 7 SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY…………………………………………….54 8 SEZNAM TABULEK A OBRÁZKŮ……………………………………………..59 9 SEZNAM ZKRATEK……………………………………………………………..62 10 PŘÍLOHY………………………………………………………………………...64

8

1 ÚVOD Estery kyseliny ftalové (ftaláty) jsou organické látky, které patří mezi významné kontaminanty životního prostředí. Díky svým fyzikálně – chemickým vlastnostem se používají jako změkčovadla plastických hmot a to především polyvinylchloridu (PVC). Z měkčeného PVC se vyrábí celá řada výrobků (podlahové krytiny, gumové rukavice, závěsy do koupelen, dětské hračky, obalové materiály pro potraviny, specializované pomůcky používané ve zdravotnictví, stavební materiál atd.). Dále se používají při výrobě barev, lepidel, inkoustů, adhezivních materiálů apod. Díky tomu že nejsou v polymeru chemicky vázané mohou se z něj uvolňovat do materiálu se kterým je plast v kontaktu. Rezidua PAE můžeme nalézt ve všech složkách životního prostředí, v živých organismech, surovinách, krmivech a potravinách. K úniku ftalátů do životního prostředí může docházet jednak při výrobě plastů, během jejich používaní a také při jejich likvidaci. Přítomnost ftalátů v potravinách může být důsledkem zpracování kontaminované suroviny nebo migrací ftalátů z obalových materiálů, které jsou s potravinou v kontaktu. Migrace PAE z obalů do potravin je ovlivněna mnoha faktory a to především druhem polymerního materiálu, teplotou, přítomností bílkovin a tuků, délkou kontaktu atd. Mezi nejdůležitější ftaláty patří di(2-ethylhexyl) ftalát (DEHP) a dibutyl ftalát (DBP). DEHP patří mezi nejpoužívanější ftalát a byl u něho prokázán toxický účinek na reprodukci (např. na vývoj varlat). Stejně tak je i DBP klasifikován jako látka toxická pro reprodukci. DEHP i DBP jsou látky lipofilního charakteru a mají schopnost kumulovat se v živočišných tkáních.

9

2 CÍL PRÁCE Estery kyseliny ftalové patří mezi významné polutanty životního prostředí a mají schopnost kumulovat se v živočišných tkáních. Z hlediska negativních účinků na člověka je nutné sledovat jejich obsah v celém potravním řetězci.

Cílem diplomové práce bylo: -

prostudovat dostupnou literaturu

-

prostudovat chromatografické metody, které se používají při stanovení PAE

-

zpracovat literární rešerši k dané problematice

-

zpracovat diplomovou práci

10

3 SOUČASNÝ STAV ŘEŠENÉ PROBLEMATIKY Ftaláty jsou estery kyseliny ftalové (PAE) a v posledním období jsou intenzivně sledovány jako cizorodé látky škodící člověku (JAROŠOVÁ, 2000). Světová produkce těchto sloučenin se odhaduje na několik tun ročně, odkud jasně vyplývá jejich velký sociální a ekonomický význam. Mají široké uplatnění a jsou tudíž důležitou součástí našeho života. Ftaláty o nízké molekulové hmotnosti jako dimethyl-ftalát (DMP), diethyl-ftalát (DEP) a DBP se používají v kosmetice a výrobcích osobní hygieny. DMP a DEP zpomalují vypařování vůní z parfémů, které tak déle vydrží a malé množství DBP zvyšuje odolnost laků na nehty. Ftaláty jako DEHP, di-isononyl-ftalát (DINP) a butylbenzyl-ftalát (BBP) mají široké uplatnění jako změkčovadla v polymerovém průmyslu, kde zvyšují pružnost, usnadňují zpracování a opracování. Pro tyto účely se používá zhruba 80 % všech ftalátů. Díky stabilitě, pružnosti a stálosti jsou tyto sloučeniny velmi vhodné při výrobě PVC a dalších plastů. Mezi dlouhými molekulami polymerů se chovají jako lubrikanty a ty potom po sobě snadno kloužou. PVC s obsahem 20-50 % DEHP slouží k výrobě lékařského vybavení jako jsou vaky a trubice pro krevní transfúze, dialýzu nebo pro intravenózní dávkování antibiotik. DINP se běžně používá při výrobě vinylových výrobků pro děti, stavebních materiálů a dalšího spotřebního zboží. BBP se hojně používá ve výrobě vinylových podlach, umělé kůže, inkoustů a lepidel (GÓMEZ – HENS a AGUILAR – CABALLOS, 2003). Plastická hmota může obsahovat až 40 % změkčovadla, které není v polymeru chemicky vázáno a může se uvolňovat (např. vyluhováním, difuzí) do matriálu, se kterým je plastická hmota v kontaktu (STRATIL a KUBÁŇ, 2005). Díky širokému používání je jimi životní prostředí kontaminováno všude. Ftaláty nacházíme často ve vodě, půdě, ovzduší, v potravinářských produktech a v lidském těle. Toxicita ftalátů byla a dosud je předmětem diskusí a veřejného zájmu. Komerční význam ftalátů se spojuje s debatou o jejich účincích na lidské zdraví a na životní prostředí. Zatímco některé skupiny odborníků tvrdí, že určité ftaláty představují hrozbu pro lidské zdraví, jiné skupiny, obvykle spojené s výrobci ftalátů naopak namítají, že riziko těchto sloučenin je minimální, protože úrovně dávek jsou nízké (GÓMEZ – HENS a AGUILAR – CABALLOS, 2003). Nejpoužívanějším ftalátem v Evropě je DEHP. V polovině 90.let ho bylo vyráběno téměř 600 000 tun ročně. V případě DEHP byl prokázán toxický účinek na

11

reprodukci (např. na vývoj varlat u savců) a je proto v Evropské unii klasifikován jako látka toxická pro reprodukci. Jeho toxický účinek na vývoj pohlavního systému u samců je způsoben hlavně metabolitem mono-ethylhexyl-ftalátem (MEHP), který ovlivňuje řadu procesů souvisejících s vývojem a funkcí jater, včetně metabolismu hormonů a imunitních funkcí. DEHP je považován za natolik nebezpečnou látku, že Evropská unie požádala Švédský inspektorát pro chemické látky (KEMI) o zpracování a speciální strategie minimalizace rizik. Za zvlášť ohrožené skupiny jsou podle KEMI považováni zaměstnanci v závodech zpracovávajících DEHP a spotřebitelé , především pacienti a děti. Podle nejnovější švédské studie je v domácnostech s vyšším obsahem DEHP v prachu ( uvolněný např. z podlahové krytiny nebo tapet) asi třikrát vyšší riziko výskytů astmatu a alergie u dětí. Výroba dalších ftalátů (DINP, di-isodecylftalát- DIDP) dosahuje v Evropě cca 200 000 tun ročně. V případě DINP a DIDP je za nejzávažnější považován jejich toxický účinek na játra a ledviny. V roce 2003 byly publikovány výsledky výzkumu ovlivnění vývoje spermií u člověka působením DEP, který byl do té doby považován za toxikologicky poměrně málo významný. Jako látka toxická pro reprodukci je klasifikován také DBP a nejnovější studie potvrzují reprodukční toxicitu i u dalších běžně užívaných ftalátů, např.BBP. V roce 1997 pak byla popsána korelace mezi výskytem astmatu a používáním materiálů obsahujících ftaláty v domácnostech. Skandinávská studie prokázala statisticky významně vyšší výskyt alergií a astmatu v rodinách, kde byla v prachu z domácností nalezena vyšší hladina některých ftalátů (ŠUSTA, 2005).

3.1 Estery kyseliny ftalové 3.1.1 Chemická struktura Základem chemické struktury PAE je kyselina ftalová se sumárním vzorcem C6H6(COOH)2. Na její dvě karboxylové skupiny jsou esterovou vazbou vázány alkoholy. Jde tedy o diestery kyseliny ftalové (Obr.1). Jsou většinou připravovány reakcí mezi anhydridem kyseliny ftalové a příslušným alkoholem. Lze říci, že s délkou postranního alkoholového řetězce (R,R´) se zvyšuje plastifikační schopnost PAE (ŠEVELA a GAJDŮŠKOVÁ, 1996).

12

Obr.1 Diester kyseliny ftalové

dimethylftalát DMP,

R=R´

diethylftalát DEP,

R=R´

dipropylftalát DPP,

R=R´

dibutylftalát DBP,

R=R´

di-n-butylftalát DnBP,

R=R´

diizobutylftalát DiBP,

R=R´

dioctylftalát DOP,

R=R´

di-n-decylftalát DnDP,

R=R´

dimethylhexylftalát DMHP, kde R a R´ jsou rozdílné diethylhexylftalát DEHP,

kde R a R´ jsou rozdílné

butylbenzylftalát BBP,

kde R a R´ jsou rozdílné.

Vedle délky postranního řetězce zvyšuje plastifikační schopnost PAE také větvení na postranním řetězci, což lze doložit na příkladu dvou izomerů, DOP a DEHP (ŠEVELA a GAJDŮŠKOVÁ 1996).

3.1.2 Fyzikální a chemické vlastnosti Estery kyseliny ftalové jsou ve většině případů čiré, olejovité, nehořlavé kapaliny bez zápachu, s nízkou tenzí par a vysokým bodem varu. Jsou relativně značně lipofilní (hlavně estery s delším postranním řetězcem), a proto velmi málo rozpustné ve vodě. Je zřejmé, že s rostoucí relativní molekulovou hmotností klesá rozpustnost ftalátů ve vodě a stoupá hodnota rozdělovacího koeficientu oktan-1-ol/voda, který je mírou lipofility sloučenin. Se vzrůstající molekulovou hmotností také klesá tenze par. Vyšší ftaláty jsou při pokojové teplotě prakticky netěkavé, pouze u nižších esterů může docházet k významnějšímu odpařování. Esterifikovaná karboxylová skupina je hlavním faktorem, určujícím chemické vlastnosti ftalátů. Stejně jako u jiných esterů je hlavní reakcí hydrolýza (Obr.2), která

13

může být katalyzována kyselinami i zásadami. Díky malé rozpustnosti ftalátů ve vodě je však tato reakce velmi pomalá, i když ji lze urychlit zvýšním teploty. Stérické zábrany alkoholového zbytku jsou rozhodujícím činitelem pro rychlost celého procesu. V praxi to znamená, že estery s rozvětveným postranním řetězcem, např. DEHP, jsou vůči hydrolýze mnohem odolnější než estery s přímým řetězcem DBP (VELÍŠEK, 2002).

Obr.2 Hydrolýza ftalátů

3.2 Výskyt esterů kyseliny ftalové v životním prostředí Hlavním a zřejmě i jediným zdrojem ftalátů je lidská činnost. K úniku ftalátů do prostředí dochází nejen při jejich výrobě a výrobě materiálů ftaláty obsahujících, ale i během jejich používání a následné likvidace. Kontaminovány mohou být odpadní vody, atmosféra i půda (VELÍŠEK, 2002). Odbourávání ftalátů v životním prostředí může probíhat prostřednictvím hydrolýzy, fotodegradace a biodegradace. I když tyto sloučeniny podléhají hydrolýze, jejich rychlost je tak nízká, že za běžných podmínek v životním prostředí nehraje při odbourávání ftalátů významnou roli (GÓMEZ – HENS a AGUILAR – CABALLOS, 2003).

3.2.1 Ovzduší Odpařování ftalátů do atmosféry je vzhledem k nízké tenzi jejich par zanedbatelné. Důležitosti nabývá pouze v okolí průmyslových závodů, kde se vyrábějí ftaláty či plasty, nebo v uzavřených prostorách, kde se vyskytují výrobky ftaláty obsahující (automobily, místnosti s novými podlahovými krytinami apod.). Kontaminace v průmyslových centrech či uzavřených prostorách může dosáhnout hodnot desítek mg.m-3. V ovzduší nad oceány jsou koncentrace na úrovni ng.m-3 (VELÍŠEK, 2002).

14

V atmosféře a vodách Severního moře (Německý záliv) byly měřeny různé ftaláty, například DMP, DEP, DBP, BBP a DEHP. Vzorky ovzduší a vody byly odebírány při expediční plavbě německé výzkumné lodi v Severním moři od 29. února do 10. března 2004. Koncentrace ftalátů v atmosféře se pohybovaly od úrovní pod detekčním limitem až po 3,4 ng.m-3. DBP, BBP a DEHP byly stanoveny ve vodní fázi s koncentracemi od úrovní pod detekčním limitem až po 6,6 ng.l-1 (XIE aj., 2005). V pařížské městské oblasti byl zkoumán osud šesti ftalátů v atmosféře a byly zjištěny celkové úrovně v atmosféře pro DMP 0,5 ng.m-3, DEP 10,7 ng.m-3, DnBP 22,2 ng.m-3, BBP 4,6 ng.m-3, DEHP 18,9 ng.m-3 a DnOP 0,5 ng.m-3, je zřejmé, že převládá DnBP a DEHP (TEIL aj., 2006). V ovzduší mohou ftaláty existovat buď ve formě par (estery s nižší relativní molekulovou hmotností), aerosolu nebo vázané na prachové částice. V této formě mohou být transportovány na dlouhé vzdálenosti, hlavně DEHP, či vymyty dešťovými a sněhovými srážkami (VELÍŠEK, 2002).

3.2.2 Voda Rozpustnost ftalátů ve vodě je nízká a snižuje se s rostoucí relativní molekulovou hmotností. Koncentrace těchto látek ve vodě však může hodnoty rozpustnosti značně převýšit, a to hlavně v případě DEHP, díky tendenci sorbovat se na organické částice a interagovat s rozpuštěným organickým materiálem, jako jsou huminové kyseliny a vulvokyseliny v půdě. Ftaláty se z vodného prostředí tedy spíše sorbují na sediment (VELÍŠEK, 2002). Byla také popsána studie charakterizující organické polutanty v odpadních vodách z textilního průmyslu a ve výluhu ze skládek pomocí metod založených na toxicitě. Jako cílový organismus pro identifikaci toxických sloučenin v různých frakcích byla zvolena Daphnia manga. Dvě z nejtoxičtějších frakcí byly DEHP a DBP (GÓMEZ – HENS a AGUILAR – CABALLOS, 2003). Ke kontaminaci povrchových a spodních vod může docházet jak přímo (odpadní vody, pevné odpady), tak i nepřímo srážkami. Nacházené hladiny se liší podle lokality (v blízkosti průmyslových center jsou zvýšené) a pohybují se v rozmezí desetin až tisíců µg.dm-3 . V sedimentu mohou koncentrace hydrofobnějších ftalátů dosáhnout až stovek mg.kg -1 ( VELÍŠEK, 2002).

15

3.2.3 Půda Hlavním zdrojem kontaminace půdy jsou průmyslové a městské odpady. Kromě toho se však ftaláty mohou dostat do půdy po aplikaci zemědělských přípravků a v důsledku vzdušných emisí. V půdě mají ftaláty tendenci sorbovat se na organickou hmotu a akumulovat se tam. Půdní adsorpční koeficient KOC se zvyšuje s rostoucí relativní molekulovou hmotností a s klesající rozpustností ve vodě. DEHP je silně sorbován a v podstatě nemobilní, DEP je velmi pohyblivý. U vyšších esterů (počínaje BBP) nastává v půdě natolik silná sorpce, že k jejich transportu již prakticky nedochází. Také u DEHP lze však při jeho kontinuálním přísunu (na skládkách) po jisté době pozorovat nasycení vrchních vrstev půdy a migraci do hlubších vrstev, někdy až do spodních vod. U DMP dochází k vyluhování do spodních vod a stejně jako DEP se může ze suchých půd částečně ztrácet těkáním. U dalších ftalátů již tento mechanismus nepřipadá v úvahu (VELÍŠEK, 2002). KAPANEN aj. (2007) studovali toxicitu DEP, který se vyskytoval v kompostním substrátu pro pěstování rostlin, a to Flash testem akutní toxicity při klíčení a růstu ředkviček. V testu akutní toxicity bylo zjištěno, že DEP je méně toxický jako čistá sloučenina než při smísení s kompostovou směsí. To poukazuje na možné synergické efekty neznámých toxických sloučenin nebo na uvolňování sloučenin po přidání DEP. Stejné úrovně koncentrace DEP v kompostním substrátu vyvolaly toxické reakce

ve zkouškách rostlin i v analýze mikrobiální komunity. Diverzita hlavní

mikrobiální komunity se při toxických koncentracích DEP zredukovala ze širokého spektra jen na 10 hlavních druhů. Je známo, že několik z identifikovaných druhů mikroorganismů je schopno degradace ftalátů což znamená, že potlačení ostatních druhů mikroorganismů může být důsledkem dostupnosti a toxicity substrátu. Mezi hlavní

identifikované

druhy

patřily

Sphingomonas

Actinomycetes sp.

16

sp.,

Pseudomonas

sp.,

3.3 Degradace esterů kyseliny ftalové Hydrolýza esterů ftalové kyseliny v abiotickém prostředí je velice pomalá a u vyšších esterů, jako jsou DEHP a dioktyl-ftalát, odbourávání tímto způsobem prakticky neexistuje. Kromě hydrolýzy může také probíhat fotodegradace ve vodě i v atmosféře, nicméně ani tato reakce není příliš významná. Hlavní cestou eliminace ftalátů z prostředí je biodegradace. Téměř všechny organismy disponují biochemickým aparátem (nespecifické esterázy) schopným katalyzovat hydrolýzu ftalátů. Některé z enzymů mohou produkty primární hydrolýzy (monoestery) rozkládat na jednodušší produkty. Mikrobiální degradace ftalátů probíhá převážně za aerobních podmínek působením půdních a vodních bakterií a plísní. Degradační proces začíná hydrolýzou a vede přes monoester k ftalové kyselině. Další degradací přes pyruvát a sukcinát vzniká oxid uhličitý a voda (VELÍŠEK, 2002). SHANKER aj. (1985) zkoumali biodegradaci tří esterů kyseliny ftalové v zahradní půdě a to DMP, DBP a DEHP. Rychlost degradace DMP a DBP byla za aerobních podmínek vyšší než u DEHP. Po zaplavení půdy, kdy bylo dosaženo anaerobních podmínek, se degradace tří ftalátů výrazně zpomalila. V jiné studii byly z říčních sedimentů, respektive petrochemických kalů, izolovány dva kmeny bakterií, které jsou schopny aerobní degradace PAE, DK4 a O18. Oba kmeny velice rychle odbourávaly PAE s kratším alkylovým řetězcem jako DEP, (dipropyl-ftalát) DPrP, DBP, BBP a difenyl-ftalát (DPP), zatímco PAE s delším alkylovým řetězcem dicyclohexyl-ftalát (DCP), dihexyl-ftalát (DHP) a DEHP se odbourávaly pomaleji. Rychlost degradace osmi PAE byla u kmene DK4 vyšší než u kmene O18. Při současné přítomnosti kmenů DK4 a O18 se rychlost degradace osmi zkoumaných PAE zvýšila. Také za současné přítomnosti osmi PAE se zvýšila rychlost degradace. Rovněž se zjistilo že degradaci PAE zpomaluje přidání nonylfenolu nebo vybraných polycyklických aromatických uhlovodíků v koncentraci 1 µg/g sedimentu. Izolované kmeny bakterií DK4 a O18 byly označeny jako Sphigonomas sp. a Corynebacterium sp. (CHANG aj., 2004). Při anaerobním rozkladu odpadních kalů byla zkoumána mikrobiální degradace tří ftalátů a to DMP, DBP a DOP. Výsledky experimentů ukazují, že rychlost biodegradace a schopnost biodegradace těchto tří ftalátů za anaerobních podmínek souvisí s délkou postranních alkylových řetězců. Více než 90 % DMP a DBP s krátkým

17

postranním alkylovým řetězcem je možné degradovat, zatímco degradace DOP je za stejných podmínek relativně pomalá (JIANLONG aj., 2000). Byly zkoumány důsledky ultrazvukového a různého dalšího působení na aerobní degradaci čtyř esterů kyseliny ftalové (PAEs) jako DEP, BBP, DBP a DEHP v odpadních kalech. Byly hodnoceny účinky degradace PAE při působení ultrazvuku na kaly po 20 minut s úrovní výkonu 0,1 W.ml-1. Podle rychlosti degradace je možné porovnat: DBP > BBP > DEP > DEHP. Konstanty rychlosti degradace (k1) a poločasy rozpadu (t1/2) čtyř PAEs (50 mg.kg-1) se pohybovaly od 0,182 do 0,379/den a od 1,8 do 3,8 dní. Optimální pH pro degradaci PAE bylo 7 při 30°C (CHANG aj., 2007). Mezi estery kyseliny ftalové, která americká United States Environmental Protection Agency (US EPA) považuje za přední polutanty, je hlavním polutantem DEHP, který byl v kalových odpadních vodách identifikován ve vysoké koncentraci okolo 28,67 mg.kg mg.kg

-1

-1

a v aktivovaných odpadních vodách s koncentrací asi 6,26

. Další estery kyseliny ftalové jako DBP a DMP vykazovaly velmi nízké

koncentrace. Během kompostování po stabilizační fázi došlo k následnému výskytu DEP a poté DMP, což znamená, že mikrobiální metabolismus začíná degradací alkylové strany řetězce a teprve poté následuje štěpení aromatických cyklů. Vypočtený poločas rozpadu DEHP byl 45,4 dní pro kalové odpadní vody a 28,9 dní pro aktivované kalové vody (AMIR aj., 2005).

3.4 Osud esterů kyseliny ftalové v organismu 3.4.1 Vstřebávání a distribuce esterů kyseliny ftalové Většina ftalátů je rozpustná v tucích a může být resorbována kůží, sliznicí i plícemi. Esterázy ze střevní sliznice a lipáza z pankreatu hydrolyzují DEHP na MEHP a 2-ethylhexanol. Jen malá část je resorbována jako diester. Proto játra a další orgány přicházejí do kontaktu především s MEHP. U většiny živočišných druhů jsou tedy ftaláty resorbovány ze zažívacího traktu jako monoestery. Přitom bakteriální činnost nehraje podstatnou roli. Hlavní úlohu při hydrolýze PAE hrají pankreatické esterázy. Bylo totiž prokázáno, že inhibice střevních esteráz neovlivní stupeň resorpce ftalátů. Hydrolýza PAE v tenkém střevě za vzniku monoesteru a příslušného alkoholu se zdá být rozhodující také pro resorpci těchto látek. Po orálním podání krysám v denních dávkách 1,0 g . kg-1 DEHP po dobu 35 dnů bylo největší množství DEHP nalezeno v játrech a tuku. Přitom biologický poločas

18

v játrech činil 1 - 2 dny, v tuku 3 - 5 dnů. Při parenterálním vstupu byl v krvi prokazován diester, který byl především ukládán v tukové tkáni. Po dlouhodobé intravenózní infuzi opicím byl DEHP detekovatelný v játrech, tuku, srdci a varlatech ještě 14 dnů po poslední aplikaci DEHP. Po podání izotopem

14

C značeného di(methylhexyl)-ftalátu (DMHP) krysím

samcům bylo 60 % vyloučeno do moče, vše ve formě mono-methylhexyl-ftalátu (MMHP). Třicet procent bylo ve výkalech (z toho malé množství nezměněno, přítomno bylo i malé množství kyseliny ftalové). Ve žluči může být až 15 % ve formě MMHP, částečně ve formě glukuronidu (ŠEVELA a GAJDŮŠKOVÁ, 1996). Bylo zkoumáno vylučování, distribuce a metabolismus DBP u krys. Během 48 hodin po intravenózním nebo orálním podání bylo v moči vyloučeno přes 90 % dávky, ale ve stolici bylo vylučování nízké. Vylučování žlučí bylo při orálním podávání DBP významně vyšší než ve stolici. Z experimentů in vitro se ukázalo, že esteráza krysích jater vyvolala velmi rychlou hydrolýzu DBP na mono-butyl-ftalát (MBP). DBP a jeho metabolity (MBP a kyselina ftalová), nevyvolaly v prostředí in vitro žádný významný účinek na aktivitu jaterních a sérových enzymů (TANAKA aj., 1978).

3.4.2 Metabolismus esterů kyseliny ftalové Metabolismus DEHP začíná hydrolýzou v gastrointestinálním traktu, při které vzniká MEHP a 2-ethylhexan-1-ol. V dalším metabolickém kroku se může malá část MEHP hydrolyzovat na ftalovou kyselinu. Převážná většina monoesteru se však oxiduje v postranním alifatickém řetězci. Identifikováno bylo asi 30 metabolitů. U většiny savců MEHP a jeho oxidované deriváty reagují s D-glukuronovou kyselinou za vzniku konjugátů, které jsou z organismu vylučovány. Metabolismus ftalátů s kratším postranním řetězcem probíhá podobně jako u DEHP. Ftalová kyselina vznikne ve větším množství. I přes rychlý metabolismus a vylučování ftalátů (60 až 90 % je vyloučeno výkaly a močí během 24 hodin) dochází k jejich akumulaci v organismu, neboť rychlost příjmu převyšuje rychlost metabolické konverze (VELÍŠEK, 2002).

19

3.5 Nežádoucí účinky esterů kyseliny ftalové 3.5.1 Toxicita PAE Akutní toxicita PAE je nízká (ŠEVELA a GAJDŮŠKOVÁ, 1996). Projevem je podráždění gastrointestinálního traktu, nevolnost, spavost, snížení krevního tlaku, závratě, halucinace, poruchy vidění, slzení, při inhalaci par kašel, podráždění hrdla a jícnu (VELÍŠEK, 2002). Podle dostupných literárních zdrojů je LD50 pro krysy uváděna v těchto rozmezích: •

BBP

2-18 g . kg-1

•

DMP

6,8 g . kg-1

•

DEP

8,6-31 g . kg-1

•

DnBP

8-16 g . kg-1

•

DiBP

15-20 g . kg-1

•

DEHP

31 g . kg-1

Nejčastěji uváděnými cílovými orgány pro PAE při akutní intoxikaci jsou játra a varlata. Jde především o atrofii testes a hepatomegalii. Při subakutní intoxikaci se vedle hepatomegalie rozvíjí proliferace peroxizomů, indukce peroxizomálních enzymů, změny v lipidovém metabolismu jako inhibice syntézy cholesterolu a indukce beta-oxidace mastných kyselin (ŠEVELA a GAJDŮŠKOVÁ, 1996). Rozšíření PAE a jejich toxikologicky významné zdroje napovídají, že v případě PAE přichází v úvahu především chronická expozice. Délka a větvení postranního alkoholového řetězce přitom zejména při dlouhodobé expozici zvyšují intenzitu nežádoucích vedlejších účinků PAE na lidský organismus. Při dlouhodobé expozici v experimentech in vivo nebo in vitro na živých tkáňových kulturách byly reprodukovatelně prokázány zejména tyto nežádoucí účinky PAE: •

teratogenní a embryotoxický,

•

spermiotoxický,

•

hepatotoxický,

•

nefrotoxický,

•

karcinogenní,

•

vliv na membránové funkce.

20

Hodně diskutována je otázka karcinogenního působení PAE na savčí organismus. Lze říci, že zejména tyto nálezy mohou vysvětlit, jak PAE působí při rozvoji hepatokarcinomů v experimentech na myších a krysách: •

zvýšení růstové aktivity epidermálních buněk myší nezávislé na výživné půdě,

•

inhibice intercelulární komunikace hepatocytů myší stanovená po aplikaci 3

•

H- uridinu,

perzistující proliferace peroxizomů v hepatocytech myší, provázená výrazným zvýšením produkce volných kyslíkových radikálů, spojená ze zvýšenou kapacitou enzymatického systému beta-oxidace mastných kyselin, se zvýšenou tvorbou PPA-80 (polypeptid spojený s proliferací peroxizomů o molekulové hmotnosti 80 000), s relativně menším zvýšením aktivity katalázy,

•

zvýšení propustnosti membrány peroxizomů pro volné kyslíkové radikály,

•

zvýšení aktivity urikázy s následným snížením koncentrace významného zametače volných kyslíkových radikálů, kyseliny močové,

•

zvýšená peroxidace lipidů a následné zvýšení akumulace lipofuscinu.

K přenosu těchto výsledků, získaných v experimentech na malých zvířatech, do humání medicíny

chybí

zatím

průkazné

experimenty

na

primátech

(ŠEVELA

a

GAJDŮŠKOVÁ, 1996).

3.5.2 Negativní účinky esterů kyseliny ftalové RAO aj., (1990) kvantitativně vyhodnocovali poškození jaterních buněk krys indukované DEHP. Krysám byla podávána dieta s obsahem 2 % DEHP po dobu 108 týdnů. Následně bylo poškození jater (pod mikroskopem) vyhodnoceno. Zjistilo se, že dávkování potravy obsahující 2 % DEHP způsobilo u 78,5 % pokusných krys nádorové poškození jater. LABOW aj., (1990) prokázali, že MEHP, hlavní metabolit DEHP, zapříčinil srdeční a respirační blok, když prováděli infúzi krysám pod narkózou. Koncentrace MEHP v plicích po infúzi byla 20-40 µg . g -1. U pracovníků, kteří pracují ve výrobě PVC materiálů, byl zjištěn mírný celkový zánět nervů a objevila se snížená vnímatelnost smyslovými orgány (WAMS, 1987) V posledních desetiletích byly prokázány problémy s kvantitou a kvalitou lidských spermií a v některých zemích se evidentně zvyšuje rakovina varlat a rakovina

21

prsu u žen ( COPESTAGE aj., 1996). Také se objevuje malformace a rakovina penisu u mužů.

3.6 Expozice lidí vůči esterům kyseliny ftalové Ftaláty jsou všudypřítomným kontaminantem životního prostředí, protože se používají při výrobě plastů a jiného spotřebního zboží. Lidé jsou těmto sloučeninám exponováni po celý život při jídle, dýchání a přes kůži a dokonce i v prenatálním vývoji. V poslední době se odborná i laická veřejnost znepokojuje nad zdravotními riziky souvisejícími s expozicí ftalátů. Hlavní těžiště se přesunulo od hepatotoxických účinků těchto látek k poškození činnosti endokrinních žláz. I když jsou k dispozici konzistentní toxikologické údaje o účincích ftalátů, informace o zdrojích expozice člověka a cestách do organismu jsou dosud omezené (LATINI, 2005). V Evropě se pouze odhaduje maximální expozice DEHP z obalů na 0,02 mg na osobu a den a expozice všem ftalátům vyjádřeným jako DMP na 4,37 mg na osobu a den. Denní příjem DEHP potravinami je v Holandsku odhadován na 0,5 – 0,8 mg, v Japonsku na 2 mg, v USA na 0,25 mg (celkový příjem potravinami, vodou a vzduchem se pohybuje okolo 0,27 mg). V průmyslových závodech s maximální povolenou koncentrací DEHP 5 mg. m-3 ovzduší činí denní příjem pracovníků až 20 mg. Dalším zdrojem ftalátů, týkajícím se speciální skupiny pacientů, jsou krevní transfuze, kdy může pacient při jednorázové transfuzi získat 300 mg a pacient při dialýze krve 40 mg DEHP denně (VELÍŠEK, 2002). Evropská komise pro potraviny určila 0,025 mg DEHP a 0,050 mg DBP na kg živé hmotnosti a den u člověka jako tolerovatelnou denní dávku TDI (COMMISSION OF THE EUROPEAN COMMUNITES, 1991). KOCH aj., (2003) analyzovali v 85 vzorcích moče německé populace specifické metabolity

ftalátů.

hydroxyhexyl)-ftalátu

Byly

stanoveny

sekundární

(5OH-MEHP)

a

metabolity

mono(2-ethyl-5-

mono(2-ethyl-5-oxo-hexyl)-ftalátu

(5oxo-MEHP), DEHP a primární monoesterové metabolity DEHP, di-n-octyl-ftalátu (DnOP), di-n-butyl-ftalátu (DnBP), butylbenzyl-ftalátu (BBzP) a DEP. Na základě těchto hodnot interní expozice, byly vypočteny denní dávky mateřských ftalátů podle faktorů exkrece močových metabolitů.

22

Pro DEHP byl stanoven medián příjmu 13,8 µg . kg dávka na 95.percentilu 52,1 µg . kg

-1

-1

tělesné hmotnosti/den a

tělesné hmotnosti/den. TDI stanovená výborem

EU Scientific Committee for Toxicity, Ecotoxicity and the Environment (CSTEE) je 37 µg . kg

-1

tělesné hmotnosti/den. Tuto hodnotu překračovalo 12 % jedinců, 31 %

jedinců mělo hodnoty vyšší než je referenční dávka (RfD) 20 µg . kg

-1

tělesné

hmotnosti/den stanovená US EPA. Pro DnBP, BBzP, DEP a DnOP byly hodnoty dávek 0,42 µg . kg -1 tělesné hmotnosti/den.

na 95 percentilu 16,2; 2,5; 22,1 a

WITTASSEK aj., (2007) zase analyzovali vzorky 24 hodinové moči, které byly shromážděny od 634 pokusných osob (především studentů ve věku 20-29 let, 326 žen, 308 mužů) za 9 let, od r.1988 do r. 2003 a zjišťovali u nich koncentrace primárních a nebo sekundárních metabolitů DnBP, DiBP, BBzP, DEHP a DiNP. Na základě exkrece metabolitů odhadli denní příjem mateřských ftalátů a zkoumali chronologii expozice ftaláty. Více než 98% vzorků moči mělo detekovatelnou úroveň metabolitů všech 5 ftalátů, které tak poukazují na plošnou expozici německé populace všemi pěti ftaláty za posledních 20 let. Medián denní dávky v podmnožině let 1988 a 1993 byl poměrně konstantní pro DnBP (asi 7 µg . kg

-1

tělesné hmotnosti/den) a DEHP (asi 4 µg . kg

-1

tělesné hmotnosti/den) . Od r. 1996 se mediány obou ftalátů postupně snižovaly až do r. 2003 (DnBP 1,9 µg . kg

-1

tělesné hmotnosti/den; DEHP 2,4 µg . kg

-1

tělesné

hmotnosti/den). Oproti tomu denní dávky DiBP se během celého zkoumaného období mírně zvyšovaly (medián 1988: 1,1 µg . kg 2003: 1,4 µg . kg

-1

-1

tělesné hmotnosti/den; medián

tělesné hmotnosti/den). U BBzP byly pozorovány mírně klesající

hodnoty, i když mediány z r. 1998 se pohybovaly kolem 0,2 µg . kg

-1

tělesné

hmotnosti/den. U denní expozice DiNP byly zjištěny trvale rostoucí hodnoty, přičemž nejnižší medián byl 0,20 µg . kg -1 tělesné hmotnosti/den pro podmnožinu z roku 1988 a nejvyšší (dvojnásobný) r. 2003. Trendy pozorované v expozici ftaláty je možné připisovat změnám ve výrobě a vzorcích používání. Ženy vykazovaly výrazně vyšší denní dávku DnBP. Celkově u 14 % skupiny zkoumaných osob byly denní dávky DnBP nad přípustnou tolerovatelnou denní dávkou

(TDI) 10 µg . kg

-1

tělesné hmotnosti/den, kterou stanovila European

Food Safety Authority (EFSA). Výskyt těchto nadměrně exponovaných osob se ale postupem času snižoval a v podmnožině dat z r. 2003 byl již pod 2 %. I když překročení limitu expozice stanoveného v EFSA a US EPA se vyskytlo jen u relativně malého procenta pokusných osob, je nutno uvážit také kumulativní expozici všech zkoumaných ftalátů a možné aditivní efekty jejich dávek v endokrinních žlázách. 23

V jiné studii WITTASSEK aj., (2007) odhadovali denní příjem DEHP u 239 dětí ve věku 2-14 let a to extrapolací úrovní metabolitů DEHP v moči, tedy 5OH-MEHP, 5oxo-MEHP a MEHP. Použili dva výpočetní modely založené na objemu a koncentraci močových metabolitů souvisejících s kreatininem a stanovili medián denního příjmu DEHP na 7,8 nebo 4,3 µg . kg 15,2

µg . kg

-1

-1

tělesné hmotnosti/den a 95 percentil. 25,2 nebo

tělesné hmotnosti/den. U tří dětí (tedy u 1%) byla překročena

tolerovatelná denní dávka (TDI) stanovená European Food Safety Authority, 50 µg . kg -1 tělesné hmotnosti/den, zatímco referenční dávka (RfD) US EPA, 20 µg . kg -1 tělesné hmotnosti/den, byla překročena u 7,5 % nebo 3 % (podle výpočetního modelu). Obecně se expozice DEHP snižovala s rostoucím věkem a u hochů byla vyšší než u dívek. Výsledky ukazují, že většina dětí v obecné populaci je vystavena množství DEHP pod limity TDI a RfD. Mnoho dětí však ve významné míře limity překračuje a v některých jednotlivých případech bylo pozorováno podstatné překročení. Malé děti jsou podle všeho zasaženy výrazněji, což může být způsobeno vyšším příjmem potravy v poměru k tělesné hmotnosti a také tím, že dávají věci do úst a hrají si blíže k zemi. V ČR nejvyšší přípustné hodnoty DEHP a DBP (suma), byly stanoveny Zákonem o potravinách a tabákových výrobcích a jeho prováděcí vyhláškou MZ ČR. Pro mléko, maso, drůbež, nealkoholické nápoje, pivo, víno, mouku, chléb, pečivo, čerstvou, zmrazenou, kořenovou a listovou zeleninu, brambory a dětskou výživu je stanoven limit 2,0 mg.kg-1. Pro mléčné výrobky, ryby, tuky, masné výrobky, vejce, konzervy, droby, mlýnské a pekařské výrobky, sirupy, lihoviny, víno desertní, ovoce, cukr, cukrovinky, luštěniny, sušenou, naťovou a cibulovou zeleninu byl stanoven limit 4,0 mg.kg-1 (JAROŠOVÁ, 2000).

3.7 Výskyt esterů kyseliny ftalové ve zdravotnických materiálech Pacienti v nemocnicích včetně novorozenců v celé Evropské unii jsou zbytečně vystavováni působení ftalátů, které jsou obsaženy ve zdravotnických pomůckách vyrobených z polyvinylchloridu (PVC). V dubnu 2004 otestovala mezinárodní síť Health Care Without Harm 48 zdravotnických pomůcek, které se běžně používají v nemocnicích v Rakousku, České republice, Francii, Německu, Polsku, Španělsku a Švédsku. Třicet devět z těchto čtyřiceti osmi výrobků obsahovalo mezi 17 a 41 hmotnostními procenty DEHP.

24

Všechny výrobky obsahující DEHP, jako infúzní sety, soupravy pro nitrožilní výživu, hadičky a masky používané většinou na novorozeneckých a dětských oddělení nemocnic byly vyrobeny z PVC ( RŮŽIČKOVÁ aj., 2004).

3.7.1 Vystavení účinkům DEHP během léčení Těhotné ženy, které podstupují lékařskou péči, mohou být vystaveny mnohem vyšším dávkám DEHP než běžná populace. Vedle krátkodobých vystavení, k nimž může dojít v období akutního onemocnění, jsou ženy na dialýze, kde jsou v důsledku selhání ledvin, vystaveny 0,01-7,2 mg DEHP/kg hmotnosti během jednoho ošetření. Průzkum provedený na 930 jednotkách ukázal, že 2,4 % pacientek v plodném věku na hemodialýze v průběhu čtyřletého období otěhotnělo.U těhotných žen může DEHP prostupovat placentární bariérou a působit na plod (RŮŽIČKOVÁ aj., 2004). FAOUZI aj., (1999) zkoumali u 21 pacientů s chronickým selháním ledvin, kteří se pravidelně podrobovali hemodialýze migraci DEHP z dialyzátoru. Pomocí HPLC byly měřeny oběhové koncentrace DEHP v krvi pacientů získané ze vstupu a výstupu dialyzátoru během 4 hodinové dialýzy. Při léčbě selhání ledvin s použitím plastových hadiček se úroveň DEHP v plazmě zvýšila. Průměrně bylo z dialyzátoru za jednu dialyzaci

extrahováno

odhadované

množství

75,2

mg

DEHP

s intervalem

44,3 mg – 197,1 mg. Dalším možným zdrojem vystavení účinkům DEHP je mateřské mléko. Švédská národní chemická inspekce odhaduje, že průměrný denní příjem DEHP při kojení dosahuje u kojenců do 3 měsíců 0,021 mg . kg-1/den, a u kojenců mezi 3-12 měsíci stáří hodnoty 0,008 mg . kg-1/den u zdravých matek. U kojících matek na hemodialýze může být vystavení DEHP výrazně vyšší. Úřad pro potraviny a léky Spojených států (US FDA) (2001), odhaduje že toto vystavení by mohlo dosahovat až 90 mg . kg-1/den. Kromě infuzí krevních derivátů mohou pacienti dostávat infuzí také léky, výživu a další roztoky jako např. glukózu nebo roztoky elektrolytů. Nitrožilní set obsahuje vak s roztokem a hadičku dopravující roztok z vaku ke katetru zavedenému do pacientovy žíly. Přibližně 80 % nitrožilních setů se skládá z vaků a hadiček zhotovených z PVC měkčeného DEHP (RŮŽIČKOVÁ aj., 2004). ŠEVELA aj., (1996) zjistili že roztok pro peritoneální dialýzu skladovaný ve vacích vyrobených z materiálu, který neobsahuje DEHP, je statisticky významně méně kontaminován tímto plastifikátorem oproti roztoku skladovanému ve vacích z PVC s přídavkem DEHP. Přívodná hadice, která DEHP obsahovala u všech sledovaných 25

souprav, nebyla významným zdrojem tohoto plastifikátoru pro peritoneální roztok. Kontaminace peritoneálního roztoku DBP, přidávaným do potiskových barev byla nalezena u obou typů vaku (přitom statisticky významné rozdíly nebyly nalezeny). Po 6 hodinách instalace v peritoneální dutině nebyly DEHP a DBP v peritoneálním roztoku detekovatelné to znamená ,že byly úplně retinovány nebo metabolizovány v peritoneální dutině nemocného. KHALIQ aj. (1992) simulovali různá prostředí a vyluhovatelnost ftalátů z PVC materiálu, používaného pro medicínské účely a sledovali v závislosti na teplotě a době vyluhování. Celkový obsah DEHP, DBP a DMP v plastových dialyzačních setech byl 225 mg.g-1, 54 mg.g-1 a 28 mg.g-1. Se zvyšující se teplotou a dobou se vyluhovatelnost ftalátů do prostředí zvyšovala.

3.7.2 Alternativní materiály ve zdravotnictví Používání výrobků neobsahujících PVC v podstatě odstraňuje problém vystavení účinkům DEHP, protože alternativní polymery neobsahují ftaláty ani jiná změkčovadla. Mezi alternativní materiály pravidelně používané výrobci zdravotnických pomůcek patří polyetylen, polyuretan a jiné polyolefiny, silikon, etylenvinyl acetát a vícevrstvé laminátové plasty. Polymery neobsahující PVC jsou také méně náchylné k tomu, aby se při dlouhodobém používání staly křehkými. Téměř pro každý výrobek z PVC dnes na trhu existují alternativy bez PVC. Jedinou výjimkou, kde na trhu ještě nejsou k dostání výrobky z alternativních materiálů, jsou vaky na červené krvinky. U tohoto výrobku představuje DEHP v PVC tu výhodu, že slouží jako konzervační látka červených krvinek (RŮŽIČKOVÁ aj., 2004). PAE v materiálech z PVC bude snad možno nahradit použitím jiných změkčovadel, např. tri-2-ethylhexyltrimelitátem (TEHTM). Plastifikační účinek na PVC má však řada dalších látek, které jsou studovány z hlediska možného použití ve zdravotnictví. Mimo jiné k těmto látkám patří: di-2-ethylhexyladipát (DEHA), di-2-ethylhexylsebakát, dibutylsebakát, acetyltributylcitrát a difenyl-2-ethylhexylfosfát . Zkoumáno

je

také

použití

některých

derivátů

toluensulfonamidu

(např. N-etyltoluensulfonamid nebo N-metyltoluensulfonamid), i když jde o substance, jejichž použití ve zdravotnictví i v potravinářském průmyslu bude zřejmě značně omezeno. U všech zkoumaných látek s plastifikačním účinkem byly však pozorovány jak výluhy z PVC, tak i migrace přes PVC materiál (ŠEVELA a GAJDŮŠKOVÁ, 1996). 26

3.8 Výskyt esterů kyseliny ftalové v potravním řetězci 3.8.1 Výskyt esterů kyseliny ftalové v krmivech, potravinách a obalových materiálech Estery kyseliny ftalové jako plastifikátory jsou přidávány i do potiskových barev obalů používaných pro balení potravin a mohou být detekovány i v potravinách v důsledku jejich migrace (JAROŠOVÁ, 2000). Migrace ftalátů z obalu do potravin je obecně ovlivněna mnoha faktory: •

druhem polymerního obalového materiálu,

•

druhem potraviny,

•

teplotou,

•

délkou kontaktu aj.

Čím více mají potraviny tuku, tím větší je riziko vyluhování ftalátů. Obecně se kontaminace potravin pohybuje v rozmezí setin až jednotek mg. kg-1 s ojedinělými extrémními

hodnotami

převážně

v tučných

potravinách

(desítky

mg.kg-1)

(VELÍŠEK, 2002). TOMITA aj., (1977), uvádějí že ve 22 druzích komerčně dostupných potravin, většinou v plastových obalech byla zaznamenána rezidua DNBP a DEHP. Úroveň byla obecně vyšší u potravin v prášku než v jiných materiálech a obsah PAE se během jejich skladování výrazně zvýšil. Byla nalezena úzká korelace mezi obsahem reziduí esterů kyseliny ftalové v obalových materiálech a ve vlastních potravinách. PFORDT, (2004) uvádí, že ve 31 vzorcích potravin z maloobchodu a 10 vzorcích mateřského mléka byl stanoven obsah DEHP, DBP a DIBP. DEHP byl nalezen v největším počtu vzorků, zatímco DBP a DIBP bylo možné detekovat jen příležitostně. Nejvyšší úroveň DEHP, 1,58 mg . kg-1 byla nalezena ve vzorku lískových oříšků, jinak se obsah DEHP v oříšcích pohyboval od 0,06 do 0,25 mg . kg-1. V žitném chlebu byla úroveň DEHP mezi 0,04 a 0,75 mg . kg-1. Sýr gouda vykazoval koncentraci od 0,12 do 0,92 mg . kg-1. V mletém mase a šunkovém salámu byl objem DEHP nižší, hodnoty byly často pod 0,05 mg . kg-1, nejvyšší úroveň DEHP byla 0,28 mg . kg-1. Všechny vzorky potravin byly prodávány v plastových obalech, ale žádný z obalů neobsahoval estery kyseliny ftalové jako změkčovadla. Takže tento zdroj kontaminace, který byl po dlouhou dobu významný, již v těchto vzorcích nehrál roli. Ve všech vzorcích mateřského mléka se koncentrace DEHP pohybovaly do 0,01 mg . kg-1. Úrovně DBP a DIBP byly pod limitem detekce.

27

PETERSEN (1991), uvádí že byly vyšetřovány vzorky mléka z jedné německé a čtrnácti dánských mlékáren na přítomnost reziduí DEHP. Šetření bylo provedeno zhruba 6 měsíců poté, co bylo v Dánsku zakázáno používání hadic měkčených DEHP při

zpracování

mléka.

Výsledky

prokázaly,

že

střední

koncentrace

DEHP

v maloobchodních vzorcích mléka byla nižší než 50 µg .l-1 a byl vysloven závěr že příjem DEHP z mléka a mléčných výrobků nepředstavuje pro dánskou populaci žádné zdravotní riziko. JAROŠOVÁ aj., (1999) zkoumali distribuci a kumulaci nejtoxičtějších ftalátů, DEHP a DBP v tělesných tkáních prasat a brojlerů po orálním podání. Kromě toho byla zkoumána přítomnost MEHP, který je metabolitem DEHP, v krvi a moči. Ftaláty byly orálně podávány prasatům v dávce 5 g denně po dobu 14 dnů (rozpuštěny v jedlém oleji a přidány do první části krmiva) a brojlerům v dávce 100 mg denně, v želatinové kapsli, přímo do volete. U třech prasat byla analyzována přítomnost ftalátů v játrech, ledvinách, plicích, mozku, srdci, svalovině, nadledvinovém a podkožním tuku, zatímco u brojlerů byla analyzována jejich přítomnost ve svalovině, kůži, játrech a mezenteriálním tuku. Analýza byla provedena bezprostředně po 14 dnech aplikace a poté dalších 14 a 28 dní po posledním dni aplikace ftalátů. Během pokusu nevykazovala zvířata žádné klinické příznaky nemocí. DEHP byl přítomen v krvi a moči prasat, zatímco krev brojlerů byla pozitivní na MEHP. Byl potvrzen lipofilní charakter DEHP a DBP. Po 14 dnech aplikace DEHP a DBP byla jejich nejvyšší koncentrace nalezena ve svalovině a v tukové tkáni pokusných prasat (DEHP: 1,22 a 1,43 ve svalovině, 14,37 a 12,20 v tukové tkáni; DBP: 1,44 a 1,83 ve svalovině, 9,42 a 9,64 v tukové tkáni vše v mg . kg-1 původního vzorku). Celkové množství DBP u brojlerů bylo 8 krát menší než DEHP. DBP se ve všech sledovaných tkáních šířil rovnoměrně, zatímco DEHP se kumuloval především v tukové tkáni. Po 14 dnech aplikace byl obsah DBP v kůži 0,9, ve svalovině 0,19, v mezenteriálním tuku 3,13 a v játrech 0,27 mg . kg-1. Obsah DEHP v kůži 8,28, ve svalovině 1,93, v mezenteriálním tuku 18,20 a v játrech 0,32 mg . kg-1 původního vzorku (průměr ze 6 pokusných brojlerů). V těle brojlerů byla 14 a 28 dní po poslední aplikaci detekována vysoká perzistence obou ftalátů. Tuková tkáň je nejlepším indikátorem přítomnosti ftalátů v organismu. Tkáně kontrolních prasat a brojlerů obsahovaly DEHP i DBP v detekovatelných koncentracích a také byla potvrzena přítomnost ftalátů pocházejících z kontaminovaných krmiv.

28

Všechny vzorky odebrané z krmných směsí, které byly momentálně na trhu a, které byly použity pro krmení pokusných i kontrolních zvířat , obsahovaly DEHP a DBP (DEHP 0,24-1,77, DBP 0,06-2,37 mg . kg-1 krmiva). V roce 1997 byly v okrese Hodonín provedeny pilotní studie koncentrací esterů kyseliny ftalové v krmných směsích (n = 21) a ve vepřové (n = 6) a hovězí (n = 6) tukové tkáni. Vzorky byly opakovaně odebírány ve dvou závodech na zpracování krmiv a ve třech chovech prasat a dvou chovech dobytka. Střední koncentrace (mg . kg-1 původního vzorku) DBP, DEHP a součtu DBP + DEHP v krmných směsích byly 0,207; 0,216 a 0,423. Odpovídající hodnoty u vepřové podkožní tukové tkáně (na hýždích) byly 3,363; 0,505 a 3,868 a u hovězího dobytka (tukové pouzdro pravé ledviny) byly 2,537; 0,790 a 3,327. Přípustná koncentrace v tukové tkáni pro součet DBP + DEHP, platná v ČR (4,0 mg . kg-1 původního vzorku) byla překročena u třech ze šesti prasat (4,260; 4,520; 6,920) a u jedné ze šesti krav (4,750) (RASZYK aj., 1998).

3.9 Metody stanovení esterů kyseliny ftalové Vzhledem k hojnému používání ftalátů je při řadě aplikací vyžadována kontrola těchto chemikálií. Součástí zvolené analytické metody je obvykle zpracování vzorku, které může být podle konkrétní matrice více či méně složité, a zpravidla vyžaduje předběžnou koncentraci analytu a separační techniku s vhodným detektorem pro kvantifikaci ftalátů ve vzorku. I když pro tyto účely byly navrženy jisté elektroforetické metody, bezpochyby nejvhodnější jsou metody plynové chromatografie (GC) a vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC) (GÓMEZ – HENS a AGUILAR – CABALLOS, 2003).

3.9.1 Plynová chromatografie Principem plynové chromatografie je distribuce složek mezi dvě fáze – mobilní (plynnou) fázi a stacionární (pevnou nebo kapalnou fázi). Dle použité stacionární fáze lze využít buď: -

plynovou adsorpční chromatografii (GSC), kde řídícím procesem je adsorpce složky z plynné fáze na povrch pevného sorbetu nebo,

-

plynovou rozdělovací chromatografii (GLC), kde probíhá distribuce mezi plynnou mobilní fází a kapalnou stacionární fází.

29

Plynové chromatografie se používá k dělení a následnému stanovení plynů, kapalin a látek s bodem varu zhruba do 400 °C. Protože složky jsou vždy separovány v plynné fázi, musí být definovaným způsobem vypařovány. Při vypařování se látky nesmí rozkládat a teplota 400 °C představuje horní teplotní limit většiny běžných plynových chromatografů. Mobilní fází v plynové chromatografii je nosný plyn, nejčastěji dusík, argon, helium a vodík. Stacionární fáze je součást kolon buď náplňových, nebo kapilárních. Náplňové kolony jsou trubice ze skla nebo nerezové ocely plněné např. adsorbentem (u GSC)- silikagel, Al2O3, syntetické makromolekulární adsorbenty nebo nosičem pokrytým kapalnou stacionární fází (GLC). Nosičem bývá nejčastěji křemelina o velikosti částic 0,1-0,15 mm. U kapilárních kolon funkci nosiče mají vnitřní stěny kapilár, kdy vnitřní povrch je potažen tenkým filmem zakotvené stacionární fáze. Kapilární kolony se zhotovují např. z taveného křemene, jehož povrch je pokryt vrstvičkou polyamidu. Délka kolon náplňových se pohybuje nejčastěji od 0,5 – 4 m, a u kapilárních od 10-100m.Vzorky lze dávkovat injekční stříkačkou nebo dávkovacími kohouty. U plynové chromatografie lze využít několika typů detektorů, např. -

detektor tepelně vodivostní

-

plamenový ionizační detektor

-

detektor elektronového záchytu (JANČÁŘOVÁ a JANČÁŘ, 2003).

3.9.2 Kapalinová chromatografie V kapalinové chromatografii je mobilní fáze kapalina. Na rozdíl od plynové chromatografie rozhodují o separaci složek vzorku nejen jejich interakce se stacionární fází, ale velmi výrazně i použitá mobilní fáze. Během separace se analyt rozděluje mezi mobilní a stacionární fázi. Čas, jaký stráví v jedné nebo druhé fázi, závisí na afinitě analytu ke každé z nich. Jsou využitelné všechny možné mechanismy separace – adsorpce, rozdělování na základě různé rozpustnosti, iontová výměna, molekulově sítový efekt nebo specifické interakce v afinitní chromatografii. Podle uspořádání stacionární fáze rozlišujeme kolonovou a tenkovrstvou či papírovou kapalinovou chromatografii. Protože je možno pracovat za laboratorní teploty bez nutnosti převádět vzorek na plyn, je kapalinová chromatografie vhodná i pro separaci tepelně nestálých a netěkavých sloučenin. Pracujeme obvykle eluční metodou (KLOUDA, 2003). 30

Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) HPLC zahrnuje soubor metod založených na různém mechanismu separace, jejichž společným znakem je použití kapalné mobilní fáze, vysokotlaké techniky a účinných kolon. Metody HPLC lze rozdělit na chromatografii: -

v systému kapalina-tuhá látka, kterou lze dále rozdělit např. na chromatografii na polárních adsorbentech, na nepolárních adsorbentech, na chemicky vázaných fázích, na chromatografii iontově výměnnou a gelovou

-

v systému kapalina-kapalina (využívá kapalnou stacionární fázi, zakotvenou na inertním nosiči).

Vysoké účinnosti a rychlosti se u této metody dosahuje použitím kolon plněných náplněmi s velmi jemnými částicemi (3 – 15 µm) a poměrně velkých průtoků mobilní fáze, což ovšem vyžaduje použití vysokotlakých čerpadel, která zajišťují konstantní průtok mobilní fáze. Kolony pro HPLC jsou zhotoveny z materiálu, který odolává vysokým tlakům (až 60 MPa)- nejčastěji z borosilikátového tvrzeného skla nebo z antikorozní oceli. Kolony jsou plněny sorbety s částicemi o velikosti 3-10 µm, délka kolon se pohybuje mezi 5-50 cm s vnitřním průměrem 2-4 mm. K dávkování vzorku se používá kohout (ventil) s dávkovací smyčkou (µl), která se naplňje mikrostříkačkou. Důležitým a limitujícím prvkem kapalinové chromatografie je detektor, přičemž se používají převážně detektory: - optické (spektrofotometrický, fluorimetrický, refraktometrický detektor), - elektrochemické (vodivostní detektory). Adsorpční kapalinová chromatografie (LSC) využívá interakci mezi složkami vzorku a tuhou fází (adsorbentem) a prostředím mobilní fáze. Nejpoužívanějším adsorbentem je polární adsorbent silikagel (hydratovaný oxid křemičitý s proměnlivým stupněm hydratace) nebo Al2O3. Při volbě mobilní fáze se vychází z toho, že na polárních adsorbentech roste eluční účinnost od méně polárních k polárnějším rozpouštědlům. Dle rostoucí eluční účinnosti tvoří rozpouštědla eluotropickou řadu ve zkráceném zápisu: heptan, tetrachlormethan, toluen, chloroform, aceton, acetonitril, ethanol, methanol a octová kyselina.

31

Rozdělovací kapalinová chromatografie (LLC) využívá distribuce složek mezi kapalnou mobilní fází a kapalnou stacionární fází, přičemž obě kapaliny nesmí být mísitelné. U rozdělovací kapalinové chromatografie je stacionární fází kapalina fixovaná na vhodném nosiči. Vzhledem k tomu, že u mechanicky zakotvené fáze kapalné, může dojít k narušení filmu stacionární fáze na nosiči, osvědčily se chemicky vázané stacionární fáze. Základem většiny náplní, které obsahují chemicky vázanou stacionární fázi, je silikagel ve formě plně porézních částic nepravidelného tvaru nebo plně porézních kulovitých částic. Chemicky vázaná stacionární fáze na těchto nosičích se získává vytvořením vrstvičky chemicky vázaného silikonového polymeru. Součástí silikonového polymeru je vždy určitá koncová funkční skupina, která ovlivňuje vlastnosti chemicky vázané fáze. Používají se buď uhlovodíkové (hydrofobní) skupiny (např. oktyl-, oktadecyl-), těmto fázím potom říkáme obrácené, jsou označovány zkratkou RP nebo polární funkční skupiny (např. nitridové, aminové), jež jsou zatím méně běžné. V chromatografii s obrácenými fázemi se pracuje s polárními mobilními fázemi. Používají se alkoholy (methanol), nitrily (acetonitril) a ethery (tetrahydrofuran, dioxin). Většinou se používají ve směsi s vodou. Rozpouštědla používaná jako mobilní fáze můžeme seřadit podle rostoucí eluční síly pro nejčastěji používaná rozpouštědla: voda, methanol, acetonitril, tetrahydrofuran, aceton. Při chromatografickém dělení směsi látek je možné použít jedinou mobilní fázi s konstantním složením neboli využívá se tzv. izokratická eluce. Při analýzách složitých směsí nelze někdy pracovat s jedním eluentem, neboť bychom mohli získat složky buď nerozdělené nebo bychom zaznamenali dlouhé retenční (eluční) časy pomalých složek, což znamená nežádoucí prodloužení doby analýzy. Proto se využívá technika tzv. gradientové eluce, kdy lze buď využít postupně několik rozpouštědel o stoupající eluční síle, nebo lze vícestupňový růst eluční síly nahradit plynulou změnou- tj. mění se během eluce plynule složení mobilní fáze. Gradient mobilní fáze se může týkat také jejího pH (JANČÁŘOVÁ a JANČÁŘ, 2003). V celkem 136 obalových materiálech na potraviny byla analyzována přítomnost šesti ftalátů. Materiály všech vzorků byly vyrobeny buďto ze syntetických polymerů nebo dřevité kaše a většinou byly v bezprostředním kontaktu s potravinou uvnitř. Extrahovány byly do směsi chloroformu a methanolu 2:1 a byly analyzovány pomocí plynové chromatografie a hmotnostní spektrometrie. Ve všech zkoumaných materiálech byly nalezeny dvě nebo více těchto sloučenin nad detekčním limitem 0,01 µg . kg-1. 32

Celkové koncentrace ftalátů se pohybovaly od 5 do 8160 µg . g-1. Nejvyšší koncentraci ftalátů vykazovaly obecně materiály s nejvíce potištěným povrchem. Výskyt a koncentrace ftalátů byly zkoumány v období 12 měsíců v letech 1996-1997 a byl u nich pozorován jistý rozptyl ( BALAFAS aj., 1999). Metodou GC-MS byly stanoveny DBP a DEHP ve 22 vzorcích dětského mléka, dětské stravy a lidského i kravského mléka. Zjištěná střední hodnota byla 50 ng . g-1 pro DBP a 200 ng.g-1 pro DEHP (GÓMEZ – HENS a AGUILAR – CABALLOS, 2003). DE ORSI aj., (2006), vyvinuli jednoduchou a rychlou analytickou metodu pro stanovení ftalátů, používaných obvykle v produktech nehtové kosmetiky. Metoda je založena na ultrazvukové extrakci vzorku směsí ethanol-voda (90:10, v/v), po níž následuje separace HPLC a kvantitace. HPLC byla prováděna se sloupcem C18 a spektrofotometrickou detekcí při 254 nm. Dále byla provedena lineární gradientová eluce se směsí ethanol-voda, počínaje od 50 do 95 % ethanolu za 30 min. Standardní kalibrační křivky byly lineární pro všechny analyty nad intervalem koncentrace 5-200 µg . cm-3, s hodnotami LOD okolo 0,5 µg .cm-3. LI a WANG (2005), vytvořili metodu pro nepřímé stanovení esterů kyseliny ftalové ve vzorcích ze životního prostředí pomocí fluorimetrie. Za správných podmínek hydrolýzy byl DEP kompletně hydrolyzován a poté se vytvořil ftalát sodný. V tlumícím roztoku Na2HPO4-Na2HPO4 při pH 7,4 dochází díky Fentonově reakci ke tvorbě radikálu bez hydroxylů; objem roztoku EDTA-Fe (II) byl 5,7.10-3 mol . dm-3, 3% H2O2, roztok byl 0,5; 1,0 ml a optimální reakční doba 50 minut. Radikál má sklon reagovat s ftalátem sodným a poté vznikl fluorescentní hydroxyftalát sodný, který zůstal stabilní po více než 5 hodin. Maximální excitační a emisní vlnová délka byla 317 nm, respektive 442 nm. DEP měl dobrou lineární závislost v intervalu 5,03.10-7 podobném 1,01.10-5 s korelačním koeficientem 0,9998 a detekčním limitem 8,26.10-8 mol . dm-3. Tato metoda byla s uspokojivými výsledky aplikována na stanovení PAE ve vzorcích vody a půdy. Pomocí metody GC-MS byla zkoumána kontaminace citrusových esenciálních olejů ze Sicílie a Kalábrie estery kyseliny ftalové v letech 1994-1996. Celkem bylo analyzováno

35

vzorků

citrónového

oleje,

31

vzorků

pomerančového

a

21 mandarinkového oleje. Téměř ve všech vzorcích byl nalezen DiBP a/nebo DEHP, zatímco DnBP byl přítomen jen v 8 vzorcích. Pro DiBP byly zjištěny koncentrace až do maxima 62 ppm a pro DEHP až do maxima 29,9 ppm ( DI BELLA aj., 1999).

33

4 MATERIÁL A METODY ZPRACOVÁNÍ 4.1 Použitý materiál Do pokusu bylo zařazeno 200 kusů jednodenních kuřat ROSS 308. Kuřata byla rozdělena do 4 skupin (v každé skupině 50 kuřat): •

kuřata skupiny K

-

od 1. do 21. dne pokusu byla krmena běžnou kompletní krmnou směsí (KKS) BR1 (netukovaná)

-

od 22. do 35 dne pokusu byla krmena běžnou KKS BR2 (netukovaná)

-

od 36. do 42. dne pokusu byla krmena běžnou KKS BR3 (netukovaná)

•

kuřata skupiny N

-

od 1. do 21. dne pokusu byla krmena běžnou KKS BR1 (netukovaná)

-

od 22. do 35. dne pokusu byla krmena běžnou KKS BR2 s přídavkem 3 % rostlinného oleje s nízkým obsahem ftalátů; olej byl skladován v plechové nádobě

-

od 36. do 42. dne pokusu byla krmena běžnou KKS BR3 s přídavkem 5 % rostlinného oleje s nízkým obsahem ftalátů; olej byl skladován v plechové nádobě

•

kuřata skupiny V

-

od 1. do 21. dne pokusu byla krmena běžnou KKS BR1 (netukovaná)

-

od 22. do 35. dne pokusu byla krmena běžnou KKS BR2 s přídavkem 3 % rostlinného oleje s vysokým obsahem ftalátů; olej byl skladován v plastové nádobě

-

od 36. do 42. dne pokusu byla krmena běžnou KKS BR3 s přídavkem 5 % rostlinného oleje s vysokým obsahem ftalátů; olej byl skladován v plastové nádobě

•

kuřata skupiny Ž

-

od 1. do 21. dne pokusu byla krmena běžnou KKS BR1 (netukovaná)

-

od 22. do 35. dne pokusu byla krmena běžnou KKS BR2 s přídavkem 3 % živočišného tuku s vysokým obsahem ftalátů

-

od 36. do 42. dne pokusu byla krmena běžnou KKS BR3 s přídavkem 5 % živočišného tuku s vysokým obsahem ftalátů

34

Obsah DBP a DEHP (mg.kg-1) v krmivech, která byla podávána kuřatům kontrolní skupiny (K), kuřatům skupiny s nízkým obsahem ftalátů (N), kuřatům skupiny s vysokým obsahem ftalátů (V) a kuřatům skupiny s přídavkem živočišného tuku (Ž) jsou uvedeny v tab.1. Tab. 1 Koncentrace DBP a DEHP ( mg . kg -1) v krmivech (BR1, BR2, BR3), která přijímala kuřata kontrolní skupiny (K), kuřata skupiny s nízkým obsahem ftalátů (N), kuřata skupiny s vysokým obsahem ftalátů (V) a kuřata skupiny s přídavkem živočišného tuku (Ž) K běžné KKS BR1 BR2 DBP 0,96 1,37 [mg . kg-1] DEHP 0,48 0,52 [mg . kg-1] 1,44 1,89 Σ

N

V

Ž přídavek živočišného tuku v KKS

BR3

nízký obsah ftalátů v KKS

vysoký obsah ftalátů v KKS

1,02

15,56

51,35

43,28

0,76

2,25

7,00

2,10

1,78

17,81

58,35

45,38

Kuřata byla po omráčení pařena horkou vodou a oškubána tak, aby nedošlo k poškození kůže. Jatečná těla kuřat byla převezena na Ústav technologie potravin MZLU v Brně, kde byla následně rozbourána. Na obsah DEHP a DBP byla analyzována svalovina (směsný vzorek prsní a stehení svaloviny levé půlky), kůže a mezenteriální tuk. Játra byla pro malou hmotnost analyzována jako směsný vzorek (homogenát 8 jater z každé skupiny). U pokusných kuřat bylo stanovení DEHP a DBP provedeno individuálně u každého kuřete. Vzorky byly označeny, zabaleny do mikrotenových sáčků a zamraženy.

4. 2 Metody stanovení esterů kyseliny ftalové Pro stanovení PAE byly použity zavedené metody pro stanovení ftalátů v potravinách (JAROŠOVÁ aj., 1998 a 1999).

35

4.2.1 Příprava vzorku před extrakcí Vzorky byly po dodání do laboratoře homogenizovány, naváženy na Petriho misky (50-200g podle obsahu tuku ve vzorku). Vzorky byly zamraženy, skladovány v mrazícím boxu a postupně lyofilizovány.

4.2.2 Extrakce PAE Extrakce třepáním s organickým rozpouštědlem Lyofilizovaný vzorek o hmotnosti 5-15 g (odpovídá 10-50 g původní matrice) byl převeden do Erlenmayerovy baňky a PAE byly extrahovány třikrát 80 ml hexanu na třepačce 60, 30, 30 minut. Spojené hexanové extrakty byly zahuštěny na RVO při 40 °C a skladovány v mrazničce. Před separací PAE byl hexan odpařen do sucha pod proudem dusíku. Extrakce je vhodná pro matrice s nízkým obsahem tuku.

4.2.3 Separace PAE od koextraktů metodou GPC Na kolonu o rozměrech 8 x 500 mm byl dávkován smyčkou objem 1 ml, což reprezentovalo 0,25 g extrahovaného tuku nebo alikvotní množství extraktu vzorku rozpuštěného v mobilní fázi. Při průtoku mobilní fáze dichlormethan: cyklohexan (1:1) 1 ml . min-1 byla eluována frakce s PAE od 10 do 18 min.

4.2.4 Čištění koncentrovanou kyselinou sírovou Při nedokonalém oddělení PAE od tuku u živočišných matric se provádělo dočištění koncentrovanou kyselinou sírovou. Z frakce obsahující PAE byla odpařena mobilní fáze, odparek byl převeden hexanem do zkumavky s uzávěrem (skleněná zkumavka se zábrusovou zátkou nebo vialka s teflonovým uzávěrem). Objem hexanu byl adjustován na 1 ml, přidán 1 ml konc. H2SO4 a obsah byl intenzivně třepán 10 minut. Fáze byla oddělena odstředěním a hexanová fáze byla odstraněna. Ke konc. H2SO4 byly přidány 2 ml vychlazené hydratované H2SO4. Hydratovaná H2SO4 byla připravena zředěním konc. H2SO4 destilovanou vodou na výslednou koncentraci 65 % (ředění bylo prováděno v lázni s ledovou vodou). PAE byly extrahovány 1 ml hexanu za intenzivního třepání 10 minut. Fáze byla oddělena odstředěním a hexanová fáze byla převedena do zkumavky (vialky). Extrakce PAE byla opakována ještě dvakrát vždy 1 ml hexanu. Spojené hexanové extrakty byly ve zkumavce odpařeny pod dusíkem a rozpuštěny v příslušném objemu acetonitrilu pro HPLC stanovení. 36

4.2.5 HPLC analýza - kolona: Cogent e-Colum C 18, zrnění 5 µm, délka 150 mm, Super Link - detektor: UV a MS - vlnová délka 224 mm - mobilní fáze: acetonitril: voda (99:1) - průtok: 0,8 ml . min-1 - kapalinový chromatograf Agilent Technologies LC/MSD VL

QA/QC parametry metody Před každou analýzou se kontrolují použité sklo a chemikálie na přítomnost PAE pro vyloučení sekundární kontaminace. Všechny laboratorní pomůcky a potřeby se opláchnou a promyjí hexanem nebo acetonem. S každou sérií vzorků se provádí slepý pokus pro kontrolu čistoty analytického postupu a korekci chromatografického pozadí. Aby nedocházelo ke ztrátám PAE při odpařování, zahušťují se extrakty a eluáty na rotační vakuové odparce při teplotě vodní lázně do 40 °C a odpaření do sucha se provádí pod mírným proudem dusíku. Množství tuku dávkované na GPC kolonu se řídí parametry kolony, je přímo úměrné hmotnosti náplně gelu. Proto je nutné pro každou kolonu otestovat navážku tuku, průtok mobilní fáze pro účinné oddělení PAE od tuků a eluční čas PAE frakce. Pokud je navážka tuku nízká, musí být vzorek na kolonu dávkován ve dvou podílech a frakce ftalátů se spojí. Mobilní fáze musí být shodná s organickou fází ve které byl gel Bio-beads S-X3 bobtnán a plněn do kolony. Účinnost separace PAE od tuků vyžaduje přesné nastavení všech parametrů, jinak dochází k přechodu tuků do frakce PAE. Eluční časy frakcí PAE při GPC separaci se kontrolují průběžně UV detektorem s registrací. Pro výpočet výsledků se měří plochy píků a koncentrace PAE se odečtou z kalibrační přímky, jež obsahuje alespoň 4 body a je sestavena v rozsahu koncentrací 0 – 1000 ng (0-100 mg PAE . kg-1). V této oblasti je odezva daného UV detektoru lineární. Kalibrační přímka se kontroluje s každou sérií analyzovaných vzorků nástřikem standardních roztoků sledovaných analytů. Koncentrace PAE se vyjadřují na celý vzorek v mg . kg-1 v souladu s hygienickými limity. Vzorky se analyzují v duplikátech. Při celém postupu musí být vzorek vážen a bilancován obsah tuku pro zpětný přepočet koncentrace PAE na celý vzorek a paralelně se stanoví obsah sušiny. Nejnižší detekovatelné množství DEHP a DBP v nástřiku je při HPLC stanovení 20 ng. Kvantitativní limit detekce závisí na obsahu tuku ve vzorku. Pro tukové matrice se 37

pohybuje od 0,2 do 0,4 mg PAE v 1 kg, pro živočišný materiál s nízkým obsahem tuku od 0,01 do 0,05 mg PAE v 1 kg původního vzorku. Výtěžnost a opakovatelnost metody je pravidelně kontrolována na vzorcích se známým přídavkem standardů PAE. Jelikož nejsou k dispozici referenční biologické materiály o známé koncentraci PAE, je prováděna kontrola výtěžnosti přídavkem známé koncentrace DEHP a DBP k homogenátu vzorku, který neobsahuje rezidua nad detekční limit metody nebo je stanovena koncentrace PAE ve vzorku (8 paralerních stanovení) a přidán standardní přídavek ftalátu (GAJDŮŠKOVÁ aj., 1996; JAROŠOVÁ aj., 1998 a 1999).

38

5 VÝSLEDKY A DISKUSE Pro sledování kumulace PAE v živočišných tkáních bylo použito 32 kuřat ROSS 308, které byly rozděleny do 4 skupin (v každé skupině 8 jedinců): kontrolní (K), s nízkým obsahem ftalátů (N), s vysokým obsahem ftalátů (V), s přídavkem živočišného tuku (Ž). Pokusná zvířata byla v průběhu pokusu bez klinických příznaků onemocnění. Pro stanovení se z každého jedince odebrala svalovina, tuk, játra a kůže. Koncentrace DBP a DEHP se stanovila pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie. U každého vzorku se měření provádělo 2krát. Naměřené hodnoty DBP a DEHP jednotlivých pokusných skupin jsou uvedeny v tab. 2 – 6 a obr. 3 – 15.

5.1 Výsledky stanovení PAE u kontrolní skupiny kuřat Koncentrace DBP a DEHP (mg . kg-1 původního vzorku), které byly naměřeny ve vzorcích kůže a tuku v kontrolní skupině jsou uvedeny v tab.2 a obr. 3 – 4. Hodnoty koncentrace DBP ve vzorcích kůže se pohybovaly v rozmezí od 0,11 do 0,78 mg . kg-1. Průměrná hodnota koncentrace byla (0,36 ± 0,26) mg . kg-1. Hodnoty koncentrace DBP ve vzorcích tuku se pohybovaly v rozmezí od 0,24 do 1,45 mg . kg-1 a průměrná hodnota koncentrace byla (0,55 ± 0,36) mg . kg-1. Hodnoty koncentrace DEHP ve vzorcích kůže se pohybovaly v rozmezí od 0,31 do 4,68 mg . kg-1. Průměrná hodnota koncentrace byla (1,18 ± 1,36) mg . kg-1. Koncentrace DEHP ve vzorcích tuku se pohybovaly v rozmezí od 0,31 do 3,08 mg . kg-1. Průměrná hodnota koncentrace byla (1,38 ± 0,91) mg . kg-1.

39

Tab. 2 Koncentrace DBP a DEHP ( mg . kg

-1

původního vzorku) v kůži a tuku kuřat

kontrolní skupiny DBP [mg . kg-1]

DEHP [mg. kg-1]

Vzorek č.

Kůže

Tuk

Kůže

Tuk

1

0,78

0,53

0,31

1,32

2

0,17

0,24

0,39

0,89

3

0,78

0,42

0,98

2,36

4

0,26

0,42

4,68

0,66

5

0,13

1,45

1,17

3,08

6

0,29

0,56

1,00

0,31

7

0,38

0,27

0,47

1,82

8

0,11

0,48

0,45

0,57

x

0,36

0,55

1,18

1,38

S.D

0,26

0,36

1,36

0,91

DBP 1,60 1,40 -1

c [mg . kg ]

1,20 1,00 KŮŽE

0,80

TUK

0,60 0,40 0,20 0,00 1

2

3

4

5

6

7

8

kuřata

Obr. 3 Koncentrace DBP (mg . kg-1 původního vzorku) v kůži a tuku kuřat kontrolní skupiny

40

-1

c [mg . kg ]

DEHP 5,00 4,50 4,00 3,50 3,00 2,50 2,00 1,50 1,00 0,50 0,00

KŮŽE TUK

1

2

3

4

5

6

7

8

kuřat

Obr. 4 Koncentrace DEHP (mg . kg-1 původního vzorku) v kůži a tuku kuřat kontrolní skupiny

5.2 Výsledky stanovení PAE u skupiny kuřat krmených krmivem s nízkým obsahem ftalátů V tab. 3 a obr. 5 – 6 jsou uvedeny hodnoty koncentrace DBP a DEHP (mg . kg-1 původního vzorku) naměřené ve vzorcích kůže a tuku ve skupině kuřat krmených krmivem s nízkým obsahem ftalátů. Koncentrace DBP ve vzorcích kůže se pohybovala v rozmezí od 0,20 do 1,49 mg . kg-1. Průměrná hodnota koncentrace DBP v kůži byla (0,51 ± 0,39) mg . kg-1. Koncentrace DBP ve vzorcích tuku se pohybovala v rozmezí od < 0,20 do 1,70 mg . kg-1. Průměrná hodnota koncentrace DBP v tuku byla (0,59 ± 0,46) mg . kg-1. Koncentrace DEHP ve vzorcích kůže se pohybovala v rozmezí od 0,58 do 1,95 mg . kg-1. Průměrná hodnota koncentrace DEHP v kůži byla (1,10 ± 0,55) mg . kg-1. Hodnoty koncentrace DEHP ve vzorcích tuku se pohybovaly v rozmezí od 0,67 do 4,96 mg . kg-1. Průměrná hodnota koncentrace DEHP v tuku byla (1,92 ± 1,35) mg . kg-1.

41

Tab. 3 Koncentrace DBP a DEHP (mg . kg

-1

původního vzorku) v kůži a tuku ve

skupině kuřat krmených krmivem s nízkým obsahem ftalátů DBP [mg . kg-1]

DEHP [mg . kg-1]

Vzorek č.

Kůže

Tuk

Kůže

Tuk

1

0,30

0,34

1,46

0,67

2

0,54

1,70

1,93

4,96

3

0,20

0,54

0,58

1,82

4

1,49

0,36

0,83

1,92

5

0,26

0,19

0,73

0,71

6

0,35

0,52

0,70

0,74

7

0,54

< 0,2

0,62

2,79

8

0,38

0,46

1,95

1,72

x

0,51

0,59

1,10

1,92

S.D

0,39

0,46

0,55

1,35

DBP 1,80 1,60

-1

c [mg . kg ]

1,40 1,20 1,00

KŮŽE

0,80

TUK

0,60 0,40 0,20 0,00 1

2

3

4

5

6

7

8

kuřat

Obr. 5 Koncentrace DBP (mg . kg -1 původního vzorku) v kůži a tuku ve skupině kuřat krmených krmivem s nízkým obsahem ftalátů

42

DEHP 6,00

-1

c [mg . kg ]

5,00 4,00 KŮŽE

3,00

TUK

2,00 1,00 0,00 1

2

3

4

5

6

7

8

kuřat

Obr. 6 Koncentrace DEHP (mg . kg -1 původního vzorku) v kůži a tuku ve skupině kuřat krmených krmivem s nízkým obsahem ftalátů

5.3 Výsledky stanovení PAE u skupiny kuřat krmených krmivem s vysokým obsahem ftalátů V tab. 4 a obr. 7 – 8 jsou uvedeny hodnoty koncentrace DBP a DEHP (mg. kg-1 původního vzorku) ve skupině kuřat krmených krmivem s vysokým obsahem ftalátů. Koncentrace DBP ve vzorcích kůže se pohybovala v rozmezí od 0,23 do 1,14 mg . kg-1. Průměrná hodnota koncentrace DBP v kůži byla (0,57 ± 0,37) mg . kg-1. Koncentrace DBP ve vzorcích tuku se pohybovala v rozmezí od 0,28 do 2,56 mg . kg-1. Průměrná hodnota koncentrace DBP v tuku byla (1,28 ± 1,00) mg . kg-1. Koncentrace DEHP ve vzorcích kůže se pohybovala v rozmezí od 0,33 do 3,61 mg . kg-1. Průměrná hodnota koncentrace DEHP v kůži byla (1,38 ± 1,07) mg . kg-1. Koncentrace DEHP ve vzorcích tuku se pohybovala v rozmezí od 0,71 do 9,85 mg . kg-1. Průměrná hodnota koncentrace DEHP v tuku byla (3,27 ± 2,87) mg . kg-1.

43

Tab. 4 Koncentrace DBP a DEHP (mg . kg

-1

původního vzorku) ve skupině kuřat

krmených krmivem s vysokým obsahem ftalátů DBP [mg . kg-1]

DEHP [mg . kg-1]

Vzorek č.

Kůže

Tuk

Kůže

Tuk

1

0,23

0,36

0,88

1,32

2

0,88

0,28

0,64

1,06

3

0,32

0,28

0,63

0,71

4

1,08

2,56

3,61

4,66

5

0,32

2,54

0,33

1,32

6

0,30

2,42

1,56

9,85

7

1,14

1,35

2,56

4,48

8

0,27

0,48

0,81

2,76

x

0,57

1,28

1,38

3,27

S.D

0,37

1,00

1,07

2,87

DBP 3,00

-1

c [mg . kg ]

2,50 2,00 KŮŽE

1,50

TUK

1,00 0,50 0,00 1

2

3

4

5

6

7

8

kuřat

Obr. 7 Koncentrace DBP (mg . kg -1 původního vzorku) v kůži a tuku ve skupině kuřat krmených krmivem s vysokým obsahem ftalátů

44

DEHP 12,00

-1

c [mg . kg ]

10,00 8,00 KŮŽE TUK

6,00 4,00 2,00 0,00 1

2

3

4

5

6

7

8

kuřat

Obr. 8 Koncentrace DEHP (mg . kg -1 původního vzorku) v kůži a tuku ve skupině kuřat krmených krmivem s vysokým obsahem ftalátů

5.4 Výsledky stanovení PAE u skupiny kuřat krmených krmivem s přídavkem živočišného tuku Hodnoty koncentrace DBP a DEHP (mg . kg-1 původního vzorku) ve vzorcích kůže a tuku jsou uvedeny v tab. 5 a obr. 9 – 10. Koncentrace DBP ve vzorcích kůže se pohybovala v rozmezí od 0,21 do 0,73 mg . kg-1. Průměrná hodnota koncentrace DBP v kůži byla (0,44 ± 0,17) mg . kg-1. Koncentrace DBP ve vzorcích tuku se pohybovala v rozmezí od 0,34 do 2,54 mg . kg-1. Průměrná hodnota koncentrace DBP v tuku byla (0,89 ± 0,74) mg . kg-1. Koncentrace DEHP ve vzorcích kůže se pohybovala v rozmezí od 0,14 do 3,02 mg . kg-1. Průměrná hodnota koncentrace DEHP v kůži byla (1,60 ± 1,01) mg . kg-1. Koncentrace DEHP ve vzorcích tuku se pohybovala v rozmezí od 0,25 do 3,84 mg . kg-1. Průměrná hodnota koncentrace DEHP v tuku byla (1,85 ± 1,27) mg . kg-1.

45

Tab. 5 Koncentrace DBP a DEHP (mg . kg

-1

původního vzorku) v kůži a tuku ve

skupině kuřat krmených krmivem s přídavkem živočišného tuku DBP [mg . kg-1] Vzorek č.

Kůže

DEHP [mg . kg-1]

Tuk

Kůže

Tuk

1

0,47

1,69

1,51

3,12

2

0,73

0,37

2,38

0,93

3

0,41

2,54

3,02

1,41

4

0,22

0,65

0,14

3,25

5

0,55

0,48

2,38

1,36

6

0,21

0,34

0,40

0,61

7

0,34

0,48

2,29

3,84

8

0,59

0,54

0,70

0,25

x

0,44

0,89

1,60

1,85

S.D

0,17

0,74

1,01

1,27

DBP 3,00

-1

c [mg . kg ]

2,50 2,00 KŮŽE TUK

1,50 1,00 0,50 0,00 1

2

3

4

5

6

7

8

kuřat

Obr. 9 Koncentrace DBP (mg . kg -1 původního vzorku) v kůži a tuku ve skupině kuřat krmených krmivem s přídavkem živočišného tuku

46

DEHP 4,50 4,00

-1

c [mg . kg ]

3,50 3,00 2,50

KŮŽE TUK

2,00 1,50 1,00 0,50 0,00 1

2

3

4

5

6

7

8

kuřat

Obr. 10 Koncentrace DEHP (mg . kg -1 původního vzorku) v kůži a tuku ve skupině kuřat krmených krmivem s přídavkem živočišného tuku

5.5 Výsledky stanovení PAE v játrech Játra byla analyzována jako směsný vzorek pro celou skupinu a zjištěné hodnoty koncentrace DBP a DEHP (mg . kg-1 původního vzorku) pro všechny 4 skupiny [kontrolní (K), s nízkým obsahem ftalátů (N), s vysokým obsahem ftalátů (V) a s přídavkem živočišného tuku (Ž)] jsou uvedeny v tab. 6 a obr. 11. Nejvyšší koncentrace DBP (0,13 mg . kg-1 původního vzorku) byla zjištěna v játrech skupiny kuřat krmených krmivem s přídavkem živočišného tuku, nejnižší koncentrace DBP (0,03 mg . kg-1 původního vzorku) byla zjištěna v játrech skupiny kuřat krmených krmivem s nízkým obsahem ftalátů. Nejvyšší koncentrace DEHP (0,24 mg . kg-1 původního vzorku) byla zjištěna v játrech skupiny kuřat krmených krmivem s vysokým obsahem ftalátů. Nejnižší koncentrace DEHP (0,16 mg . kg-1 původního vzorku) byla zjištěna v játrech kuřat kontrolní skupiny a skupiny krmených krmivem s nízkým obsahem ftalátů.

47

Tab. 6 Koncentrace DBP a DEHP (mg . kg

-1

původního vzorku) v játrech kuřat

kontrolní skupiny (K), skupiny kuřat krmených krmivem s nízkým obsahem ftalátů (N), skupiny kuřat krmených krmivem s vysokým obsahem ftalátů (V), skupiny kuřat krmených krmivem s přídavkem živočišného tuku (Ž) DBP [mg . kg ] DEHP [mg . kg-1] -1

K 0,05 0,16

N 0,03 0,16

V 0,11 0,24

Ž 0,13 0,23

0,30

0,20

-1

c [mg . kg ]

0,25

DBP

0,15

DEHP

0,10 0,05 0,00 K

N

V

Ž

SKUPINA

Obr. 11 Koncentrace DBP a DEHP v játrech kuřat skupiny (K, N, V, Ž)

5.6 Srovnání kumulace PAE v tuku, kůži a játrech mezi jednotlivými skupinami Koncentrace DBP a DEHP v tuku, kůži a játrech kuřat kontrolní skupiny (K), skupiny kuřat krmených krmivem s nízkým obsahem ftalátů (N), skupiny kuřat krmených krmivem s vysokým obsahem ftalátů (V) a skupiny kuřat krmených krmivem s přídavkem živočišného tuku (Ž) jsou uvedeny v obr. 12 – 15.

48

3,50 3,00

-1

c [mg . kg ]

2,50 2,00

DBP DEHP

1,50 1,00 0,50 0,00 TUK

KŮŽE

JÁTRA

Obr.12 Koncentrace DBP a DEHP (mg . kg-1 původního vzorku) ve vzorcích kontrolní skupiny kuřat

3,50 3,00

-1

c [mg . kg ]

2,50 2,00

DBP DEHP

1,50 1,00 0,50 0,00 TUK

KŮŽE

JÁTRA

Obr. 13 Koncentrace DBP a DEHP (mg . kg-1 původního vzorku) ve vzorcích skupiny kuřat krmených krmivem s nízkým obsahem ftalátů

49

3,50 3,00

-1

c [mg . kg ]

2,50 2,00

DBP DEHP

1,50 1,00 0,50 0,00 TUK

KŮŽE

JÁTRA

Obr. 14 Koncentrace DBP a DEHP (mg . kg-1 původního vzorku) ve vzorcích skupiny kuřat krmených krmivem s vysokým obsahem ftalátů

3,50 3,00

-1

c [mg . kg ]

2,50 2,00

DBP DEHP

1,50 1,00 0,50 0,00 TUK

KŮŽE

JÁTRA

Obr. 15 Koncentrace DBP a DEHP (mg . kg-1 původního vzorku) ve vzorcích skupiny kuřat krmených krmivem s přídavkem živočišného tuku

50

Z obrázků 3 až 15 je patrné že DBP se nejvíce kumuloval v mezenteriálním tuku. Nejvyšší průměrná hodnota koncentrace DBP v tuku (1,28 ± 1,00 mg . kg-1 původního vzorku) byla nalezena ve skupině kuřat krmených krmivem s vysokým podílem ftalátů. V kůži se DBP kumuloval přibližně stejně ve všech skupinách (0,36 – 0,57 mg . kg-1). Nejnižší průměrná hodnota koncentrace DBP (0,36 ± 0,26 mg . kg-1 původního vzorku) byla nalezena v kůži kuřat kontrolní skupiny, která byla krmena běžnými kompletními krmnými směsmi. DEHP se kumuloval nejvíce v mezenteriálním tuku (1,38 – 3,27 mg . kg-1) a kůži (1,10 – 1,60 mg . kg-1) . Nejvyšší průměrná hodnota koncentrace DEHP (3,27 ± 2,87 mg . kg-1) byla nalezena v tuku kuřat krmených krmivem s vysokým podílem ftalátů. Nejnižší průměrná hodnota koncentrace DEHP (1,10 ± 0,55 mg . kg-1 původního vzorku) byla nalezena v kůži kuřat krmených krmivem s nízkým podílem ftalátů. DEHP se kumuloval v mezenteriálním tuku 2,6 krát více než DBP a v kůži se DEHP kumuloval 2,9 krát více než DBP. V práci z roku 1999 kdy bylo zkoumáno distribuce a kumulace DEHP a DBP v tělesných tkáních prasat a brojlerů po orálním podávání ftalátů, byly zjištěny tyto hodnoty: obsah DBP v kůži 0,9; ve svalovině 0,19; v mezenteriálním tuku 3,13 a v játrech 0,27 mg . kg-1 původního vzorku; obsah DEHP v kůži 8,28; ve svalovině 1,93; v mezenteriálním tuku 18,20 a v játrech 0,32 mg . kg-1 původního vzorku (JAROŠOVÁ aj., 1999). Naše výsledky byly poněkud nižší, hlavně v obsahu DEHP a DBP v kůži a tuku, což souviselo s obsahem PAE v krmné dávce. Rozdíl v kumulaci DEHP a DBP je obdobný jako u našich výsledků.

51

6 ZÁVĚR Pro sledování kumulace esterů kyseliny ftalové (DBP a DEHP) v živočišných tkáních byly použity vzorky mezenteriálního tuku, kůže a jater z kuřat ROSS 308. Výkrm probíhal ve spolupráci s Veterinární a farmaceutickou univerzitou v Brně. Do pokusu bylo zařazeno 200 kusů jednodenních kuřat ROSS 308. Kuřata byla rozdělena do 4 skupin (v každé skupině 50 kuřat). Kuřata skupiny K byla krmena běžnými kompletními krmnými směsmi (KKS) bez přídavku tuku, kuřata skupiny N byla krmena běžnými KKS s přídavkem 3 % rostlinného oleje (olej byl skladován v plechové nádobě) s nízkým obsahem ftalátů do krmiva BR2 a 5 % do krmiva BR3, kuřata skupiny V byla krmena běžnými KKS s přídavkem 3 % rostlinného oleje (olej byl skladován v plastové nádobě) s vysokým obsahem ftalátů do krmiva BR2 a 5 % do krmiva BR3, kuřata skupiny Z byla krmena běžnými KKS s přídavkem 3 % živočišného (ŽV) tuku s vysokým obsahem ftalátů do krmiva BR2 a 5 % do krmiva BR3. Výkrm probíhal do 42 dne. Jatečná těla kuřat byla dovezena na Ústav technologie potravin MZLU v Brně, kde byla rozbourána a dále analyzována. U pokusných kuřat bylo stanovení DEHP a DBP provedeno individuálně u každého kuřete. Vzorky se po dodání do laboratoře homogenizovaly, zamrazily a postupně lyofilizovaly. Pak následovala extrakce PAE ze vzorku organickým rozpouštědlem a to 3 x 80 ml hexanu na třepačce 60, 30 a 30 minut. Poté se prováděla separace PAE od koextraktů metodou GPC a dočištění koncentrovanou kyselinou sírovou. Vlastní stanovení vzorků se provádělo vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií s UV detekcí. DBP i DEHP byly nalezeny ve všech matricích u všech skupin. Obsah DBP v tuku se pohyboval v rozmezí od < 0,20 - 2,56 mg . kg -1, v kůži od 0,11 - 1,49 mg . kg

-1

a játrech od 0,03 – 0,13 mg . kg -1. Obsah DEHP se v tuku pohyboval od

0,25 – 9,85 mg . kg -1, v kůži od 0,14 – 4,68 mg . kg

-1

a v játrech od 0,16 – 0,24

mg . kg -1. Nejvyšší koncentrace DBP 1,28 ± 1,00 mg . kg-1 původního vzorku (průměr z 8 kuřat) byla stanovena v mezenteriálním tuku kuřat, která byla krmena běžnými KKS s přídavkem 3 % rostlinného oleje (olej byl skladován v plastové nádobě) s vysokým obsahem ftalátů do krmiva BR2 a 5

% do BR3. Nejvyšší koncentrace DEHP

52

3,27 ± 2,87 mg . kg-1 původního vzorku (průměr z 8 kuřat) byla

stanovena

v mezenteriálním tuku kuřat, která byla krmena běžnými KKS s přídavkem 3 % rostlinného oleje (olej byl skladován v plastové nádobě) s vysokým obsahem ftalátů do krmiva BR2 a 5 % do BR3. DEHP se kumuloval v mezenteriálním tuku 2,6 krát více než DBP a v kůži se DEHP kumuloval 2,9 krát více než DBP. Měřením byla potvrzena kumulace esterů kyseliny ftalové v živočišných tkáních a byl také potvrzen lipofilní charakter DBP a DEHP. Jako prvním možným zdrojem kontaminace živočišných tkání ftaláty lze považovat krmiva a obalové materiály krmiv a je proto vhodné tyto suroviny a materiály na obsah PAE sledovat. Výsledky byly již prezentovány v květnu 2008 na symposiu „XXXIX. symposium o nových směrech výroby a hodnocení potravin“ (příloha 1).

53

7 SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY AMIR, S., HAFIDI, M., MERLINA, G., HAMDI, H., JOURAIPHY, A., EL CHAROUS, M., REVEL, J.C. Fate of phthalic acid esters during composting of both lagooning and activated sludges. Process Biochemistry. MAY 2005, vol. 40, is. 6, p. 2183 – 2190.

BALAFAS, D., SHAW, K.J., WHITFIELD, F.B., Phthalate and adipate esters in Australian packaging materials. Food Chemistry. MAY 1999, vol. 65, is. 3, p. 279 – 287.

COPESTAGE, P., LAUGHLAND, T., RUSSEL, T. Environmental oestrogens. Food Chem.Toxicol. 1996, vol. 34, is. 2, p. 229 – 239.

DE ORSI, D., GAGLIARDI, L., PORRÁ, R., BERRI, S., CHIMENTI, P., GRANESE, A., CARPANI, I., TONELLI, D. A environmentally friendly reversed – phase liquid chromatography method for phthalates determination in nail cosmetics. Analytica Chimica Acta. JAN 2006, vol. 555, is. 2, p. 238 – 241.

DI BELLA, G., SAITTA, M., PELLEGRINO, M., SALVO, F., DUGO, G. Contamination of italian citrus essential oils - Presence of phthalate esters. Journal of Agricultural and Food Chemistry. MAR 1999, vol. 47, is. 3, p. 1009 – 1012.

FAOUZI, M.A., DINE, T., GRESSIER, B., KAMBIA, K., LUYCKX, M., PAGNIEZ, D., BRUNET, C., CAZIN, M., BELABED, A., CAZIN, J.C. Exposure of hemodialysis patiens to di-2-ethylhexyl phthalate. International Journal of Pharmaceutics. MAR 1999, vol. 180, is. 1, p. 113 – 121.

GAJDŮŠKOVÁ, V., JAROŠOVÁ, A., ULRICH, R. Occurrence of phthalic acid esters in food packaging materials. Potrav. Vědy. 1996, č. 14, s. 99 – 108. GÓMEZ-HENS, A., AGUILAR-CABALLOS, M.P. Social and economic interest in the control of phthalic acid esters. TrAC – Trends in Analytical Chemistry. December 2003, vol. 22, is. 11, p. 847-857.

54

CHANG, B.V., WANG, T.H., YUAN, S.Y. Biodegradation of four phthalate esters in sludge. Chemosphere. OCT 2007, vol. 69, is. 7, p. 1116 – 1123. CHANG, B.V., YANG, C.M., CHENG, C.H., YUAN, S.Y. Biodegradation of phthalate esters by two bacteria strains. Chemosphere. APR 2004, vol. 55, is. 4, p. 533 – 538.

JANČÁŘOVÁ, I., JANČÁŘ, L. Analytická chemie. 1. vyd. BRNO: Mendlova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, 2003. 195 s. ISBN 80 – 7157 – 647 – 6.

JAROŠOVÁ, A. Ftaláty v potravním řetězci a jejich toxicita. Výživa a potraviny. 2000, sv. 55, č. 2, s. 34 – 35. ISSN 1211-846X

JAROŠOVÁ, A., GAJDŮŠKOVÁ, V., RASZYK, J., ŠEVELA, K. Di-2-ethylhexyl phthalate and di-n-butyl phthalate in the tissues of pigs and broiler chicks after their oral administration. Vet. med.- Czech., 1999, vol. 44, no. 3, p. 61 – 70.

JAROŠOVÁ, A., GAJDŮŠKOVÁ, V., RASZYK, J., ŠEVELA, K. Determination of phthalic acid esters (PAEs) in biological materials by HPLC. Czech J. Food Sci., 1998, vol 16, no. 4, p. 122 – 130.

JIANLONG, W., LUJUN, CH., HANCHANG, S., YI, Q. Microbial degradation of phthalic acid esters under anaerobic digestion of sludge. Chemosphere. OCT 2000, vol. 41, is. 8, p. 1245 – 1248.

KAPANEN, A., STEPHEN, J.R., BRÜGGEMANN J., KIVIRANTA, A., WHITE, D.C., ITÄVAARA, M. Diethyl phthalate in compost - Ecotoxicological effects and response of the microbial community. Chemosphere. May 2007, vol. 67, is. 11, p. 2201 – 2209.

KHALIQ, M.A., ALAM, M. S., SRIVASTAVA, S.P. Implications of physico-chemical factors on the migration of phthalate esters from tubing commonly used for oral/nasal feeding. Bull. Environ. Contam. Toxicol. 1992, vol. 48, p. 572 – 578.

55

KLOUDA, P. Moderní analytické metody. 2 vyd. upr. a dop. OSTRAVA: Pavel Klouda, 2003. 132 s. ISBN 80 – 86369 – 07 – 2.

KOCH, H.M., DREXLER, H., ANGERER, J. An estimation of the daily intake of di (2ethylhexyl) phtalate (DEHP) and other phalathes in the general population. International Journal of Hygiene and Enviromental Health. 2003, vol. 206, is. 2, p. 77 – 83. LABOW, R. S., BARRY, Y. A., TOCCHI, M., KEON, W. J. The effect of mono(2ethylhexyl)phthalate on an isolated perfused rad heart-lung preparation. Environ. Health Perspec. 1990, vol. 89, p. 189 – 193.

LATINI, G. Monitoring phthalate exposure in humans. Clinica Chimica Acta. NOV 2005, vol. 361, is. 1-2, p. 20 – 29.

LI, MX., WANG, HY. Determination of phthalate esters in environmental samples by fluorimetry. Chinese Journal of

Analytical Chemistry. SEP 2005, vol. 33, no. 9,

p. 1315 – 1317.

PETERSEN, JH. Survey of di –(2-ethylhexyl) phthalate plasticizer contamination of retail danish milks. Food aditives and contaminants. 1991, vol. 8, is. 6, p. 701 – 705.

PFORDT, J. Levels of di (2-ethylhexyl) phthalate (DEHP) and dibutyl phthalates in some

foodstuffs

with

plastic

packagings

and

in

mother’s

milk.

Deutche

Lebensmittel – Rundschau. November 2004, vol. 11, p. 431 – 436.

RAO, M.S., YELDANDI, A.V. Quantitative analysis of hepatocellular lesions induced by di(2-ethylhexyl)phthalate in F-344 rats. J. Toxicol. Environ. Health. 1990, vol. 30, p. 85 – 89. RAZSYK, J., GAJDŮŠKOVÁ, V., JAROŠOVÁ, A., SALAVA, J., PALAC, J. Occurence of phthalic acid esters (PAEs) in combined feedstuffs and adipose tissue of swine and cattle. Vet. med. MAR 1998, vol. 43, no.3, p. 93 – 95.

56

RŮŽIČKOVÁ, K., COBBING, M., ROSSI, M., BELAZZI, T. Ohrožení pacientů ftaláty lze zabránit náhradou PVC výrobků v nemocnicích. Health Care Whithout Harm [on line]. 2004 [cit. 2008-03-10]. DOSTUPNÝ Z WWW: http://www.noharm.org/details.cfm?type=document&ID=975. STRATIL, P., KUBÁŇ, V. Exogenní karcinogeny v potravinách a karcinogeny vznikající při jejich technologickém zpracování. Chemické listy. 2005, roč. 99, s. 3 – 12.

SHANKER, R., RAMAKRISHMA, C., SETH, P.K. Degradation of some phthalic acid esters in soil. Environmental Pollution Series A, Ecological and Biological. 1985, vol. 39, is. 1, p. 1 – 7.

ŠEVELA, K., GAJDŮŠKOVÁ, V. Estery kyseliny ftalové a lidský organismus. Čas. Lék. čes. 1996, roč. 135, č. 21, s. 679 – 682.

ŠEVELA,

K.,

GAJDŮŠKOVÁ,

V.,

HAVLÁT,

F.,

HAVRÁNKOVÁ,

V.,

JAROŠOVÁ, A. Estery kyseliny ftalové v peritoneální dutině nemocných léčených kontinuální ambulantní peritoneální dialýzou. Vnitř. Lék. 1996, roč. 42, č. 6, s. 404 – 407.

ŠUSTA, M. Ftaláty pomocník nebo škůdce ?. EKO – Ekologie a společnost. 2005, roč. 16, č. 6, s. 6 – 8.

TANAKA, A., MATSUMOTO, A., YAMAHA, T. Biochemical studies on phthalic esters. III. - Metabolism of dibutyl phthalate (DBP) in animals. Toxikology. FEB 1978, vol. 9, is. 1 – 2, p. 109 – 123.

TEIL, M.J., BLANCHARD, M., CHEVREUIL, M. Atmospheric fate of phthalate esters in an urban area (Paris- France). Science of the Total Environment. FEB 2006, vol. 354, is. 2 – 3, p. 212 – 223.

TOMITA, I., NAKAMURA, Y., YAGI, Y. Phthalic acid esters in various foodstuffs and biological materials. Ecotoxicology and Environmental Safety. SEP 1977, vol. 1, is. 2, p. 275 – 287.

57

VELÍŠEK, J. Chemie potravin 3. Václav Šedivý. 2 upr. vyd. Tábor: OSSIS, 2002. 368 s. ISBN 80 – 86659 – 03 – 8.

WAMS, T.J. Diethylhexylphthalate as an environmental contaminant – a review. Sci. Total. Envir. 1987, vol. 66, p. 1 – 16.

WITTASSEK, M., HEGER, W., KOCH, H.M., BECKER, K., ANGERER, J., KOLOSSA- GEHRING, M. Daily intake of di(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP) by German children – A comparsion of two estimation models based on urinary DEHP metabolite levels. International Journal of Hygiene and Environmental Health. FEB 2007, vol. 210, is. 1, p. 35 – 42.

WITTASSEK, M., WIESMÜLLER, G.A., KOCH, H.M., ECKARD, R., DOBLER, L., MÜLLER, J., ANGERER, J., SCHLÜTER, CH. Internal phthalate exposure over the last two decades – A retrospective human biomonitoring study. International Journal of Hygiene and Environmental Health. MAY 2007, vol. 210, is. 3 – 4, p. 319 – 333.

XIE, Z., EBINGAUS, R., TEMME, CH., CABA, A., RUCK, W. Atmospheric concentrations and air-sea exchange of phthalates in the North Sea (German bight). Atmospheric Environment. JUN 2005, vol. 39, is. 18, p. 3209 – 3219.

58

8 SEZNAM TABULEK A OBRÁZKŮ Seznam tabulek Tab. 1 Koncentrace DBP a DEHP ( mg . kg -1) v krmivech (BR1, BR2, BR3), která přijímala kuřata kontrolní skupiny (K), kuřata skupiny s nízkým obsahem ftalátů (N), kuřata skupiny s vysokým obsahem ftalátů (V) a kuřata skupiny s přídavkem živočišného tuku (Ž)

s. 35

Tab. 2 Koncentrace DBP a DEHP ( mg . kg

-1

původního vzorku) v kůži a tuku kuřat

kontrolní skupiny

s. 40 -1

Tab. 3 Koncentrace DBP a DEHP (mg . kg

původního vzorku) v kůži a tuku ve

skupině kuřat krmených krmivem s nízkým obsahem ftalátů

Tab. 4 Koncentrace DBP a DEHP (mg . kg

-1

původního vzorku) ve skupině kuřat

krmených krmivem s vysokým obsahem ftalátů

Tab. 5 Koncentrace DBP a DEHP (mg . kg

s. 44 -1

původního vzorku) v kůži a tuku ve

skupině kuřat krmených krmivem s přídavkem živočišného tuku

Tab. 6 Koncentrace DBP a DEHP (mg . kg

s. 42

-1

s. 46

původního vzorku) v játrech kuřat

kontrolní skupiny (K), skupiny kuřat krmených krmivem s nízkým obsahem ftalátů (N), skupiny kuřat krmených krmivem s vysokým obsahem ftalátů (V), skupiny kuřat krmených krmivem s přídavkem živočišného tuku (Ž)

s. 48

Seznam obrázků

Obr. 1 Diester kyseliny ftalové

s. 13

Obr. 2 Hydrolýza ftalátů

s. 14

Obr. 3 Koncentrace DBP (mg . kg-1 původního vzorku) v kůži a tuku kuřat kontrolní skupiny

s. 40

59

Obr. 4 Koncentrace DEHP (mg . kg-1 původního vzorku) v kůži a tuku kuřat kontrolní skupiny

Obr. 5 Koncentrace DBP (mg . kg

s. 41

-1

původního vzorku) v kůži a tuku ve skupině kuřat

krmených krmivem s nízkým obsahem ftalátů

Obr. 6 Koncentrace DEHP (mg . kg

-1

původního vzorku) v kůži a tuku ve skupině

kuřat krmených krmivem s nízkým obsahem ftalátů

Obr. 7 Koncentrace DBP (mg . kg

-1

s. 42

s. 43

původního vzorku) v kůži a tuku ve skupině kuřat

krmených krmivem s vysokým obsahem ftalátů

s. 44

Obr. 8 Koncentrace DEHP (mg . kg -1 původního vzorku) v kůži a tuku ve skupině kuřat krmených krmivem s vysokým obsahem ftalátů

Obr. 9 Koncentrace DBP (mg . kg

-1

s. 45

původního vzorku) v kůži a tuku ve skupině kuřat

krmených krmivem s přídavkem živočišného tuku

Obr. 10 Koncentrace DEHP (mg . kg

-1

s. 46

původního vzorku) v kůži a tuku ve skupině

kuřat krmených krmivem s přídavkem živočišného tuku

s. 47

Obr. 11 Koncentrace DBP a DEHP v játrech kuřat skupiny (K, N, V, Ž)

s. 48

Obr.12 Koncentrace DBP a DEHP (mg . kg-1 původního vzorku) ve vzorcích kontrolní s. 49

skupiny kuřat

Obr. 13 Koncentrace DBP a DEHP (mg . kg-1 původního vzorku) ve vzorcích skupiny kuřat krmených krmivem s nízkým obsahem ftalátů

s. 49

Obr. 14 Koncentrace DBP a DEHP (mg . kg-1 původního vzorku) ve vzorcích skupiny kuřat krmených krmivem s vysokým obsahem ftalátů

60

s. 50

Obr. 15 Koncentrace DBP a DEHP (mg . kg-1 původního vzorku) ve vzorcích skupiny kuřat krmených krmivem s přídavkem živočišného tuku

61

s. 50

9 SEZNAM ZKRATEK PAE ester kyseliny ftalové C6H6(COOH)2 kyselina ftalová PVC polyvinylchlorid DMP dimethylftalát DEP diethylftalát DBP dibutylftalát BBP butylbenzylftalát DEHP di(2-ethylhexyl)ftalát MEHP mono-ethylhexylftalát DINP diisononylftalát DIDP diisodecylftalát DOP dioctylftalát DnBP di-n-butylftalát DnOP di-n-octylftalát DPrP dipropylftalát DPP difenylftalát DCP dicyclohexylftalát DHP dihexylftalát DMHP dimethylhexylftalát MMHP mono-methylhexylftalát MBP monobutylftalát DiBP diisobutylftalát BBzP butylbenzylftalát DNBP di-n-butylftalát 5OH-MEHP mono(2-ethyl-5-hydroxyhexyl)ftalát 5oxo-MEHP mono(2-ethyl-5-oxo-hexyl)ftalát KEMI Švédský inspektorát pro chemické látky KOC půdní adsorpční koeficient US EPA United States Environmental Protection Agency LD50 akutní toxicita PPA-80 polypeptid

62

TDI tolerovatelná denní dávka RfD referenční dávka CSTEE Scientific Committee for Toxicity, Ecotoxicity and the Environment EFSA European Food Safety Autority MZ Ministerstvo zemědělství US FDA Úřad pro potraviny a léky Spojených států TEHTM tri-2-ethylhexyltrimeliát DEHA di-2-ethylhexyladipát GC plynová chromatografie HPLC vysokoúčinná kapalinová chromatografie MS hmotnostní spektrometr GPC gelová permeační chromatografie UV ultrafialová oblast RVO rotační vakuová odparka KKS kompletní krmné směsi

63

10 Přílohy Seznam příloh Příloha 1 STANCOVÁ, V., JAROŠOVÁ, A., HARAZIM, J., KRÁTKÁ, L., KOLENČÍKOVÁ, D., SUCHÝ, P. Estery kyseliny ftalové (DBP, DEHP) v tkáních drůbeže. In.: XXXIX. symposium o nových směrech výroby a hodnocení potravin. Skalský Dvůr, 2008.

64