Zm ny erytrocyt. po lokální kryoterapii

Masarykova univerzita v BrnČ PĜírodovČdecká fakulta

BakaláĜská práce

ZmČny erytrocytĤ po lokální kryoterapii Vypracovala: Martina RĤžiþková Vedoucí práce: MUDr. Lenka Forýtková, CSc.

Brno, kvČten 2008

Prohlašuji, že jsem bakaláĜskou práci vypracovala samostatnČ a použila pouze uvedenou literaturu. Martina RĤžiþková, v. r.

Ráda bych tímto podČkovala MUDr. Lence Forýtkové, CSc. a Prof. RNDr. VojtČchu Mornsteinovi, CSc. za jejich vČdecké pĜipomínky i odborné rady k dané problematice. Dále bych chtČla vyjádĜit podČkování panu Miroslavu Horákovi za technickou asistenci pĜi sestavování aparatury a neustálou pomoc pĜi jakýchkoliv potížích. Paní SvatavČ Modrové dČkuji za odbornou asistenci v þásti mČĜení s hlubokomrazícím boxem. FirmČ DN FORMED Brno, s. r. o. dČkuji za bezplatné zapĤjþení pĜístroje Cryo-T i za cenné pĜipomínky k této práci.

ZmČny erytrocytĤ po lokální kryoterapii

4

Abstrakt PĤsobení chladu na lidský organismus se prokázalo jako velmi úþinná podpĤrná metoda pĜi léþbČ revmatických a chronických zánČtlivých onemocnČní pohybového aparátu. Toto tvrzení je podloženo mnoha lékaĜskými studiemi vČdcĤ z Japonska, Polska, NČmecka i Francie. Japonec Toshiro Yamauchi se zasloužil o zavedení celotČlové chladové terapie do lékaĜské praxe, podílel se i na zkonstruování první kryokomory. Lokální kryoterapie je založena na místním chlazení postiženého místa na lidském tČle. Lokální terapie je vhodná pro pacienty, kteĜí trpí alergií na chlad nebo z jiných dĤvodĤ nemohou podstoupit terapii celotČlovou. Tato práce se zabývá zmČnami erytrocytĤ po použití pĜístroje pro lokální kryoterapii Cryo-T in vitro. Pro chlazení využívá Cryo-T plyn oxid uhliþitý, který má dva fyzikální úþinky – funguje jako chladicí prvek a v další fázi jako biochemické þinidlo.

Abstract When treating rheumatic and chronic inflammatory diseases of the motional apparatus, the action of cold on human organism proved as a very effective supportive method. This argument is verified by many medical studies carried out by scientists from Japan, Poland, Germany and France. The Japanese Toshiro Yamauchi had merit in implementation a whole-body cold therapy into the practice of medicine and he participated in constructing the first cryo-chamber as well. Local cryo-therapy is based on local human body lesion cooling. Local therapy is advisable for patients who suffer cold allergy or cannot undertake a whole-body therapy for other reasons. This paper focuses on changes in erythrocytes after local cryo-therapy performed by a Cryo-T in vitro appliance. The Cryo-T appliance uses carbon dioxide which has two physical results – it acts as a cooling element and a biochemical agent in the next stage.

5

Klíþová slova Kryoterapie Vasokonstrikce, vasodilatace Erytrocyty Hemolýza SvČtelný mikroskop

Key words Cryo-therapy Vasoconstriction, vasodilatation Erythrocytes Haemolysis Light microscope

Martina RĤžiþková


6

Obsah

ABSTRAKT .................................................................................................................... 4 ABSTRACT..................................................................................................................... 4 KLÍýOVÁ SLOVA......................................................................................................... 5 KEY WORDS.................................................................................................................. 5 OBSAH ............................................................................................................................ 6 1

2

ÚVOD........................................................................................................................ 8 1.1

HISTORIE ............................................................................................................. 8

1.2

ADAPTACE NA CHLAD .......................................................................................... 9

TEORETICKÁ ýÁST........................................................................................... 11 2.1

KRYOTERAPIE .................................................................................................... 11

2.1.1 Kryoterapie celotČlová............................................................................... 11 2.1.2 Kryoterapie lokální .................................................................................... 14 2.2

KRYOTERAPEUTICKÝ PěÍSTROJ .......................................................................... 16

2.2.1 Cryo-T ....................................................................................................... 16 2.2.1.1

Ovládací panel ............................................................................... 19

2.2.1.2

Chladicí médium............................................................................ 20

2.2.1.3

Trysky ............................................................................................ 20

2.2.2 Úþinek oxidu uhliþitého ............................................................................ 21 2.3

SVċTELNÝ MIKROSKOP ...................................................................................... 23

2.4

TEPLOMċRY ....................................................................................................... 26

3

CÍL PRÁCE ........................................................................................................... 27

4

EXPERIMENTÁLNÍ ýÁST................................................................................. 28 4.1

METODIKA ......................................................................................................... 28

4.2

POUŽÍVANÁ ZAěÍZENÍ ........................................................................................ 30

4.3

SUSPENZE ERYTROCYTģ .................................................................................... 30

4.4

HEMOLÝZA ERYTROCYTģ .................................................................................. 30


7

4.5 5

ZPRACOVÁNÍ VÝSLEDKģ .................................................................................... 31

VÝSLEDKY ........................................................................................................... 33 5.1

KONTROLNÍ MċěENÍ .......................................................................................... 33

5.2

CHLAZENÍ SUSPENZE ERYTROCYTģ,

TEPLOTA MċěENÁ POMOCÍ LIHOVÉHO

TEPLOMċRU ................................................................................................................. 33

5.3

CHLAZENÍ

SUSPENZE

ERYTROCYTģ,

TEPLOTA

MċěENÁ

POMOCÍ

DIGITÁLNÍHO TEPLOMċRU ........................................................................................... 33

5.3.1 Rychlé rozmrazení chlazené suspenze erytrocytĤ ..................................... 34 5.3.2 Rozmrazení chlazené suspenze erytrocytĤ pĜi pokojové teplotČ............... 34 5.4

CHLAZENÍ SUSPENZE ERYTROCYTģ POMOCÍ MRAZICÍHO BOXU .......................... 36

5.5

CHLAZENÍ SUSPENZE ERYTROCYTģ POMOCÍ KAPALNÉHO DUSÍKU...................... 36

5.6

CHLAZENÍ SUSPENZE ERYTROCYTģ PěI STEJNÉ TEPLOTċ CHLADICÍ SMċSI ......... 39

5.7

CHLAZENÍ SUSPENZE ERYTROCYTģ V RģZNÝCH KONCENTRACÍCH .................... 40

6

DISKUZE ............................................................................................................... 41

7

ZÁVċR ................................................................................................................... 43

8

SEZNAM LITERATURY..................................................................................... 44 8.1

KNIHY ................................................................................................................ 44

8.2

ELEKTRONICKÉ ZDROJE ..................................................................................... 44


8

1 Úvod

1.1 Historie Skuteþnost, že chlad pĤsobí na lidský organismus blahodárnČ, pozorovali lidé již velmi dávno. Léþbu prostĜednictvím nízkých teplot používali už staĜí EgypĢané asi 2500 pĜed naším letopoþtem, v 5. století pĜed n. l. Hippokrates poukázal na výrazné analgetické pĤsobení chladu na organismus. V širším rozmČru se tato metoda rozvinula v prĤbČhu napoleonských válek, kdy se velký poþet tČžkých zranČní Ĝešil amputacemi a na znecitlivČní poškozených konþetin se dávaly obklady z ledu anebo snČhu. V odborné terminologii se zaþal používat název „narkóza chladem“ – hypotermie. Poþátky souþasné kryogeniky (konec 19. století) úzce souvisejí s technickým pokrokem, který umožnil zkapalĖování a dlouhodobé uchovávání plynĤ, ale také prĤmyslovou produkci vzniklých chladicích tekutin. Od roku 1907 se v medicínČ objevuje pojem kryochirurgie, která se zabývá destrukcí tkání pomocí nízkých teplot. BČhem první poloviny 20. století se rozvinula kryobiologie, vČda o bunČþných zmČnách podmínČných extrémnČ nízkými teplotami. V návaznosti na ni se zrodila kryoterapie, tedy impulsní stimulující povrchové aplikace nízkých teplot v krátkém þasovém úseku (dvČ až tĜi minuty). Zavedení kryoterapie do lékaĜské praxe se pĜipisuje Japonci Toshiro Yamauchimu z revmatologického institutu v Oite, který se podílel i na zkonstruování první kryogenické komory na svČtČ (1978). Od prvního užití celotČlové chladové kryoterapie (CChT) Yamauchim, který s její pomocí léþil revmatoidní artritidu, ubČhlo již více než 25 let. V tomto období se tato terapeutická metoda rozšíĜila hlavnČ v EvropČ, o zdokonalení této technologie se zasloužili pĜedevším polští a nČmeþtí odborníci. Indikaþní spektrum chladové terapie je velmi rozsáhlé. Kryoterapie se úspČšnČ používá jak v oblasti akutní (klinické, rehabilitaþní, ambulantní) a lázeĖské, tak i ve sportu. Na základČ znalostí fyziologického úþinku krátkodobého chladu na lidský organismus se v posledních deseti letech podaĜilo vČdecky zdĤvodnit a vysvČtlit úþinky této metody. V dnešní dobČ se využívá chladová terapie celotČlová þi lokální.


9

1.2 Adaptace na chlad ýlovČk si udržuje v prĤbČhu dne i noci témČĜ konstantní tČlesnou teplotu. Tato teplota kolísá pouze v rozmezí 1 °C. ZmČnu tČlesné teploty mĤžeme pozorovat pĜi dlouhodobé fyzické zátČži, pĜi nemoci nebo pĜi extrémních vnČjších podmínkách. TČlesná teplota je regulována principem zpČtné vazby. Termoregulaþní centrum najdeme v zadní þásti hypothalamu. Sem pĜicházejí informace jak z periferních receptorĤ, které jsou uloženy v kĤži, tak i z centrálních receptorĤ, které se nacházejí v pĜením hypothalamu, v míše a podél velkých cév. ýím vČtší je teplotní gradient mezi kĤží a chladným prostĜedím, tím vČtší jsou tepelné ztráty. Ochrana pĜed tepelnými ztrátami v zásadČ probíhá dvČma zpĤsoby: zvČtšením izolaþních schopností povrchu tČla a zvýšenou produkcí tepla – termogenezí.1 Mezi dČje, pĜi nichž dochází k zvČtšení izolaþních schopností povrchu tČla, Ĝadíme vasokonstrikci (stažení cév) a zvČtšení vrstvy podkožního tuku. V extrémním chladu bývá þasto vasokonstrikce vystĜídána vasodilatací (rozšíĜením cév). Díky vasodilataci dojde ke zvýšení prokrvení a konþetiny tak mají vČtší rezistenci vĤþi omrzlinám. Termogeneze je umožnČna svalovou þinností þi tĜesem nebo tzv. netĜesovou termogenezí. Zvýšeného prokrvení povrchových oblastí tČla lze dosáhnout hlavnČ svalovou prací. NejúþinnČjší metoda produkce tepla je však netĜesová termogeneze. NetĜesová termogeneze probíhá v hnČdé tukové tkáni, která se vyskytuje u novorozencĤ a u zvíĜat adaptovaných na chlad. U dospČlého þlovČka se mĤže netĜesová termogeneze vyvíjet v bílém tuku nebo v kosterní svalovinČ.2 Hlavní reakþní typy chladové aklimace mĤžeme rozdČlit do tĜí skupin:

Metabolická – dochází ke zvýšené tvorbČ tepla.

Izolaþní – tvorba tepla zĤstává stejná a dochází ke zvyšování izolace (vasokonstrikce, tuková vrstva).

1

PĜevzato z Zeman, V.: Adaptace na chlad u þlovČka, možnosti a hranice. Galén, Praha 2006,

2


str. 23. str. 26.


10

Hypotermická – tvorba tepla ani vasokonstrikce se nezvyšují, dochází k poklesu tČlesné teploty, organismus se adaptuje na nižší tČlesnou teplotu.3

3

str. 26.



11

2 Teoretická þást

2.1 Kryoterapie 2.1.1 Kryoterapie celotČlová CelotČlová kryoterapie nebo celotČlová chladová terapie (CChT) je krátkodobá terapie se systémovým úþinkem, pĜi níž se zpravidla používá teplota v rozmezí od -100 °C do -150 °C. Princip úþinku terapie se odvíjí na základČ „podnČtu-reakce-adaptace“. CChT probíhá v kryokomoĜe a celková doba trvání je nejvýše 3 minuty. PĜed touto terapií je vždy nutno projít lékaĜským vyšetĜením, pĜi nČmž se zjišĢují základní životní funkce, kam patĜí: poslech srdce a plic, prohmat dutiny bĜišní, mČĜení tlaku a pulzu. LékaĜe rovnČž zajímá anamnéza prodČlaných nemocí a operaþní zákroky. V prĤbČhu kryoterapie se teplota krve a vnitĜních orgánĤ nemČní. Teplota povrchu tČla se mČní znaþnČ. Povrchová teplota tČla v oblasti hrudní kosti se mČní o 0,5 °C až 3,2 °C a teplota dolních konþetin dokonce o 9,5 °C až 11,5 °C. PĜi mČĜení teploty pod jazykem v dobČ terapie v kryokomoĜe pĜi -110 °C, která trvala 90 vteĜin, se u skupiny 229 dobrovolníkĤ zjistilo, že u 78 % byl pokles teploty pod jazykem menší než 0,5 °C, u 13 % nebyl zjištČn rozdíl teplot žádný a dokonce u 9 % došlo k nárĤstu teploty o 0,5 °C.4 Úþinek CChT spoþívá v náhlém ochlazení kĤže. Tím se utlumí kožní nervová zakonþení, a tudíž i vnímání bolesti. Organismus vnímá nízkou teplotu jako stresovou situaci. Dochází vyplavování látek, které mají tento stres a jeho pĤsobení na naše tČlo snížit nebo dokonce úplnČ zastavit. Vyplavují se edorfiny, oznaþované jako hormony štČstí, jež se významnČ podílejí na snížení bolesti. Dále se v krvi pĜi kryoterapii nacházejí ve vČtší míĜe kortikoidy, adrenalin a noradrenalin, které vykazují pozitivní efekt pĜi hojení ran a pĜi léþbČ poúrazových stavĤ. V neposlední ĜadČ se zvyšuje i hladina mužského hormonu testosteronu.

4

PĜevzato z MUDr. Ernest Caban: Kryoterapia.


12

CChT zahrnuje okamžitou vasokonstrikci s reflexní vasodilatací, prokrvení vaziva, kĤže, podkoží a šlachosvalového aparátu dosahuje nČkolikanásobkĤ oproti normálnímu stavu. PĜi pravidelných návštČvách kryokomory mĤžeme oþekávat uvolnČní kosterní svaloviny, zlepšení funkce kloubĤ, zlepšené prokrvení celého tČla, mizení otokĤ a zánČtĤ v oblasti konþetin a snížení bolestivosti. Komplexní úþinky na lidský organismus jsou doprovázeny významným posílením obranyschopnosti vĤþi akutním i chronickým nemocem. Tyto úþinky je nezbytné využít pĜi intenzivním procviþení a rozpohybování jak celého tČla, tak jeho bolestivých, nemocných, operovaných þi jinak postižených þástí. Kombinace extrémního chladu a následného cviþení je cesta k trvalejšímu zlepšení obtíží. U zdravého jedince by fyzická zátČž po terapii mČla trvat alespoĖ 15 min. PĜi intenzivním cviþení dochází k výraznČjší látkové výmČnČ, pĜi níž jsou vyluþovány látky zpĤsobující poškození a stárnutí bunČk. K tČmto látkám Ĝadíme jedy, kyselinu mléþnou a volné radikály. CChT je vhodná pro všechny, kdo se chtČjí adaptovat na zvýšenou tČlesnou zátČž a zvýšit si tČlesnou kondici, jako je tomu napĜ. u sportovcĤ. Dále je tato terapie vhodná pro osoby s „civilizaþními chorobami“:

bolestivé páteĜní syndromy

chronický únavový syndrom

oslabení imunitního systému (snížená odolnost vĤþi infekþním chorobám)

psychická deprese

pomeranþová kĤže (celulitida)

nadváha5

Terapie se doporuþuje i osobám s následujícími chorobami nebo chorobnými stavy:

5

akutní a chronická zánČtlivá onemocnČní kloubĤ a páteĜe

degenerativní kloubní onemocnČní, dna

zánČtlivá revmatická onemocnČní mČkkých tkání a kĤže

bolestivé kontraktury (stahy) kosterní svaloviny

fibromyalgie

PĜevzato z webových stránek www.kryocentrum.cz


13

rehabilitace po operacích velkých kloubĤ a páteĜe

poúrazové a pooperaþní hematomy a otoky

autoimunitní onemocnČní a poruchy imunity

roztroušená skleróza

lupénka (psoriasa) s kloubními i kožními pĜíznaky

neurodermitida

ekzémy

migréna

chronická onemocnČní dýchacího systému

astma

zvonČní, pískání v uších (tinnitus)

stavy po kosmetických a plastických operacích (odsátí podkožního tuku, zlepšení hojení jizvy)

senná rýma6

Využití CChT není vhodné pro osoby s:

alkoholovým nebo drogovým opojením

klaustrofobií – strachu z malých prostor

známou tČžkou alergií na chlad

extrémní nebo neléþenou hypertenzí – s krevním tlakem stabilnČ pĜes 160/110

akutním onemocnČním srdce a obČhu (srdeþní infarkt, nestabilní angína pectoris, plicní embolie, myokarditis atd.)

prodČlanými v posledních šesti mČsících závažnými chronickými i akutními chorobami (vždy je nutno otázat se svého lékaĜe)7

Kryoterapie se podílí na lepším snášení fyzické námahy, omezuje nárĤst únavy pĜi svalové práci. Lepší prokrvení zpomaluje stárnutí bunČk, urychluje odplavení toxických látek z tČla a zlepšuje pĜísun vitamínĤ, minerálĤ a dalších stavebních látek.

6

PĜevzato z webových stránek www.kryocentrum.cz.

7

PĜevzato z webových stránek www.kryocentrum.cz.


14

Léþba chladem má široké pole pĤsobení u lidí všech vČkových kategorií (výjimku tvoĜí jen velmi malé dČti a velmi staĜí), obou pohlaví, kde nezáleží na druhu nemoci.

2.1.2 Kryoterapie lokální Lokální používání chladu je v souþasné medicínČ velmi rozšíĜené, jeho použití nachází uplatnČní hlavnČ pĜi léþbČ a rehabilitaci poúrazových stavĤ a pĜi onemocnČních pohybového aparátu. Používaná teplota pĜi lokální terapii se rĤzní. Japonští a nČmeþtí odborníci pod pojmem kryoterapie rozumí teploty nižší než -100 °C, kdežto v anglosaských zemích se k terapii používají i vyšší teploty než -100 °C a název kryoterapie (cryotherapy) zĤstává. Optimální teplota chlazení není pĜesnČ známá. PĜi chlazení þástí tČla je však optimální, aby teplota tkání dosáhla 18 °C. PĜi nižší teplotČ (15 °C) se zvČtšuje propustnost pro tkáĖový mok, þímž mĤže dojít ke zvČtšení edému. PĜi chlazení jednotlivých þástí tČla dochází ke snížení teploty tkání, vasokonstrikci, ke zpomalení zánČtlivých procesĤ, zmenšení bolesti a snížení svalového napČtí.8 Je to efektivní metoda snížení bolesti, což umožĖuje pohodlnČjší rehabilitaci. Dochází rovnČž k ohraniþení krevní podlitiny a zmenšení edému. ýas chlazení se také rĤzní. PĜi chlazení ledovými sáþky mĤže doba chlazení dosahovat dvacet až tĜicet minut. U hluboko umístČných poškození lze dobu chlazení prodloužit až na 45 min. PĜi použití kryoterapeutických pĜístrojĤ, které dosahují teplot -60 °C a nižších, se doba chlazení pohybuje v rozmezí 2 – 3 minut. Lokální kryoterapie je urþena pro následující onemocnČní:

8

9

pĜi revmatických a degenerativních poruchách kloubĤ

po zranČní, pohmoždČní v prĤbČhu rekonvalescence

rehabilitace po operaci

natažené svaly, svalové kĜeþe

pĜi syndromech bolesti

u nadváhy a obezity (zvyšuje bunČþný metabolismus)

v kosmetice – léþba celulitidy (v kombinaci s kompresními masážemi)9

PĜevzato z MUDr. Ernest Caban: Kryoterapia. PĜevzato z webových stránek www.dnformed.com


15

PodrobnČjší aplikace lokální kryoterapie je uvedena v kapitole o pĜístroji Cryo-T, který byl používán k mČĜení. V prĤbČhu terapie je tĜeba dát pozor na to, aby nedošlo ke vzniku omrzlin nebo i poškození nervĤ pĜi aplikaci chladu. PĜi kryoterapii se pokožka zbarvuje na bílo. Tento jev vyžaduje neustálé sledování a kontrolování barvy pokožky pacienta. Lokální kryoterapie je vhodná metoda pĜi první pomoci v pĜípadČ poškození pohybového aparátu, aĢ už se jedná o svaly, šlachy þi mČkké tkáĖové struktury. UmožĖuje proces rehabilitace a pĜi poškození kloubĤ rychlejší návrat na normální rozsah kloubového pohybu.


16

2.2 Kryoterapeutický pĜístroj 2.2.1 Cryo-T PĜístroj Cryo-T je urþen pro kryoterapii, umožĖuje jednoduchou a bezpeþnou aplikaci chladicího média oxidu uhliþitého. Chladicí médium dosahuje teplot až -75 °C. Oxid uhliþitý má na lidský organismus dvojí úþinek:

chladicí médium zpĤsobuje vasokonstrikci

sekundární reakcí je vasodilatace

Kryoterapie pomocí pĜístroje Cryo-T je vhodná metoda pro léþbu následujících chorobných stavĤ: zlomeniny a pohmoždČniny: à

opoždČné synostózy

à

nová poranČní

à

pseudoarthrosis

popáleniny – zmírnČní teplotního šoku pooperaþní rehabilitace revmatické a degenerativní kloubová onemocnČní, osteopatie: à

degenerace

à

chronický – postupující revmatismus

à

ankylozující artritida v poþáteþní fázi

à

Bechterowa nemoc

à

Scheuermannova nemoc

à

kloubová spojení po chirurgických zákrocích na ploténkách

à

bolestivé syndromy

à

odvápnČní kostí – osteoporóza

à

aseptická nekróza stehenních kostí

à

SudeckĤv syndrom

onemocnČní kloubĤ: à

akutní a chronické zánČty

à

periartikulární zánČty ramena

à

degenerativní zmČny


17

à

mnohokloubní zánČty

à

zánČty kotníkĤ

à

revmatické kloubní zánČty

nadmČrné svalové kĜeþe, kĜeþovitost onemocnČní svalĤ, šlach, podvrtnutí, zánČtlivé stavy: à

mezižeberních nervĤ

à

sedacích nervĤ

à

bolesti v kĜíži

à

parézy

à

kĜeþovitost

bolesti v kĜíži migrény otékání, nadváha a otylost – urychlení bunČþného metabolismu kosmetická terapie – celulitida10 Možné kontraindikace u lokálních kryoterapeutických procedur jsou:

10

kryoglobulinemie

chladová aglutinace nebo hemolýza

chladová hemoglobinurie

chladová kopĜivka

pĜecitlivČlost na chlad

Raynaudova nemoc

trofické poruchy

poruchy vnímavosti

výrazná anémie

nádory

omrzliny

mikrocirkulaþní tkáĖové poruchy

vážná onemocnČní srdeþního a obČhového systému

PĜevzato z firemních materiálĤ firmy DN FORMED, s. r. o., Návod k obsluze na

Kryoterapeutický pĜístroj Cryo-T.


18

onemocnČní ledvin a moþového mČchýĜe

neurologické poruchy

parestézie

polyneuropatie11

Kryoterapeutický pĜístroj Cryo-T se skládá ze tĜí hlavních þástí: ovládacího panelu, ocelové láhve, v níž je stlaþený oxid uhliþitý, a vymČnitelných trysek umožĖující pĜesné chlazení pĜedem zvolených þástí tČla. PĜístroj používá napČtí 220 – 240 V.

11

PĜevzato z firemních materiálĤ firmy DN FORMED Brno, s. r. o., Návod k obsluze

na Kryoterapeutický pĜístroj Cryo-T.


19

Obr. 1 PĜístroj Cryo-T. Zdroj: Firemní materiály firmy DN FORMED, s. r. o., Návod k obsluze na Kryoterapeutický pĜístroj Cryo-T.

2.2.1.1

Ovládací panel

Na ovládacím panelu pĜístroje je umístČn þasovaþ. ýasovaþ mČĜí délku procedury, umožĖuje pĜednastavení doby procedury a poté nás upozorní akustickým signálem, také umožĖuje akustickou signalizaci každých 30 vteĜin. Další displej mČĜí celkovou dobu


20

používání a sþítá dobu procedur od posledního resetování. Vynulování je možné delším stiskem tlaþítka režimu þasovaþe.

2.2.1.2

Chladicí médium

Chladicí médium oxid uhliþitý je v kapalné formČ uložen v ocelových lahvích. PĜi použití nejvČtší trysky obsahuje desetilitrová láhev dostateþné množství pro 45 minut terapie. PĜi použití nejmenší trysky mĤžeme provádČt proceduru celé 2 hodiny. Desetilitrová láhev obsahuje asi 7,5 kg kapalného plynu. Provozní tlak oxidu uhliþitého se v lahvích pohybuje mezi 5 – 6 MPa, maximální tlak dosahuje hodnot 8 MPa. Oxid uhliþitý je netoxická látka, pĜi vyšších koncentracích v ovzduší mĤže zpĤsobit dušení. PĜi kryoterapii se do ovzduší dostává vČtší množství oxidu uhliþitého, proto je velmi dĤležitá dobrá ventilace v místnosti, kde se procedura provádí. TvorbČ vČtších koncentrací oxidu uhliþitého v ovzduší mĤžeme také zabránit pĜestávkami mezi terapiemi.

2.2.1.3

Trysky

PĜístroj Cryo-T obsahuje 3 trysky, které se liší velikostí a tvarem, þímž umožĖují pĜesné chlazení vybrané þásti tČla. a) Nejmenší tryska – kryopunkþní procedury, výbornČ se hodí na terapie pro malé klouby a ke zmírnČní bolesti v urþitých bodech na tČle. b) StĜední tryska – použití pro chlazení stĜednČ velkých oblastí. Tuto trysku lze použít na kloubní spojení, kolena þi kotníky. c) NejvČtší tryska – vhodná pro kryoterapie velkých þástí tČla, napĜ. hýždČ, boky, ramena. K nastavení požadované teploty pĜi proceduĜe slouží nastavovací kroužek na zadní þásti trysky. Pokud tímto kroužkem otoþíme ve smČru hodinových ruþiþek (pĜi pohledu od konce trysky), dojde v chladicím médiu ke zvýšení procenta vzduchu, a tím se zvýší i teplota proudu v trysce. PĜi opaþném pohybu dojde ke snížení teploty proudu chladícího média. LED kontrolka, která je umístČna na zadním konci trysky, zobrazuje teplotu chladicího média. Rozsvícení první kontrolky (zelená) signalizuje, že je pĜístroj


21

pĜipraven k provozu. Druhá LED kontrolka se rozsvítí pĜi dosažení teploty -50 °C, tĜetí pĜi dosažení teploty -63 °C a poslední kontrolka signalizuje teplotu -75 °C.

2.2.2 Úþinek oxidu uhliþitého Oxid uhliþitý mĤže do bunČk vstoupit na základČ prosté difúze. Plazmatická membrána, která se nachází na povrchu bunČk, je volnČ propustná pro malé molekuly. K tČmto molekulám patĜí napĜ. kyslík, oxid uhliþitý a další.

Obr. 2 PrĤchod látek pĜes plazmatickou membránu. Zdroj: http://www.zoologie.upol.cz/osoby/fellnerova/memtrans.pdf Zvýšený obsah oxidu uhliþitého v povrchové vrstvČ pokožky zpĤsobí rozšíĜení všech cév až po vláseþnice se souþasným zvýšením obsahu kyslíku v krvi. To má za následek dokonalé prokrvení pokožky, svalstva a všech tČlesných orgánĤ vþetnČ žláz a mozku, dobĜe okysliþenou krví. DĤsledkem je zlepšená þinnost všech tČlesných


22

orgánĤ a žláz, což vede k všeobecnému posílení organismu, k povzbuzení imunitního systému a sebehojivých schopností tČla.12 PĜi látkové výmČnČ, která probíhá v buĖkách živých organismĤ, je jedním z koneþných produktĤ i oxid uhliþitý. Proto je tato látka tČlu vlastní a pro nČ pĜirozená. Pokud zvýšíme obsah oxidu uhliþitého v pokožce tČla, organismus spouští Ĝadu fyziologických procesĤ, jejichž úkolem je dostat vČtší množství dobĜe okysliþené krve ke všem buĖkám. Hlavním úþinkem oxidu uhliþitého je:

vasodilatace

zvýšená dodávka kyslíku do tkání

Zvýšenou dodávkou kyslíku do tkání a tím i do bunČk umožĖujeme tČlu zvýšenou tvorbu energeticky bohatých látek, tzv. adenosintrifosfátĤ (ATP). Dostateþné množství ATP vylepšuje þinnost tkání a orgánĤ, které produkují látky tČlu prospČšné – hormony a látky imunitního systému.

12

koupele.

PĜevzato z webových stránek http://www.studio-evik.estranky.cz/stranka/suche-uhlicite-


23

2.3 SvČtelný mikroskop Mikroskop je nástroj, který nám umožĖuje pozorovat pĜedmČty, jež jsou pro sledování pouhým okem pĜíliš malé. Snažíme-li se dobĜe vidČt nČjaký drobný pĜedmČt, pĜibližujeme si jej k oku. Tím si zvČtšujeme zorný úhel. Pokud ovšem u zdravého oka umístíme pĜedmČt do menší vzdálenosti, než je konvenþní zraková vzdálenost (= 25 cm), vidíme ho nezĜetelnČ a rozmazanČ. Mikroskop umožĖuje zvČtšení zorného úhlu díky soustavČ þoþek, a tím dovoluje prohlédnutí malých pĜedmČtĤ. Mikroskop se skládá ze tĜí základních þástí:

optické soustavy

osvČtlovací soustavy

mechanického zaĜízení

Optická soustava se skládá ze tĜí þástí: objektivu, okuláru a pohyblivého tubusu. Objektiv i okulár mají kladnou optickou mohutnost, tzn. že se chovají jako spojky. Objektiv vytváĜí zvČtšený, skuteþný a pĜevrácený obraz. Obraz vytvoĜený objektivem se stává pĜedmČtem pro okulár. Obraz okuláru je zvČtšený, zdánlivý a pĜevrácený. V praxi se nejþastČji setkáme se dvČma druhy mikroskopĤ. Jedná se o mikroskop monokulární a binokulární.

Obr. 3 Schéma optické soustavy mikroskopu. Zdroj: Hrazdira, I., Mornstein, V., Škorpíková, J.: Základy biofyziky a zdravotnické techniky. Neptun, Brno 2006, 312 s.


24

OsvČtlovací soustava se skládá se svČtelného zdroje, kondenzoru, zrcátka a irisové clony. U starších mikroskopĤ je použito zrcátka, aby odráželo umČlé nebo pĜirozené svČtlo do optické soustavy mikroskopu. Moderní pĜístroje mají osvČtlovací zaĜízení zabudováno pĜímo v tČle mikroskopu. Kondenzor je tvoĜen soustavou þoþek o krátké ohniskové vzdálenosti. Jeho hlavním úkolem je soustĜećovat svČtlo, které prochází pozorovaným preparátem. Kondenzor je uložen pod stolkem mikroskopu. Irisová clona je souþástí kondenzoru a umožĖuje regulovat kontrast obrazu analyzovaného preparátu. Mechanická þást zahrnuje stativ, nosiþ tubusu, stolek a revolverovou hlavici. Stativ vytváĜí velmi pevnou oporu mikroskopu, je spojen svým ramenem s nosiþem tubusu a se stolkem. V horní þásti tubusu se nachází okulár, ve spodní þásti je revolverová otáþecí hlavice, v níž jsou umístČny jednotlivé objektivy. Revolverová hlavice umožĖuje snadné stĜídání objektivĤ. Na tČle mikroskopu se nalézají dva šrouby – makrometrický a mikrometrický. Makrometrický šroub slouží k hrubšímu posunu a zaostĜení pozorovaného pĜedmČtu. Mikrometrický šroub umožĖuje jemný posuv a pĜesné zaostĜení preparátu. Celkové zvČtšení Z mikroskopu se vypoþítá jako souþin zvČtšení objektivu Zob a okuláru Zok: Z = Z ob ⋅ Z ok =

∆⋅d , f ok ⋅ f ob

kde d ….. konvenþní zraková vzdálenost,

ǻ ….. optický interval mikroskopu (vzdálenost mezi obrazovým ohniskem objektivu a pĜedmČtovým ohniskem okuláru), fob a fok ….. ohniskové vzdálenosti objektivu a okuláru.

V tuto chvíli by nás mohlo napadnout, že vhodnou volbou þoþek v mikroskopu dosáhneme neomezeného zvČtšení preparátu. Takové zvČtšení by nám však neumožĖovalo rozlišení detailĤ vzorku. ZvČtšení je tedy omezeno rozlišovací mezí mikroskopu:

δ=

λ n ⋅ sin α

,


25

kde

į ….. mĜížková konstanta (vzdálenost dvou vrypĤ mĜížky), Ȝ ….. vlnová délka použitého svČtla, n ….. index lomu prostĜedí mezi þelem objektivu a krycím sklíþkem preparátu,

Į ….. úhel svíraný optickou osou mikroskopu s pláštČm kuželu, v nČmž se nacházejí paprsky, které z daného místa preparátu mohou vstoupit do objektivu a podílet se na zobrazení. Výraz ve jmenovateli se nazývá numerická apertura objektivu.


26

2.4 TeplomČry Teplota tČla þi jiných objektĤ je dĤležitým parametrem nejen v lékaĜství. Mezi hlavní dĤvody mČĜení teploty patĜí sledování nemocných pacientĤ a fyziologických reakcí, léþby hypertermií a další laboratorní experimenty. PĜi mČĜení teploty teplomČrem musíme vzít v úvahu následující parametry jako pĜesnost teplomČru, doba ustálení teplotního údaje, invazivita, tepelná kapacita þi vodivost þidla. Termometrie je obor, který se zabývá mČĜením teploty. Rozložení hodnot teploty na povrchu tČla sleduje termografie. Termometrické metody dČlíme na mČĜení kontaktní a bezkontaktní. Mezi kontaktní termometrické možnosti mČĜení teploty patĜí metody založené na tepelné roztažnosti jednotlivých látek, objem mČrné látky je závislý na její teplotČ (rtuĢové a alkoholové teplomČry), a na metody, které jsou založeny na zmČnách elektrických vlastností vodiþĤ þi polovodiþĤ (termistory a termoþlánky). Bezkontaktní mČĜení teploty se provádí radiaþním teplomČrem. V experimentální þásti byl k mČĜení teploty používán klasický dilataþní lihový teplomČr s rozsahem do -80 °C a dále digitální teplomČr pro mČĜení i extrémnČ nízkých hodnot kapalného dusíku typ GTH 175/MOP s mČĜícím rozsahem od -199,9 °C do +199,9 °C.


27

3 Cíl práce Cílem této práce je provČĜit úþinky chladu na bunČþné úrovni. V dostupné literatuĜe se jen velmi málo prací zamČĜuje na pĜímý vliv chladu na buĖky. Hlavním úkolem je tedy analyzovat a popsat základní pĤsobení chladu na buĖky. Konkrétním zástupcem bunČk budou koĖské erytrocyty. Teoretická þást má za úkol uvést þtenáĜe do dané problematiky. Seznamuje nás se základními principy kryoterapie jak celotČlové, tak i lokální. PodrobnČji se zabývá pĜístroji, které byly nezbytné pro mČĜení. Praktická þást se zabývá studiem chladové terapie na erytrocyty. Cílem je pozorování stupnČ hemolýzy v závislosti na zpĤsobu a délce chlazení suspenze erytrocytĤ. MČĜení se zamČĜujeme na:

poþetní zmČny erytrocytĤ pĜi rĤzných teplotách (teplotní závislost)

porovnání poþetních zmČn erytrocytĤ pĜi používání rozdílných chladicích smČsí (oxid uhliþitý, kapalný dusík)

poþetní zmČny erytrocytĤ pĜi chlazení suspenze o rozdílných koncentracích


28

4 Experimentální þást

4.1 Metodika Na kovový stojan byla pomocí svorek upevnČna stĜední tryska pĜístroje Cryo-T. Nad ni byla v konstantní vzdálenosti upevnČna plastová zkumavka se zkoumaným materiálem. Plastová zkumavka byla umístČna v takové vzdálenosti od trysky, aby chlazení oxidem uhliþitým bylo co nejúþinnČjší, tedy se nacházela ve vrcholu kužele, který byl tryskající chladicí smČsí tvoĜen. Do plastové zkumavky se vložil teplomČr pomocí otvoru v plastové uzávČrce zkumavky. TeplomČr byl nastaven tak, aby se nacházel ve stĜedu zkumavky a nedotýkal se jejích okrajĤ a aby byl uprostĜed suspenze krve, tedy aby þidlo teplomČru bylo dostateþnČ ponoĜeno v mČĜené kapalinČ a zároveĖ se nedotýkalo dna zkumavky. Tímto by mohlo dojít ke zkreslení mČĜené teploty suspenze. TČlo teplomČru nebo mČĜicího þidla bylo udržováno stále v konstantní vzdálenosti, aby vyhovovalo výše uvedeným podmínkám.

Obr. 4 P Ĝ ístroj Cryo-T – uspo Ĝ ádání p Ĝ i m ČĜ ení.


29

Obr. 5 Mikroskop Olympus CX21 s fotoaparátem Olympus SP-350 p Ĝ ipojeným k po þ íta þ i. Na po þ íta þ i je spušt Č ný program Quick PHOTO CAMERA 2.2.

Obr. 5 Celkové uspo Ĝ ádání laborato Ĝ e p Ĝ i m ČĜ ení.


30

4.2 Používaná zaĜízení PĜi mČĜení se používal pĜístroj Cryo-T od firmy DN-FORMED Brno, s. r. o., ostatní vybavení poskytl Biofyzikální ústav LF MU. Dále se využíval svČtelný mikroskop Olympus CX21, který byl pĜipojen k poþítaþi pĜes fotoaparát Olympus SP-350. Program Quick PHOTO CAMERA 2.2 umožĖoval pohodlnČjší zpĤsob poþítání erytrocytĤ. K urþování poþtu erytrocytĤ bylo využito Bürkerovy poþítací komĤrky (viz níže).

4.3 Suspenze erytrocytĤ PĜi mČĜení se užívala koĖská krev z Kliniky chorob koní na Veterinární a farmaceutické univerzitČ v BrnČ. Pro práci jsem používala 2% suspenzi koĖské krve, která se získala naĜedČním pomocí sterilního fyziologického roztoku.

4.4 Hemolýza erytrocytĤ K poþítání erytrocytĤ se používalo Bürkerovy poþítací komĤrky. Tato komĤrka je tvoĜená speciálnČ upraveným podložním sklem, na nČmž je mikroskopická mĜížka. Podložní sklo se pĜikryje sklem krycím, které je pĜichyceno pomocí svorek. Tímto zpĤsobem se vytvoĜí pĜesnČ definovaný prostor, v nČmž se poté poþítají erytrocyty. Erytrocyty se poþítají v malých þtvercích, jejichž plocha je S = 0,0025 mm2, výška prostoru komĤrky je 0,1 mm. Poþet þtvercĤ, ve kterých se erytrocyty zapoþítávají, je rĤzný. V této práci byl pro mČĜení zvolen poþet 20. Bürkerovo pravidlo nám Ĝíká, jak poþítat erytrocyty v jednotlivých þtvercích. Zapoþítávají se þervené krvinky, které jsou uvnitĜ þtverce nebo se dotýkají horní a pravé hrany þtverce.


31

Obr. 6 Bürkerovo pravidlo pro poþítání erytrocytĤ. Zdroj: Mornstein, V. a kol.: Biofyzikální praktikum. Masarykova univerzita, Brno 2004, 150 s. Poþet erytrocytĤ byl stanoven dle vztahu: N=

n⋅z , S ⋅h⋅x

kde n ….. souþet erytrocytĤ v x þtvercích (pro náš pĜípad ve 20 þtvercích), z ….. zĜedČní suspenze, S ….. plocha jednoho þtverce (S = 0, 002 5 mm2), h ….. hloubka komĤrky (h = 0,1 mm), x ….. poþet þtvercĤ.

4.5 Zpracování výsledkĤ SmČrodatná odchylka se poþítala dle vzorce: n

¦ (n − n ) δN =

i =1

a (a − 1)

2

,


32

kde n ….. aritmetický prĤmČr, a ….. poþet mČĜení.

Výsledný poþet erytrocytĤ v 1 mm3 je N = (N ± įN).


33

5 Výsledky

5.1 Kontrolní mČĜení Na zaþátku mČĜení bylo provedeno kontrolní mČĜení poþtu erytrocytĤ. Poþet erytrocytĤ v koĖské krvi se pohybuje v rozmezí (6 – 9) · 106 þástic v mm3. z 500

x 20

n1 88

n2 87

N · 106 (þástic · mm-3) 8,67 ± 0,09

n3 85

5.2 Chlazení suspenze erytrocytĤ, teplota mČĜená pomocí lihového teplomČru Vzorky 2% suspenze erytrocytĤ byly chlazeny pomocí pĜístroje Cryo-T. PostupnČ se snižovala teplota vzorku až na -70 °C a pozorovala hemolýza erytrocytĤ. PĜi mČĜení byla 2% suspenze erytrocytĤ v množství 2 ml uložena v plastové zkumavce. z 500 500 500 500 500 500 500

x 20 20 20 20 20 20 20

t (s) 146 168 211 244 294 354 591

T (°C) -10 -20 -30 -40 -50 -60 -70

n1 38 23 17 5 3 2 2

n2 37 21 17 4 1 1 1

n3 34 18 15 6 2 4 2

N · 106 (þástic · mm-3) 3,63 ± 0,12 2,07 ± 1,50 1,63 ± 0,07 0,50 ± 0,06 0,20 ± 0,06 0,23 ± 0,09 0,17 ± 0,03

5.3 Chlazení suspenze erytrocytĤ, teplota mČĜená pomocí digitálního teplomČru Vzorky suspenze erytrocytĤ byly uloženy v plastové zkumavce v množství 2 ml a chlazeny pomocí pĜístroje Cryo-T jako v pĜedchozím mČĜení. MČĜení se lišilo použitím jiného druhu teplomČru. Digitální teplomČr mČl zajistit pĜesnČjší a rychlejší mČĜení teploty chlazeného vzorku. PĜi chlazení se zmrznutá suspenze erytrocytĤ rozmrazovala dvČma zpĤsoby – teplou vodou a pĜi pokojové teplotČ. Byla pozorována závislost zpĤsobu rychlého þi samovolného rozmrazení na poþet erytrocytĤ.


34

5.3.1 Rychlé rozmrazení chlazené suspenze erytrocytĤ Suspenze erytrocytĤ byla po chlazení pomocí pĜístroje Cryo-T ponoĜena do teplé vody. Zmrzlá suspenze erytrocytĤ se tak rychle rozmrazila. Cílem této þásti mČĜení bylo provČĜit, zda lze ovlivnit výsledný poþet erytrocytĤ zpĤsobem jejich rozmrazení. PĜed mČĜením bylo pĜedpokládáno, že rychlejším rozmrazením se zachová vČtší poþet erytrocytĤ. z 500 500 500 500 500 500 500

x 20 20 20 20 20 20 20

t (s) 156 180 208 239 262 288 463

T (°C) -10 -20 -30 -40 -50 -60 -70

n1 29 18 14 5 2 1 2

n2 30 21 12 4 2 1 1

n3 33 23 14 5 4 0 1

N · 106 (þástic · mm-3) 3,07 ± 0,12 2,07 ± 0,15 1,33 ± 0,07 0,47 ± 0,03 0,27 ± 0,07 0,07 ± 0,03 0,13 ± 0,03

5.3.2 Rozmrazení chlazené suspenze erytrocytĤ pĜi pokojové teplotČ Po chlazení oxidem uhliþitým byla suspenze erytrocytĤ ve zkumavce uložena do stojanu a suspenze rozmrzala pĜi pokojové teplotČ po dobu nČkolika minut. PĜedpokladem pro toto mČĜení byla domnČnka, že pĜi samovolném rozmrzání suspenze erytrocytĤ bude hemolýza erytrocytĤ vČtší než pĜi rychlém rozmrazení. z 500 500 500 500 500 500 500

x 20 20 20 20 20 20 20

t (s) 147 175 210 249 271 299 404

T (°C) -10 -20 -30 -40 -50 -60 -70

n1 36 15 2 1 1 0 2

n2 35 16 1 2 2 1 1

n3 34 17 1 1 0 1 1

N · 106 (þástic · mm-3) 3,50 ± 0,06 1,60 ± 0,06 0,13 ± 0,03 0,13 ± 0,03 0,10 ± 0,06 0,07 ± 0,03 0,13 ± 0,03

-70

-60

-50

a digitálním teplom Č rem. Teplota (° C)

-40

-30

-20

Srovnání hemolýzy erytrocytĤ

Poþet erytrocytĤ (þástic • mm-3)

-10

0,00E+00

5,00E+05

1,00E+06

1,50E+06

2,00E+06

2,50E+06

3,00E+06

3,50E+06

4,00E+06

Digitální teplomČr rozmrazení pĜi pokojové teplotČ

Digitální teplomČr rychlé rozmrazování

Lihový teplomČr rychlé rozmrazování

35 Martina RĤžiþková

Graf þ . 1 Chlazení suspenze erytrocyt Ĥ , teplota m ČĜ ená lihovým


36

5.4 Chlazení suspenze erytrocytĤ pomocí mrazicího boxu PĜi mČĜení byla snaha porovnat hemolýzu erytrocytĤ v závislosti na zpĤsobu chlazení suspenze erytrocytĤ. V tomto mČĜení se používal mrazicí box, který dosahoval teploty -78 °C. Teplota byla mČĜena až po vyjmutí vzorku z mrazicího boxu, proto neodpovídá skuteþnČ dosažené teplotČ vzorku pĜi chlazení. z 500 500 500 500 500 500 500 500 500

x 20 20 20 20 20 20 20 20 20

t (min.) 5 10 15 20 25 30 60 120 1200

T (°C) 0,5 -1,3 -1,8 -6,2 -8,1 -10,5 -10,7 -11,0 -35,4

n1 44 39 4 4 4 3 3 1 0

n2 48 39 6 3 3 3 2 1 1

n3 45 41 7 4 3 3 3 0 1

N · 106 (þástic · mm-3) 4,57 ± 0,12 3,97 ± 0,07 0,57 ± 0,09 0,37 ± 0,03 0,33 ± 0,03 0,30 ± 0,00 0,27 ± 0,03 0,07 ± 0,03 0,07 ± 0,03

5.5 Chlazení suspenze erytrocytĤ pomocí kapalného dusíku Tento experiment navazuje na pĜedchozí mČĜení, kde je cílem ukázat, jak se liší hemolýza erytrocytĤ pĜi použití rĤzných zpĤsobĤ chlazení erytrocytĤ. V tomto mČĜení se použil kapalný dusík. Suspenze erytrocytĤ byla uložena v plastové zkumavce, která se pĜímo ponoĜovala do kapalného dusíku. Teplota byla mČĜena pomocí digitálního teplomČru, který se vložil pĜímo do suspenze erytrocytĤ pĜi mČĜení. z 500 500 500 500 500 500 500 500

x 20 20 20 20 20 20 20 20

t (s) 10 20 30 60 120 180 240 300

T (°C) -1,8 -1,3 -10 -76,2 -188,5 -195,3 -196,9* -197,3*

n1 80 34 7 1 1 1 1 1

n2 85 30 12 1 1 0 0 1

n3 72 29 11 2 1 1 1 1

N · 106 (þástic · mm-3) 7,90 ± 0,38 3,10 ± 0,15 1,00 ± 0,15 0,13 ± 0,03 0,10 ± 0,00 0,07 ± 0,03 0,07 ± 0,03 0,10 ± 0,00

* Zde mĤžeme vidČt nepĜesnost teplomČru pĜi mČĜení na spodním konci jeho mČĜícího rozsahu. Kapalný dusík nemĤže dosáhnout tČchto hodnot. NicménČ tyto hodnoty byly odeþteny z displeje digitálního teplomČru.

Poþet erytrocytĤ (þástic • mm-3)

Cryem-T.

0,00E+00

1,00E+06

2,00E+06

3,00E+06

4,00E+06

5,00E+06

6,00E+06

7,00E+06

8,00E+06

9,00E+06

1,00E+07

0

50

100

150

ýas (s)

200

250

300

RĤzné druhy chladicích smČsí

350

400

Cryo-T

kapalný dusík

37 Martina RĤžiþková

Graf þ . 2 Chlazení suspenze erytrocyt Ĥ kapalným dusíkem a

Poþet erytrocytĤ (þástic • mm -3)

0,00E+00

5,00E+05

1,00E+06

1,50E+06

2,00E+06

2,50E+06

3,00E+06

3,50E+06

4,00E+06

4,50E+06

5,00E+06

0

10

20

30

40

50

ýas (min.)

60

70

Chlazení pomocí mrazicího boxu

80

90

100

110

120

38 ZmČny erytrocytĤ po lokální kryoterapii

Graf þ . 3 Chlazení suspenze erytrocyt Ĥ pomocí mrazicího boxu.


39

5.6 Chlazení suspenze erytrocytĤ pĜi stejné teplotČ chladicí smČsi V této þásti mČĜení se teplota chladicí smČsi oxidu uhliþitého udržovala kolem -50 °C. Snahou bylo prokázat, že pokud chlazení nepĜesáhne 3 minuty, což je doporuþená doba chlazení pĜi terapii, hemolýza erytrocytĤ je témČĜ neznatelná. z 500 500 500 500 500 500

x 20 20 20 20 20 20

t (s) 60 120 180 240 300 360

T (°C) 3,2 -0,5 -2 -24,6 -42,9 -62,7

n1 92 84 85 11 2 1

n2 90 83 85 11 3 1

n3 89 87 85 10 4 0

N · 106 (þástic · mm-3) 9,03 ± 0,09 8,47 ± 0,12 8,50 ± 0,00 1,07 ± 0,03 0,30 ± 0,06 0,07 ± 0,03

Chlazení erytrocytĤ pĜi stejné teplotČ chladicí smČsi - þasová závislost


1,00E+07 9,00E+06 8,00E+06 7,00E+06 6,00E+06 5,00E+06 4,00E+06 3,00E+06 2,00E+06 1,00E+06 0,00E+00 60

120

180

240

300

360

ýas (s)

Graf þ . 5 Chlazení suspenze erytrocyt Ĥ p Ĝ i stejné teplot Č chladicí sm Č si.


40

5.7 Chlazení suspenze erytrocytĤ v rĤzných koncentracích Ve všech doposud uvedených mČĜeních se používala 2% koĖská krev. Cílem tohoto mČĜení bylo prozkoumat, jak bude postupovat hemolýza erytrocytĤ, když se krev o rĤzných koncentracích bude chladit na stejnou teplotu. Jednotlivé koncentrace byly vybrány náhodnČ, snahou bylo promČĜit celou škálu koncentrací, od velmi zĜedČných až po plnou krev. Koncentrace vzorku Plná krev 50% krev 25% krev 2% krev 0,2% krev

z

x

t (s)

T (°C)

n1

n2

n3

100 200 400 500 500

20 20 20 20 20

202 196 205 208 229

-30 -30 -30 -30 -30

11 13 11 5 3

15 10 8 4 3

13 11 9 6 2

N · 106 (þástic · mm-3) 0,26 ± 0,02 0,45 ± 0,04 0,75 ± 0,07 0,50 ± 0,06 0,27 ± 0,03

Chlazení erytrocytĤ o rĤzných koncentracích suspenze krve


8,00E+05 7,00E+05 6,00E+05 5,00E+05 4,00E+05 3,00E+05 2,00E+05 0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Koncentrace krve (%)

Graf þ . 6 Chlazení suspenze erytrocyt Ĥ o r Ĥ zných koncentracích suspenze krve.


41

6 Diskuze Cílem této práce bylo sledovat pĜímý vliv chladu na buĖky. PĤsobení chladu na erytrocyty se zkoušelo nejen pĜístrojem Cryo-T, ale i dalšími zpĤsoby, jako je mrazicí box nebo kapalný dusík. Nutno zde podotknout, že pĜístroj Cryo-T nebyl vybrán pro tuto práci úþelnČ. Primárním úþelem práce je studium pozorování stupnČ hemolýzy v závislosti na zpĤsobu a délce chlazení suspenze erytrocytĤ. Práce byla rozdČlena na nČkolik þástí. V první þásti se pozornost vČnovala chlazení 2% suspenze erytrocytĤ pomocí pĜístroje Cryo-T. V prvním grafu lze vidČt porovnání mČĜení teploty lihovým a digitálním teplomČrem, také zde vidíme srovnání rychlého a pĜirozeného rozmrzání chlazených vzorkĤ. MČĜení lihovým a digitálním teplomČrem se pĜíliš neliší. U srovnání rychlého a pomalého rozmrzání chlazených vzorkĤ byla pĤvodní domnČnka taková, že pĜi rychlém rozmrazení nedojde k velkému poškození bunČk a hemolýza erytrocytĤ bude menší. Z grafu je patrné, že pĜi rychlém rozmrazení je hemolýza erytrocytĤ skuteþnČ menší. Naproti tomu vzorky, které rozmrzaly pĜi pokojové teplotČ, vykazují stupeĖ hemolýzy vČtší. Další þást se soustĜedila na srovnání úþinkĤ rĤzných chladicích smČsí na hemolýzu erytrocytĤ. Z dĤvodu velké rozdílnosti þasĤ použitých k mČĜení jsou výsledky rozdČleny do dvou grafĤ. U mČĜení s kapalným dusíkem se vzorek suspenze erytrocytĤ pĜímo ponoĜoval do nádoby s kapalným dusíkem. Teplota kapalného dusíku dosahuje za normálního tlaku témČĜ - 196 °C. Díky tČmto extrémnČ nízkým teplotám je hemolýza erytrocytĤ již po jedné minutČ témČĜ úplná. Naopak chlazení pomocí oxidu uhliþitého se zdá být šetrnČjší. Hemolýza erytrocytĤ je po chlazení pĜístrojem Cryo-T do tĜech minut témČĜ neznatelná. Teprve po delším chlazení zaþíná být hemolýza erytrocytĤ pozorovatelná. Po pČti minutách je hemolýza erytrocytĤ po chlazení pĜístrojem Cryo-T srovnatelná s hemolýzou erytrocytĤ po vložení suspenze erytrocytĤ na jednu minutu do kapalného dusíku. PĜi chlazení v mrazicím boxu je kĜivka hemolýzy srovnatelná s kĜivkou hemolýzy pĜi chlazení kapalným dusíkem, hlavní rozdíl spoþívá v þasových hodnotách. Chlazení v mrazicím boxu není pĜi krátkých þasových úsecích tak úþinné jako u kapalného dusíku. K témČĜ úplné hemolýze je potĜeba mnohem delší


42

doba chlazení. Mrazicí box dosahoval vnitĜní teploty -78 °C. Po jedné minutČ pĜi chlazení kapalným dusíkem klesl poþet erytrocytĤ na 0,13 · 106 (þástic · mm-3), k dosažení stejného výsledku u mrazicího boxu by byla tĜeba doba chlazení více než hodinu. V tĜetí þásti se mČĜení zamČĜilo na bezpeþnost pĜístroje pro uživatele. PĜi nejúþinnČjším chlazení dosahuje teplota chladicí smČsi -75 °C. Taková extrémní teplota jistČ vystraší mnoho pacientĤ. Proto je zajímavý závČr, že pĜi chlazení suspenze erytrocytĤ po dobu tĜí minut pĜi konstantní teplotČ chladicí smČsi je hemolýza erytrocytĤ témČĜ neznatelná. Doporuþená doba terapie pro pĜístroj Cryo-T je maximálnČ 3 minuty. Z mČĜení by tedy mohlo vyplývat, že pokud doba terapie nepĜesáhne doporuþenou dobu chlazení, je procedura bezpeþná. V poslední, praktické þásti této práce byla pozornost vČnována koncentraci chlazené suspenze erytrocytĤ. Pro celé pĜedcházející mČĜení byla vybrána konstantní koncentrace krve, konkrétnČ 2 %. Proto byly vybrány náhodnČ rĤznČ koncentrované vzorky krve (plná krev, 50 %, 25 %, 2 % a 0,2 %) a sledovala se hemolýza erytrocytĤ pĜi chlazení na stejnou hodnotu (-30 °C). Zajímavé bylo zjištČní, že nejmenší stupeĖ hemolýzy vykazuje 25% a 2% krev, zatímco plná krev vykazuje stupeĖ hemolýzy vČtší. U velmi nízkých koncentrací, v našem pĜípadČ 0,2 %, kdy je pĜítomno velké množství rozpouštČdla, se oþekávalo a mČĜením i potvrdilo, že hemolýza je velmi rozšíĜená.


43

7 ZávČr Stanovených cílĤ, které jsou uvedeny v samostatné kapitole, bylo úspČšnČ dosaženo. Z výsledkĤ v experimentální þásti mĤžeme usoudit, že po aplikaci oxidu uhliþitého pomocí pĜístroje Cryo-T na suspenzi erytrocytĤ je tato suspenze ovlivnČna a dochází pĜedevším k jejich hemolýze. Rozsah hemolýzy je však rĤzný, závisí pĜedevším na zpĤsobu chlazení, dobČ chlazení a jaké použijeme médium pro chlazení. Sledování pĤsobení chladu na buĖky je však dĤležité hlavnČ z dĤvodu zavádČní chladové terapie do praxe. Erytrocyty a další buĖky jsou pro živý organismus nesmírnČ dĤležité, neboĢ jsou jejich základní stavební jednotkou.

ýinit závazné závČry z výsledkĤ této práce by bylo pĜedþasné. Experimenty se neprovádČly s lidskou krví a byly provádČny in vitro, proto ve výsledcích nejsou zahrnuty ochranné mechanismy lidského organismu. Pro posuzování pĜímého vlivu oxidu uhliþitého na buĖky in vitro, by bylo tĜeba použít místo plastové zkumavky, zkumavku vyrobenou z materiálu, který by mČl podobné, þi stejné vlastnosti (fantom) jako lidská pokožka. Nápadná je þasová shodnost délky doporuþené aplikace chladu (která je stanovena na základČ praktických zkušeností) se shodností délky þasového intervalu, kdy je hemolýza erytrocytĤ témČĜ neznatelná. VysvČtlení, zda se jedná o náhodu nebo zda jde o hlubší souvislosti, by mohlo být zajímavé. Pokud je známo, v þeské odborné literatuĜe, kromČ odkazu 6. v seznamu literatury, který pĜedstavuje první mČĜené studie v souvislosti s použitím celotČlové chladové terapie, neexistují další práce zabývající se mČĜením této problematiky. Tato práce nastínila studium pĜímého vlivu chladu na buĖky. Z experimentální

þásti mĤžeme usoudit na základní chování erytrocytĤ po aplikaci chladové terapie. Jisté je, že na tomto poli zĤstává ještČ mnohé k objevování.


44

8 Seznam literatury

8.1 Knihy 1. Caban, E.: Kryoterapia. (firemní brožura firmy KRYOMED, spol. s r. o.) 2. KostĜica, R.: Kryoterapie v medicínČ. Vydavatelství Masarykovy univerzity v BrnČ, Brno 1995, 124 s. 3. Zeman, V.: Adaptace na chlad u þlovČka, možnosti a hranice. Galen, Praha 2006, 131 s. 4. Hrazdira, I., Mornstein, V., Škorpíková, J.: Základy biofyziky a zdravotnické techniky. Neptun, Brno 2006, 312 s. 5. Mornstein, V. a kol.: Biofyzikální praktikum. Masarykova univerzita, Brno 2004, 150 s. 6. Steinerová, A., Korotviþka, M., Racek, J., Zeman, V., Strnad, P., Bajgar, M.: Posouzení vlivu celotČlové kryoterapie na lidský organismus. In: Sborník XIV. sjezdu Spoleþnosti rehabilitaþní a fyzikální medicíny, Luhaþovice, duben 2007.

8.2 Elektronické zdroje 7. http://www.kryocentrum.cz/konsensus-celotelova-kryoterapie/ 8. http://www.kryocentrum.cz/kryoterapie-lecba-chladem/ 9. http://www.muzes.cz/clanky/clanek/85/ 10. http://www.kryomed.sk/cs/kryoterapia.html


45

11. http://www.dnformed.com/ 12. http://www.studio-evik.estranky.cz/stranka/suche-uhlicite-koupele 13. http://mikroskop.navajo.cz/ 14. http://ireferaty.lidovky.cz/302/1830/Mikroskop

Zm ny erytrocyt. po lokální kryoterapii

Recommend Documents