Základy imunologických metod: interakce antigen-protilátka využití v laboratorních metodách
Imunoglobuliny – membránově vázané a solubilní receptory
Epitopy • Antigen = částice rozpoznávaná protilátkou • Epitop (antigenní determinanta) = část antigenu, na který se váže protilátka. • Většina antigenů má více epitopů (multivalentní)
Fig. 2.9 • Většinou cukr nebo peptid.
Epitopy rozpozávané protilátkami jsou obvykle lokalizovány na povrchu antigenu
Fig. 2.8
Konformační vs. lineární epitopy
Fig. 2.11
Epitopy
heat, acid
Konformační epitopy – zničení při denaturaci Lineární epitopy – neovlivněné denaturací
Základní struktura imunoglobulinů
2 lehké řetězce -lambda (λ) -kappa (κ)
2 těžké řetězce
Fig. 2.2
Základní struktura imunoglobulinů
Fig. 2.2 Fig. 2.2
Štěpení protilátek
Antigen-binding Fragment (Fragment vážící protilátku)
Crystallizable Fragment (krystalizovatelný fragmen
Třída imunoglobulinů (izotypy)
H: γ
µ
δ
(IgG1 – 4)
α (IgA1 – 2)
L-chain: κ or λ
ε
Rozdíly mezi imunoglobuliny
Fyzikální vlastnosti imunoglobulinů
IgM • Membránově vázaný monomer and sekretovaný pentamer. • První třída protilátek syntetizovaná během ontogeneze a při imunitní odpovědi • Aktivace komplementu; aglutinace. • Může být transportována na slizniční povrch
IgG
• • • •
Nejvyšší koncentrace v séru 4 podtřídy: IgG1 - 4 Aktivace komplementu Binds to Fcγ -receptors on neutrophils, macrophages and NK cells
IgA • Obvykle dimer • Sekreční IgA je dimer se sekreční komponentou • 2 podtřídy: IgA1 and IgA2 • Nejčastější imunoglobulin ve slizničních sekretech • Neutralizace; Zabraňuje vazbě mikroorganismů na receptory • Není efektivní v aktivaci komplementu
IgE • Velmi nízká sérová koncentrace u zdravých lidí. • Koncentrace je vyšší u pacientů s parazitárními infekcemi a u pacientů s alergiemi • Váže se na receptory na žírných buňkách a bazofilech. Následuje degranulace a uvolňování zánětlivých mediátorů
IgD • Velmi nízká koncentrace v séru • Primárně nalézána spolu s IgM na naivních B buňkách • Neznámá funkce
Funkce imunoglobulinů
Funkce imunuglobulinů
Polyklonální vs. monoklonální protilátky • Polyklonální protilátky – Purifikace ze séra imunizovaných zvířat (koza, králík) – Proti mnoha epitopům, různe affinitní – Rozdíly mezi šaržemi
• Monoklonální protilátky – Produkce imortalizovanými plazmatickými buňkami, většinou myší původ – Jedna specificita, definovaná afinita
Monoklonální protilátky
• •
Imortalizace jednoho klonu B buněk produkujících určitou protilátku Fúze B buněk s buňkami myelomu
Interakce antigen - protilátka • Nekovalentní vazba: – Elektrostatická – Vodíkové můstky – Van der Waalsovy síly – Hydrofobní síly
• Afinita: Síla interakce mei epitopem a jedním vazebným místem protilátky • Avidita: Suma všech interkací meyi protilátkou a antigenem
Crosreaktivita A
B
Antiserum vyrobené proti antigenu A reaguje také s antigenem B • Antigen A a B mají stejný epitop • Antigen A a B mají podobný (ale ne stejný) epitop
Metody, kde se využívájí protilátky Neznačený antigen/protilátka • Precipitace • Aglutinace Značený antigen/protilátka • Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) • Radioimmunoassay (RIA) • Western blotting • Immunofluorescence • Průtoková cytometrie
Sensitivita metod precipitace - 30 µg/ml
aglutinace - 1 µg/ml
radioimunoassay, ELISA - 1 pg/ml
Agregáty vzniklé interakcí multivalentních protilátek a multivalentních makromolekulárních antigenů Precipitation reaction
Poměr reagujících složek, při němž je doba flokulace nejkratší nebo precipitace nejvýrazněj ší, se nazývá optimální poměr a j e obvyke tvořen ekvivalentními množstvími antigenu a protilátky.
Precipitační reakce Ab + solubilní Ag
Síť antigenů a protilátek Precipitace
Stanovení imunoprecipitace: vizuálně metodami rozptylu světla (nefelometrické nebo turbidimetrické stanovení) Metody Flokulační : postupné ředění jedné z reagujících složek - ve zkumavce Imunodifuzní (ID) : ředění se dosahuje difuzí do prostředí gelu
•Radiální imunodifúze •Dvojitá difúze •Imunoelektroforéza
Radiální imunodifúze Protilátka je rozpuštěná v gelu; Ag je přidán do jamek Měření koncentrace různých sérových proteinů, např. hladiny imunoglobulinů
Dvojitá difúze Ab a Ag difundují proti sobě • • • •
Stanovení homogenity systému antigen-protilátka Diagnostika specifických autoimunitních onemocnění Používáno následně po purifikaci směsi antigenů Hledání reakcí mezi serologicky příbuznými antigeny
Identické
Neidentické
Částečně identické
Dvojitá difúze
Dvojitá difúze
Dvojitá difúze
Imunoelektoforéza Kombinace separace antigenů elektroforézou s identifikací pomocí dvojité difúze detekce presence nebo absence proteinu v seru
Aglutinační reakce Ab + částicový Ag
Aglutinace (shlukování)
• Přímá aglutinace • Pasivní aglutinace • Aglutinační inhibice
Přímá aglutinace • •
Ag je přirozenou složkou částice Např. testování pacientova séra na přítomnost protilátek proti určité bakterii: –
Pacientovo serum je seriově ředěno do zkumavek s danou bakterií. Poslední zkumavka s viditelnou aglutinací určuje titr protilátky v séru
Přímá aglutinace • Stanovení protilátek proti erytrocytům • Erytrocyty: negativně nabité (zeta potenciál), může být ovlivněna agluginační reakce (zejména IgG protilátky) • Řešení: Coombsův test - použití anti imunoglobulinového séra
Eg. Detection of anti-Rh antibodies in the blood of an Rh- woman
Coombsův Test • Přímý: přidá se protilátka proti lidskému imunoglobulinu (Coombsovo činidlo) k červeným krvinkám. Aglutinace se objeví, pokud jsou erytrocyty pokryty protilátkami • Nepřímý: inkubuje se testované sérum s erytrocyty zdravého dárce. Incubate test serum with red blood cells. Promytí. přidá se Coombsovo činidlo. • stanovení Rh protilátek • diagnostika získané hemolytické anémie - průkaz volných antierytrocytárních protilátek v plazmě (séru)
Přímý a nepřímý Coombsův test
Měření vázané protilátky
Měření sérové protilátky
Pasivní aglutinace • Aglutinace mezi protilátkou a solubilním antigenem vázaným na nesolubilní částici (latexová částice) • Mnohonásobně zvýšení citlivosti oproti precipitační reakce • Diagnostika autoprotilátek u autoimunitních onemocnění – Diagnostika autoimunitní thyroitidy: Thyroglobulin je připojen k latexové částici a je použit k detekci anti-thyroidních protilátek v séru pacienta - Diagnostika revmatoidní artritidy
Inhibice aglutinace • velmi citlivá metoda, umožňující detekci malých množství antigenu. Ag je navázán např. na latexové partikule a v testu je přítomná protilátka proti tomuto Ag, která aglutinuje. • Přítomnost totožného Ag ve zkoumaném vzorku inhibuje aglutinaci, protože tento Ag obsadí vazebná místa Ab. • Průkaz užívání drog (kokain, heroin). • Některé viry spontánně hemaglutinují a proto inhibice hemaglutinace sérovými protilátkami může být využita k diagnostice (zarděnky, chřipka).
Hemaglutinace
Metody se značeným antigenem/protilátkou • radioaktivní • fluorescenční • enzymatické • Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) • Radioimmunoassay (RIA) • Western blotting • Imunofluorescence • Průtoková cytometrie
1
Enzyme-linked Principle of ELISA/RIA immunosorbent assay (ELISA) 2 1. Potažení jamek antigenem
3
4
2. Přidání vzorku séra 3. Přídání enzymem značené protilátky (anti-human IgG) 4. Přidání substrátu 5. Odečtení barevné reakce
Western blotting
Western blot
Imunofluorescence
Přímá – vazba značené protilátky Nepřímá • vazba primární protilátky a značené sekundární protilátky • k detekci autoprotilátek. Sérum pacienta se nechá reagovat se substrátem. (normální tkáň jiného pacienta nebo tkáň zvířecí nebo buňky standardních buněčných kult). Detekce navázaných protilátek pomocí značených sekundárních protilátek, specifických vůči jednotlivým třídám lidských protilátek.
Průtoková cytometrie
Průtoková cytometrie: stanovení CD4 T buněk
Monitoring CD4 T buněk u HIV pacienta
