Základní principy interpretace spekter

MC230P75 Hmotnostní detekce v separačních metodách, 2016

Základní principy interpretace spekter

Obecný postup interpretace spekter Určení molekulové hmotnosti Fragmentace iontů se sudým počtem elektronů Fragmentace iontů s lichým počtem elektronů



Interpretace hmotnostního spektra 1. Určíme, které ionty souvisí s analytem a které ne 2. Určíme molární hmotnost - hledáme molekulární ion M+•, adukty (M+H)+, (M+Na)+, (M+HCOO)- nebo deprotonované molekuly (M-H)-, příp. vícenásobně nabité ionty 3. Odhadneme prvky, které jsou přítomny: inspekce izotopového klastru, aplikace dusíkového pravidla 4. Určíme elementární složení na základě měření přesné hmotnosti 5. Porovnáme spektrum s knihovnou, pokusíme se najít alespoň podobná spektra 6. Řešíme fragmentaci (vyžaduje znalost fragmentačních mechanismů a empirických pravidel)


1.

Vyloučení iontů, které nesouvisí s analytem


Ionty pozadí, kontaminanty Hmotnostní spektra často obsahují ionty, které nemají vztah k analytu • nečistoty (z rozpouštědel, nádobí, předchozích nástřiků) • “bleeding” kolony • nečistoty ve vzorku klastrové ionty rozpouštědel • matriční ionty v MALDI

klastry ACN v APCI spektru


Ionty pozadí, kontaminanty O

149 +

OH

Ftaláty: - změkčovadla z plastů m/z 149, 279, 301, 317 ...

Polyethylenglykoly: - z plastů pravidelné píkyve spektru vzdálené 44 u

O


Ionty pozadí, kontaminanty

Volně dostupné databáze běžných kontaminujících iontů: Mass spectrometry Contaminant Database http://www.maconda.bham.ac.uk/index.php http://www.maconda.bham.ac.uk/index.php

Seznam tabulek a databází: Common background contaminant ions and adducts.xls, http://sea.rice.edu/


Odečet pozadí SPEKTRUM V PÍKU

SPEKTRUM PO ODEČTU POZADÍ

SPEKTRUM POZADÍ siloxany z kolony


Ionty matrice u MALDI

klastry, fragmenty, adukty iontů matrice v nízké oblasti spektra, velmi intenzivní. Spektra se proto měří až od ~ m/z 500.

MALDI ionty z matrice

analyt


2.

Určení molekulové hmotnosti


Určení molekulové hmotnosti identifikace molekulového iontu, případně molekulového aduktu

I. Elektronová ionizace M + e-  M+• + 2 e-

Molekulový ion (M+•) je radikál kation. Jeho m/z odpovídá monoizotopické hmotnosti analytu Identifikace molekulového iontu ve spektru 1. ve spektru nemusí být přítomen 2. pokud je přítomen, musí mít nejvyšší m/z ve spektru 3. je to ion s lichým počtem elektronů (OE+•) 4. poskytuje logické neutrální ztráty


Určení molekulové hmotnosti I. Elektronová ionizace dekan Mw 142 M+•

1-dekanol Mw 158


Určení molekulové hmotnosti II. Měkké ionizační techniky (ESI, APCI, MALDI) molekulární adukty ([M+H]+, [M+Na]+) nebo deprotonované molekuly ([M-H]-) Molekulový adukt je ion se sudým počtem elektronů a nemusí být nejvyšším iontem ve spektru.

vícenásobně nabité ionty molekulární adukty

multimery (dimery, trimery ..)


Určení molekulové hmotnosti II. Měkké ionizační techniky (ESI, APCI, MALDI) molekulovou hmotnost určujeme na základě přítomnosti aduktů, dimerů, nebo vícenásobně nabitých iontů

M+1

M+1 (M+2)/2

M+23

2M+1

M+39

Výpočet aduktů, multimerů, vícenásobně nabitých iontů – Kalkulátor EIC I:\MISC\MS\DOWNLOAD\


Určení molekulové hmotnosti 365.1

347.1

381.0


Určení molekulové hmotnosti – nábojové stavy Určení počtu nábojů iontu Počet nábojů lze zjistit ze vzdálenosti mezi píky v izotopovém klastru.


Určení molekulové hmotnosti – nábojové stavy Příklad: relativní hmotnost 1000 [M + H]+

[M + 2H]2+

1001

Izotopy

1002 1002

1003 1003

12C

13C 1

1004

13C 2

12C

1001/1=1001

Spektrum (m/z!)

13C 1

1002/2=501

1002/1 = 1002 1003/1=1003

1 Da

1003/2 = 501.5 1004/2=502 0.5 Da


3.

Určení prvků přítomných v molekule

13C 2


Izotopové klastry Izotopické klastry naznačují přítomnost některých prvků v molekule (např. Cl, Br, kovy).

Počítačové programy umožňují spočítat složení klastru ze zadaného sumárního vzorce a porovnat ho s experimentem.

http://www.colby.edu/chemistry/N MR/IsoClus.html


Dusíkové pravidlo Dusíkové pravidlo: platí pro organické sloučeniny obsahující C, H, N, O, S, P, F, Cl, Br, I. Založeno na faktu, že pouze dusík má lichou vaznost při sudé nominální hmotnosti (ostatní mají sudou nebo lichou vaznost i hmotnost). lichá hmotnost molekuly = lichý počet dusíků sudá hmotnost molekuly = sudý (nulový) počet dusíků Aplikace pravidla na ionty EI – platí pro M+• tak, jak je uvedeno ESI, APCI, MALDI – pro molekulové adukty, platí pravidlo opačně ! NH2

M=93

+

NH2

m/z 93

+

NH3

m/z 94


4.

Určení elementárního složení z přesné hmotnosti


Určení elementárního složení z přesné hmotnosti Čím přesněji určíme hmotnost iontu, tím více omezíme počet možných struktur, tj. tím spíše dojdeme ke správnému elementárnímu složení

Př. paclitaxel, C47H51NO14, mon. hmotnost 854.3388 Omezení pro výpočet vzorce: C: 0-100 H: 0-100 N: 0-10 O: 0-30


5.

Hledání v knihovnách spekter


Knihovny spekter EI NIST/EPA/NIH Mass Spectral Library

276 248 EI spekter (70 eV) 234 284 MS/MS spekter, retenční indexy látek strukturní vzorce

Wiley Registry of Mass Spectral Data

719 000 EI spekter (70 eV) strukturní vzorce


Knihovny spekter měkkých ionizačních technik Problémy s tvorbou knihoven: - vzhled MS spektra velmi silně závisí na experimentálních podmínkách (adukty v závislosti na složení mobilní fáze) - v MS spektrech většinou nejsou fragmentové ionty -> knihovny spekter na úrovni MSn - MSn spektra závisí na experimentálních podmínkách (energie ionizace, typ analyzátoru apod.) → spektra v knihovnách jsou měřena při několika experimentálních podmínkách

http://www.massbank.jp/

https://www.mzcloud.org/


Knihovny spekter měkkých ionizačních technik Veřejné uložiště MS dat pro sdílení ve vědecké komunitě (~ 40 tis. spekter). Tvorba spojeného (merged) spektra ze spekter měřených za různých podmínek CID.


Knihovny spekter měkkých ionizačních technik Volně přístupná databáze spekter, spektrálních strumů, struktur, fragmentů, chromatografických dat, odkazů apod. (~ 170 tis. spekter, 2600 látek). Spektrální strom: databázová struktura tandemových spekter Identifikace podstruktur – možnost identifikace látek které nejsou v databázi


6.

Interpretace fragmentových iontů


Fragmentace iontů se sudým počtem elektronů (EE+) ESI, APCI (APPI, MALDI, DESI ...)


Fragmentace EE+ CID fragmentace iontů se sudým počtem elektronů ([M+H]+, [M+Na]+, [M-H]-) štěpení sousední vazby vzhledem k náboji, migrace náboje R-OH + H  R-OH2+ R-OH2+ R+ + H2O FRAGMENTACE EE+: vzniká ion se sudým počtem elektronů (EE+) a neutrální částice EE+  EE+ + M Ionty EE jsou obecně stabilnější než OE+• Spektra jsou jednodušší, poskytují tak méně informací než spektra EI, bývají citlivá na malé změny ve struktuře


Fragmentace EE+ Odštěpení neutrální molekuly závisí na bazicitě a stabilitě vznikajícího iontu Typické ztráty neutrálních částic: 17: NH3 – aminy alifatické, aromatické (+) 18: H2O – kyslíkaté sloučeniny, hydroxyderiváty(+/-) 27: HCN - aminy alifatické, aromatické, nitrily arom. (+/-) 28: CO – aldehydy, ketony, nitroaromáty (+/-) 32: CH3OH – methyl estery (+) 42: CH2C=O – N-acetyl deriváty (+/-) 44: CO2 – karboxylové kyselin, karbamáty (+/-) 80: SO3 – sulfonové kyseliny (+/-) 162: anhydroglukosa – glukosidy (+/-) “Zakázané” neutrální ztráty: 3-14, 21-25, 37-40


Paracetamol N-(4-hydroxyfenyl)acetamid

ESI+, MS

152.0

C8H9NO2; M=151.1

303.1 Mass 152 153 154

Intensity 100.0 8.7 0.7

153.0 325.1



ESI+, MS/MS

110.0

152.0

134.0



ESI+, MS3

110.0

92.0

93.0 82.1


Kyselina menthyloxyoctová

ESI-, MS/MS

75.3

C12H22O3; M=214.2

213.3

73.3

167.3 169.2

195.2


Kyselina 2-merkaptonikotinová

ESI+, MS/MS 138.1

C6H5NO2S; M=155.0

156.1


Kyselina 2-merkaptonikotinová

ESI+, MS3 138.1

110.1

128.1 100.1


Cyklopentafuranol-deriv

ESI+, MS/MS 311.2

C18H26O4; M=306.2 329.2 269.2


Cyklopentafuranol-deriv, disil

ESI+, MS/MS 557.3

C30H54O4Si2; M=534.4 425.1 293.1

497.2

275.1

539.2


PGF2-methylester, diTHP

ESI+, MS/MS 459.3

457.3 475.3

C31H52O7; M=536.4

373.1 375.1

559.3


Triacylglyceroly

APCI+, MS/MS

547.5

OMoPo C51H92O6; M=800.7

519.4

575.5 801.7 818.7


Triacylglyceroly

Určete strukturu triacylglycerolu.

635.5

APCI+, MS


Digalaktosyldiacylglyceroly

ESI+, MS/MS

681.2

DGDG 18:3/16:0 C49H86O15; M=914.6

659.3

937.4 775.3 497.3 519.3


Fragmentace iontů s lichým počtem elektronů (OE+•) EI


Fragmentace OE+• Při EI vznikají fragmenty již v MS kroku (nejsou nutné fragmentační techniky jako CID apod.)

FRAGMENTACE OE+• I. vzniká ion se sudým počtem elektronů a radikál OE+•  EE+ + R• II. vzniká ion s lichým počtem elektronů a neutrální částice OE+•  OE+• + M

Spektra jsou bohatá, informačně obsažná, mohou být použita jako “fingerprint” pro tvorbu knihoven spekter Probíhají pouze monomolekulární reakce


Štěpení σ vazby •je-li při ionizaci “vyražen” elektron ze -vazby, dojde k jejímu štěpení •typická fragmentace pro alkany, případně pro F-, Cl-, CN- substituované alkany

43

100

H3 C

57

CH3

dekan 50

41

29

71 27

85 39

0

20 30 (mainlib) Decane

53

36 40

50

63 60

99

77 70

80

90

100

142

113 110

126 120

130

140

150


Štěpení σ vazby •intenzita fragmentových iontů závisí na jejich schpnosti stabilizovat náboj

57

100

253 43

50

71

57 85 253 99 113

0

141

30 60 90 120 (m ainlib) Nonadecane, 3-m ethyl-

169

150

180

197 210

225

267 282 240

270


Chloromethan

EI M+

CH3+

Cl+


Unknown

EI

Jaká je struktura látky?


α-štěpení: fragmentace vyvolaná radikálem • štěpení vyvolané tendencí elektronů tvořit páry – lichý elektron je poskytnut na tvorbu nové vazby, štěpí se sousední vazba

31

100

59

50

45

29

74

27 15 0

19

10 15 20 (mainlib) Ethyl ether

41

26 28 30 32 25

30

39 35

40

43 44 46 45

57 50

55

73

60 60

65

70

75 75

80


α-štěpení: benzylové štěpení

91

100

50

106

27

15

0

10 20 (mainlib) Ethylbenzene

51

39 30

65

77 74

40

50

60

70

86

89

80

90

100

110

120


Indukční štěpení: fragmentace vyvolaná nábojem • štěpení vyvolané přitahováním elektronového páru nábojem

31

100

59

50

45

29

74

27 15 0

19

10 15 20 (mainlib) Ethyl ether

26 28 30 32 25

30

39 35

41 43 44 46

40

45

57 50

55

73

60 60

65

70

75 75

80


Fragmentace cyklických struktur – Retro Diels-Alder • -elektrony dvojné vazby u cyklických struktur jsou primárním místem ionizace

4-fenylcyklohexen


Přesmyky vodíku – McLaffertyho přesmyk • přesmyk -vodíku na nenasycenou skupinu přes 6-členný kruh. Nové radikálové místo vyvolá -štěpení


Přesmyky vodíku – McLaffertyho přesmyk • Vziklé OE+• jsou typické pro řadu funčních skupin – aldehydy, ketony, estery, kyseliny, amidy, karbonáty, fosfonáty apod.

74

100

O O 87 50

41

55

29 15 0

101 115 129

10 40 70 100 130 (mainlib) Dodecanoic acid, methyl ester


Přesmyky vodíku – McLaffertyho přesmyk

143 157

171

160

214 190

220


Charakteristické iontové série Homologické série v oblasti nízkých m/z mohou podat informace o strukturních prvcích v molekule


Charakteristické ionty Charakteristické ionty

podle M.Poláška – Škola MS


Logické neutrální ztráty Neutrální ztráty musí dávat chemický smysl. Ztráty radikálů i neutrálních molekul.


Intenzita molekulárního iontu Intenzita molekulárního iontu souvisí s jeho stabilitou. Podle intenzity lze usuzovat na přítomnost určitých strukturních prvků v molekule.


Literatura EI

Fred W. McLafferty and Frantisek Turecek: Interpretation of Mass Spectra. University Science Books (1993). ISBN-10: 0935702253, ISBN-13: 978-0935702255 Fulton G. Kitson, Barbara S. Larsen, and Charles N. McEwen: Gas Chromatography and Mass Spectrometry. Academic Press (1996). ISBN-10: 0124833853, ISBN-13: 978-0124833852

ESI APCI CI

Levsen et al.: Even-electron ions: a systematic study of the neutral species lost in the dissociation of quasi-molecular ions. J. Mass Spectrom. 42, 1024 – 1044, 2007

Alex. G. Harrison: Chemical Ionization Mass Spectrometry, CRC(1992). ISBN-10: 0849342546, ISBN-13: 978-0849342547

Základní principy interpretace spekter

Recommend Documents