Interpretace hmotnostních spekter měkkých ionizačních technik
Poznámky k interpretaci API spekter • vliv funkčních skupin na fragmentaci lze orientačně seřadit: nitrát > fosfát ~ sulfát >> sulfonová kyselina > karboxylová kyselina > hydroxy skupina > nitro skupina > halogeny > ostatní funkční skupiny • ve velké většině ionty se sudým počtem e• štěpení menšího počtu labilních vazeb ve srovnání s EI • minimum nebo absence fragmentových iontů v MS1 • fragmentace pomocí CID (MS/MS, MSn) • knihovny ESI/APCI spekter neexistují s výjimkou biomolekul a individuálních knihoven pro omezený rozsah látek
Pravidlo sudého počtu e- (Even-Electron Rule)
měkké ion.tech. 1/ OE+•
EE+ + R•
EI
OE+• + N
2/ EE+
EE+ + N
EI
OE+• + R•
1/ Fragmentace iontů s lichým počtem e- (OE+•) – mohou vznikat opět ionty s lichým počtem e- anebo se sudým počtem e2/ Fragmentace iontů se sudým počtem elektronů (EE+) přednostně vznikají opět ionty se sudým počtem elektronů - vznik kation-radikálů při fragmentaci iontů se sudým počtem elektronů vyžaduje energeticky nevýhodné rozdělení elektronového páru (popsané výjimky)
Dusíkové pravidlo Základní formulace (platí pro MR a OE+.): $ lichá MR = lichý počet dusíků v molekule $ sudá MR = sudý počet dusíků v molekule nebo bez dusíku Pro ionty EE+ přesně naopak: lichá hodnota m/z znamená sudý počet dusíků nebo bez dusíku, sudá hodnota m/z lichý počet dusíků O platí pro běžné organické prvky (C, H, N, O, F, Si, P, S, Cl, Br, I)
Počet dusíků
m/z lichá
m/z sudá
0, 2, 4, ... (sudý)
EE+
OE+.
1, 3, 5, ... (lichý)
OE+.
EE+
Dusíkové pravidlo Základní formulace (platí pro MR a OE+.): $ lichá MR = lichý počet dusíků v molekule $ sudá MR = sudý počet dusíků v molekule nebo bez dusíku Pro ionty EE+ přesně naopak: lichá hodnota m/z znamená sudý počet dusíků nebo bez dusíku, sudá hodnota m/z lichý počet dusíků O platí pro běžné organické prvky (C, H, N, O, F, Si, P, S, Cl, Br, I)
Počet dusíků
m/z lichá
m/z sudá
0, 2, 4, ... (sudý)
EE+
OE+.
1, 3, 5, ... (lichý)
OE+.
EE+
Určení molekulové hmotnosti (API-MS) 100
100
401 [M+H]+
Positive-ion APCI
MW = 400
%
Negative-ion APCI m/z = 2
399 [M-H]-
[M+Na]+ % 423 [M+K]+ 439
0
100
200
300
400
m/z
0
100
200
300
400
m/z = 22 m/z = 16 + + [M+Na] [M+K]+ [M+H] m/z = 38 m/z = 17
[M+NH4]+
m/z
Nejběžnější typy molekulárních aduktů
+ -
Obvyklé kroky při interpretace API spekter • Určení MR, ověření správnosti podle charakteristických aduktů [M+Na]+, [M+K]+, [M+NH4]+; méně často adukty s mobilní fází typu [M+H+methanol]+ nebo [M+H+acetonitril]+, výjimečně dimerní ionty typu [2M+H]+, [2M+Na]+ - většina aduktů má malou intenzitu (obvykle nejintenzivnější [M+Na]+), ale jejich význam pro potvrzení správnosti určení MR je velký, protože aduktové ionty se obvykle nevyskytují u fragmentů (jsou výjimky) - u záporných iontů kromě [M-H]- lze v závislosti na složení mobilní fáze a matrici vzorku očekávat např. [M+Cl]-, [M+CH3COO]-, [M+HCOO]-, apod. - typ a relativní intenzita aduktových iontů velmi výrazně závisí na složení mobilní fáze a obsahu solí v eluentu či vzorku • Dusíkové pravidlo • M+2 prvky: určení počtu Cl+Br, event. odhad přítomnosti S+Si • MS/MS (MSn) spektra, měření přesných hmot • Sumarizace všech získaných informací a návrh struktury • Retenční chování – ověřit soulad s návrhem struktury • Potvrzení s komerčním nebo syntetizovaným standardem
Uhlovodíky (CxHy), alkyl/aryl substituce • alkany, alkeny, alkiny, aromáty • pro alkyl substituci na aromatickém nebo obecně cyklickém systému očekávány ztráty alkenu (nebo alkanu, zejména u druhé a další ztráty pro více přítomnost více alkylů) • podobně pro aryl substituci jsou obvyklé neutrální ztráty C6H4 (m/z 76) nebo C6H6 (m/z 78) • ztráty alkyl/aryl radikálů jsou méně obvyklé, někdy se vyskytují v záporném módu (zejména pro APCI / APPI) • pro uhlovodíky bez funkčních skupin nejvhodnější APCI / APPI v kladném módu, v ESI jen pomocí tvorby aduktů (Li, Ag, Na, apod.)
Iontové funkční skupiny • orientační pravidlo - čím polárnější je funkční skupina, tím větší vliv na ionizační a fragmentační chování lze očekávat • anionické funkční skupiny (sulfát, sulfo, karboxy) - výborná ionizační účinnost a tím i citlivost v záporném módu (obecně vhodnější ESI než APCI), signál v kladném módu horší nebo žádný, částečně může vylepšit jiná protonovatelná skupina (např. NH2) • intenzivní adukty se sodným iontem (popř. K+, NH4+), typicky zasolené vzorky • kationické funkční skupiny (např. kvartérní aminy) – vynikající signál v kladném ESI módu, pozor na silné paměťové efekty (lépe se těmto látkám zcela vyhnout), signál v záporném módu obvykle neposkytuje
Více anionických funkčních skupin • často rozsáhlá fragmentace, nízká intenzita [M-H]- iontu • vznik série násobně nabitých iontů typu [M-xH]x- a jejich kombinace se sodnými adukty typu [M-(x+y)H+yNa]x• využití sérií vícenásobně nabitých iontů pro určení MW a počtu iontových skupin
Určení MW a počtu iontových skupin • série iontů [M-xH]x- a [M-(x+y)H+yNa]x• maximální pozorovaný náboj x a/nebo maximální počet vyměnitelných protonů y = počet iontových skupin
Intens. 5 x10
309.85
3
m/z 0.25 2
310.06 310.31
1
C.I. Direct Green 26 MW = 1222 5 iontových skupin
0
310.56 310.81 311.07 309.5 310.0 310.5 311.0
Intens. 5 x10
m/z
243.24
1.25
m/z 0.20
1.00 0.75
243.43 243.63
0.50
243.84 244.05
0.25
M. Holčapek, P. Jandera, J. Přikryl, Dyes Pigm., 43 (1999) 127
0.00
243.0
243.5
244.0 244.5 m/z
Funkční skupiny obsahující fosfor (31P)
Fosfor je monoizotopický
OH R O
P O O
OH R O [M-H-HPO3]-
+
P O O
OH R O H
P O O
OH (R-H) + O
P O
[H2PO4]- OH
Fosfátová skupina (ROPO3H2) • časté u biomolekul (peptidů, lipidů, cukrů) • lze měřit nejlépe v ESI-, někdy i ESI+ (fosfolipidy), labilní iontová skupina • adukty se sodným iontem a dalšími kationty • diagnostické fragmenty m/z 79 [PO3]-, 97 [H2PO4][H2PO4]-
[M-H][PO3]-
C. Antonio et al, J. Chromatogr. A 1172 (2007) 170
[M-H-H2O]-
Funkční skupiny obsahující síru (32S)
M (32S) = 100% M+1 (33S) = 0.79% M+2 (34S) = 4.4%
O R O
S O
O
R O [M-H-SO3]-
+ S O
O
O
O O
R O
S
H
O
O
(R-H) + O
S
[HSO4]- OH
O
Sulfátová skupina (ROSO3H) [HSO4]m/z 97
- SO3 (- 80)
O O S
O OH
O S
O H
O-
O H
- H2SO4 (- 98) • intenzivní adukty se sodným iontem • pro polysulfatované látky rozsáhlá fragmentace, nízká intenzita nebo absence [M-H]- iontu (opakované ztráty H2SO4 a/nebo SO3), násobně nabité ionty • ideální pro ESI-, popř. MALDI- (APCI nelze)
Vliv zavedení iontové funkční skupiny (sulfát) APCI+
APCI+
+
[M+H]
SO2NH(CH2)6OH
(alkohol) MS1
+
[M+H-NH2(CH2)6OH-SO2]
201 217
0.0
100
150
200
382
[M+H-NH2(CH2)6OH]+
265
+
[M+H-H2O]
364 250
300
350
400
MS2 of m/z 404
ESI-
-
SO2NH(CH2)2OSO3H
(sulfát)
[M-H-SO3]
324
-
[M-H-SO3-CH3CHO]
MS/MS
280
[M-H]
404
217 0.0 100
150
200
250
300
350
400
-
Sulfonové kyseliny (RSO3H)
O R
S O
O O
R [M-H-SO3]-
+
S O
O
O O
R
S O
O
R. +
.S
O
O
[SO3]-
.
Sulfonové kyseliny (RSO3H)
O S O
OH
ESI(APCI-)
- SO3 (- 80) - SO2 (- 64) O S
O-
O [SO3]-. m/z 80
• vynikající citlivost v ESI-, lze i MALDI-, pro mono- a disulfonané sloučeniny lze s horší citlivostí i APCI- a APPI• intenzivní adukty se sodným iontem • pro polysulfonované látky série násobně nabitých iontů a jejich aduktů s Na+, ale nikoliv fragmentace v MS1, proto snadné určení MW a počtu sulfo skupin • typické ztráty v MS/MS jsou m/z 80 = SO3 (někdy může poskytnout i sulfát) a m/z 64 = SO2 (naprosto charakteristické) a radikál anion m/z 80 = [SO3]-.
ESI-MS – barvivo Reactive Black 5 OH HO3SOCH2CH2O2S
• 2 sulfát • 2 sulfo • 2 azo • 1 hydroxyl • 1 amino
MW=901 [M-2H]2- = 449.5
NH2
N N
N N
HO3S
SO3H
SO2CH2CH2OSO3H
Funkční skupiny obsahující dusík (14N)
O R NH3
+ NH3 R [M+H-NH3]+
M (14N) M+1 (15N)
R C NH3
O R C [M+H-NH3]+
= 100% = 0.37%
+ NH3
Funkční skupiny obsahující dusík (14N)
Alifatické nitráty - výbušniny (RONO2) • bez aditiv úplná absence [M+H]+ / [M-H]- iontů, intenzivní fragmenty m/z 62 = [NO3]-, m/z 46 = [NO2]-, obtížně intepretovatelné adukty a fragmenty • přídavek CCl4 (nebo halogenidu, octanu, mravenčanu) – velmi charakteristická tvorba aduktů [M+Cl]-, [M+CH3COO]-, atd. u APCI
X.M. Zhao, J. Yinon, J. Chromatogr. A, 977 (2002) 59
Nitro sloučeniny (RNO2)
Nitro sloučeniny (RNO2)
• známá výjimka tvorby molekulárního radikál aniontu M-. v APCI• obecně hodně radikálových ztrát pro nitro látky: m/z 46 = NO2., m/z 30 = NO., někdy i ztráta m/z 17 = OH. • méně obvyklé ztráty m/z 31 = HNO, m/z 47 = HNO2
- NO2 (- 46)
O N
O N
-
O
O- NO (- 30) O
-O (- 16)
Nitroso sloučeniny (RNO) • ztráta m/z 30 = NO.
Dusíkaté sloučeniny • dusíkové pravidlo; dusík je obvykle místem protonace
Primární aminy RNH2 • ztráta amoniaku [M+H-NH3]+ je spíše výjimečná
Sekundární a terciární aminy R1NHR2 nebo R1NR2R3 • ionty typu [R1NH3]+ a [R2NH3]+ (na aminoskupině dochází obvykle k protonaci a přenosu vodíku při fragmentaci), analogicky [R1NH2R2]+ či [R1NHR2R3]+ ionty • vedle toho mohou být přítomny též ionty [R1NH]+ a [R2NH]+, méně časté • neutrální ztráty R1NHR2 vedou ke vzniku iontů např. [M+H-R1NHR2]+, typický příklad ztráta dimethylaminu či podobného dialkylaminu • ztráty radikálů R. méně obvyklé, nicméně v APCI- existují, např. [M-H-butyl]-.
Kvartérní aminy (R)4N+X• velice stabilní ionty [(R)4N]+ s vysokou ionizační účinností (např. tetrabutylamoniová ion-párová činidla), POZOR: velmi silné paměťové efekty!!! • záporný mód není vhodný
Azo sloučeniny – organická barviva (N2)
Azo sloučeniny – organická barviva (N2) Y + 14 Y - 14 Y N N
N N - N2 (- 28)
X X - 14
X + 14
• azo skupina je typicky doprovázené řadou dalších polárních funkčních skupin (sulfo, sulfát, karboxy, amino, atd.) v molekule barviva, které podléhají fragmentaci přednostně • zajímavá a typická je přesmyková ztráta m/z 28 = N2 (analogie EI)
ESI-MS/MS – barvivo Mordant Black 15
MW = 389 • 1 sulfo • 1 nitro • 1 azo • 2 hydroxyl
Nitrily (RCN) • neutrální ztráta m/z 27 = HCN, tato ztráta může být běžně pozorována i u dusíkatých heterocyklických sloučenin (nebo ztráta m/z 41 = acetonitril či obecně alkylnitril) a aromatických aminů, málo specifické • nepatří mezi příliš preferované fragmentační cesty, pokud je přítomna jiná polárnější funkční skupina, pak ztráta nitrilu obvykle málo významná
N-oxidy • labilní vazba s iontovým charakterem, tato část molekuly bývá často primárním místem štěpení • příklad: skupina N,N-dimethylaminooxid vznikající metabolizmem dimefluronu se primárně štěpí, čímž lze identifikovat místo oxidace v metabolitu • pozorovaná preference tvorby aduktů s chloridem [M+Cl]- v záporném ESI módu (pro malé množství dat není jasné, zda lze zobecnit)
Halogeny (19F, 35Cl, 79Br, 127I)
R X H
+ X H R [M+H-HX]+
Halogeny – monoizotopické 19F a 127I • monoizotopické prvky jsou oblíbené pro kalibrační směsi • obecně ve spektrech ztráty HF (20) nebo HI (128), ale ztráta HF vůbec nemusí být pozorována (zejména v případě substituce F na aromátu) a přítomnost F se pozná pouze podle zvýšení MW o 18 (MW = F – H = 18) • ionty m/z 19 [F]- nebo m/z 127 [I]- mohou být důležité diagnostické ionty při záznamu záporných iontů (MS nebo lépe MS/MS), pozor na nastavení m/z rozsahu (m/z 19 lze spolehlivě diagnostikovat na kvadrupólu, IT nelze) • pro polyfluorované nebo perfluorované sloučeniny opakované ztráty HF, F2 nebo F., což může vést k poklesu intenzity [M+H]+ / [M-H]- iontů, tento typ látek se měří spíše na GC/MS; typické ionty m/z 69 [CF3]+ pro perfluorované látky, m/z 113 [CF3COO]- pro kyselinu trifluoroctovou a její deriváty • přítomnost jódu v molekule je natolik neobvyklá, že je většinou očekávána předem na základě předběžných informací
Halogeny – Cl, Br Cl
100%
Poměr izotopů 32%
H - HCl (- 36)
35
36
35Cl
n * Cl = (3a + b)n
37 m/z
Poměr izotopů
Br
79Br
H - HBr (- 80)
: 37Cl = 3 : 1
: 81Br = 1 : 1
n * Br = (a + b)n 79
80
81 m/z
• pro poly- a perhalogenované sloučeniny opakované ztráty HX nebo X. (zejména Br.), což vede k výraznému poklesu [M+H]+ či [M-H]- iontů
Funkční skupiny obsahující kyslík (16O)
H R O O H
H
H R O
R O O H
+ O H
[M+H-H2O]+
R
+
[M+H-H2O2]+
H R O H
H
H R
+
[M+H-H2O]+
O H
O O H
Funkční skupiny obsahující kyslík (16O)
Methoxy skupina M (16O) = 100% M+1 (17O) = 0.04% M+2 (18O) = 0.2%
H R O CH3
H R
+
O CH3
[M+H-CH3OH]+
H R O CH3
H R O. [M+H-CH3]+
+ .
.CH
3
Karboxylové kyseliny (RCOOH)
O H R C O H
O R C [M+H-H2O]+
H
O
+ O H
R C O
O R
+ C O
[M-H-CO2]-
Karboxylové kyseliny (RCOOH) O C OH
APCIESI-
O C O
- CO2 (- 44)
• lze použít záporný mód všech API technik i MALDI, v případě dalších funkčních skupin možný i záznam kladných iontů • naprosto charakteristická ztráta m/z 44 = CO2, může být intenzivní již v MS1, typické pro záznam záporných iontů, často i v kladném módu (další ztráty H2O, CO, H2O+CO), u alifatických kyselin ztráta CO2 méně výrazná • v oblasti nízkých m/z může být pozorován ion m/z 44 [CO2]-, jiné ztráty nejsou • polykarboxyláty (nebo kombinace karboxy + sulfo skupin) tvoří aduktové ionty záměnou kyselých protonů za sodné ionty podobně jako sulfo kyseliny _______________________________________________________________________________________________________________________________
• falešná interpretace m/z 44 téměř vyloučena, jediná možná záměna je ztráta radikálu NH2CO. pro dusíkaté heterocykly obsahující karbonylovou skupinu, avšak tato ztráta nebývá jednotně 44 v obou módech polarity, ale doprovázena m/z 43 = NHCO
Kyslíkaté sloučeniny • ztráta vody m/z 18 - teoreticky možná téměř pro všechny kyslíkaté sloučeniny – diagnostická hodnota je malá, nutno posuzovat i intenzitu iontu • alifatické alkoholy – velice intezivní ztráta vody již v MS1, v APCI většinou 100% intenzitu již v MS1 (často i v ESI), v MS/MS ion [M+H-H2O]+ opět převládá • fenoly a chinony – ztráta vody může být patrná, ale oproti alkoholům nižší relativní intenzita, někdy ztráta radikálu OH. (např. nitro látky), přesmyková ztráta m/z 28 = CO • polyhydroxylované sloučeniny (např. cukry) – nutné použít ESI, opakované ztráty vody, pokles intenzity [M+H]+ / [M-H]• ketony - analogicky -štěpení u EI vznikají [R1CO]+ a [R2CO]+, někdy též ztráta vody [M+H-H2O]+ s velmi malou intenzitou • aldehydy – ztráta CO pozorovaná v obou módech polarity (nespecifické, běžné např. pro karbonyl v cyklické struktuře), někdy ztráta m/z 30 = HCOH • estery – při absenci dalších funkčních skupin vhodnější záznam kladných iontů, typická ztráta alkoholu R2OH z esterové funkční skupiny R1COOR2 (např. ztráta methanolu u methylesteru) následovaná ztrátou CO, dále vznik karbonylových iontů [R1CO]+ • obecně výrazné analogie s EI, zejména při použití APCI
Shrnutí vlivu funkčních skupin na fragmentaci
K. Levsen et al., J. Mass Spectrom.,42 (2007) 1024
Obecný postup HPLC/MS/MS identifikace (analýza metabolitů, přírodních extraktů, syntetických produktů) A/ Hlavní (cílová, výchozí, parentní) látka – struktura známá, dostatečné množství standardu - změření a detailní interpretace „všech možných“ MS experimentů, lze využít i přímé infúze (různé ionizační techniky, obě polarity záznamu, různé typy analyzátorů, chromatografické chování, UV spektra z PDA detektoru) Cíl: a) znalost chování hlavní látky při ionizaci, fragmentaci a HPLC retenci kvůli uplatnění analogie pro identifikaci „vedlejších“ látek (metabolitů, meziproduktů, nečistot, minoritních složek, atd.) b) volba optimálních podmínek pro vlastní analýzu vzorku B/ Standardy „vedlejších“ látek – pokud jsou k dispozici, provést vše viz A/ C/ HPLC/MS analýza – vzhledem ke komplexnosti uvedených typů vzorků není vhodné vynechání separačního kroku, jinak ztráta informace - volba HPLC podmínek – optimalizace separace, MS kompatibilní podmínky - měřit oba módy polarity, podle charakteristických iontů určení MR všech hlavních složek a maximálního počtu minoritních píků - ověřovat a rozlišovat koeluce pomocí rekonstrukce iontových proudů (RIC)
Obecný postup HPLC/MS/MS identifikace D/ HPLC/auto MS/MS – experimentálně lze provést zároveň s C/ HPLC/MS - interpretace následně po určení MR z HPLC/MS - optimální volba podmínek (práh citlivosti „threshold“), počet iontů pro kolize, kolizní energie, exkluze iontů, ukončení exkluze, atd.) by měla zajistit změření MS/MS spekter pro všechny píky včetně koelucí, obvykle pro ionty [M+H]+ nebo [M-H]-, možnost interaktivní úpravy nastavení v průběhu analýzy - ne vždy se podaří, obtížné nastavení u koelucí, chvostování píků, stopových složek (D2/ HPLC/manuální MS/MS - dodatečné experimenty v případě chybějících důležitých MS/MS spekter, nutnosti doměření MS3 či „in-source“ CID +MS2) E/ Měření přesných hmot – pomocí QqTOF, Orbitrap, FTICR, určení elementárního složení pro prekurzorové i produktové ionty (kalibrace, <3 ppm) F/ Sumarizace a korelace všech dostupných dat – retenční chování, UV spektra z PDA detekce, určení MR, interpretace MS/MS spekter, další spektrální informace + základní chemický cit = návrh struktury (nebo aspoň její části) G/ Ověření návrhu struktury pomocí identického standardu
HPLC/MS/MS identifikace nečistoty Acid Red 118 UV chromatogram
Nečistota 100%
12.72
8.00
Int.
Time [min]
ESI spektrum nečistoty v záporném módu
MR=512
[M-H]-
ESI spektrum Acid Red 118 v záporném módu
MR=28
[M-H]-
MR=540
HPLC/MS/MS barviva a nečistoty -SO2 (186) 250 H
H3C
IDENTICKÉ
H2N
N N 237
N O2S CH2 CH3
HO 355 -N2 (327) -SO3 (275) 459
80
SO3-
IDENTICKÉ
-SO2 (186) 250 H
H3C
H2N
N N 237
HN O2S
HO
355 -N2 (327) -SO3 (275)
80 431
SO3-
Identifikace produktů syntézy Výchozí látka
Očekávaný produkt CN
Cl N
N
N N
Cl
m/z 129
N N
CN
m/z 207 (OE+.) +H = m/z 208 (EE+)
Zadání syntetika: Potvrdit strukturu očekávaného produktu syntézy. Cíl servisních měření: Co nejrychleji a nejsnadněji dát jasnou odpověď na otázku. Volba MS podmínek: 1/ Ionizační technika? Polarita záznamu? 2/ Separace? 3/ Měření přesných hmot?
Identifikace produktů syntézy 516 [M+H]+
[M+H]+ 682
[M+H]+ 507
[2M-2H-HCl]2- 496
M-.
506
M-. 681
Identifikace produktů syntézy 228
MS/MS = 682 N
N N
200
682
480 228
MS/MS = 516 N
480
200
N N
516
228
MS/MS = 507 N
N N
200
Cl
507
CN
Identifikace produktů syntézy Výchozí látka
Očekávaný produkt CN
Cl N
N
N N
Cl
Produkt 1
N
N
CN
Produkt 2
N N
N
N CN
Produkt 3
N N
N Cl
N N
ESI-MS/MS analýza peptidů Schéma značení fragmentových iontů peptidů
z3
y3
x3 z2
R1 O H2N
C
R2 O
C
H a1
y2 x2 z1
b1
N
C
H
H c1
C
y1
x1
R3 O N
C
H
H
a2 b2 c2
C
R4 N
C
H
H
a3 b3 c3
(typická písemková otázka)
COOH
ESI-MS/MS spektrum peptidu Série iontů typu „b“ a „y“
Metabolismus xenobiotik •
•
Základní funkce metabolismu xenobiotik (látky cizí organismu – léčiva, pesticidy, kontaminanty, atd.) je transformace na derivát s vyšší rozpustností ve vodě, který může být snáze eliminován z těla Metabolismus xenobiotik má dva základní kroky: I. fáze – reakce funkčních skupin II. fáze – konjugační reakce II. fáze
I. fáze H
OH
OSO3H
Experimentální přístup •
HPLC/MS v obou módech polarity, správná volba ionizační techniky
•
Určení molekulové hmotnosti: I. fáze – APCI, ESI, APPI, II. fáze – ESI
•
Identifikace metabolitů je založena na interpretaci MS/MS spekter, retenčního chování, UV spekter z PDA detektoru, popř. informací z dalších spektrálních technik
Defekty atomových hmotností Element
Nominal atomic mass [Da]
Mass defect [mDa]
H
1
+7.8
C
12
0
N
14
+3.1
O
16
-5.1
F
19
-1.6
Si
28
-23.1
P S
31 32
-26.2 -27.9
Cl
35
Br I
Nejběžnější metabolické reakce I. fáze Nominal mass shift [ΔDa]
Metabolic reaction (elemental composition change)
Exact mass shift [mDa]
-44
Decarboxylation (-CO2)
+10.2
-31.1
-18
Alcohol dehydration (-H2O)
+10.6
79
-81.7
-14
Demethylation (-CH2)
-15.7
127
-95.5
-2
Ring formation (-H2)
-15.7
+2
Ring opening (+H2)
+15.7
+14
Hydroxylation and cyclization (+O-H2)
-20.7
Hydroxylation (+O)
-5.1
Epoxidation (+O)
-5.1
Oxidation (+O)
-5.1
Epoxidation and hydration (+H2O2)
+5.5
+16 +34
Nejběžnější metabolické reakce II. fáze Nominal mass shift [ΔDa] +14
Conjugation reaction (elemental composition change)
Drug functional group
Methylation (+CH2)
NH2, OH, SH
Exact mass shift [mDa] +15.7
+42
Acetyl conjugation (+C2H2O)
NH2, NHNH2, SO2NH2, OH
+10.6
+57
Glycine conjugation (+C2H3ON)
COOH
+21.5
+79
Phosphorylation (+PO3)
OH
-41.5
+80
Sulfation (+SO3)
NH2, SO2NH2, OH
-43.2
+162
Glucosylation (+C6H10O5)
OH, COOH
+52.8
+176
Glucuronidation (+C6H8O6)
OH
+32.1
+220
Indirect carbamate glucuronidation of amines (+C7H8O8)
NH2 + CO2
+21.9
+306-X
Glutathione conjugation – halide substitution (-X+C10H16O6N3S)
Halide (X)
+76.0
+305
Glutathione conjugation via epoxidation (+C10H15O6N3S)
Aromatic
+68.2
• V review celkem popsáno 54 metabolických reakcí I. fáze a 25 reakcí II. fáze M. Holčapek, L. Kolářová, M. Nobilis, Anal. Bioanal. Chem, 216 (2008) 1962
Metabolismus dimefluronu Dimefluron (DMF) - 3,9-dimethoxy-5-(2-dimethylaminoethoxy)7H-benzo[c]fluoren-7-one-hydrochlorid • potenciální antineoplastikum • vzorky: krysí výkaly OCH3 H3C N CH 3 H3CO
O O
P. Císař et al., J. Pharm. Biomed. Anal., 37 (2005) 1059
DMF MW = 377
OCH3
I.S. MW = 391
OCH3 H3C
CH3
N CH 3
N H3CO
O
H3CO
CH3
O O
O OH
1 MW = 349
H3C
4
OCH3
MW = 379
H3C N H
N CH 3
O
2 MW = 363
O
H3CO
O
HO
N-desmethyl DMF
3,9-O-desmethyl DMF OH H3C
O
5
OCH3
MW = 363
N CH 3
N CH 3 O
H3CO
O
H3CO
3-O-desmethyl DMF
O
O
DMF N-oxid OCH3
OCH3
3 MW = 363
H3C
6
MW = 393
H3C N CH 3
N CH 3 O
HO O
O
H3C
9-O-desmethyl DMF
O
H3CO H OH
redukovaný DMF
DMF (ESI-MS a MSn) ESI+
OCH3
[M+H]+
H3C N CH 3 O
H3CO O
[M+Na]+ [M+K]+
MW = 377
ESIžádný signál MS3 (378-333)
MS2 (378)
[333-CO]+ [378-CH3NHCH3]+
378
[333-H2O]+
9-O- or 3-O-desmethyl DMF
MW = 363
OH H3C N CH 3
ESI+
O
H3CO
[M+H]+
ESI[M-H]-
O
[M+Na]+ [2M-H]-
[M+K]+
MS2 (362)
MS2 (364) [364-CH3NHCH3]+
[362-(CH3)2NCH2CH2]-• [362-(CH3)2NH]-
364 shodná spektra pro 3,9-O-desmethyl DMF (MW = 349)
N-desmethyl DMF ESI+ [M+H]+
OCH3 H3C N H O
H3CO
[2M+H]+
O
MW = 363
MS2 (364)
ESI[364-CH3NH2]+ [364-CH3NHCHCH2]+ 364
žádný signál
Redukovaný DMF OCH3 H3C N CH 3
ESI+
O
H3CO H OH
[M+H]+
ESI[M-H]-
MW = 379 [M+Na]+
MS2 (378)
MS2 (380) [380-H2O]+ [362-(CH3)2NCHCH2]+ [362-CH3NCH2]+
[378-CO][378-(CH3)2NCH2CH2]-• [306-CO]- [350-CH3OH]-
[319-CH2O]+
380
378
UV spektra Redukovaný DMF
DMF
OCH3
OCH3
H3C
H3C
N CH 3
N CH 3 O
H3CO
O
H3CO
H OH
O
mAU
mAU
1500
1000 800
1000
600 400 500
200
200
250
nm
300
350
200
250
300 nm
350
HPLC/ESI-MS Standardy ESI+ 3,9-O-
1
ESI-
1 - MW = 349 DMF 8 I.S. 2 - MW = 363 7 6 3-O4 3 - MW = 363 9-O3 2 4 - MW = 379 5 5 - MW = 363 6 - MW = 393 2 7 - MW = 377 N-oxid 8 - MW = 391 N-desmethyl redukovaný
1
3 6
HPLC podmínky: 0 min – 40%, 20 min - 80% acetonitril / 5 mM CH3COONH4 ve vodě (pH=3), kolona Supelco Discovery (250x4 mm), F=1ml/min, T=30°C.
HPLC/ESI-MS Vzorky ESI+
7 8 16.6 min 1 3 26
ESI-
1 45
3
2
metabolity II. fáze ionty: [M+Na]+, [M-H2O+H]+, atd., sudé MW adukty s glycinem nebo kyselinou glukuronovou
metabolity I. fáze
od tr = 16 min
MW = 363
3 2 6
N-oxid DMF
(zvětšená oblast metabolitů I. fáze od tR=16 min) DMF I.S. ESI+ 7 8 = 379
4 5
MW = 391
MW = 377
= 363 MW = 393
N-desmethyl DMF MW
redukovaný DMF MW
3-O-desmethyl DMF
1
9-O-desmethyl DMF
MW = 349
3,9-O-desmethyl DMF
HPLC/ESI-MS a MS/MS
OH
MS2
[M+H]+
H3C
NH2CH3
N H O
H3CO
-31
10
O
CH2CHNHCH3 -57
MW = 349
3-O-desmethyl N-desmethyl DMF
CH2NCH3 -43
3,9-O-
1
9-O-
3
7 DMF 8 I.S.
N-desmethyl 3-O- redukovaný
N-oxid
6
2
9
4 5
OCH3
[M+H]+
13
H3C N H
MW = 379
NH2CH3
O
H3CO
-31
MS2
H OCH3
CH2CHNHCH3 -57
[M+H]+
O-methyl redukovaný N-desmethyl DMF
CH2NCH3 -43
3,9-O-
9-O-
1
3
11
10
7 DMF 8 I.S.
N-desmethyl 3-O- redukovaný
N-oxid
6
2
9
4 5
Metabolismus dimefluronu OH
1
OCH3
3
H3C
O
O
HO
MW = 349 3,9-O-desmethyl DMF
O
MW = 363 H OH MW = 365 9-O-desmethyl DMF reduk. 9-O-desmethyl DMF OCH3
O
H3CO
MW = 363 3-O-desmethyl DMF
O
OH
MW = 377
4 O
MW = 365 reduk. 3-O-desmethyl DMF
O
MW = 379 N-desmethyl DMF
MW = 349
O
O
3-O-desmethyl N-desmethyl DMF
13
MW = 363 DMF N-oxid OCH3 H3C
N H O
HO
11
O
O
O
H3CO
H3C
N H
O
H3C
N CH 3
OCH3
OH
10
OCH3
5
H3C
H3CO
H OH
H3CO
MW = 393 reduced DMF
H OH
N H
O
H3C
O
H3CO
DMF
N CH 3
MW = 349
N CH 3
OCH3 H3C
H3CO
H3C
N CH 3
O
14
6
H3C
N CH 3
O
O
HO
H3C
H3CO
N CH 3
OCH3
OH
2
H3C
N CH 3
O
HO
15
H3C
N CH 3
OCH3
N H H3CO
O
9-O-desmethyl MW = 365 H OH N-desmethyl DMF reduk. N-desmethyl DMF
