Využití Sequence Capture v diagnostice svalových onemocnění

Využití Sequence Capture v diagnostice svalových onemocnění

Kristýna Stehlíková Daniela Skálová Lenka Fajkusová

Centrum molekulární biologie a genové terapie IHOK, FN Brno Sekce vrozených genetických poruch

Diagnostika svalových onemocnění - postižení kosterního svalstva Neuromuskulární onemocnění – vzácná onemocnění (<1:2000), která postihují některou z částí neuromuskulárního systému: - svaly, periferní nervy, spojení mezi nervy a svaly, motorické neurony - Všechna onemocnění jsou progresivní, vedou ke svalové slabosti a úbytku svalů - Nástup onemocnění – od narození až do pozdějšího věku - Délka přežití - různorodá

- Pacienti často trpí respiračními a srdečními obtížemi - Výsledná svalová slabost vede ke křečím, ztuhlosti, deformitám kloubů a chronické bolesti

Diagnóza svalové dystrofie je založena na klinických nálezech, EMG, MR, výsledcích svalové biopsie, biochemických nálezech (zvýšená hodnota kreatin fosfokinázy)

IH: Normální exprese α-dystroglykanu v kontrolní vzorku

IH: Sekundární deficit α-dystroglykanu v LGMD2I

1. Fenotypové projevy neuromuskulárních chorob mohou být společné pro nemoci asociované s mutacemi v různých genech a často nelze rozlišit, o jaký konkrétní typ svalové dystrofie se jedná. 2. Mutace v jednom genu → různé fenotypové projevy → u pacienta je vyšetřováno několik genů → bez detekované mutace možnosti: Sangerovo sekvenování dalších genů – časová a finanční náročnost jiná metoda – NGS + Sequence Capture

Vybrané nemoci (geny): - Duchennova svalová dystrofie (gen DMD) - Emery-Dreifussova svalová dystrofie (geny EMD, FHL1, LMNA) - pletencové svalové dystrofie, dominantní (geny MYOT, LMNA, CAV3) - pletencové svalové dystrofie, recesivní (geny CAPN3, DYSF, SGCG, SGCA, SGCB, SGCD, TCAP, TRIM32, FKRP, TTN, POMT1, ANO5, FKTN, POMT2, POMGNT1) - kongenitální svalové dystrofie (LAMA2, LARGE, SEPN1, COL6A1, COL6A2, COL6A3, ITGA7, DNM2) - kongenitální myopatie, distální myopatie, and další myopatie (NEB, TPM3, ACTA1, TPM2, TNNT1, CFL2, RYR, MTM1, BIN, CRYAB, DES, LAMP2, PABPN1)

42 genů, 1020 exonů V případě analýzy všech exonů a přilehlých intronových oblastí vybraných genů je potřeba sekvenovat cca 300 000 bází na pacienta.

Sequence Capture 1. Třídenní hybridizace + sekvenování GS Junior 2. Double capture + sekvenování GS Junior

3. Double capture + sekvenování MiSeq

NimbleGen SeqCap EZ Library LR User’s Guide

SeqCap EZ Library SR User’s Guide

Příprava knihovny

NimbleGen SeqCap EZ Library LR User’s Guide

SeqCap EZ Library SR User’s Guide

1. Štěpení gen. DNA (nebulizace, sonikace) 2. Fragment End Polishing 3. Ligace Adaptorů 4. Odstranění krátkých fragmentů 5. Pre-Captured LM-PCR 6. Hybridizace – 3 dny double capture – hybridizace přes noc, PCR, hybridizace přes noc

7. Odstranění nenavázaných úseků DNA – SeqCap EZ Capture Beads Streptavidin Dynabeads 8. Post-Captured LM-PCR 9. Přečištění 10. Kontrola knihovny

Sekvenování GS Junior

NimbleGen SeqCap EZ Library LR User’s Guide

1.Třídenní hybridizace 2. Double capture protokol

Příprava knihovny před hybridizací – štěpení + 1 den Příprava vzorku pro sekvenování – 1,5 dne

Třídenní hybridizace – 3 pacienti – coverage: 20x - 95%; 100x - 12% ready v cílové oblasti: 58 %; prům.coverage: 70x 2 dvojice pacientů v hybridizační reakci: ready v cílové oblasti: 40 % – nedostatečná coverage → nutno sekvenovat 2x Double capture protokol – 2 pacienti – coverage 20x – 95;94 %; 100x – 53;63 %

ready v cílové oblasti: 89;90 %; prům.coverage: 107x;126x 12 dvojic pacientů v hybridizační reakci: coverage 20x – 65 %; 100x – 5 % ready v cílové oblasti: 83 %; prům.coverage: 33x Sekvenování GS Junior – DNA: wells – 0,3:1 Passed Filter Wells: 144 000 – 217 000

Sekvenování MiSeq Double capture protokol

SeqCap EZ Library SR User’s Guide

Příprava knihovny před hybridizací – štěpení + 1 den

Příprava vzorku pro sekvenování – 0,5 dne

1. sekvenační běh – 24 pacientů – 6 pacientů v jedné hybridizační reakci coverage: 20x - 99%; 100x - 95%

ready v cílové oblasti: 98 %; prům.coverage: 393x Smíchání před hybridizací – koncentrace knihovny (Nanodrop) Smíchání před sekvenací -

qPCR -KAPA quantification kit, Roche lightcycler II

- Mgr. Filip Párdy (CEITEC MU)

Vyhodnocení – SeqPilot (JSI medical systems)

Dosud: 57 pacientů – 27 s uzavřeným výsledkem

Library LR + GS Junior

Library SR + MiSeq

Obsah GC párů – 70,5 %

Poděkování Roche Dr. Jaroslav Vohánka Dr. Xavier Miró Dr. Viktor Horváth CEITEC MU Brno Centrální laboratoř - Genomika Dr. Boris Tichý Mgr. Filip Párdy Mgr. Nikola Tom

Děkuji za pozornost