Postavení sekvenační analýzy v diagnostice infekčních onemocnění Bolehovská R., Plíšková L., Ryšková L. ÚKBD a ÚKM LF a FN Hradec Králové FONS 2010 20. - 21. 9. 2010
Význam určení původce infekce
základní cíl mikrobiologie (molekulární biologie extrahumánní genom) – správná identifikace původce infekce
etiologie infekčního onemocnění, zánětu
volba antibiotické terapie, její délky –
20 až 25 % antibiotické empirické terapie je nasazeno nesprávně – negativní důsledek pro prognózu pacienta ⇒ urychlení dg. infekce
rozhodnutí, zda nalezená bakterie je skutečnou příčinou zánětu, onemocnění nebo je pouze kolonizujícím či kontaminujícím mikroorganizmem
Metodické přístupy
specifické PCR - cílená diagnostika, využití specifických primerů,
event. sond pro detekci konkrétní bakterie, houby, viru - využití specifických primerů (PCR) s následnou sekvenací pro hledání mutací (precore mutanta HBV, rezistence u HBV, CMV …)
broad-range PCR - primery z univerzálních oblastí
- bakterie - 16S rRNA, ITS (16S a 23S rRNA), 23S rRNA - fungi – 18S rRNA, ITS (ITS1 – 18S rRNA a 5.8S rRNA; ITS2 – 5.8S rRNA a S rRNA), 28S rRNA
Specifické PCR
klinik (event. mikrobiolog) očekává určitého původce rychlejší, lacinější, citlivější - diagnostika původců bakteriálních meningitid – NM, SP, SA, LM… - průkaz DNA Mycobacterium TBC komplex - pneumonie (obraz HRCT) – cílená detekce ASP, PC atd. Metody – PCR (+ modifikace), rtPCR, multiplex PCR – často komerční panely pro detekci původců BM, atyp. pneumonií apod.
Specifické PCR
Př. bakteriální meningitidy – proč? - rychlost, event. změna ATB - negativní mikrobiologický výsledek - konfirmace nejasného výsledku 7 nejčastějších původců: Ö Streptococcus pneumoniae (asi 37 %) Ö Neisseria meningitidis (asi 32 %) Ö Haemophilus influenzae b Ö Listeria monocytogenes (asi 10 %) Ö Staphylococcus aureus (asi 5 %) Ö Escherichia coli Ö Streptococcus agalactiae
-
-
70 % BM objasněno (kultivačně nalezen původce) 30 % ne, vyšetření PCR
⇒ objasnění dalších 11 % infekcí
Diagnostika infekcí
průkaz bakteriální, fungální DNA X virová DNA nelze
- možnost detekce živý i mrtvých (event. dezintegrovaných) mikroorganizmů - hledání bakteriálního, fungálního původce
využití PCR metod
- rychlost (BM, sepse, ..) - pomalu nebo obtížně kultivovatelné bakterie (Mycobacterium, Tropheryma whippeli, ……) - infekce s negativní kultivací nebo růst bakterií potlačený ATB terapií – hledání původce při zaléčených komunitních infekcích (artritidy) - bakterie rostoucí na cizorodém materiálu (biofilmy)
Broad-range PCR - ÚKBD izolace DNA amplifikace bakteriální DNA (primery z oblasti 16S rRNA) nebo fungální DNA (primery z oblasti 18S rRNA (event. ITS) nebezpečí kontaminace - rozdělení prostorů a vybavení laboratoře, provedení izolace (laminár. box, dezinfekce, UV světlo) - edukace personálu (rukavice, oblečení) - kontrola a ochrana činidel před kontaminací (tzv. čisté chemikálie, zejm. polymerázy – Molzym) - příprava PCR směsí – box, UV světlo
Broad-range PCR - ÚKBD ELFO ⇒ při pozitivitě sekvenační analýza ⇒ (detekční prostor) - čištění PCR produktu - sekvenační PCR (s F nebo R primerem) - čištění po sekvenační PCR - sekvenace – přístroj ABI 3130 - vyhodnocení
Vyhodnocení Vyhodnocení zjištěné sekvence automaticky pomocí 3 databází přístupných na internetu - BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) - RDPII (Ribosomal Database Project) - SepsiTest™ BLAST (Identification by 16S/18S rDNA Sequence Analysis) Nezastupitelná role mikrobiologa !!! FASTA formát:
TCTGGTATCCCCCACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGACCCGGGAACGTAT TCACCGCAGTATGCTGACCTGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGCACTCGAGTTGCA GAGTGCAATCCGGACTACGATCGGTTTTCTGGGATTGGCTCCACCTCGCGGCTTGGCTA CCCTCTGTACCGACCATTGTATGACGTGTGAAGCCCTGGTCATAAGGGCCATGAGGACT TGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCATTAGAGTGCCCAACTA AATGATGGCAACTAATGACAAGGGTTGCGCTCGTTGCGG
Broad-range PCR
krevní sepse – přibl. 25 bakteriálních a fungálních původců je zodpovědných za 90 % sepsí - hemokultivace – zlatý standard, nižší cena - PCR – rychlost, ale krev je velmi problematickým materiálem (načasování odběru!!) - komerčních testů - (SeptiFast Roche, Sepsis ID (1-5) Seeplex, atd.) – multiplex PCR - broad-range PCR - bakteriální DNA ANO/NE, poté dourčení původce sekvenační analýzou (komerční – SepsiTest Molzym nebo in-house metoda)
Kazuistika č. 1 28-letý pacient - 19. 4. v odpol. hod. přijat na infekční kliniku – dg. A399 meningokokové infekce, odběr krve – PCR, HK + aglutinace (negat. NM, HI, SP) - 20. 4. dopoledne překlad na KARIM, dg. A403 septikémie – CRP 322 (6h), 364 (12h), odběr moči - specif. PCR NM, SP - negativní - provedena detekce bakteriální DNA v krvi, moči ⇒ pozitivní, 21. 4. provedena sekvenace s výsl. Streptococcus suis, nasazena cílená ATB - kultivace – obtížná, později narostlo několik kolonií Str. suis - 3.5. propuštěn
Broad-range PCR
biofilmy - často dlouhodobá ATB terapie ⇒ PCR diagnostika zásadní pro nalezení původce - dg. endokarditid na chlopenních náhradách - periprotetické infekce - infekce drenážních likvorových systémů
další vhodné materiály – punktáty kolene, plodové vody atd.
- při podezření na určitou bakterii – specifická PCR - neví se, jakého původce očekávat - bakteriální DNA, při pozitivitě následná sekvenační analýza
Kazuistika č. 2, 3
68-letý pacient - dg. I330 akutní a subakutní infekční endokarditida - materiál: aortální chlopeň (9.3.) - ÚKM – kultivace - aerobní negativní, anaerobní 16.3. kmen k doručení (Enterococcus faecalis) - PCR + sekvenace – mat. na vyšetření z ÚKM ⇒ 12.3. výsledek: Enterococcus faecalis 69-letý pacient (překlad z Nem. Chrudim) - dg. I339 akutní endokarditida - materiál: aortální chlopeň (2. 9.) - ÚKM- kultivace – negativní - PCR + sekvenace – duální infekce, specif. PCR – SA;
pravděp. enterokok
Kazuistika č. 4 41-letá pacientka - od 11/09 bolesti v laterální části levého stehna bez úrazu, od vánoc zhoršování, výrazná bolestivost – Nem. Litomyšl - MRI – suspekce na tumor - 15.1.2010 odeslána na ortop. kliniku FN HK (2M od začátku obtíží) – CRP 554 mg/l, zhoršení stavu, sepse - provedena revize – nález mohutných abscesů okolo femuru a osteomyelitidy, provedena trepanace, proplachová drenáž, nasazena ATB - 1. den po operaci přeložena na KARIM (zhoršení vitál. fcí) - kultivace (17.1.) – G- vláknité tyče, změna ATB (i na anaeroby) - gynekolog. vyšetření – dlouhodobě přesluhující nitroděložní tělísko – extrakce neúspěšná
Kazuistika č. 4 41-letá pacientka
- stomatol. vyšetření – veškerá dentice kariézní – extrakce zubů - komplikace – hluboká žilní trombóza - progrese septického stavu – materiál absces (+ hnis) - ÚKM - nepotvrzeny nokardie a aktinomycety, kult. 3 kolonie, které dále nerostou, nelze dourčit - PCR – TBC + atyp. negat., PCR+sekvenace – Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum ⇒ změna ATB, zlepšení stavu, překlad na chir. JIP Litomyšl, stav se postupně upravil - konec 08/10 – zpět na ortop. klin. – zlomenina femuru v místě pův. trepanace – z femuru odebrány vzorky – ÚKM kult. negat., PCR + sekvenace – Fusobact. nucleatum ⇒ ATB
Kazuistika č. 5 11-letý pacient - příjem na ortop. kliniku s dg. M0080 artr. a polyartritida způsobená jinými urč. bakteriemi, mnohočetné lokalizace - 11.6. – odběr materiálu – hnis z rány, punktát kolene ÚKM – anaerobní negat., aerobní kultivace pozitivní (netypické růst, obtížné dourčení bakterie – pravděpodobně Eikenella nebo Kingella) ⇒ kmen zaslán na PCR+sekvenace – dourčena Eikenella corrodens - původ infekce – poúrazová artritida infekčního původu – skákání na trampolíně, kdy si chlapec zarazil zuby do kolene
Závěr Využití širokospektrých PCR se sekvenační analýzou v průkazu bakteriálních nebo fungálních původců infekcí má/bude mít své opodstatněné zastoupení, které se ale nesmí přeceňovat – limitace (identifikace klinicky významného patogena???) Při využití těchto technik hraje velmi důležitou roli správná interpretace výsledků, kde svou nezastupitelnou roli má mezioborová spolupráce zejména s mikrobiologem, event. klinikem.
Děkuji za pozornost
