Význam sekvenační analýzy v mikrobiologické diagnostice Plíšková L., Kutová R., Bolehovská R., Ryšková L. ÚKBD, ÚKM FN Hradec Králové FONS 2012
Široké použití v mikrobiologii • Identifikace mikroorganizmů (bakterie, houby)
kultivace
• Vyhledávání mutací spojených s rezistencí a léčbu (antivirotika – CMV, HSV, HBV, HCV, HIV…; antibiotika – MRSA…) • Epidemiologie • Identifikace nových virů ⇓
Identifikace mikroorganizmů Provádění specifických PCR reakcí - cílená diagnostika, využití specifických primerů umožňujících detekci konkrétní bakterie Provádění broad-range – širokospektré, panbakteriální, panfungální PCR s následnou sekvenací dle Sangera - primery z oblasti 16S rRNA (18S) společné všem bakteriím (houbám) - spektrum obdobné jako při mikroskopii nebo kultivacích!! „nahrazuje“ ji v případech, kdy kultivovat nelze
Sekvenační analýza Využití v diagnostice mikroorganizmů - často dlouhodobá ATB terapie ⇒ PCR diagnostika zásadní pro nalezení původce - biofilmy - dg. endokarditid na chlopenních náhradách - periprotetické infekce - infekce drenážních likvorových systém tkáně, punktáty (kolene), abscesy plodová voda, likvor atd. krev??? moč???, BAL???
PCR/sekvenace • • • • •
Extrakce DNA, PCR, gelová elfo Čištění PCR produktu po PCR Sekvenační PCR s forward/reverse primerem Čištění po sekvenační PCR před vlastní sekvenací Sekvenace (ABI 3130) – kapilární elektroforéza Sekvence ve FASTA formátu
TCTGGTATCCCCCACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGACCCGGGAACGTATTCACCGCAG TATGCTGACCTGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGCACTCGAGTTGCAGAGTGCAATCCGGACTA CGATCGGTTTTCTGGGATTGGCTCCACCTCGCGGCTTGGCTACCCTCTGTACCGACCATTGTATGACG TGTGAAGCCCTGGTCATAAGGGCCATGAGGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCG GCAGTCTCATTAGAGTGCCCAACTAAATGATGGCAACTAATGACAAGGGTTGCGCTCGTTGCGG
• Zhodnocení
Analytické hodnocení výsledku • Hledá se shoda s referenčními sekvencemi bakterií FASTA formát získané sekvence se vkládá do 3 databází volně přístupných na internetu - BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) - RDPII (Ribosomal Database Project) - SepsiTest™ BLAST (Identification by 16S/18S rDNA Sequence Analysis) a automaticky se vyhodnocuje Výsledek – bakterie se 100% pravděpodobností identifikace ve všech 3 použitých databázích
Interpretace výsledků Zásadní je rozhodnout, zda určená bakterie je: • Patogen (etiologický původce, příčina onem.) • Kontaminující nebo kolonizující bakterie (neidentifikovatelný, nekultivovatelný, všudypřítomný nebo bez bez patogenity u lidí a zvířat) Je nutné zvážit: - klinické (anamnestické údaje, imunita pacienta, klinický a biochemický profil, odpověď na ATB) • odběr vzorku – před/po ATB, místo odběru Nutná spolupráce s mikrobiologem a klinikem!
Případ č. 1 • 68-letý pacient • Dg. akutní a subakutní infekční endokarditida 9.3.2010 • Materiál k vyšetření – aortální chlopeň • PCR + sekvenace 12.3.2010 výsledek : Enterococcus faecalis • Kultivace 16.3.2010 – aerobní – negativní anaerobní – kmen k dourčení
Případ č. 2 • 52-letý pacient • Dg. akutní infekční endokarditida 9.8.2012 Materiál k vyšetření – aortální chlopeň 10.8. • PCR + sekvenace 14.8.2012 výsledek : Bartonella sp. • Kultivace– negativní sérologie – hraniční protilátky
Případ č. 3 69-letý pacient (překlad z Nem. Chrudim) - dg. I339 akutní endokarditida - materiál: aortální chlopeň (2. 9.) - ÚKM- kultivace – negativní (ATB léčba) - PCR + sekvenace – duální infekce – nejsme schopni určit – překrytí sekvencí specif. PCR – SA, + další patogen ??? (HK - nem. Chrudim – Enterococcus)
Případ č. 4 41-letá pacientka
Několika měsíční bolesti v laterální části levého stehna bez úrazu, MRI – suspekce na tumor zhoršení stavu, sepse, nález abscesů okolo femuru a osteomyelitidy, nasazena ATB kultivace G- vláknité tyče, změna ATB (i na anaeroby), nepotvrzeny zdroj ??? - PCR – specif. PCR (TBC + atyp.) negat. PCR + sekvenace Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum ⇒ změna ATB, ⇒ zlepšení stavu, postupně se upravil
28-letý pacient
Případ č. 5
- Přijat na infekční kliniku jako septický stav nejasné etiologie Dg.: susp. IMO?, pneumokoková infekce?
Odběr krve na PCR, HK + aglutinace (negat. NM, HI, SP), zahájena ATB léčba - Po 2 dnech. zhoršení stavu, UPV, CRP 322 provedena detekce panbakteriální DNA v krvi, moči ⇒ pozitivní, sekvenačně
Streptococcus suis – streptokoková sepse
s multiorgánovým selháním, PNC kryst. postupné zlepšení stavu. kultivace – obtížná, později po několika dnech narostlo několik kolonií, které nelze dourčit
Pyrosekvenování Využití – hDNA, mikroby, zvířecí a rostlinná DNA • Začíná se objevovat v klinickém použití zejména hDNA • Pro rutinní v mikrobiologii použití chybí protokoly, validace, programy pro zpracovávání výsledků výzkum, studie, granty… • Sekvenátory vyšší generace (NGS)
(Roche454 FLX, Illumina, Solid Helicos, IonTorrent, GS Junior…)
Pyrosekvenování v mikrobiologii • Hlavní rozdíl: více pacientů současně více sekvencí (nevýhoda – naplnění kapacity přístroje) • Citlivost – detekuje minimální množství mikroorganizmů i na pozadí jiných • Umožní analyzovat spektrum mikroorganizmů v jakémkoli materiálu či prostředí
Rozdíly mezi Sangerem a NGS • Sangerovo sekvenování vznik fragmentů DNA o různé délce, kapilární elektroforéza, seřazení dle velikosti, detekce značených nukleotidů, přečtení kolem 500 bazí, vždy 1 sekvence • NGS syntetická reakce v pyrosekvenátoru syntéza celého vlákna přímo v jamkách destičky
Princip sekvenování podle Sangera Rozdělení podle velikosti jednotlivých sekvencí DNA pomocí kapilární elektroforézy (v 1 kapiláře), automatizováno
Princip pyrosekvenování
Pyrosekvenování • Výstup dat ze sekvenátorů – „změť sekvencí, soubor různých sekvencí • Zhodnocení - rozdělení dat pro jednotlivé vzorky (rozlišení pacientů) - clustely konsensuálních sekvencí – různé skupiny sekvencí, různý počet čtení důležité zvolit citlivost (dle počet čtení) - vkládání do BLASTu – identifikace - interpretace dat
Mikrobiom recta
rectum počet čtení celkem 2000 mikroorganismy počet čtení zastoupení v % Streptococcus anginosus 800 40,12% Parasutterella excrementihominis 167 8,38% Streptococcus agalactiae 108 5,42% Lactobacillus acidophilus 97 4,86% Dialister micraerophilus 57 2,86% Bilophila wadsworthia 40 2,01% Parvimonas micra 40 2,01%
Celkem 78 mikroorganizmů
Mikrobiom cervixu cervix počet čtení celekm 1600 mikroorganismy počet čtení zastoupení v % Lactobacillus iners 1155 68,18% Gardnerella vaginalis 374 22,08% Atopobium vaginae 23 1,36% Aerococcus christensenii 16 0,94% Parvimonas micra 2 0,12%
Lactobacillus iners
Gardnerella vaginalis
Aerococcus christensenii
Parvimonas micra
Atopobium vaginae
Pyrosekvenování v mikrobiologii • Zkoumání spektra bakterií, ochranná role některých, změna poměru zastoupení – hledání příčin onemocnění (postantibiotické kolitidy – CD, mykózy u žen, infekční příčina předčasných porodů…) • Viry – celogenomové sekvenování, genomová variabilita, možné zachytit změny u „starých“ agens, mutace… identifikace nových virových patogenů Dále?????
Děkuji za pozornost
