Přínos metody ELISPOT v diagnostice lymeské boreliózy A. Ondrejková, I. Špačková, H. Švandová Laboratoř klinické imunologie a alergologie, Laboratoře AGEL a.s., Nový Jičín
Lymeská borelióza - LB Epidemiologie: přenos klíštětem Ixodes ricinus, incidence ČR 31-42/100 tis. Původce: gramnegativní spirocheta Borrelia burgdorferi sensu lato (B. garinii, B afzelii, B. burgdorferi ss) Projevy: multisystémové - kožní (65%), muskoskeletární (17%), nervové (12%) Mediální zpráva: „…v Česku nejvíc nakažených klíšťat v Evropě…„ (kachna, pravda..?), oficiální údaje kolem 10% (někde až 30%)
Lymeská borelióza – diagnostika anamnéza, přítomnost klinických příznaku, laboratorní testy
Přímý průkaz patogenu:
Nepřímé metody:
Kultivace na speciální půdě, PCR, imunofluorescence, elektronová mikroskopie Vysoce specifické, ale provedení a hodnocení je komplikované a časově náročné
Průkaz specifických IgM a IgG protilátek EIA IMUNOBLOTY - konfirmační charakter Podpůrný diagnostický význam
Nepřímé laboratorní metody
diagnostiky LB - protilátková odpověď
Kdyby to bylo takhle ideální…, ale není (BORRELIE, CHLAMYDIE …)
Nepřímé laboratorní metody
diagnostiky LB - protilátková odpověď Pacient XY: IgM protilátky léta pozitivní (EIA, IB - antigen OspC) bez dynamiky a sérokonverze. Je anebo není to borelióza? Opakovaná ATB (1) Zoufalý pacient i lékař (2)
Konstatování doktora (3)
Diskuze pacientů (4)
Výsledek (5) LÉKAŘ „BLBEC“
Nová nepřímá laboratorní metoda diagnostiky LB
více pozitivního světla do diagnostického procesu vnáší testy T-specifické buněčné imunity
I G R A testy Interferon Gamma Release Assays
T- specifická buněčná imunitní odpověď
T- specifická buněčná imunitní odpověď
LymeSpot test specifické buněčné imunity k nepřímé diagnostice boreliózy je založen na technologii ELISPOT - technika pro přímé měření funkce efektorových T-lymfocytů měří se počet aktivovaných efektorových T-lymfocytů produkujících INFγ po stimulaci specifickými boreliovými antigeny: Borrelia lyzát B31 a Osp mix (OspA, OspC, p18)
LymeSpot - teorie IGRA Funkční test - detekce a kvantifikace efektorových T-lymfocytů produkujících IFNγ po stimulaci specifickými boreliovým antigeny (Borrelia lyzát B31 a Osp mix) 1.
izolace PBMC Leucosep
Vyšetřovaný materiál: nesrážlivá krev s heparinem, dodat do 6 hodin po odběru do laboratoře ! Periferní krevní mononukleární buňky (lymfocyty, monocyty)
2. přidání PBMC & boreliových antigenů
inkubace 37°C / 5% CO2, 20 - 24 hod.
3.
4.
přidání sekundární značené Ab
inkubace 2h, přidání substrátu
Protilátka proti IFNγ
vizualizace spotů
LymeSpot - teorie IGRA Negativní kontrola
OSP Mix antigen
Borrelia lyzát antigen Pozitivní kontrola
Pozitivní výsledek
Cut off: < 2 SI, < 5 spotů (OSP mix), < 10 spotů (Borrelia lyzát)
Negativní výsledek
Každý spot reprezentuje antigen-specifický aktivovaný efektorový T-lymfocyt reagující na boreliové antigeny a produkující IFN-γ
Nepřímá laboratorní diagnostika LB LymeSpot
Sérologie IgG, IgM
Zdroj: https://www.neurorelief.com/index.php?p=cms&cid=486&pid=149
Možnosti laboratorní diagnostiky LB PCR - klíště, erythema migrans PCR - sérum/plazma PCR - moč možnosti laboratorní diagnostiky a pravděpodobnost pozitivního záchytu
IgM Western blot - sérum IgM Elisa - sérum IgG Western blot - sérum IgG Elisa - sérum ELISPOT* - nesrážlivá krev (heparin) IgG IgM
teoretická hladina antigenu a hladiny protilátek
A
1.d.
1.tý.
2.tý.
1.měs.
2.měs.
3.měs.
6.měs.
1.rok.
LymeSpot - výsledky Soubor: 109 provedených vyšetření (11/2013 – 01/2015), z toho 64 pacientů s kompletním souborem (ELISA + IB + ELISPOT) ELISA & IB
LYMESPOT NEGATIVNÍ
HRANIČNÍ
POZITIVNÍ
IgM+ IgG+
6
0
4
IgM+ IgG-
18
2
5
IgM- IgG+
14
3
5
IgM- IgG-
5
0
2
Total
43
5
16
Korelace s ELISA a IB (48%)
Diskrepance s ELISA a IB (52%)
LymeSpot - monitoring terapie míra poklesu aktivovaných efektorových T-lymfocytů produkující INFγ po stimulaci specifickými boreliovými antigeny spolupráce s Kožním oddělením Nemocnice Nový Jičín - 2 pacienti s pozitivní korelací
Kazuistika poukazující na význam LymeSpot testu v diagnostice a monitorování efektivity ATB terapie lymské boreliózy I.B., 50 let, žena - počátkem 11/2013 zánětlivé postižení kůže na vnitřní straně levé dolní končetiny popisované jako erythema chronicum migrans, bolesti kloubů, celková slabost - podezření na LB - 11/2013 pozitivita specifických IgM protilátek, ATB léčba (amoxicillin/kyselina klavulanová) - kontrolní odběr 01/2014 - nárůst IgM - proveden LymeSpot test - pozitivní - 02/2014 - dosazen doxycyklin - 04/2014 přetrvává pozitivita IgM, IgG negativní, LymeSpot - hraniční (24→11 spotů) - nález by mohl svědčit pro doznívající fázi LB - subjektivní potíže pacientky vymizely - 09/2014 LymeSpot test již zcela negativní
IGRA testy v diagnostice infekčních onemocnění „take home…“ nejsou „spásonosné“…, ale vnáší hodně světla do nejasných sérologických nálezů se susp. nespecifickým zvýšením protilátek (falešná pozitivita EIA anebo polyklonální aktivace IS?) ne vždy tvorba specifických protilátek kopíruje schéma IgM → IgG (i pacienti pouze s tvorbou IgG v anamnéze měli klinické symptomy LB s následnou ATB léčbou) výsledky LymeSpotu lépe korelují s klinickými projevy možnosti monitoringu úspěšnosti ATB terapie výhody: krátká doba odezvy (funkční test), možnost provést po pacientovi nevýhody: časová náročnost, nutnost větší erudice laboratorního personálu stále platí: “laboratorní nález je nutné interpretovat v korelaci s klinikou a anamnézou…“
Děkuji za pozornost
