Gynekol 4-011
1.9.2011
13:14
Str. 261
Aplikace metody SNP array v prenatální diagnostice Application of SNP array method in prenatal diagnosis
Čes. Gynek. 2011, 76, č. 4 s. 261-267
Bečvářová V.1, Hynek M.1, Putzová M.1, Soldátová I.1, Horáček J.1, Smetanová D.1, Kulovaný E.1, Matoušková M.1, Krutílková V.1, Hlavová E.1, Rašková D.1, Hejtmánková M.1, Čutka K.2, Čutka D.2, Stejskal D.1, Mihalová R.3, Trková M.1 1Gennet, Centrum lékařské genetiky a reprodukční medicíny, Praha, vedoucí lékař MUDr. D. Stejskal 2Centrum lékařské genetiky, České Budějovice, vedoucí lékař MUDr. K. Čutka 3Ústav biologie a lékařské genetiky 1. LF UK a VFN, Praha, přednostka doc. MUDr. M. Kohoutová, CSc. ABSTRACT Objectives: SNP array (array method using Single Nucleotide Polymorphisms) enables to detect cytogenetically undetectable submicroscopic alterations (microdeletions, microduplications), which could be also causative for ultrasonographic anomalies of fetus. This article describes the principle, advantages, disadvantages and application possibilities of the SNP array method in prenatal diagnosis. The ten month experience with SNP array use in prenatal diagnosis is presented. Design: Prospective study. Settings: Gennet, Prague. Material and methods: During the period from April 2010 to January 2011 we performed 110 SNP array analyses of fetal DNA: 14 chorionic villi samples (CVS), 88 amniotic fluid samples (AMC), 1 cord blood sample and 7 miscarriage samples. Laboratory tests were carried out on DNA from both cultured and uncultured fetal cells. Examinations were performed in fetuses with sonographic abnormal findings having normal karyotype. In addition 14 fetal cytogenetic abnormalities were solved. SNP array analysis was performed using Illumina InfiniumHD HumanCytoSNP-12 chip. All data were analysed by Illumina KaryoStudio and GenomeStudio software. Results: SNP array analysis was performed in 108 fetuses (only 2 examination failures, 1.8%). In total, we detected CNV (copy number variation) in 29 samples (29/108 = 27%). 15% (16/108) of fetuses with abnormal ultrasound findings were found to carry clinically relevant CNV. Probably benign CNVs were found in 8 samples (8/108 = 7%) and in additional 5 CNVs parental samples have not been analysed yet. Excluding karyotypically abnormal cases clinically relevant CNVs were found in 10% of fetuses (9/94). In all cases with de novo chromosomal aberration the clinical relevancy was clarified (imbalances in 50%). Conclusion: Our data suggest that SNP array analysis is a relevant and useful technique in prenatal diagnosis. Key words: SNP array, CNV, prenatal diagnosis, ultrasound diagnosis. SOUHRN Cíl studie: Metoda SNP array (využívající k diagnostice polymorfismy v 1 nukleotidu – single nucleotide polymorphism) umožňuje odhalit v karyotypu nedetekovatelné submikroskopické změny (mikrodelece, mikroduplikace), jež mohou mít kauzální souvislost s patologickým ultrazvukovým nálezem u plodu. V článku je stručně popsán princip, výhody, nevýhody a možnosti použití metody SNP array v prenatální diagnostice. Jsou prezentovány zkušenosti za 10 měsíců používání této metody v prenatální diagnostice. Typ studie: Prospektivní studie. Pracoviště: Gennet, Praha.
261
Gynekol 4-011
1.9.2011
13:14
Str. 262
Metodika: Vyšetření SNP array bylo v období duben 2010 až leden 2011 provedeno u 110 vzorků DNA získané z kultivovaných nebo nekultivovaných buněk plodů po biopsii choria (CVS, n=14), amniocentéze (AMC, n=88), kordocentéze (n=1) a z tkáně z abortů (n=7). Vyšetření byla indikována na základě patologického nálezu na ultrazvuku s normálním karyotypem plodu, případně k dořešení patologického cytogenetického nálezu vzniklého de novo. Zpracování DNA pro chip Illumina InfiniumHD HumanCytoSNP-12v2.1, jeho příprava a skenování byly provedeny podle standardních protokolů firmy Illumina. Data byla analyzována pomocí softwaru Illumina KaryoStudio a GenomeStudio. Výsledky: Metodou SNP array bylo úspěšně vyhodnoceno 108 vzorků (neúspěch vyšetření byl pouze ve 2 případech, 1,8 %). Odchylky od normálního profilu (CNV-Copy Number Variation) byly zachyceny u 29 případů (29/108 = 27 %), z nichž 16 bylo klinicky významných (16/108=15 %). Jako pravděpodobně nepatogenní byly CNV u 8 případů a u 5 případů nebyl zatím původ nalezené CNV ověřen u rodičů. Po odečtení případů ověřujících de novo patologii v karyotypu plodu byla klinicky významná CNV nalezena v 9 případech (9/94 = 10 %). Nález klinicky významné CNV byl nejčastěji v kategorii ultrazvukových nálezů srdečních vad, vad centrálního nervového systému (CNS) a mnohočetných anomálií. Ve všech 14 případech de novo chromozomální přestavby v karyotypu byla jasně specifikována závažnost přestavby (patologie u 7/14 = 50 %). Závěr: Výsledky studie ukazují, že vedle jednoznačného přínosu při posuzování patogenity de novo chromozomálních aberací prokazuje SNP array i jednoznačný přínos pro záchyt dosud skrytých submikroskopických změn. Klíčová slova: SNP array, CNV, prenatální diagnostika, ultrazvuková diagnostika.
ÚVOD
Tab. 1. Srovnání diagnostických možností metod užívaných v prenatální diagnostice Metoda
Současná prenatální péče představuje komplexní spolupráci ultrazvukové, biochemické a genetické diagnostiky. V indikovaných případech jsou za účelem diagnostiky vrozených vad a chorob plodu prováděna vyšetření metodami cytogenetickými (konvenční karyotyp), molekulárně genetickými (QF-PCR – kvantitativní fluorescenční PCR pro rychlé potvrzení či vyloučení nejčastějších trizomií, i přímá a nepřímá diagnostika předem známých chorob) a molekulárně cytogenetickými (FISH – fluorescenční in situ hybridizace). Všechny používané metody mají své přednosti a současně omezení daná principem každé metody. Na jedné straně je to rychlost provedení vyšetření, na druhé straně nutná cílenost a omezený rozsah zjistitelných odchylek [9]. Proto dochází často ke kombinaci více typů vyšetření. Přesto zůstává určitá část gravidit s patologickým ultrazvukovým (UZ) nálezem (často s infaustní prognózou) a s normálním výsledkem ve všech uvedených vyšetřeních. Možnou alternativou pro zjištění genetické příčiny a stanovení diagnózy u výše popisovaných případů je metoda SNP array. Je to jedna z technologií celogenomového screeningu (podobně jako metoda array CGH – komparativní genomová hybridizace), která při 1000krát vyšší rozlišovací schopnosti než klasický karyotyp detekuje nebalancované chromozomální abnormity. Vyšetřovacím principem metody SNP array je využití statisticky vybraných konkrétních polymorfismů v 1 nukleotidu mezi 2 alelami (formami téhož genového lokusu) vyskytujících se v genomu každého jedince (single nucleotid polymorphism – SNP). Metodou SNP array můžeme zachytit chromozomální aberace pod rozlišovací schopností G-pruhovaných chromozomů v konvenčním karyotypu (10 kb versus 262
Karyotyp
ANO
NE
aneuploidie, polyploidie
mikrodelece
balancované přestavby (>5 Mb)
mikroduplikace
nebalancované přestavby (>5 Mb)
intrachromozomální amplifikace
mozaiky
uniparentální disomie (UPD)
aneuploidie, polyploidie
uniparentální disomie (UPD)
cíleně balancované přestavby FISH
cíleně nebalancované přestavby mozaiky cíleně některé mikrodelece intrachromozomální amplifikace
SNP array
aneuploidie
balancované přestavby
mikrodelece
malé chromozomální mozaiky
mikroduplikace
polyploidie
mozaiky (>10 %) intrachromozomální amplifikace uniparentální disomie (UPD)
5–10 Mb) a současně doplnit standardní cytogenetickou metodu v případě nálezu některých typů chromozomálních aberací (např. určení původu marker chromozomů, derivovaných chromozomů apod.). Výhody a nevýhody
Gynekol 4-011
1.9.2011
13:14
Str. 263
jednotlivých cytogenetických metod jsou shrnuty v tabulce 1. V našich vyšetřeních byla metoda SNP array použita u plodů se závažným UZ nálezem a současně normálním výsledkem konvenčního karyotypu jako metoda doplňková. Dále byla array technologie použita také pro jednoznačné posouzení závažnosti abnormalit nalezených v karyotypu (marker chromozomy, de novo „balancované“ chromozomální aberace apod.).
Tab. 2. Přehled prenatálních vyšetření z hlediska původu vyšetřovaného materiálu Typ tkáně
Počet
Biopsie choria (CVS)
14
Amniocentéza (AMC)
88
Tkáň abortu Kordocentéza
7 1
Celkem
110
Úspěšná SNP array vyšetření
108
SOUBOR A METODIKA Do souboru vyšetřovaných pacientek (plodů) bylo v období duben 2010 až leden 2011 zařazeno 110 případů, u kterých bylo primárně indikováno cytogenetické vyšetření plodu na základě abnormálního nálezu při ultrazvukovém vyšetření: 14 vyšetření choriové biopsie v 1. trimestru těhotenství (CVS), 88 vyšetření plodové vody ve druhém trimestru těhotenství (AMC) a 1 kordocentéza. Bylo provedeno i vyšetření u 7 abortů. Přehled typů vyšetřovaných vzorků je uveden v tabulce 2. Před provedením SNP array vyšetření byly známy výsledky QF-PCR a karyotypu plodu. Dovyšetření a jasné určení chromozomální abnormity nalezené v karyotypu bylo provedeno u 14 vzorků. Všechny pacientky i jejich partneři byli při klinickogenetické konzultaci informováni o provedení a možnostech SNP array vyšetření plodu. Souhlas s ním potvrdili podpisem informovaného souhlasu k vyšetření a dobrovolným odevzdáním vzorku periferní krve v případě nutnosti srovnání SNP array profilů plodu a rodičů. Vzorky plodů s cytogeneticky nebo molekulárně geneticky potvrzenou jasnou patologií (např. trizomie, triploidie apod.) nebyly metodou SNP array vyšetřovány. DNA byla izolována z buněk plodů po biopsii choria, amniocentéze, kordocentéze a z tkáně potracených plodů (tab. 2). Přibližně u 75 % případů byly před izolací DNA fetální buňky kultivovány, v průměru 15 dní. Pro izolaci DNA byl použit kit QIAamp DNA Mini Kit Qiagen (viz QIAamp DNA Mini Kit Handbook 2003), umožňující izolaci kvalitní DNA ze všech typů výše uvedených vzorků. Zpracování, aplikace na vyšetřovací chip, hybridizace a barvení bylo provedeno podle standardního protokolu firmy Illumina pro chip typu InfiniumHD HumanCytoSNP-12. Skenování chipu bylo provedeno na Illumina Bead Array Reader (servisní laboratoř Ústavu molekulární genetiky AV ČR). K vyhodnocení dat byly použity programy Illumina KaryoStudio1.3 a Illumina GenomeStudioV2010.2. Oba programy pracují se dvěma základními statistickými veličinami. Tyto veličiny jsou v případě Illumina SNP array virtuálně srovnávány softwarem se statisticky vybraným reprezentativním souborem 200 kontrolních vzorků zdravých jedinců. Z toho vyplývá, že vlastní laboratorní příprava každého chipu musí být provedena za striktního dodržení podmínek, za kterých byly tyto referenční vzorky zpracovávány. První vyšetřovanou veličinou je „normalizovaná hodnota intenzity fluorescence“ – pojem log R ratio.
Ta charakterizuje, stejně jako u běžné CGH, zvýšení (např. duplikace) nebo snížení (delece) počtu kopií (CNV – copy number variation) daného úseku v konkrétním vzorku vyšetřované DNA. Oproti běžné CGH odpadá díky počítačové analýze nutnost přípravy standardní referenční DNA. Druhou užívanou veličinou je „frekvence alely B“ – pojem B allele frequency. Díky výpočtu této hodnoty je možné zjistit, jaký je genotyp vzorku v místě daného vyšetřeného polymorfismu a lze detekovat potenciálně patogenní místa neutrální z hlediska počtu kopií (ztrátu heterozygozity, uniparentální dizomii). To běžná array-CGH neumožňuje. V případě nálezu odlišností v SNP array profilu od standardní statistické normy (Illumina KaryoStudio a GenomeStudio) byla zjištěná data porovnávána s veřejně dostupnými genomickými databázemi pro populační varianty CNV a pro popsané patologie [14, 15, 16]. Za účelem potvrzení původu CNV byl takový profil plodu porovnáván s profily obou rodičů, aby se vyloučila možnost familiárního polymorfismu. Hodnocení se řídí mezinárodními doporučeními Cytogenetic European Quality Assessment (CEQA) a nomenklaturou International System of Cytogenetic Nomenclature (ISCN). Časové schéma metody zahrnovalo 4 dny laboratorní práce, několik hodin skenování a dobu nutnou pro samotné vyhodnocení profilu (liší se podle UZ nálezu a zjištěného CNV – 1 až 3 dny). U kultivovaných buněk je časové schéma prodlouženo o dobu kultivace. Tj. u vzorků bez kultivace od dodání vzorku k odevzdání výsledku dohromady přibližně 7 dní, při kultivaci fetálních buněk před vlastním vyšetřením je to 15 až 20 dnů. Výstupem z laboratoře je protokol o molekulárně cytogenetickém vyšetření předaný klinickému genetikovi nebo gynekologovi s genetickou specializací. Protokol obsahuje popis nálezu a komentář. V případě patologického nálezu jsou přiloženy články, abstrakta, případně odkazy na další zdroje informací týkající se daného nálezu.
VÝSLEDKY Z celkového počtu 110 vzorků bylo vyšetření neúspěšné ve dvou případech, tj. 1,8 %, kdy se nepodařilo zajistit dostatečné množství kvalitní DNA (plodová voda s nízkou koncentrací amniocytů, kontaminace mateřskou
263
Gynekol 4-011
1.9.2011
13:14
Str. 264
Tab. 3. Přehled výsledků prenatálních vyšetření metodou SNP array
Jednoznačné posouzení závažnosti cytogenetického počet UZ patologie nálezu se podařilo ve všech celkem patogenní nepatogenní zatím nejasné vyšetřovaných případech; NT>3mm 6 4 1 3 0 u 50 % (7/14) byla prokázána srdeční vady 19 4 3 1 0 patogenita (nevyvážená chroCNS 14 5 2 1 2 mozomální výbava). U dalkostní dysplazie 14 2 1 1 0 ších 7 plodů byly SNP array vady urogenitální 13 2 1 0 1 profily v normě, což umožnilo uzavřít prenatální vyšetření růstové disproporce 4 0 0 0 0 s příznivou prognózou. Např. vady gastrointestinální 10 1 0 0 1 u 2 našich pacientek byly rozštěpy orofaciální 10 3 0 2 1 v karyotypu nalezeny kommnohočetné vady 4 1 1 0 0 plexní translokace zahrnující celkem 94 22 9 (10 %) 8 5 5 (chromozomy 1, 6, 8, 18 dořešení cytogen.patologie 14 7 7 (50 %) 0 0 a 21) resp. 3 chromozomy vyšetření celkem 108 29 16 (15 %) 8 5 (chromozomy 3, 9 a 4). Obě translokace se cytogeneticky Rozdělení UZ patologií dle Kleeman et al. Use of array CGH for prenatal diagnosis of fetuses with v karyotypu jevily jako balansonographic anomalies [3] cované. Po provedení vyšetření SNP array byl tento závěr krví) a výsledný array profil byl nehodnotitelný. Většina v obou případech potvrzen ve smyslu zachování normálnízískaného biologického materiálu obou vzorků byla ho počtu kopií ve všech vyšetřovaných SNP markerech. přednostně zpracována pro vyšetření konvenčního ka- První gravidita (translokace s 5 chromozomy) byla v ledryotypu. nu 2011 úspěšně završena porodem fyziologického novoPřehled výsledků je uveden v tabulce 3. Z úspěšně rozence, druhá gravidita pokračuje s normálním ultrazvuvyšetřených 108 vzorků jsme našli odlišnost od stan- kovým nálezem. dardního SNP array profilu (CNV) ve 29 případech V tabulce 4 je uveden přehled 16 kauzálních aberací (29/108 = 27 %). Porovnáním s veřejně dostupnými s UZ nálezy. Příklady patologických profilů u 2 plodů databázemi CNV u zdravých kontrol, případně vyšetře- jsou uvedeny v obr. 1 a 2. ním rodičů plodu, bylo 16 z nich (16/108 = 15 %) potvrzeno jako patogenní (související s patologickým UZ nálezem). Dalších 8 nalezených CNV (8/108 = 7 %) bylo DISKUSE vyhodnoceno jako pravděpodobně nepatogenní a dalších 5 CNV nebylo dosud ověřeno (5/108 = 5 %). Pokud odečteme 14 případů, kde byla řešena závažnost abnorLidská populace je z hlediska CNV (mikrodelecí málního karyotypu plodu, z celkového počtu 94 vyšetře- a mikroduplikací) velmi variabilní a v každém vyšetřoných plodů byl záchyt klinicky významných CNV v 9 vaném místě existuje poměrně velká pravděpodobnost případech (10 %). V jednom případě (tab. 4 – pacientka variant [10]. Za účelem shromažďování dat o těchto va8) bylo z důvodu vysokého týdne těhotenství (23. týden) riantách, jejich klinické významnosti, eventuálně spojiprovedeno array vyšetření z nekultivovaných buněk dří- tosti se známými postiženími a geneticky podmíněnými ve, než byl znám výsledek karyotypu. Byla nalezena ter- chorobami vznikly volně dostupné databáze [14, 15, 16], minální delece na krátkých raménkách chromozomu 7 které jsou stále aktualizovány. Zavedení metody SNP velikosti přibližně 3,4 Mb (megabase – 106 bazí). Tento array v prenatální diagnostice následovalo v naší laboranález byl posléze verifikován v karyotypu plodu, kde toři až po období, kdy byla tato metoda užívána pouze byla aberace na hranici mikroskopické rozlišitelnosti. pro postnatální vyšetření. Jednak k ověření cytogeneticV jednotlivých UZ indikacích byl nejvyšší záchyt kli- ky známých aberací a poté pro pacienty s různým stupnicky relevantní patogenní CNV u anomálií centrálního něm geneticky podmíněného postižení, kde nebyla jinýnervového systému (2/14 a 2 další zatím nedořešeny) mi metodami stanovena příčina postižení. Bez ohledu na a srdečních vad (3/19). Nejvíce dalších nálezů klinicky původ vzorku vyšetřované DNA se laboratorní provedevýznamných CNV bylo u indikace s patologií nuchální ní i hodnocení řídí v podstatě shodnými pravidly. Vzhletranslucence (1/6), mnohočetných ultrazvukových vad dem k tomu, že nepatogenní CNV různého rozsahu se (1/4), urogenitálních anomálií (1/13, 1 zatím nedořešena) nalézají i u zdravých kontrol jako běžné varianty, byla a kostních dysplazií (1/14). Nedořešené případy se týkají také u každé zachycené CNV u plodu prověřena závažtěhotenství, která byla ukončena a rodiče zatím neposkyt- nost nálezu porovnáním s databází známých variant [15]. li vzorek periferní krve ke srovnání jejich SNP array pro- Pro posouzení klinické relevance musí být dále prokázán filů s nálezem u plodu. U prenatálně zjištěných vad typu původ CNV vyšetřením rodičů. Uvádí se, že 90-97 % růstové retardace, vad gastrointestinálního traktu a orofa- zjištěných odlišností totiž může být familiárních [1, 3, 5]. ciálních rozštěpů (které nejsou asociovány s jiným UZ Teprve až po porovnání nalezené CNV plodu s databází nálezem) nebyl dosud žádný záchyt patologické CNV. známých a popsaných mikrodelecí / mikroduplikací, CNV nálezy
264
Gynekol 4-011
1.9.2011
13:14
Str. 265
ověření případného parentál- Tab. 4. Přehled klinicky významných nálezů u plodů s ultrazvukovými anomáliemi v 1. nebo 2. trimestru ního původu CNV, vyloučení Č. GT UZ nález karyotyp CNV Chromozom Rozsah běžné varianty a po prostudoVSV, VV 21. 46,XY duplikace 8q24.13 0,8 Mb vání genů lokalizovaných 1. urogenitálního traktu v duplikované nebo deletova2. 19. VSV 46,XY delece 3p25.3-p25.2 1,6 Mb né oblasti, byly CNV povaagenese corpus žovány za klinicky význam- 3. 20. 46,XY duplikace 22q11.2 2,9 Mb callosum né. Je-li to metodicky NTD delece dostupné, doporučuje se 4. 17. 46,XY Xq25 0,7 Mb v sakrální páteři homozygotní nález paralelně vyšetřit osteochondroplazie, některou jinou laboratorní 5. 21. 46,XX delece 2p15.14 1,4 Mb oligohydramnion metodou (FISH, MLPA-Mulmulticystická dystiple Ligation-dependent Pro- 6. 19. 46,XY duplikace 13q14.11 0,6 Mb plazie / ageneze ledvin be Amplification) [13]. 23. NT=8,5, VSV 46,XX delece 10q22.3-q23.2 7,7 Mb Jak je patrno z tabulky 3, 7. byl v jednotlivých UZ indicheilognatoschisis, 46,XY,susp. 23. delece 7p22.3-p22.2 3,4 Mb kacích nejúčinnější záchyt 8. VSV, stenóza plicnice del (7) (p22) klinicky relevantní CNV závažná VSV, 20. 46,XY delece 7q11.23 1,4 Mb u anomálií CNS (2/14, 2 9. asym. vývoj plodu zatím nedořešeny) a srdeč46,XY,add(13) 2 duplikace 5q33.3 / 5q35 11 Mb / 9,5 Mb ních vad (3/19). Více nálezů 10. 23. VSV (p10) klinicky významných CNV vývojová atypie 46,XX,del(11) delece 11q24.1-q25.12 12,9 Mb bylo u indikace s patologií 11. 22. obou ledvin (q23.3) nuchální translucence (1/6), 46,XY,del(13) 13q14.12delece 26.6 Mb mnohočetných ultrazvuko- 12. 23. mikromandibula (q32?) q21.33 vých vad (1/4), urogenitáldelece/ 1p36.3 / 3p2646,XY,der(1) 3 Mb / 22,5 Mb ních anomálií (1/13, 1 zatím 13. 18. acranius duplikace 3p24.3 nedořešena) a kostních dysUZ bez patologie, 47,XY,+i(18) 18p11.32triplikace 15,4 Mb plazií (1/14). Žádný záchyt 14. 15. věková indikace (p10) p11.21 patologické CNV zatím duplikace/ 47,XY,+mar 22p11.1-q11.1 2,8 Mb nebyl u prenatálně zjištěných 15. 19. atrézie rekta triplikace vad typu růstové retardace, 46,XY,del(21) delece 21q22.13-q22.3 9,9 Mb vad gastrointestinálního trak- 16. 16. mnohočetné VV (q22.1) tu a orofaciálních rozštěpů (které nejsou asociovány Vysvětlivky: s jiným UZ nálezem). Č - číslo pacienta; GT - gestační týden; CNV - Copy Number Variation; VSV - vrozená srdeční vada; NTnuchální translucence; Mb - megabase (106 bází) Výsledky jsou srovnatelné Cytogenetické zápisy podle aktuální verze International System of Cytogenetic Nomenclature (ISCN s výsledky podobných studií 2009) používajících některou z me- p - krátké raménko chromozomu; q - dlouhé raménko chromozomu; číslo před "p" (resp. "q") označuje čístod array (array CGH nebo lo chromozomu; číselné údaje za písmenem p (resp. q) udávají přesnou polohu aberantního místa na konkrétním chromozomu; mar - marker chromozom; add - na chromozomu přítomen nadbytečný neznámý SNP array) v prenatální dia- chromozomální materiál; del - delece; i - isochromozom; der - derivovaný chromozom (změna na chromognostice: Tyreman a kol. zomu dále cytogeneticky neidentifikovatelná) našli patogenní CNV u 10 % plodů s abnormálním UZ nálezem [11]; Faas a kol. našli de novo klinicky rele- roduplikacemi v oblasti zlomů [12]. Velký přínos předvantní CNV u 16 % plodů s patologickým UZ a normál- stavuje metoda SNP array v případech, kdy je v karyotypu plodu nalezen de novo marker chromozom (nadpočetním karyotypem [2]. Stejně tak i výsledky jednotlivých UZ nálezů odpoví- ný, dále cytogeneticky nezařaditelný genetický materiál). dají údajům srovnatelných studií, kde byl nejvyšší záchyt Je možné rozlišit, zda je v marker chromozomu obsažeklinicky relevantních CNV u srdečních vad, vad CNS, na kódující DNA, včetně určení popsaných genů, nebo urogenitálních a skeletálních vad [3, 11]. Ukazuje se, že zda jde pravděpodobně o heterochromatinový nekódujív případě některých UZ abnormalit (izolované vady gast- cí materiál, bez fenotypických následků pro plod. Vyšetrointestinálního traktu a izolované orofaciální rozštěpy) ření SNP array tak poskytuje cenné informace klinickému genetikovi a významně přispívá k rozhodování array vyšetření zřejmě nepřispívá k objasnění etiologie. Jednoznačný přínos pro prenatální diagnostiku před- rodičů o osudu gravidity. Příkladem vyšetření marker stavuje array technologie při upřesňování rozsahu nebo chromozomu v našem souboru je případ 15 (viz tab. 4). Naprosto unikátní je SNP array v identifikaci ztráty závažnosti aberací vzniklých de novo. Vermeesh ve své studii udává, že 6–10 % zdánlivě balancovaných translo- heterozygozity, a tím identifikace uniparentální disomie. kací je spojeno s následnými kongenitálními anomálie- Je známo, že potomci nosičů některých typů chromozomi, což nepochybně souvisí s mikrodelecemi nebo mik- málních přestaveb, například některých robertsonských 265
Gynekol 4-011
1.9.2011
13:14
Str. 266
Obr. 1. Výsledek vyšetření metodou SNP array – mikrodelece na chromozomu 7 (případ č. 9, tab. 4). Mikrodelece 7q11.23 (okrový blok) o velikosti 1.4 Mb u plodu se závažnou srdeční vadou a vývojovou asymetrií. Mikrodelece překrývá oblast pro Williamsův-Beurenův syndrom.
Obr. 2. Výsledek vyšetření metodou SNP array - mikroduplikace na chromozomu 22 (případ č. 3, tab. 4). Duplikace 22q11.21 (modrý blok) o velikosti 2.9 Mb u plodu s agenezí corpus callosum. Duplikace překrývá oblast pro tzv.22q11.21 mikroduplikační syndrom. Zdroj: Illumina GenomeStudioV2010.2 / Chromosome Browser
translokací, mají zvýšené riziko uniparentální disomie (izodisomie nebo heterodisomie), jejímž důsledkem je projev genetického onemocnění při zdánlivě normálním karyotypu [4, 6]. Vyšetřením plodu a rodičů dítěte touto metodou lze rozlišit uniparentální disomii na jakémkoli chromozomu či jeho části. Hlavním úskalím použití array technologie v prenatální diagnostice je omezená možnost korelovat nalezenou mikroduplikaci nebo mikrodeleci s fenotypem. Na rozdíl od postnatálního vyšetření pacientů s psychomotorickou retardací nebo stigmatizací, kde se staly metody molekulární cytogenetiky vyšetřením první volby [1, 7], je array v prenatální diagnostice zatím metodou doplňkovou. Přibývající studie v tomto oboru přinesou dosud chybějící poznatky pro stanovení souvislostí mezi patologickými ultrazvukovými nálezy u plodu a jejich molekulárním základem [3, 11, 12]. Vyšetření SNP array je nutné plánovat i s ohledem na gestační týden. Z kapacitních a ekonomických důvodů není možné provádět takové vyšetření denně. Jako optimální a časově dostačující se ukazuje počkat na zaplnění alespoň dvou chipů (24 vzorků). Stávající perioda v naší 266
laboratoři je 2–3 týdny. Pro maximální zkrácení doby vyšetření se podařilo vypracovat protokol izolace kvalitní DNA (minimální koncentrace 50 ng/μl) přímo z nekultivovaných buněk. Díky tomu se doba trvání vyšetření zkrátila o dobu kultivace. Výsledky SNP array profilů při použití DNA z kultivovaných a nekultivovaných buněk jsou zcela srovnatelné.
ZÁVĚR Celogenomový screening submikroskopických změn metodou SNP array má v prenatální diagnostice význam díky svému vysokému rozlišení. Jejím použitím dochází k záchytu mnoha klinicky významných mikrodelecí a mikroduplikací, jež by nebyly jinými genetickými metodami odhaleny. Metoda SNP array tak může objasnit příčinu závažných ultrazvukových nálezů a dát relevantní informaci pro genetické poradenství u případné další gravidity. Současně může pomoci při rozhodování o osudu gravidity tam, kde při abnormálním nálezu na
Gynekol 4-011
1.9.2011
13:14
Str. 267
ultrazvuku všechna ostatní vyšetření vykazují normální výsledky. Nepopíratelný význam má v případech identifikace de novo aberace nejasného významu v karyotypu plodu. V této souvislosti se již objevily i odkazy na význam stanovení abnormálních CNV ve vzorcích plodů pocházejících z opakovaných potratů, k nimž dochází u některých párů bez zjevné příčiny [8]. Poděkování Chceme poděkovat kolektivu Laboratoře molekulární genetiky Gennet za vstřícnost a spolupráci při izolaci DNA včetně vylepšení protokolu izolace z nekultivovaných buněk. Dále děkujeme všem pracovníkům Cytogenetické laboratoře Gennet za vedení kultivací a za přípravu buněk pro izolaci. Děkujeme za ochotnou spolupráci kolektivu Oddělení fetální medicíny a Oddělení lékařské genetiky. V neposlední řadě také pracovníkům IT oddělení Gennet. Naše poděkování patří i všem spolupracujícím gynekologům a klinickým genetikům, kteří nechápou abnormální těhotenský nález izolovaně, ale v širších medicínských souvislostech. Tím zprostředkovaně přispívají k rozšíření poznatků o souvislostech abnormálních těhotenských nálezů s jejich možnou genetickou příčinou.
LITERATURA 1. Ahn, J., Mann, K., Walsh, S., et al. Validation and implementation of array comparative genomic hybridisation as a first line test in place of postnatal karyotyping for genome imbalance. Molecular Cytogen, 2010, 3, p. 9. 2. Faas, BHW., de Burgt, I., Kooper, AJA., et al. Identification of clinically significant submicroscopic chromosome alterations and UPD in fetuses with ultrasound anomalies using genome-wide 250k SNP array analysis. J Med Genet, 2010, 47, p. 586. 3. Kleeman, L., Bianchi, DW., Shaffer, LG., et al. Use of array comparative genomic hybridization for prenatal diagnosis of fetuses with sonographic anomalies and normal metaphase karyotype. Prenatal Diagnosis, 2009, 29, p. 1213. 4. Kotzot, D. Complex and segmental uniparental disomy updated. J Med Genet, 2008, 45, p. 545.
5. LaFramboise, T. Single nucleotide polymorphism arrays: a decade of biological, computational and technological advances. Nucleic Acids Res, 2009, 37, p. 4181. 6. Liehr, T. Cytogenetic contribution to uniparental disomy (UPD). Molecular Cytogen, 2010, 3, p. 8. 7. Miller, DT., Adam, MP., Aradhya, S., et al. Consensus Statement: Chromosomal microarray is a first-tier clinical diagnostic test for individuals with developmental disabilities or congenital anomalies. Am J Hum Genet, 2010, 86, p. 749. 8. Rajcan-Separović, E., Diego-Alvarez, D., Robinson, WP., et al. Identification of copy number variants in miscarriages from couples with idiopathic recurrent pregnancy loss. Human Reprod, 2010, 25, p. 2913. 9. Shaffer, LG., Bui, TH. Molecular cytogenetic and rapid aneuploidy detection methods in prenatal diagnosis. Am J Med Genet Part C, 2007, 145C, p. 87. 10. Shaikh, TH., Gai, X., Perin, JC., et al. High-resolution mapping and analysis of copy number variations in the human genome: A data resource for clinical and research applications. Genome Res, 2009, 19, p. 1682. 11. Tyreman, M., Abbott, KM., Willatt, LR., et al. High resolution array analysis: diagnosing pregnancies with abnormal ultrasound findings. J Med Genet, 2009, 46, p. 531. 12. Vermeesch, JR., Fiegler, H., de Leeuw, N., et al. Guidelines for molecular karyotyping in constitutional genetic diagnosis. Eur J Hum Genet, 2007, 15, p. 1105. 13. Vissers, LELM., de Vries, BBA., Veltman, JA. Genomic microarrays in mental retardation: from copy number variation to gene, from research to diagnosis. J Med Genet, 2010, 49, p. 289. Web stránky(veřejně dostupné databáze): 14. Database of Chromosomal Imbalance and Phenotype in Humans using Ensembl Resources(DECIPHER), http://decipher.sanger. ac.uk/application/, verze v 5.1, GR Ch37 15. Database of Genomic Variants(DGV), http://projects.tcag.ca/ variation/, verze Human genome assembly hg.19, Human (GR Ch37). 16. UCSC Genome Bioinformatics Site, http://genome.ucsc.edu, verze Feb. 2009 (GR Ch37/hg19). Ing. Věra Bečvářová Gennet Centrum lékařské genetiky a reprodukční medicíny Kostelní 292/9 170 00 Praha 7 Korespondence Ing Věra Bečvářová e-mail:
[email protected] RNDr. Marie Trková, Ph.D. e-mail:
[email protected]
267
