VYUŽITÍ CYTOLOGICKÝCH A MOLEKULÁRNĚ BIOLOGICKÝCH METOD PŘI DETEKCI NÁDORŮ • Definice problematiky • Profil přístupů • Nádorová heterogenita
“ Všechny nádory mají genetický podtext, ale některé mají tento podtext větší než jiné.” Parafrázováno z Animal Farm - George Orwell
NEOPLÁZIE (TUMOR) • • • • • •
Růst Diferenciace Funkce Organizace Lokalizace Regulace
CYTOLOGIE A MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE • • • • •
Původ Rozvoj Heterogenita Biomarkery Cíle zásahu
CYTOLOGIE A MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE • Kvantitativně screeningový přístup – profilování • Kvalitativní individuální přístup
METODIKY I 1. Cílené přístupy Real-time PCR Mikroskopie Exprese proteinů, RNA FC
http://www.cellsignal.com/products/images/3 094_wb_jb_040204.jpg
2. Celkové přístupy
FACS PC – hmotová spektrometrie HCS http://www.epmmagazine.com/labproducts/high-content-screeningwith-inverted-microscope-frame/
METODIKY II 1. Cílené přístupy locus (alelické imbalance) DNA-PCR-Mikrosatelity FISH Microdisekce – PCR jedné buňky 2. Celkové přístupy
Karyotypování CGH SNPs -Omiky
MUTACE • „Driver“ mutace: stimulace růstu, rozvoj nádoru, pozitivně selektovány • „Passenger“ mutace: biologicky neutrální • Výsledky:
921 bázových substitucí 763 „passenger“ mutací 159 „driver“ mutací u 119 (66/210 vzorků nádorů)
Greenman et al. (2007) Nature 446:153
INTERNATIONAL CANCER GENOME CONSORTIUM • 25,000 nádorových genomů • Genomická • Epigenomická • Transkriptomická
INTERNATIONAL CANCER GENOME CONSORTIUM • Buňky karcinomu plic – 23 000 mutací • Buňky melanomu – 33 000 mutací • Buňky glioblastomu – 30 000 mutací
INTERNATIONAL CANCER GENOME CONSORTIUM
http://www.nature.com/nature/journal/v463/n7283/full/nature08768.html
INTERNATIONAL CANCER GENOME CONSORTIUM • Téměř 750 nádorových linií • 1/9 genů - delece • 1/100 genů na chromozomu X – inaktivace s němým dopadem • 1/ 50 genů – inaktivace u zdravých subjektů • Nádory – tolerantnější něž zdravé tkáně
PERSONALIZOVANÁ NÁDOROVÁ GENOMIKA
EPIGENETICKÉ ZMĚNY U NÁDORŮ • Téměř všechny nádory • 50% genů (familiární forma) umlčeny u sporadických forem • Stochastický výskyt • Defekty v epigenetických mechanizmech
TYPY EPIGENETICKÝCH ZMĚN • DNA metylace • Modifikace histonů • Dysregulace nekódujících RNA • Chromatinová organizace • Telomerová stabilita a funkce
INAKTIVACE TSG
TP73 MLH1
RASSF1 CDKN2A
HIC1
cadherin
TP53
p16INK4A + p14ARF
BRCA2
BRCA1
Červená = pouze hypermetylace Zelená = pouze mutace Purpurová = oba mechanizmy
HIC1 = hypermetylován u nádorů (častý LOH) Nature Rev 3:415, 2002
Nat Rev Cancer 6:866, 2006
miRNA PROFILOVÁNÍ – NOVÝ KLINICKÝ DIAGNOSTICKÝ NÁSTROJ
Nat Rev Cancer 6:866, 2006
NEKÓDUJÍCÍ RNA
VNITŘNÍ HETEROGENITA • Všechny odlišitelní fenotypické znaky • Darwinovská evoluce • Genetická heterogenita – fenotypická heterogenita • Heritabilní fenotypy vs nedědivé fenotypy
NEDĚDIVÉ ZDROJE DIVERSITY NÁDOROVÝCH POPULACÍ • Nádorové kmenové buňky • Fenotypická plasticita • Environmentální signály • Stochastické buněčně-autonomní mechanizmy?
FENOTYPICKÁ PLASTICITA Genotypy – rozsah fenotypů (norma reakce)
Mikroprostředí nádorů ≠ homogenní prostředí
FENOTYPICKÁ PLASTICITA v HOMOGENNÍCH PROSTŘEDÍCH „Hluk“ v genové expresi
Metastabilní intracelulární signální dráhy
Baktérie (viry) – perzistence
Savčí buňky – TRAIL, mofologie – motilita
DĚDIVÉ ZDROJE DIVERZITY NÁDOROVÝCH BUNĚČNÝCH POPULACÍ Dědičné mutace
Makroscopická (lineární) vs mikroskopická stádia (non-lineární)
Evoluce mutací – stochastický proces
Náhodné mutace a výhoda, neutrální a mírná nevýhoda
INTRATUMORÁLNÍ KLONÁLNÍ DIVERZITA 1. Buněčná genetická heterogenita 2. Klonální genetická heterogenita – genetické odlišnosti amplifikované klonální expanzí - leukémie - prsa - prostata - střevo - mozek - jícen - gynekologické
ODEBÍRÁNÍ VZORKŮ • Biopsie (50% obsah nádoru – sensitivita zachycených heterozygotních změn – 25% u NGS) • Postchirurgické vzorky • Velikost • Poměr signal-to-noise • Kvantita a kvalita • Mikrodisekce – malé, homogenní
ZDROJE KLONÁLNÍ HETEROGENITY • „Jackpot mutace“ • Selektivní síly (pozitivní selekce, téměř fixace) • Odlišné klony - proliferující neoplastické buňky - parenchyma - stroma - pojivo a cévy • Principy ekologie
HETEROGENITA METASTÁZ Klonální vztah mezi primárními a metastazujícími nádory?
Úroveň heterogenity u metastazujících nádorů?
BIOLOGICKÝ DOPAD KLONÁLNÍ HETEROGENITY 1. Klonální diverzita – vstup pro selekční tlak 2. Biologické interakce mezi klony 3. Extinkce tumoru a jeho evoluční adaptace (CML)
BIOLOGICKÉ INTERAKCE KOMPETICE • Nejsilnější interakce • Integrovaná tkáň – intrinzně a extrinzně nádorově supresivní (senescence, smrt, ztráta kmenovosti, TSG), prostorová organizace – SCs – malé „ostrůvky“ • Ekologický systém • Limitované zdroje
BIOLOGICKÉ INTERAKCE AMENSALIZMUS • Interferenční kompetice • Houby - baktérie • Bcr-Abl – upregulace 24p3 (iron transportér) • In vitro a in vivo • Primární vs metastatické nádory
BIOLOGICKÉ INTERAKCE ANTAGONIZMUS • Predace and parasitism
BIOLOGICKÉ INTERAKCE KOMENSALIZMUS A MUTUALIZMUS
• Pozitivní interakce • Přežívání a proliferace • Experimentálně neprokázáno
