Stanovení spolehlivosti metod při detekci fluidních, intermediálních a nefluidních kmenů patogena Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus tuzemské a zahraniční provenience. EKOTECH –Metody detekce rostlinných patogenů Doc. Ing. Ivan Mráz, CSc. BC AV ČR, v.v.i. Ústav molekulární biologie rostlin
Obsah přednášky 1) Škodlivost bakterióz. 2) Charakteristika bakterie Cms - hostitelský okruh - škodlivost - geografické rozšíření - symptomy - epidemiologie - ochranná opatření 3) Testování spolehlivosti vybraných metod při detekci F, I a NF variant Cms. 4) Vyhodnocení použitých metod.
Škodlivost bakterióz • Celkem cca 400 původců bakterióz, fytoplazmóz a spiroplazmóz, 1/5 – 1/4 (80 – 100) – výskyt na území ČR. • Ze 162 hospodářsky důležitých infekčních chorob zemědělských plodin ve střední Evropě 8% bakteriálního původu. • Ztráty - každoročně v Evropě 13% sklizně.
Ekonomický význam chorob
Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus [(Spieckermann & Kotthoff 1914) Davis, Gillaspie, Vidaver & Harris 1984]
http://forum.zira3a.net/my-files/3732_01238601944.jpg
Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus • • • • • • • • •
Prokaryota Mikroskopický jednobuněčný organismus Koryneformní, kyjovité buňky, G+ Nesporulující nepohyblivé bakterie (atrich) Nepigmentující,obligátně aerobní Velikost 0,3-1,1 x 0,5-4,0 um Typický okluzogen Karanténní organismus S a R-formy
Hostitelské rostliny, škodlivost patogena • Brambor – jediný přirozený hostitel. • Výnosové a skladovací ztráty 15-40 i 50% (nevzcházivost, menší počet a velikost hlíz, hniloba hlíz v půdě a při skladování. oregonstate.edu/potatoes/CSS322 WebNotes.html
Výskyt patogena v ČR
• Rok 1996 – zjištěn první výskyt patogena, zavlečen s dováženou sadbou ze západní Evropy.
Geografické rozšíření patogena
Domnělý výskyt: střední a jižní Amerika: Haiti, Mexiko, Kostarika, Panama, Venezuela, Peru Evropa: Belgie, Švýcarsko Asie: Libanon, Afghánistán, Kambodža, Vietnam
Symptomy choroby
http://www.google.z/imgres?imgurl
www.forestryimages.org/browse/detail.cfm?imgn
Obtížná diagnóza v porostu. • První symptomy - konec července Vadnutí stonků, svinování listů, hnědé nekrózy na okrajích listů.
Symptomy choroby
www.eppo.org/.../CORBSE_images.htm
www.ukpandi.com/UKPandI/Infopool.nsf/html/LPCtC8
• Hlízy: sklovitě žluté, později až hnědé zbarvení a změknutí cévních svazků i přilehlého pletiva. Rozklad pletiva, světle zbarvená kašovitá hmota. Slabě napadené hlízy - žádné symptomy.
Epidemiologie • Zdroje nákazy - infikované hlízy (krájení, napichovací sázecí mechanismus, kontaminované sklízecí stroje, obaly, dopravní prostředky), rozšíření patogena z matečných hlíz cévami do cévního systému a přes stolony do dceřinných hlíz - půda – nepatrný význam (nepřezimují), průnik do cévního systému často přes poranění farmerfredrant.blogspot.com /2009/08/whats-pot.
Epidemiologie • Šíření patogena během vegetace z nemocných na zdravé rostliny – velmi řídký jev • Rozvoj choroby - půdní teplota nad 18 °C - nadzemní teplota cca 24 °C Chladné počasí – infikované rostliny často asymptomatické
Možnosti ochrany proti Cms • Legislativní opatření Zákon č. 326/2004 Sb. o rostlinolékařské péči a o změně některých souvisejících zákonů, pozměňující zákony č.131/2006 Sb. a č. 249/2008 Sb.
-
http://www.moreauvysocina.cz/matrot-samochodne -postrikovace.html
Vyhláška č. 215/2008 Sb. o opatřeních proti zavlékání a rozšiřování škodlivých organismů rostlin a rostlinných produktů (18 bakterióz vč. Cms).
Možnosti ochrany proti Cms • Legislativní opatření Vyhláška č. 331/2004 Sb., o opatření k zabezpečení ochrany proti zavlékání a šíření původce bakteriální kroužkovitosti bramboru a původce bakteriální hnědé hniloby. -
• Produkce a výsadba zdravé sadby Netoleruje se výskyt nemocných trsů, zamořené pozemky – 2 roky nepěstovat brambory.
• Šlechtění na rezistenci Získáno několik tolerantních odrůd, příliš nepěstovány.
Testování spolehlivosti některých metod při detekci Cms (F, I, NF variant)
• Testováno celkem 57 izolátů Cms (F, I, NF varianty) ze 13 zemí (genetické, imunochemické, biochemické, patogenní vlastnosti)
http://www.padil.gov.au/pbt/files/uall/pbt23-nbymedium.jpg
Testování spolehlivosti některých metod při detekci Cms (F, I, NF variant)
• Morfologie bakteriálních kolonií Cms - fluidní (hladké, mukoidní) – častější výskyt - intermediální (méně fluidní) - nefluidní (drsné, nemukoidní) – produkce nedostatečného množství EPS nebo rozdílné EPS oproti fluidním
Testování spolehlivosti některých metod při detekci Cms (F, I, NF variant) • Nefluidní kmeny – nedetekovatelné při použití protilátek proti EPS fluidních kmenů v ELISA testu či dvojité difúzi v agaru • Použité metody: ELISA, IFAS, BIOLOG, FAA, PCR, BOX - PCR, dot blot hybridizace, testy patogenity na lilku
Použité metody • DAS - ELISA test Použity komerční monoklonální protilátky (Agdia, USA). Fluidní kmeny detekovány spolehlivěji než kmeny intermediální a nefluidní.
• IFAS (indirect fluorescent antibody stain) cs.wikipedia.org/wiki/ELISA
Použité metody • IFAS Spolehlivě detekovány všechny kmeny Cms, ačkoliv v populacích některých drsných kmenů zaznamenány i atypické buňky.
http://www.vidia.cz/wysiwyg/soubory/katalogy/katalog_CZ_k10.pdf
Použité metody • PCR (Pastrikovy primery) Spolehlivě detekovány všechny kmeny bez ohledu na stupeň fluidity, 1% gel. VAP 502 bp. PCR 16 fluidních a nefluidních Cms kmenů
Použité metody • Dot blot hybridizace Neradioaktivní sonda značená digoxigeninem, sonda = amplifikát (502 bp) kmene Cms PD59 (F, Argentina), spolehlivě detekovány všechny kmeny bez ohledu na stupeň fluidity. Dot blot 32 F, I a NF kmenů Cms
Použité metody • Rep-PCR (primer BOX) Nestanoveny žádné skupiny ve vztahu k morfologii kolonií, provenienci izolátů apod. Potvrzena vysoká homogenita Cms. BOX-PCR 26 F, I a NF kmenů Cms
Použité metody • BIOLOG NF kmeny vykazují klesající metabolickou aktivitu ve srovnání s F – identifikovány pouze na úroveň druhu nebo nedostatečně. Fluidní kmeny detekovány spolehlivěji než kmeny intermediální a nefluidní. http://plantpath.ifas.ufl.edu/FAME2/Biolog.jpg
Použité metody • Testy patogenity na lilku Vykazují rozdíly mezi F, I a NF kmeny Cms. NF a některé I kmeny vykazují na hostitelských rostlinách atypické symptomy, některé kmeny jsou asymptomatické. http://cs.wikipedia.org/wiki/Soubor: Solanum_melongena_ja001.jpg
Použité metody • Analýza mastných kyselin (FAA) Určeno několik skupin, nemají spojitost s morfologií kolonií, původem kmenů apod. Potvrzena vysoká homogenita Cms. plantpath.ifas.ufl.edu/Fame/Default.htm
Použité metody • Sekvenování Osekvenována (Pastrikovy primery) část genomu čtyř Cms kmenů (F, I, NF) z různých evropských zemí a USA. Nenalezeny rozdíly mezi jednotlivými sekvencemi.
www.naturalsciences.be/.../Volume%20137 (2).htm www.naturalsciences.be/.../Volume% 20137(2).htm
Závěr – vyhodnocení
Nejvhodnější metody pro detekci Cms jsou PCR (popř. dot blot či repPCR při použití referenčního kmenu), imunofluorescence a analýza mastných kyselin.
Děkuji za pozornost.
