PENGEMBANGAN METODE DETEKSI Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis PADA BENIH TOMAT
TITI SUMARTI
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2009
2
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER INFORMASI Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Pengembangan Metode Deteksi Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis pada Benih Tomat karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Bogor, Februari 2009
Titi Sumarti NIM A451064124
3
ABSTRACT TITI SUMARTI. The Development of Detection Method for Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis on Tomato Seed. Supervised by GIYANTO and KIKIN HAMZAH MUTAQIN. Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Cmm), the causal agent of bacterial cancer of tomato, is of special interest because of its damage and worldwide distribution. Cmm is recorded as an important pathogen in the pest quarantine list in the European Community and many other countries. The objective of this research is to develop detection method for Cmm on tomato seed which has some advantages i.e. easy, quick, and accurate. The research was conducted in Bacteriology and Bio-molecular Laboratories at Balai Besar Uji Standar Karantina Pertanian, Jakarta, during July 2008-February 2009. The research included isolation and identification of Cmm from plant, comparison of nucleic acid extraction methods and PCR conditions, and detection of Cmm from eight tomato seed varieties. This study showed that Cmm was detected on tomato stem obtained from Solok, West Sumatera. Identification of bacterial isolates as Cmm was carried out with BiologTM, ELISA, and PCR assay. Extraction methods of Cmm from SCM broth in which bacterium-artificially inoculated tomato seed was grown with different incubation periods (6, 12, and 24 hours) resulted in positive detection with ELISA. Absorbance value of sample extracted from bacterium-grown SCM broth was higher than that of extracted from PBS buffer. Detection using PCR assay showed that Cmm was positively detected in both SCM broth and PBS buffer grown with tomato seed that artificially infested with Cmm at 107 CFU/ml and were incubated for 24 hour. Cmm was detected on one of eight varieties of tomato seed using PCR test. Key words: tomato seed, C. michiganensis subsp. michiganensis, detection, isolation, identification, incubation, Biolog, ELISA, PCR
4
RINGKASAN TITI SUMARTI. Pengembangan Metode Deteksi Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis pada Benih Tomat. Dibimbing oleh GIYANTO dan KIKIN HAMZAH MUTAQIN. Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Cmm) adalah penyebab penyakit kanker bakteri pada tanaman tomat yang mendapat perhatian khusus karena tersebar luas di dunia. Cmm merupakan patogen tanaman yang termasuk dalam daftar patogen karantina di negara-negara Eropa bahkan di dunia internasional. Penelitian ini bertujuan untuk mengembangkan dan mendapatkan metode deteksi Cmm pada benih tomat yang mudah, cepat dan akurat. Penelitian dilaksanakan pada bulan Juli 2008 sampai dengan Februari 2009 di Laboratorium Bakteriologi dan Laboratorium Bio Molekuler Balai Besar Uji Standar Karantina Pertanian, Jakarta. Penelitian meliputi isolasi dan identifikasi Cmm dari tanaman tomat bergejala, perbandingan metode ekstraksi DNA dan kondisi PCR, uji beberapa metode deteksi Cmm pada benih tomat dengan inokulasi buatan, dan deteksi Cmm pada beberapa varietas benih tomat. Hasil penelitian menunjukkan bahwa Cmm sudah ditemukan di Indonesia dan berhasil diisolasi dari batang tanaman tomat bergejala asal kabupaten Solok, Sumatera Barat. Isolat yang diduga Cmm dikonfirmasi dengan metode Biolog, ELISA, dan PCR. Hasil uji konfirmasi dengan ketiga metode tersebut menunjukkan bahwa koloni berwarna abu-abu dengan bentuk tidak beraturan adalah bakteri Cmm. Metode ekstraksi DNA dilakukan dengan empat metode, dan metode ekstraksi menurut Lee et al. (metode 2) merupakan metode ekstraksi DNA terbaik dibandingkan tiga metode ekstraksi DNA lainnya. Kondisi PCR Hadas et al. menghasilkan pita DNA lebih jelas dibandingkan kondisi PCR Santos et al. Metode ekstraksi dengan media cair SCM dengan inkubasi selama 6, 12, dan 24 jam mampu mendeteksi keberadaan keberadaan Cmm pada benih tomat yang diinokulasi secara buatan dengan konsentrasi bakteri 106 - 107 CFU per ml. Nilai absorbansi ELISA pada sampel ekstrak benih dengan media cair SCM umumnya lebih tinggi dibandingkan nilai absorbansi pada ekstrak benih dengan media bufer PBS. Deteksi Cmm berdasarkan uji PCR menunjukkan bahwa Cmm hanya terdeteksi pada benih yang diinokulasi buatan dengan konsentrasi 107 dengan lama inkubasi 24 jam, baik pada ekstraksi dengan media cair SCM maupun bufer PBS. Pengujian dengan metode PCR pada delapan varietas benih tomat yang beredar di pasaran mampu mendeteksi keberadaan Cmm pada salah satu varietas benih tomat, sedangkan pengujian dengan metode ELISA terhadap sampel yang sama menunjukkan hasil negatif. Hal ini karena teknik PCR memiliki sensitifitas yang lebih tinggi dibandingkan dengan ELISA sehingga keberadaan Cmm dalam konsentrasi yang rendah pada benih masih mampu terdeteksi. Kata kunci : benih tomat, C. michiganensis subsp. michiganensis, deteksi, isolasi, identifikasi, inkubasi, Biolog, ELISA, PCR
5
© Hak Cipta milik IPB, tahun 2009 Hak Cipta dilindungi Undang-Undang Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
6
PENGEMBANGAN METODE DETEKSI Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis PADA BENIH TOMAT
TITI SUMARTI
Tesis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Program Studi Entomologi/Fitopatologi
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2009
7
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Ir. Riza Desnurvia, MSc.
8
Judul Tesis
: Pengembangan Metode Deteksi Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis pada Benih Tomat
Nama Mahasiswa
: Titi Sumarti
NIM
: A451064124
Disetujui : Komisi Pembimbing
Dr. Ir. Giyanto, MSi. Ketua
Dr. Ir. Kikin Hamzah Mutaqin, MSi. Anggota
Diketahui
Ketua Program Studi Entomologi/Fitopatologi
Dekan Sekolah Pascasarjana IPB
Dr. Ir. Sri Hendrastuti Hidayat, MSc.
Prof. Dr. Ir. Khairil Anwar Notodiputro, MS.
Tanggal Ujian : 20 Februari 2009
Tanggal Lulus :
9
PRAKATA Segala puji dan syukur kepada Allah SWT atas limpahan rahmat dan hidayah-Nya kepada penulis sehingga dapat menyelesaikan penulisan tesis yang berjudul “Pengembangan Metode Deteksi Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis pada Benih Tomat”. Salawat dan salam tercurah kepada Rasullulah SAW, keluarga, para sahabat, dan para pengikutnya. Penulis menyampaikan rasa terima kasih yang tidak terhingga kepada Dr. Ir. Giyanto, MSi. dan Dr. Ir. Kikin Hamzah Mutaqin, MSi. atas bimbingan, kesabaran, pengkayaan wawasan, saran, kritik dan dukungan moril yang sangat besar peranannya dalam penyelesaian penulisan tesis ini. Ucapan terima kasih juga disampaikan kepada Ir. Riza Desnurvia, MSc. yang bersedia menjadi Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis. Ucapan terima kasih juga disampaikan kepada Ir. Syukur Iwantoro, MS., MBA, Dr. Ir. Eliza S. Rusli, MSi., Dr. Ir Catur Putra Budiman, MAgric. atas kesempatan yang diberikan kepada penulis untuk mengikuti program magister di IPB. Penulis juga menyampaikan terimakasih kepada rekan-rekan di Balai Besar Uji Standar Karantina Pertanian Nurjanah, Jati Adiputra, Dwi Sugipriatini, Rumenda Ginting, Yani Dawi, Ummu Salamah R, dan seluruh pegawai BBUSKP atas persahabatan dan kerjasamanya. Rasa hormat yang setinggi-tingginya penulis sampaikan kepada kedua orang tua tercinta, ayahanda Resa Sumarno, ibunda Kamsiyah dan kakak dan adik yang telah mencurahkan kasih sayang, doa dan bimbingan. Ucapan terima kasih disampaikan pula pada Bapak (alm.) dan Ibu mertua, kakak dan adik ipar atas doa, dorongan semangat dan bantuan moril selama ini. Ucapan terima kasih yang tidak terhingga juga penulis ucapkan kepada suami tercinta Nana Supriatna dan ananda tercinta Pramudita Ayu Putri Permana atas kesabaran, kasih sayang dan dukungannya. Akhir kata saya haturkan terima kasih kepada semua pihak dan semoga hasil penelitian ini bermanfaat untuk kepentingan umat manusia dan ilmu pengetahuan.
Bogor, Februari 2009 Titi Sumarti
10
RIWAYAT HIDUP Titi Sumarti, SP. dilahirkan di Cilacap pada tanggal 23 September 1976, sebagai anak kelima dari enam bersaudara dari pasangan Bapak Resa Sumarno dan Ibu Kamsiyah. Penulis menempuh pendidikan dasar di SDN II Penyarang di Cilacap pada tahun 1982-1988, tahun 1988-1991 bersekolah di SMPN I Sidareja di Cilacap, dan tahun 1991-1994 bersekolah di SMAN Sidareja di Cilacap. Penulis melanjutkan ke pendidikan tinggi di Universitas Padjadjaran, Fakultas Pertanian, Jurusan Hama dan Penyakit Tumbuhan di Bandung pada tahun 1995-2001 melalui jalur UMPTN (Ujian Masuk Perguruan Tinggi Negeri). Penulis
pernah
bekerja
sebagai
Supporting
Data
Technical
di
PT. AGRICON, Bogor pada tahun 2001-2005. Pada Tahun 2005-2006 penulis diterima sebagai Tenaga Pengendali Organisme Pengganggu Tumbuhan di Stasiun Karantina Tumbuhan Kelas I Samarinda, Kalimantan Timur. Sejak tahun Juli 2006 penulis bekerja sebagai Tenaga Teknis di Balai Besar Uji Standar Karantina Pertanian, Jakarta. Pada tahun 2007 penulis berkesempatan melanjutkan pendidikan ke Program Magister Sains pada Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor, Program Studi Entomologi dan Fitopatologi. Beasiswa pendidikan pascasarjana diperoleh dari Badan Karantina Pertanian Departemen Pertanian RI.
11
DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL .........................................................................................
xii
DAFTAR GAMBAR .....................................................................................
xiii
DAFTAR LAMPIRAN ..................................................................................
xiv
PENDAHULUAN ........................................................................................
1
Latar Belakang ....................................................................................
1
Tujuan ................................................................................................
2
Manfaat Penelitian .............................................................................
3
TINJAUAN PUSTAKA ...............................................................................
4
Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis ..............................
4
Klasifikasi ...............................................................................
4
Biologi dan ekologi . ...............................................................
4
Kisaran inang .........................................................................
5
Gejala .....................................................................................
6
Dampak ekonomi ...................................................................
7
Sebaran geografi ...................................................................
7
Deteksi
dan
Identifikasi
Clavibacter
michiganensis
subsp.
michiganensis ....................................................................................
8
Deteksi dan identifikasi Cmm berdasarkan morfologi dan fisiologi ..................................................................................
8
Identifikasi berdasarkan uji Biolog .........................................
8
Identifikasi berdasarkan uji DAS-ELISA ................................
9
Identifikasi berdasarkan uji PCR.............................................
9
BAHAN DAN METODE ..............................................................................
11
Tempat dan Waktu Penelitian .............................................................
11
Isolasi
dan
Identifikasi
Clavibacter
michiganensis
subsp.
michiganensis dari Tanaman Tomat Bergejala ..................................
11
Isolasi Cmm dari tanaman tomat bergejala ............................
11
Identifikasi Cmm berdasarkan uji Biolog ................................
11
Identifikasi Cmm berdasarkan uji ELISA ................................
12
Identifikasi Cmm berdasarkan uji PCR ...................................
12
x
12 Perbandingan Metode Ekstraksi DNA dan Kondisi PCR .................... Perbandingan
metode
ekstraksi
DNA
13
Clavibacter
michiganensis subsp. michiganensis .....................................
13
Perbandingan kondisi PCR .....................................................
14
Uji Beberapa Metode Deteksi Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis pada Benih Tomat dengan Inokulasi Buatan ..............
14
Inokulasi buatan (Artificial inoculation) ...................................
14
Ekstraksi Cmm pada benih tomat ...........................................
14
Deteksi Cmm dengan metode ELISA .....................................
15
Deteksi Cmm dengan metode PCR ........................................
16
Deteksi Cmm pada Beberapa Varietas Benih Tomat yang Dijual Bebas di Pasaran ................................................................................ HASIL DAN PEMBAHASAN ...................................................................... Isolasi
dan
Identifikasi
Clavibacter
michiganensis
Identifikasi Cmm berdasarkan uji Biolog ................................ Identifikasi Cmm dengan uji ELISA ........................................ Identifikasi Cmm dengan uji PCR .......................................... Perbandingan Metode Ekstraksi DNA dan Kondisi PCR .................... metode
ekstraksi
DNA
17
subsp.
michiganensis dari Tanaman Tomat Bergejala .................................
Perbandingan
16
17 18 19 19 20
Clavibacter
michiganensis subsp. michiganensis ......................................
20
Perbandingan kondisi PCR ....................................................
21
Uji Beberapa Metode Deteksi Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis pada Benih Tomat dengan Inokulasi Buatan ..............
22
Deteksi Cmm dengan metode ELISA .....................................
22
Deteksi Cmm dengan metode PCR ........................................
25
Deteksi Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis pada Beberapa Varietas Benih Tomat yang Dijual Bebas di Pasaran .......
27
Deteksi Cmm dengan metode ELISA ....................................
27
Deteksi Cmm dengan metode PCR .......................................
28
KESIMPULAN DAN SARAN ......................................................................
30
DAFTAR PUSTAKA .................................................................................
31
xi
13
DAFTAR TABEL Halaman 1 Jenis sampel benih tomat yang diuji ....................................................
16
2 Hasil isolasi bakteri yang diduga Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis, hasil konfirmasi pada medium YDC dan identifikasi dengan uji Biolog ................................................................................
19
3 Hasil uji ELISA terhadap dua koloni bakteri yang diduga Cmm ....................................................................................................
19
4 Hasil pengukuran konsentrasi DNA yang diperoleh dengan empat metode ekstraksi DNA ......................................................................... 5 Hasil uji DAS-ELISA terhadap benih tomat yang diinokulasi secara buatan ................................................................................................. 6 Jumlah koloni Cmm yang tumbuh pada media SCM pada pengamatan hari ke-9 setelah plating ................................................. 7 Hasil pengujian DAS-ELISA terhadap beberapa varietas benih tomat.
xii
21 23 24 27
14
DAFTAR GAMBAR Halaman 1
Gejala penyakit kanker bakteri pada tanaman tomat .......................
17
2
Koloni Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis pada media SCM dan media YDC ........................................................................
18
3
Hasil PCR Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis ...........
20
4
Hasil PCR pada DNA hasil empat metode ekstraksi DNA ...............
21
5
Hasil PCR pada dua kondisi PCR ....................................................
22
6
Hasil uji ELISA pada benih tomat dengan lama inkubasi 3 jam, 6 jam, 12 jam, dan 24 jam .......................................................
24
Hasil PCR terhadap templat hasil ekstraksi Cmm pada media cair yang diinkubasikan selama 3 jam, 6 jam, 12 jam, dan 24 jam .........
25
8
Contoh beberapa kemasan benih tomat yang beredar di Indonesia .
27
9
Hasil uji ELISA pada beberapa varietas benih tomat .......................
10
Hasil PCR pada beberapa varietas benih tomat ...............................
7
xiii
28 28
15
DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1
Hasil pembacaan Biolog MicroStation Reader ...................................
34
2
Komposisi media untuk isolasi dan deteksi Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis ...............................................
35
Komposisi larutan bufer yang digunakan dalam penelitian ...............
37
3
PENDAHULUAN Latar Belakang Tomat (Lycopersicum esculentum L.) merupakan salah satu komoditas hortikultura yang terus dikembangkan karena mempunyai nilai ekonomi cukup tinggi dan potensi ekspor yang besar. Namun demikian, banyak kendala yang dihadapi dalam upaya mendukung pengembangan, peningkatan produksi dan mutu produk untuk memenuhi kebutuhan nasional dan ekspor komoditas tomat, di antaranya adalah gangguan hama dan penyakit yang belum dapat diatasi dengan efektif.
Salah satu penyakit penting yang menyebabkan penurunan
produksi tomat adalah penyakit kanker bakteri yang disebabkan oleh Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (selanjutnya disebut Cmm). Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis adalah penyebab penyakit kanker bakteri pada tanaman tomat dan tersebar luas di dunia. Penyakit ini dapat menyebabkan kerugian ekonomi hingga 60% dari produksi tomat di seluruh dunia (Strider 1969 dalam Dreier et al. 1997).
Menurut Sahin et al.
(2002), kejadian penyakit kanker bakteri di Turki pada tahun 2001 mendekati 100% dan mengakibatkan kerugian besar pada pertanaman tomat.
Produksi
bibit tomat di rumah kaca yang terserang penyakit ini mengakibatkan kerugian sebesar 300 ribu dolar AS per tahun di Michigan (Hausbeck et al. 2000). Selain menyerang tanaman tomat, patogen ini juga dilaporkan menginfeksi tanaman cabe di lapangan.
Menurut Thompson (1986) dalam Dreier et al.
(1997), menyatakan bahwa tidak ada kultivar tomat yang resisten terhadap penyakit kanker bakteri ini dan belum ada pengendalian secara kimia yang efektif. Patogen yang terbawa dalam benih tomat merupakan sumber inokulum yang sangat penting bagi bakteri ini (Fatmi and Schaad 1995). Penularan penyakit kanker bakteri melalui benih dilaporkan antara 0.25% hingga 100% (Fatmi and Schaad 1995, CAB International 2007). Cmm merupakan patogen tanaman yang termasuk dalam daftar patogen karantina di negara-negara Eropa bahkan di dunia internasional (European Union (1995) dalam Jahr et al. (2000), Kahn (1982) dan Franken et al. (1993) dalam Dreier et al. 1997).
Berdasarkan surat keputusan Menteri Pertanian
No.38/Kpts/HK.060/1/2006 tanggal 27 Januari 2006, tentang Jenis-jenis Organisme Pengganggu Tumbuhan Karantina (OPTK) Golongan I Kategori A1 dan A2, Golongan II Kategori A1 dan A2, Tanaman Inang, Media Pembawa dan Daerah Sebarnya, Cmm merupakan salah satu jenis OPTK kategori A1 (OPTK
2 yang belum ada di Indonesia) yang harus dicegah penularannya ke dalam wilayah Indonesia. Ketergantungan Indonesia terhadap benih tomat impor dan importasi benih-benih tanaman lainnya memberikan tantangan bagi Badan Karantina Pertanian dalam melakukan deteksi terhadap kemungkinan masuknya Cmm ke dalam wilayah Indonesia melalui benih impor. Hasil penelitian Anwar (2004) menunjukkan bahwa bakteri Cmm sudah masuk ke Indonesia melalui benih tomat impor.
Bakteri Cmm berhasil diisolasi
dari benih tomat komersial yang tidak menunjukkan gejala. Berdasarkan laporan Balai Besar Uji Standar Karantina Pertanian (BBUSKP) tahun 2006, 2007, dan 2008, Cmm telah terdeteksi pada tanaman tomat bergejala yang merupakan sampel pemantauan dari Unit Pelaksana Teknis (UPT) Teluk Bayur Sumatera Barat dengan uji ELISA. CAB International (2007), menyebutkan bahwa bakteri penyebab kanker pada tomat ini juga telah ditemukan di Indonesia yaitu di Jawa dan masuk pada tahun 2002. Akan tetapi sampai saat ini belum banyak data yang menunjukkan bahwa bakteri tersebut telah ditemukan di Indonesia dan sejauh mana penyebarannya. Sebagai OPT baru yang mempunyai potensi menyerang, menetap dan/atau menyebar ke kawasan tertentu, maka perlu dilakukan tindakan karantina untuk mencegah penyebaran yang lebih luas. Dalam rangka mencegah penyebaran Cmm yang lebih luas, maka diperlukan teknik deteksi patogen yang mudah, cepat dan akurat. Metode
pengujian
kesehatan
benih
banyak
dikembangkan
seperti
penggunaan medium semi selektif, uji morfologi, dan uji fisiologi. Metode ini memerlukan waktu yang cukup lama, dan tidak cukup sensitif karena banyaknya antagonis dari flora saprofitik. Metode deteksi yang banyak dikembangkan dan saat ini dilaporkan cukup sensitif dan cepat untuk deteksi patogen tanaman termasuk bakteri patogen yang terbawa benih adalah metode Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) dan Polymerase Chain Reaction (PCR). Berdasarkan hal tersebut di atas maka perlu dilakukan penelitian tentang pengembangan metode deteksi bakteri Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis untuk memperoleh metode deteksi yang relatif cepat dan akurat sehingga dapat digunakan sebagai metode pengujian kesehatan benih dalam rangka tindakan karantina. Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan untuk mengembangkan dan memperoleh teknik deteksi Cmm pada benih tomat yang mudah, cepat dan akurat.
Penelitian juga
3 dilakukan untuk melihat metode ekstraksi dan lama inkubasi ekstrak yang paling sesuai untuk mendeteksi Cmm pada benih tomat. Manfaat Penelitian Hasil penelitian
ini diharapkan dapat digunakan sebagai teknik deteksi
Cmm pada benih tomat yang mudah, cepat dan akurat dalam rangka tindakan karantina
.
TINJAUAN PUSTAKA Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis Klasifikasi Klasifikasi bakteri penyebab kanker pada tomat berdasarkan Agrios (2005); adalah sebagai berikut : Clavibacter termasuk ke dalam kingdom Procaryotae, division Firmicutes, kelas Thallobacteria, genus Clavibacter. Clavibacter mempunyai enam spesies yaitu C. iranicum, C. michiganensis, C. rathayi, C. tritici, C. toxicus, dan C. xyli (Schaad et al. 2001) .
Spesies
Clavibacter michiganensis terdiri atas lima subspesies yaitu C. m. subsp. insidiosus (Cmi), C. m. subsp. michiganensis (Cmm), C. m. subsp. nebraskensis (Cmn), C. m. subsp. sepedonicus (Cms), dan C. m. subsp. tessellarius (Cmt) (Louws et al. (1998), Pastrik and Rainey (1999), Schaad et al. (2001), Gartemann et al. (2003), Burokiene et al. 2005). Clavibacter michiganensis sebelumnya sering disebut dengan nama Corynebacterium michiganense. Biologi dan ekologi Penyakit kanker bakteri dapat ditularkan melalui benih dan mampu bertahan dalam periode waktu yang lama pada benih tomat (Chang et al. 1992). Berdasarkan Fatmi and Schaad (1995) dan CAB International
(2007),
penularan penyakit kanker bakteri melalui benih antara 0.25% hingga 100%. Kejadian penyakit pada tanaman tomat di lahan produksi yang berasal dari benih terinfeksi relatif rendah.
Meskipun demikian, benih terinfeksi adalah
sumber inokulum utama di lahan produksi. Inokulum dari sedikit tanaman sakit yang tumbuh dari benih terinfeksi dapat menghasilkan infeksi sekunder yang tinggi akibat kegiatan seperti pemangkasan, pengikatan, dan pemanenan (Chang et al. 1992). Selain ditularkan melalui benih, penyakit ini juga dapat bertahan pada sisa tanaman tomat, inang alternatif, di dalam tanah, dan menyebar ke tanaman melalui percikan air hujan, aplikasi pestisida, dan air irigasi sehingga Cmm tumbuh pada permukaan daun (Chang et al. 1992). Penyakit ini juga dapat menyebar ke bibit dan tanaman yang lain melalui kegiatan seperti pemangkasan dan pengemasan bibit tanaman, pengikatan dan pemasangan ajir tanaman tomat, membuang daun tua berpenyakit dan rusak, mengurangi tunas dan pengikatan tanaman di rumah kaca, dan umumnya melalui percikan air hujan, irigasi, atau penyemprotan bahan kimia.
Infeksi pembuluh disebabkan oleh pekerjaan
5 manual dan dapat menyebabkan tanaman menjadi kerdil, layu, dan kematian pada tahap awal pertumbuhan (CAB International, 2007). Cmm dapat menyebar dari tanaman dengan infeksi primer ke tanaman sekitarnya melalui percikan air, berpindahnya mesin pertanian, atau melalui pekerja saat kondisi lahan basah, nekrosis pinggir daun dan buah (Ricker and Riedel (1993) dalam CAB International 2007). Bakteri ini juga dapat bertahan sebagai epifit pada permukaan daun tomat. Patogen ini menyebabkan layu pada daun dan mengurangi produksi tanaman (Tsiantos (1987) dan Gleason et al. (1991) dalam CAB International 2007, Chang et al. 1992). Populasi bakteri Cmm menurun dengan cepat ketika sisa tanaman membusuk di tanah, tetapi bakteri ini dapat bertahan cukup lama pada sisa tanaman di permukaan tanah dan dapat menimbulkan penyakit pada musim tanam berikutnya (Gleason et al. 1991 dalam CAB International 2007, Chang et al. 1992. Cmm juga dapat bertahan pada tanaman tomat yang tersisa setelah panen dan pada inang alternatif (Strider 1969 dalam CAB International 2007 ). Menurut van Vaerenbergh and Chauveau (1985), tanaman muda lebih rentan terhadap bakteri kanker. Lama waktu inkubasi bervariasi tergantung pada umur tanaman, tingkat resistensi, temperatur, dan konsentrasi inokulum. Cmm terdapat pada jaringan xylem (Leyns and De Cleene 1983 dalam CAB International 2007) yang menyebabkan rongga kosong karena lisis. Patogen menghasilkan bahan beracun glikopeptida yang mempunyai aktifitas biologi (Miura et al. 1986 dalam CAB International 2007). Menurut Ueno et al. (1994) dalam CAB International (2007) bahwa Cmm menghasilkan suatu toksin dan polisakarida yang tahan panas. Suatu polisakarida dengan berat molekul yang tinggi yang dihasilkan bakteri secara in vitro ditemukan sama dengan yang dihasilkan oleh tanaman dan diperkirakan berasosiasi dengan gejala layu yang dihasilkan pada tanaman tomat (Bulk et al. 1991 dalam CAB International 2007). Kisaran inang Menurut CAB International (2007), Inang utama Cmm adalah tomat (Lycopersicon esculentum), sedangkan inang sekundernya adalah paprika (Capsicum annuum) dan tumbuhan liar black nightshade (Solanum nigrum). Gejala Benih tomat dan tanaman di pembibitan di rumah kaca dengan infeksi berat kadang-kadang tidak menunjukkan gejala dan terlihat normal.
Gejala
pertama di lapangan adalah mengeringnya bagian pinggir daun, kemudian
6 secara perlahan mengering dengan atau tanpa terlihat layu. Tanaman muda yang terinfeksi menjadi kerdil dan layu dengan cepat. Pada infeksi stadium awal, bakteri Cmm mengkoloni pada pembuluh xylem, kemudian berlanjut ke pembuluh phloem, inti sel, dan kortex. Gejala pada bagian atas tanaman, baru terlihat pada stadium akhir. Gejala layu pada tanaman merupakan akibat dari tersumbatnya pembuluh xylem oleh koloni Cmm dalam konsentrasi tinggi dan adanya produksi exopolysaccharides (EPS) dengan berat molekul yang tinggi (Bermpohl et al. dan Meletzus et al. 1993 dalam Jahr et al. 2000). Penyakit kanker bakteri pada tanaman tomat memperlihatkan gejala seperti bintik pada daun, batang, dan buah, serta mengakibatkan kelayuan pada daun dan tunas.
Pada kondisi penyakit yang parah, akhirnya seluruh tanaman
menjadi layu dan roboh. Kanker yang sangat kecil dapat terjadi pada batang dan tulang daun (Agrios 2005). Daun bagian bawah seringkali berwarna putih, lepuh seperti bintik-bintik pada pinggiran daun, menjadi coklat seiring bertambahnya umur tanaman dan akhirnya bintik-bintik tersebut menyatu. Daun layu, menggulung ke atas dan ke dalam, kemudian berubah menjadi coklat dan layu tetapi daun tidak rontok. Layu dapat berkembang secara berangsur-angsur dari satu daun ke daun berikutnya sampai seluruh daun menjadi hancur. Pada batang, tunas, dan tangkai daun terlihat adanya garis berwarna terang, biasanya diantara lipatan petiol dan batang. Terakhir, garis tersebut berkembang menjadi retak dan terbentuk kanker. Pada kondisi yang lembab atau basah massa bakteri melalui permukaan batang yang retak menyebar ke daun dan buah dan menyebabkan infeksi sekunder. Buah yang berkembang menjadi kecil, dengan bintik putih pada bagian tengah yang akhirnya berubah menjadi coklat dan kasar.
Kemudian bintik tersebut
berubah menjadi bintik yang menyerupai mata burung (bird’s eye spot), dengan warna kecoklatan pada bagian tengah dan halo putih yang merupakan karakteristik dari penyakit ini. Pada batang yang terinfeksi, bagian longitudinal jaringan pembuluh berwarna coklat dengan rongga besar timbul dalam inti dan korteks sampai permukaan luar batang, dan membentuk kanker (Agrios 2005, Fahy and Persley 1983). Infeksi lanjut ditunjukkan dengan gejala perubahan warna pada pembuluh berbentuk garis-garis coklat pada batang dan petiole. Pada potongan batang, petiole dan tangkai terutama pada bagian sambungan terjadi perubahan warna putih krem, kuning, atau coklat kemerahan dari jaringan pembuluh dan jaringan
7 gabus. Rongga pada jaringan gabus akan terlihat, dan pada kondisi tertentu, garis-garis berwarna coklat pada batang menjadi gelap dan terbuka menjadi kanker (CAB International 2007, Moffet et al. 1983). Menurut Werner et al. (2002), gejala tanaman yang terinfeksi Cmm adalah terjadinya kelayuan, tanaman menjadi kerdil, terjadi penurunan hasil, dan matinya tanaman. Gejala pada daun yaitu terjadinya nekrosis yang di kelilingi klorosis, luka pada buah berupa bintik berwarna putih yang berkembang menjadi nekrotik. Dampak ekonomi Penyakit kanker bakteri pertama kali dilaporkan di USA pada tahun 1910 dan telah menyebar ke seluruh dunia. Penyakit yang disebabkan bakteri Cmm ini dapat mengakibatkan kehilangan hasil yang serius pada tanaman tomat yang ditanam di rumah kaca dan di lapangan. Kerugian hasil yang disebabkan kanker bakteri di Amerika Serikat, Kanada, dan Kenya dilaporkan mencapai 50 - 80% Chang et al. (1992).
Menurut Hausbeck et al. (2000), penyakit kanker bakteri
dapat mengakibatkan kerugian sebesar 300 ribu dolar AS per tahun pada pertanaman di Michigan. Sebaran geografi CABI (2007) menyatakan bahwa Cmm telah terdapat di negara-negara Eropa (Austria, Belarus, Belgium, Bulgaria, Cyprus, Czech Republic, Former USSR, France, Germany, Greece, Hungary, Italy, Lithuania, Netherlands, Poland, Romania, Russian Federation, Serbia and Montenegro, Slovenia, Spain, Switzerland, Ukraine), negara-negara di Asia (Armenia, Azerbaijan, China, India, Indonesia, Iran, Israel, Japan, Lebanon, Turkey), negara-negara di Afrika (Egypt, Kenya, Madagascar, Morocco, South Africa, Tanzania, Togo, Tunisia, Uganda, Zambia, Zimbabwe), negara-negara di Amerika Tengah dan Caribbean (Belize, Costa Rica, Cuba, Dominica, Dominican Republic, Grenada, Guadeloupe, Panama), negara-negara di Amerika Utara (Canada, Mexico, USA), negaranegara di Amerika Selatan (Argentina, Brazil, Chile, Colombia, Ecuador, Peru, Uruguay), dan negara-negara di Oceania (Australia, New Zealand, Tonga). Di Indonesia, berdasarkan hasil pengujian BBUSKP terhadap sampel pemantauan dari UPT Teluk Bayur (2006, 2007, dan 2008) diketahui bahwa Cmm telah terdeteksi pada tanaman tomat bergejala dari sentra pertanaman tomat di kabupaten Solok Sumatera Barat. Anwar (2004) berhasil mengisolasi
8 Cmm berhasil dari dua lot benih komersial yang tidak menunjukkan gejala pada tahun 2002. Deteksi dan Identifikasi Cmm Deteksi dan identifikasi berdasarkan morfologi dan fisiologi Cmm merupakan bakteri gram positif, aerob, non-motil, tidak berspora katalase positif, oksidase negatif, berbentuk batang lengkung (CAB International 2007, Schaad et al. 2001). Pada medium SCM, koloni Cmm agak cembung, iregular, mukoida, dengan warna abu-abu sampai hitam (gray-to-black), sedangkan pada media YDC koloni Cmm berwarna kuning cerah sampai kuning tua, cembung, dan mukoida (Fatmi and Schaad 1998). Identifikasi berdasarkan uji Biolog Biolog
Microstation
adalah
suatu
alat
yang
digunakan
untuk
mengidentifikasi bakteri, kapang, dan jamur dengan membandingkan karakter organisme dengan data base pada software.
Data base yang tersedia
mencakup lebih dari 1900 spesies bakteri aerob, bakteri anaerob, jamur, dan kapang. Biolog
TM
Identifikasi bakteri gram positif (termasuk Cmm) berdasarkan uji dengan
menggunakan
mikroplate
GP2
yang
didesain
untuk
mengidentifikasi bakteri gram positif yang bersifat aerobik. Mikroplate yang digunakan terdiri dari 95 sumur yang berisi sumber karbon yang berbeda-beda, serta satu sumur berisi air steril sebagai kontrol. Sumuran pada mikroplate yang telah di isi dengan suspensi bakteri, akan bereaksi secara serentak dan memberikan reaksi metabolik dan membentuk pola yang khas sehingga sering disebut “metabolic fingerprint”.
Pola reaksi metabolik pada mikroplate Biolog
memberikan informasi yang sangat baik. Pola metabolik fingerprint kemudian dibandingkan dan diidentifikasi dengan data base pada software
MicrologTM.
Identifikasi dengan uji Biolog didasarkan pada reduksi tetrazolium yang merupakan respon dari proses metabolisme (seperti respirasi). Terbentuknya warna ungu pada sumuran mikroplate menunjukkan reaksi positif (Biolog 2003). Identifikasi berdasarkan uji Double Antibody Sandwich Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (DAS-ELISA) Deteksi bakteri menggunakan teknik serologi telah meningkat pesat sejalan dengan
penggunaan
antibodi
monoklonal
dan
rekombinan.
Keduanya
memungkinkan seleksi target epitop spesifik untuk menghindari hasil positif yang salah (Lopez et al 2003). Metode serologi adalah metode pengujian yang
9 didasarkan pada keberadaan protein dari bahan yang diuji. Prinsip uji serologi adalah terjadinya reaksi spesifik antara antigen dengan antibodi yang akan membentuk kompleks antigen-antibodi. Salah satu diantara teknik serologi yang banyak digunakan adalah ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) karena akurasi, kemudahan dan biaya yang rendah. Teknik ini menggunakan antibodi yang didapatkan dari hewan untuk mengenali protein dari bakteri target. Antibodi dilekatkan pada permukaan sumur dalam microplate dan ekstrak sap tanaman ditambahkan ke dalam sumur. Jika bakteri target terdapat pada tanaman, bakteri tersebut akan melekat pada antibodi. Ekstrak yang tidak terikat akan tercuci sebelum antibodi kedua yang mengenali antibodi pertama ditambahkan. Antibodi sekunder menyebabkan terjadinya pengenalan tidak langsung dari bakteri karena terdapat molekul reporter yang melekat pada antibodi sekunder.
Biasanya enzim bereaksi
terhadap substrat yang berubah warna, kemudian dideteksi secara visual menggunakan microplate reader yang telah dikalibrasi secara hati-hati (Webster et al. 2004). Identifikasi berdasarkan Polymerase Chain Reaction (PCR) Polymerase Chain reaction (PCR) merupakan suatu reaksi in vitro untuk menggandakan jumlah molekul DNA pada target tertentu dengan cara mensintesis molekul DNA baru yang berkomplemen dengan molekul DNA target tersebut dengan bantuan enzim dan oligonukleotida sebagai primer dalam suatu Thermocycler.
Teknik ini dipakai untuk menggandakan atau memperbanyak
urutan basa DNA spesifik.
Deteksi bakteri menggunakan PCR telah banyak
digunakan karena sangat sensitif.
PCR adalah metode pengujian yang
didasarkan pada perbedaan di dalam asam nukleat. Metode deteksi dengan PCR mempunyai keunggulan karena sistem analisisnya cepat, mempunyai sensitifitas yang tinggi, dan dapat mengidentifikasi bakteri patogen dengan titer/jumlah yang sedikit (Babaloka (2003), Lee et al. (1997), Lopez et al. (2003), Pastrik and Rainey (1999). Metode PCR memerlukan DNA polymerase, dNTPs, molekul DNA template, serta dua buah oligonukleotida sebagai primer.
Reaksi amplifikasi sangat
tergantung pada keberadaan enzim polymerase sebagai katalisator, terutama yang bersifat tahan panas. Produk PCR kemudian dielektroforesis melalui gel agarose dengan persentase tertentu untuk memisahkan DNA sesuai dengan ukuran molekulnya, kemudian hasil elektroforesis divisualisasi di bawah lampu
10 ultraviolet. Hasil penelitian Alvarez dan Kaneshiro (2007) menunjukkan bahwa pasangan primer CM3 dan CM4 merupakan pasangan primer yang lebih sensitif dibandingkan pasangan primer CMM-5 dan CMM-6 dalam mendeteksi bakteri Cmm dari benih tomat. Dalam bidang fitopatologi, metode PCR banyak digunakan untuk tujuan deteksi patogen, identifikasi patogen, maupun karakterisasi keanekaragaman patogen.
Dengan demikian, metode PCR secara kontinyu dikembangkan
bersama-sama dengan metode konvensional, maupun metode pengujian lainnya untuk mengidentifikasi Cmm.
BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian dilaksanakan pada bulan Juli 2008 sampai dengan Februari 2009 di Laboratorium Bakteriologi dan Laboratorium Bio-Molekuler Balai Besar Uji Standar Karantina Pertanian, Jakarta. Isolasi dan Identifikasi Cmm dari Tanaman Tomat Bergejala Isolasi Cmm dari tanaman tomat bergejala Tanaman tomat bergejala kanker bakteri diperoleh dari Unit Pelaksana Teknis (UPT) Karantina Teluk Bayur pada bulan Juli 2008 yang berasal dari pertanaman tomat di Kabupaten Solok, Sumatera Barat. Batang tanaman tomat bergejala disterilisasi permukaan dengan alkohol 70%, kemudian dibilas dengan akuades steril, dipotong dan ditimbang sebanyak 5 gram. Kemudian ditambah 50 ml bufer PBS dan dihancurkan dengan grinder selama 1 menit dan diinkubasi selama 6 jam pada suhu ruang. Supernatan dipindahkan ke tabung steril, dan dilakukan pengenceran berseri 100-10-10.
Dari setiap pengenceran dilakukan
plating pada media SCM dalam cawan petri. Kemudian diinkubasikan pada 27oC, dan diamati setiap hari selama 14 hari. Koloni bakteri yang diduga Cmm dimurnikan pada media YDC.
Koloni
bakteri yang berwarna kuning pada media YDC, dilakukan uji Gram. Koloni yang merupakan gram Positif, kemudian diidentifikasi dengan uji BiologTM, ELISA, dan PCR. Identifikasi Cmm berdasarkan uji Biolog Identifikasi koloni yang diduga Cmm dilakukan menggunakan Biolog Microlog 3TM dengan langkah sebagai berikut: Biakan dipanen dengan cotton swab steril dan disuspensikan dalam GN/GP inoculation fluid atau akuades steril, kemudian diukur turbiditasnya dengan Biolog turbiditimeter hingga transmisi 20%. Setelah itu ditambahkan 3 tetes thioglycolate, di campur dengan hati-hati sehingga tidak terbentuk gelembung udara, kemudian suspensi dituangkan dalam cawan petri steril atau reservoir.
Masing-masing lubang mikroplat GP2
diisi 150 µl suspensi bakteri, kemudian diinkubasikan pada 35-370C selama 4-24 jam dan dibaca menggunakan Biolog MicroStation Reader.
12 Identifikasi Cmm berdasarkan uji ELISA Koloni yang diduga Cmm di deteksi dengan metode serologi DAS-ELISA menurut protokol Agdia™, berturut-turut adalah sebagai berikut: antibodi poliklonal dicampur coating buffer dengan perbandingan 1:200, kemudian plat ELISA diisi sebanyak 100 µl per sumur dan diinkubasikan selama 4 jam pada suhu ruang atau semalam pada refrigerator (4 oC). Plat ELISA dikosongkan, dan dicuci dengan PBST 1x (diulang 4-8 kali), kemudian diisi dengan suspensi bakteri, bufer, kontrol negatif, dan kontrol positif, masing-masing sebanyak 100 µl per sumur sesuai lay out pengujian.
Suspensi bakteri disiapkan dengan
mencampur isolat dengan General extraction buffer (GEB) dengan perbandingan 1 : 10. Plat ELISA diinkubasikan selama 2 jam pada suhu ruang atau semalam pada refrigerator (4 oC). (diulang 4-8 kali),
Plat ELISA dikosongkan, dan dicuci dengan PBST 1x
enzim konjugat dicampur dalam ECM buffer dengan
perbandingan 1:200, kemudian dimasukkan sebanyak 100 µl per sumur dan inkubasikan selama 2 jam pada temperatur ruang. Plat ELISA dikosongkan, dan dicuci dengan PBST 1x (diulang 4-8 kali), Substrat PNP dilarutkan dalam PNP buffer dengan perbandingan 1 mg: 1 ml, kemudian diisikan dalam plat sebanyak 100 µl per sumur dan inkubasikan selama 15 sampai 60 menit pada suhu ruang. Pengamatan dilakukan terhadap perubahan warna pada sumur. Apabila warna berubah menjadi kuning menunjukkan bakteri yang diuji positif dan apabila tetap bening menunjukkan bakteri yang diuji negatif.
Pengamatan dapat dilakukan
dengan membaca absorbansi pada microplate reader pada panjang gelombang 405 nm.
Hasil dinyatakan positif apabila nilai absorbansi sampel ≥ 2x nilai
absorbansi kontrol negatif. Untuk menghentikan reaksi, di tambahkan 3M NaOH sebanyak 50 µl per sumur. Identifikasi Cmm berdasarkan uji PCR Ekstraksi DNA.
Koloni bakteri yang diduga Cmm ditumbuhkan pada
medium YDC dan diinkubasikan pada suhu 27oC selama 48-72 jam. Koloni yang tumbuh disuspensikan dalam akuades steril, 5 µl suspensi dicampur dengan 50 µl NaOH (0,05 M) dan direbus selama 15 menit (Anwar 2004). Amplifikasi. DNA hasil ekstraksi diamplifikasi dengan teknik PCR sebagai berikut:
hasil lisis (3 µl) ditambahkan ke dalam 22 µl campuran master mix
(FermentasTM), ddH2O, dan primer, dengan kondisi PCR sebagai berikut: pra denaturasi 94oC, 5 menit; denaturasi 94oC, 1 menit; penempelan (annealing)
13 62oC, 1 menit, sintesis 72oC, 30 detik, dan pasca PCR 72oC, 5 menit. Amplifikasi dilakukan sebanyak 40 siklus (Hadas et al. 2005). Pasangan primer yang digunakan adalah CM3-5’ CCT CGT GAG TGC CGG GAA CGT ATC C 3’ DAN CM4-5’ CCA CGG TGG TTG ATG CTC GCG AGA T 3’. Amplifikasi DNA spesifik Cmm dengan pasangan primer CM3 dan CM4 menghasilkan potongan DNA dengan ukuran 645 bp (Hadas et al. 2005, Santos et al. 1977 dalam Anwar 2004). Hasil amplifikasi dianalisis melalui elektroforesis gel
Visualisasi DNA.
agarose 1,5% mengandung ethidium bromida (0,5 µg/ml) dalam bufer TAE 1x, voltase 70 V selama 60 menit, kemudian diamati dengan UV transiluminator. Hasil positif dengan pasangan primer CM3 dan CM4 berupa pita DNA berukuran 645 bp. Perbandingan Metode Ekstraksi DNA dan Kondisi PCR Perbandingan metode ekstraksi DNA Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis Ekstraksi DNA terhadap biakan murni Cmm dibandingkan dalam empat metode di bawah ini.
Metode 1: Sebanyak 5 µl suspensi dicampur dengan
50 µl NaOH (0,05M) dan dilisis dengan pemanasan dalam air mendidih selama 15 menit (Anwar 2004).
Metode 2: Sebanyak 5 µl suspensi dimasukkan ke
tabung mikro dan disentrifugasi pada 16000 g selama 10 menit.
Pelet
disuspensikan dalam 25 µl NaOH (0,25N) dan direbus selama 2 menit. Suspensi ditambah 25 µl HCl (0,25N), dan 12,5 µl Tris-HCl (pH 8) yang mengandung 0,1% (v/v) Tween 20, dan disentrifugasi 6000 g selama 2 menit. Pelet disuspensikan dalam 62,5 µl TE buffer (pH 7,5).
Metode 3: Sebanyak 5 µl suspensi
dimasukkan ke tabung mikro dan disentrifugasi 16000 g selama 10 menit. Pelet disuspensikan dalam 25 µl NaOH (0,25N) dan 25 µl HCl (0,25 N), kemudian dipresipitasi dengan 0,6x volume isopropanol pada suhu -20oC selama 20 menit. Selanjutnya disentrifugasi pada 16000 g selama 20 menit. Pelet disuspensikan dalam 62,5 µl TE buffer (pH 7,5).
Metode 4: Sebanyak 5 µl suspensi
dimasukkan ke tabung mikro dan disentrifugasi pada 16000 g selama 10 menit. Pelet disuspensikan dalam 100 µl TEN buffer (pH 8 mengandung 4 mg lysozyme), dan dibiarkan selama 1 jam, kemudian ditambahkan 100 µl Sodium Dodecyl Sulphate (SDS) 20% dan divortex, diinkubasikan pada suhu 65oC selama 30 menit.
Selanjutnya ditambahkan 100 µl Na-acetate (3M) dan
dimasukkan dalam es selama 10 menit, kemudian disentrifugasi pada 12000
14 rpm selama 10 menit.
Supernatan dipindahkan ke dalam tabung baru,
ditambahkan Phenol: Chloroform: Isoamylalcohol (25: 24: 1) dengan volume yang sama dan disentrifugasi pada 12000 rpm selama 5 menit, supernatan dipindahkan ke tabung mikro steril dan ditambahkan 1x volume isopropanol, disentrifugasi pada 12000 rpm selama 10 menit. Pelet ditambah 150 µl ethanol 70% dan disentrifugasi pada 12000 rpm selama 10 menit. Pelet dikeringkan, kemudian disuspensikan dalam 62,5 µl TE buffer (pH 7,5) (Lee et al. 2000). Perbandingan kondisi PCR Perbandingan kondisi PCR menggunakan isolat Cmm dengan dua kondisi PCR, yaitu Kondisi 1: pra denaturasi 940C, 1 menit; denaturasi 940C, 1,5 menit; annealing
600C, 1 menit; sintesis 720C, 1,5 menit; dan pasca PCR 720C,
10 menit. Amplifikasi dilakukan sebanyak 35 siklus (Santos et al. (1977) dalam Anwar (2004).
Kondisi 2: pra denaturasi 94oC, 5 menit; denaturasi 94oC,
1 menit; annealing 62oC, 1 menit; sintesis 72oC, 30 detik; dan post PCR 72oC, 5 menit. Amplifikasi diulang sebanyak 40 siklus (Hadas et al. 2005). Uji Beberapa Metode Deteksi Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis pada Benih Tomat dengan Inokulasi Buatan Inokulasi buatan Inokulasi buatan pada benih tomat dilakukan dengan merendam benih tomat (varietas San Marino) dalam suspensi Cmm. Biakan murni Cmm berumur 48 jam disuspensikan dalam akuades steril dan diukur optical density (OD) dengan spectrophotometer pada 480 nm pada nilai OD sebesar 0,67 (setara dengan
108 cfu/ml) (Hadas et al., 2005). Suspensi bakteri tersebut diencerkan
secara berseri untuk konsentrasi 100-107 cfu/ml. Benih tomat yang akan diinokulasi buatan sebelumnya diambil sebagian untuk diekstrak, dan diplating media SCM untuk mengetahui konsentrasi Cmm yang ada pada benih tomat tersebut. Setiap gram benih dicampur dengan 1 ml suspensi bakteri dari setiap pengenceran, kemudian diaduk sampai merata dengan spatula steril dan dibiarkan selama 1 jam pada suhu ruang. Selanjutnya dikeringanginkan selama ± 24 jam pada suhu ruang hingga mendekati kondisi sebelum direndam suspensi bakteri.
Benih disimpan selama 3 minggu pada
suhu ruang sebelum digunakan dalam penelitian.
15 Ekstraksi Cmm pada benih tomat Benih yang diinokulasi buatan dibagi menjadi 8 bagian masing-masing 2 gram, kemudian dihancurkan dengan grinder, ditambah 20 ml SCM broth dan atau bufer PBS. Masing-masing ekstrak dishaker pada suhu ruang selama 3 jam, 6 jam, 12 jam, dan 24 jam, dan disentrifugasi pada 1000 rpm selama 10 menit, kemudian supernatan dipindah ke dalam tabung steril. Untuk uji ELISA, ekstrak diambil sebanyak 1 ml dan disentrifugasi pada 6000 g selama 10 menit, kemudian pelet disuspensikan dalam akuades steril sebanyak 2x, dan disentrifugasi kembali
pada 6000 g selama 10 menit, selanjutnya pelet
disuspensikan dalam 1 ml GEB.
Sedangkan untuk PCR, ekstrak diambil
sebanyak 200 µl dan disentrifugasi pada 16000 g selama 10 menit.
Pelet
disuspensikan dalam akuades steril sebanyak 2x, dan sentrifugasi pada 6000 g selama 10 menit, kemudian pelet digunakan untuk ekstraksi DNA. Deteksi Cmm dengan metode ELISA Koloni yang diduga Cmm di deteksi dengan metode serologi DAS-ELISA menurut protokol Agdia™, berturut-turut adalah sebagai berikut: antibodi dicampur coating buffer dengan perbandingan 1:200, kemudian plat ELISA diisi sebanyak 100 µl per sumur dan inkubasikan selama 4 jam pada suhu ruang atau semalam pada refrigerator (4 oC). Plat ELISA dikosongkan, dan dicuci dengan PBST 1x (diulang 4-8 kali), kemudian diisi dengan suspensi bakteri (isolat disuspensikan dalam GEB, bufer, kontrol negatif, dan kontrol positif, masingmasing sebanyak 100 µl per sumur sesuai lay out pengujian.
Plat ELISA
diinkubasikan selama 2 jam pada suhu ruang atau semalam pada refrigerator (4 oC).
Plat ELISA dikosongkan, dan dicuci dengan PBST 1x (diulang 4-8 kali),
enzim konjugat dicampur dalam ECM buffer dengan perbandingan 1:200, kemudian dimasukkan sebanyak 100 µl per sumur dan inkubasikan selama 2 jam pada temperatur ruang. Plat ELISA dikosongkan, dan dicuci dengan PBST 1x (diulang 4-8 kali), Substrat PNP dilarutkan dalam PNP buffer dengan perbandingan 1 mg: 1 ml, kemudian diisikan dalam plat sebanyak 100 µl per sumur dan inkubasikan selama 15 sampai 60 menit pada suhu ruang. Pengamatan dilakukan terhadap perubahan warna pada sumur. Apabila warna berubah menjadi kuning menunjukkan bakteri yang diuji positif dan apabila tetap bening menunjukkan bakteri yang diuji negatif.
Pengamatan dapat dilakukan
dengan membaca absorbansi pada microplate reader pada panjang gelombang 405 nm.
Hasil dinyatakan positif apabila nilai absorbansi sampel ≥ 2x nilai
16 absorbansi kontrol negatif. Untuk menghentikan reaksi, di tambahkan 3M NaOH sebanyak 50 µl per sumur. Deteksi Cmm dengan metode PCR Ekstraksi DNA yang digunakan untuk deteksi Cmm pada benih yang diinokulasi buatan adalah teknik dengan hasil terbaik dari perbandingan empat metode ekstraksi DNA yang dilakukan sebelumnya.
DNA hasil ekstraksi
diamplifikasi dengan teknik PCR sebagai berikut: Sebanyak 5 µl hasil ekstraksi DNA ditambahkan ke dalam 20 µl campuran master mix (FermentasTM), ddH2O, dan pasangan primer CM3 dan CM4, dengan kondisi PCR terbaik dari perbandingan 2 metode yang telah dilakukan sebelumnya. Deteksi Cmm pada Beberapa Varietas Benih Tomat yang Beredar di Pasaran Deteksi Cmm pada beberapa varietas benih tomat yang diperoleh dari pasaran dilakukan dengan menggunakan metode deteksi dan ekstraksi terbaik pada percobaan yang telah dilakukan sebelumnya.
Jumlah yang digunakan
dalam penelitian ini masing-masing varietas adalah 2000 benih. Deteksi Cmm pada beberapa varietas benih tomat dilakukan dengan metode ELISA dan PCR. Benih tomat yang diuji diperoleh dari pasaran. Tabel 1 Jenis sampel benih tomat yang diuji No
Nama varietas
Produsen/Asal Benih
1
Marta
PT. East West Seed Indonesia
2
Arthaloka
PT. East West Seed Indonesia
3
Ratna
PT. East West Seed Indonesia
4
Cosmonot
PT. Tanindo Subur Prima
5
Idola
PT. Tanindo Subur Prima
6
Sakura
PT. Tanindo Subur Prima
7
Viccario
PT. Sang Hyang Seri
8
Tomat lokal
Malino
HASIL DAN PEMBAHASAN Isolasi dan Identifikasi Cmm dari Tanaman Tomat Bergejala Gejala penyakit pada tanaman tomat akibat infeksi Cmm yang ditemukan di Kabupaten Solok Sumatera Barat adalah terjadinya benjolan/kanker pada batang tanaman, kemudian batang menjadi pecah, dan pada gejala lanjut batang mengering dan akhirnya mati (Gambar 1).
(a)
(b)
(c)
Gambar 1
Gejala penyakit kanker bakteri pada tanaman tomat (a) gejala awal berupa benjolan pada batang, (b) batang berwarna keabu-abuan dan pecah (gejala lebih lanjut), (c) batang tanaman tomat yang terserang parah (batang berwarna coklat, mengering, dan mati)
Koloni bakteri yang berhasil diisolasi pada medium SCM dan diduga Cmm, memperlihatkan bentuk dan warna koloni yang khas dan dapat dibedakan dari koloni bakteri lainnya pada pengamatan hari ke-9 setelah plating. Pada medium SCM, koloni Cmm agak cembung, iregular, mukoida, dengan bercak internal warna hitam atau abu-abu dengan halo berwarna putih, sedangkan pada medium YDC koloni Cmm berwarna kuning muda sampai kuning tua, cembung, dan mukoida (Gambar 2).
Hal ini sesuai dengan hasil penelitian Fatmi and
Schaad (1998), Schaad et al. (2001).
18
1
2
(a)
(b) Gambar 2
(c) Koloni bakteri: (a) 1. Koloni C. citreum pada media SCM, 2. koloni Cmm pada media SCM; (b) Koloni Cmm pada media YDC; (c) Koloni C. citreum pada media YDC
Hasil isolasi Cmm dari batang tomat bergejala kanker bakteri, tumbuh dua koloni bakteri yang memperlihatkan ciri morfologi agak cembung, iregular, mukoida, dengan bercak internal warna hitam atau abu-abu dengan halo berwarna putih, dan pada medium YDC, koloni berwarna kuning muda sampai kuning tua, cembung, dan mukoida, sehingga perlu dilakukan identifikasi lebih lanjut yaitu dengan uji Biolog, ELISA, dan PCR. Identifikasi Cmm berdasarkan uji Biolog Hasil uji Biolog menunjukkan bahwa koloni berwarna abu-abu dengan bentuk tidak beraturan pada media SCM merupakan koloni bakteri Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis dengan probability 95%, sedangkan koloni bulat berwarna hitam dengan halo putih teridentifikasi sebagai bakteri Curtobacterium citreum dengan probability 99%. MicroStation Reader dapat dilihat pada Lampiran 1.
Hasil pembacaan Biolog
19 Tabel 2
Hasil isolasi bakteri yang diduga C. michiganensis subsp. michiganensis, hasil konfirmasi pada medium YDC dan identifikasi dengan uji Biolog Warna koloni pada media YDC
Koloni pada media SCM
Hasil uji Biolog
Koloni bulat warna hitam dengan halo putih
Kuning tua
Curtobacterium citreum (99%)
Koloni tidak beraturan, keabu-abuan
Kuning muda
Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (95%)
Identifikasi Cmm berdasarkan uji ELISA Hasil uji ELISA menunjukkan bahwa koloni berwarna keabu-abuan dengan bentuk tidak beraturan merupakan bakteri Cmm. Hasil uji ini dapat membuktikan bahwa salah satu koloni bakteri yang berhasil diisolasi dari batang tanaman
tomat
bergejala
adalah
Clavibacter
michiganensis
subsp.
michiganensis. Tabel 3
Hasil uji ELISA terhadap dua koloni bakteri yang diduga Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Cmm)
Koloni pada media SCM
Warna koloni pada media YDC
Koloni bulat warna hitam dengan halo putih Koloni tidak beraturan, keabu-abuan
1)
Nilai absorbansi ELISA (A405 nm)1)
Kuning tua
0,319
Kuning muda
0,927*
Kontrol positif
0,802*
Kontrol negatif
0,274
rata-rata dari 2 ulangan
* Hasil positif
Untuk lebih meyakinkan bahwa bakteri yang teridentifikasi sebagai Cmm berdasarkan uji Biolog dan ELISA, maka dilakukan uji konfirmasi dengan PCR. Identifikasi Cmm berdasarkan uji PCR Uji konfirmasi berdasarkan PCR dengan primer spesifik CM3 dan CM4 menunjukkan bahwa koloni berwarna abu-abu dengan bentuk tidak beraturan pada media SCM adalah bakteri Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis.
20
M
700 bp 600 bp 500 bp
I
D
645 bp
Gambar 3 Hasil PCR Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (M= Marker 100 bp ladder, I= Isolat Cmm, D= ddH2O) Isolasi dari batang tanaman tomat bergejala berhasil mendapatkan bakteri Cmm berdasarkan penampilan koloni pada media SCM dan YDC, dan diidentifikasi dengan uji Biolog, ELISA, dan PCR. Perbandingan Metode Ekstraksi DNA dan Kondisi PCR Perbandingan metode ekstraksi DNA Hasil
ekstraksi
DNA
dari
keempat
metode
diukur
menggunakan
spektrofotometer dan menunjukkan bahwa Metode 2 (Lee et al. 2000) menghasilkan konsentrasi DNA tertinggi (4,7 µg/ml) dibandingkan tiga metode ekstraksi DNA lainnya (Tabel 4).
Untuk melihat hasil ekstraksi DNA secara
visual, selanjutnya DNA di PCR dan dielektroforesis pada gel agarosa. Hasil PCR keempat metode ekstraksi DNA menunjukkan bahwa ekstraksi DNA yang menghasilkan konsentrasi DNA tertinggi (4,7 µg/ml) menghasilkan pita DNA yang paling jelas (Gambar 4). Dari hasil tersebut, maka untuk pengujian selanjutnya digunakan metode ekstraksi DNA dengan Metode 2 sebagai berikut : Sebanyak 5 µl suspensi dimasukkan ke tabung mikro dan disentrifugasi pada 16000 g selama 10 menit. Pelet disuspensikan dalam 25 µl NaOH (0,25N) dan direbus selama 2 menit. Suspensi ditambah 25 µl HCl (0,25N), dan 12,5 µl Tris-HCl (pH 8) yang mengandung 0,1% (v/v) Tween 20, dan disentrifugasi 6000 g selama 2 menit. Kemudian Pelet disuspensikan dalam 62,5 µl TE buffer (pH 7,5).
21 Tabel 4 Hasil pengukuran konsentrasi DNA yang diperoleh dengan empat metode ekstraksi DNA Ekstraksi
Konsentrasi DNA (µg/ml)
Metode 1
3,9250
Metode 2
4,7000
Metode 3
2,6000
Metode 4
1,0250
M
M1
M2
M3
M4
D
700 bp 645 bp 600 bp 500 bp
Gambar 4 Hasil PCR pada DNA hasil empat metode ekstraksi DNA (M= Marker 100 bp ladder, M1= Metode 1, M2= Metode 2, M3= Metode 3, D= ddH2O) Perbandingan kondisi PCR Visualisasi DNA hasil PCR menunjukkan bahwa kondisi PCR menurut Hadas et al. (2005) menghasilkan pita DNA yang lebih jelas dibandingkan dengan kondisi PCR menurut Santos et al. (1977). Hal ini diduga karena waktu PCR yang dibutuhkan Santos lebih lama (± 151 menit) dibandingkan pada metode Hadas (± 110 menit).
Waktu PCR yang terlalu lama dapat
menyebabkan kerusakan DNA.
Oleh karena itu, pengujian selanjutnya
menggunakan kondisi PCR menurut Hadas et al. (2005) sebagai berikut : pra denaturasi 94oC, 5 menit; denaturasi 94oC, 1 menit; annealing 62oC, 1 menit; sintesis 72oC, 30 detik; dan post PCR sebanyak 40 siklus.
72oC, 5 menit.
Amplifikasi diulang
22
M
700 bp 600 bp
H
S
645 bp
500 bp
Gambar 5
Hasil PCR pada dua kondisi PCR (M= Marker 100 bp ladder, H= Hadas, S= Santos)
Uji Beberapa Metode Deteksi Cmm pada Benih Tomat dengan Inokulasi Buatan Deteksi Cmm dengan metode ELISA Keberadaan Cmm pada benih tomat yang diinokulasi secara buatan dengan konsentrasi bakteri 106 - 107 cfu/ml dengan waktu inkubasi 6, 12, dan 24 jam dapat dideteksi dengan uji ELISA, sedangkan pada inkubasi 3 jam Cmm hanya terdeteksi pada benih yang diinokulasi secara buatan dengan konsentrasi bakteri 107 cfu/ml. Nilai absorbansi ELISA pada ekstrak benih dengan media cair SCM umumnya lebih tinggi dibandingkan nilai absorbansi pada ekstrak benih dengan media PBS bufer. Hal ini diduga karena media SCM mengandung bahan-bahan yang merupakan nutrisi yang cocok bagi Cmm dibandingkan pada PBS. Benih yang diinokulasi bakteri dengan konsentrasi 107 dan diinkubasi dalam media cair SCM selama 24 jam, hasil ekstraksinya menunjukkan nilai absorbansi lebih tinggi dibandingkan dengan ekstrak yang diinkubasi selama 6 jam dan 12 jam (Tabel 5).
Dengan demikian, lama inkubasi berpengaruh terhadap pertumbuhan Cmm
yang diketahui lambat, paling sedikit memerlukan 24 jam inkubasi untuk dapat terdeteksi.
Hasil pengamatan secara visual terhadap perubahan warna pada
plat dapat dilihat pada gambar 6. Berdasarkan
data
hasil
pengujian
dengan
metode
ELISA
secara
keseluruhan, maka untuk pengujian Cmm pada beberapa varietas benih tomat digunakan media cair SCM dengan lama inkubasi selama 24 jam.
Tabel 5 Hasil uji DAS-ELISA terhadap benih tomat yang diinokulasi secara buatan Nilai absorbansi ELISA (A405 nm1)
Sampel SCM
PBS
3 jam
6 jam
12 jam
24 jam
3 jam
6 jam
12 jam
24 jam
Kontrol negatif
0,171
0,176
0,165
0,165
0,171
0,176
0,165
0,165
100
0,223
0,228
0,224
0,222
0,198
0,215
0,252
0,251
101
0,225
0,225
0,226
0,221
0,199
0,266
0,224
0,227
102
0,224
0,228
0,213
0,211
0,195
0,252
0,223
0,222
103
0,213
0,219
0,217
0,214
0,203
0,267
0,200
0,200
104
0,217
0,222
0,218
0,216
0,202
0,294
0,201
0,199
105
0,223
0,241
0,232
0,232
0,209
0,247
0,204
0,204
106
0,237
0,475*
0,530*
0,405*
0,224
0,404*
0,398*
0,543*
107
0,749*
0,869*
0,928*
0,948*
0,968*
0,699*
0,529*
0,541*
Kontrol positif
1,094*
1,058*
1,021*
1,040*
1,094*
1,058*
1,021*
1,040*
1)
rata-rata dari 2 ulangan
* Sampel Positif
23
24
0
1
2
3
4
5
6
7
10 10 10 10 10 10 10 10 Kontrol
+
0
1
2
3
4
5
6
7
10 10 10 10 10 10 10 10 Kontrol
(a)
(b)
(c)
(d)
+
Gambar 6 Hasil uji ELISA pada benih tomat dengan lama inkubasi (a) 3 jam, (b) 6 jam, (c) 12 jam, (d) 24 jam Hasil uji ELISA menunjukkan bahwa Cmm terdeteksi pada benih tomat yang diinokulasi secara buatan dengan konsentrasi suspensi bakteri 106 dan 107 cfu/ml, bukan berarti bahwa jumlah bakteri pada ekstrak benih yang diuji adalah 106 dan 107 cfu/ml. Jumlah bakteri pada benih yang diinokulasi buatan menurun setelah disimpan. Hal ini dibuktikan dengan data jumlah koloni yang tumbuh setelah diplating dengan pengenceran 10-2 pada media SCM (Tabel 6). Tabel 6 Jumlah koloni Cmm yang tumbuh pada media SCM pada pengamatan hari ke-9 setelah plating Sampel
Jumlah koloni Cmm yang tumbuh dengan media ekstraksi SCM broth
Bufer PBS
100
0
0
101
0
0
102
0
0
103
0
0
104
0
0
105
0
0
106
2
1
107
6
2
25 Benih tomat yang diinokulasi buatan dengan suspensi Cmm dengan konsentrasi 3 x 108 cfu/ml, setelah disimpan selama 1 minggu dan ditumbuhkan pada media SCM hanya ditemukan sebanyak 437,8 x 102 cfu/ml (Anwar 2004). Deteksi Cmm dengan metode PCR Hasil deteksi Cmm berdasarkan teknik PCR menunjukkan bahwa hanya benih yang diinokulasi buatan dengan konsentrasi 107 dengan waktu inkubasi 24 jam yang terdeteksi positif (meskipun pita DNA terlihat tipis), baik pada ekstraksi dengan media cair SCM maupun PBS (gambar 6). Hal ini diduga karena banyaknya faktor penghambat/ inhibitor PCR yang masih terikut dalam hasil ekstrasi mengingat metode ekstraksi DNA yang digunakan adalah metode yang sangat sederhana.
ccccccccc cccccccccccc ccc
26 SCM M 1 2
3 4
PBS M 1 2 3 4 5
5 6 7 8 9 10
700 bp 645 bp 600 bp 500 bp
6 7
8
9 10
645 bp
(a) M 1 2
3 4
M 1 2 3 4
5 6 7 8 9 10
700 bp 600 bp 645 bp 500 bp
(b) 5 6 7
8
9 10
6 7
8
9 10
6 7
8
9 10
645 bp
(c) M 1 2
3 4
(d) M 1 2 3 4
5 6 7 8 9 10
5
645 bp
700 bp 600 bp 645 bp 500 bp
(f)
(e) M 1 2
3 4
5 6 7 8 9 10
700 bp 645 bp 600 bp 500 bp
M 1 2 3 4
5
645 bp 645 bp
645 bp
(g)
(h)
Gambar 7 Hasil PCR terhadap templat hasil ekstraksi Cmm pada media cair yang diinkubasikan selama: (a) SCM - 3 jam, (b) PBS - 3 jam, (c) SCM - 6 jam, (d) PBS - 6 jam, (e) SCM - 12 jam, (f) PBS - 12 jam, (g) SCM - 24 jam, (h) PBS - 24 jam (M= Marker 100 bp ladder, 1= Isolat Cmm, 2= ddH2O, 3 - 10= benih tomat yang diinokulasi buatan dengan Cmm pada konsentrasi berturut-turut dari 100-107 cfu/ml)
27 Deteksi Cmm pada Beberapa Varietas Benih Tomat yang Beredar di Pasaran Deteksi Cmm pada beberapa varietas benih tomat dilakukan dengan metode ELISA dan PCR. Berikut adalah contoh beberapa kemasan benih tomat yang akan diuji (Gambar 8).
Gambar 8 Contoh beberapa kemasan benih tomat yang beredar di Indonesia Deteksi Cmm dengan Metode ELISA Cmm tidak terdeteksi pada benih tomat dari delapan varietas yang diuji dengan metode ELISA.
Hal ini diduga karena di dalam benih tersebut tidak
terdapat bakteri Cmm atau sebenarnya ada tetapi dalam jumlah sangat rendah sehingga tidak terdeteksi dengan metode ELISA (Tabel 7). Tabel 7 Hasil pengujian DAS-ELISA terhadap beberapa varietas benih tomat Nilai Absorbansi ELISA (A405 nm)1)
Sampel Marta
0,287
Arthaloka
0,279
Sakura
0,294
Ratna
0,302
Cosmonot
0,262
Idola
0,259
Viccario
0,265
Lokal Malino
0,284
Kontrol positif
1,032*
Kontrol negatif
0,295
1)
rata-rata dari 2 ulangan
* Hasil positif
28 A B
C
D
E
H Kontrol +
F G
Gambar 9 Hasil uji ELISA pada beberapa varietas benih tomat (A= Marta, B= Arthaloka, C= Sakura, D= Ratna, E= Cosmonot, F= Idola, G= Viccario, H= lokal Malino) Deteksi Cmm dengan metode PCR Cmm terdeteksi pada 1 varietas dari 8 varietas benih tomat yang diuji dengan metode PCR. Hal ini karena teknik PCR memiliki sensitifitas yang lebih tinggi
dibandingkan
dengan
ELISA
sehingga
keberadaan
Cmm
dalam
konsentrasi yang rendah pada benih masih mampu terdeteksi. Menurut Lopez et al. (2003), metode PCR konvensional mampu mendeteksi patogen dalam bahan tanaman dengan konsentrasi 103-104 cfu/ml, sedangkan metode ELISA hanya mempu mendeteksi patogen dengan konsentrasi > 105 cfu/ml.
M
700 bp 600 bp 500 bp
645 bp
A
B
C
D
E
F
G
H
I
J
645 bp
Gambar 10 Hasil PCR pada beberapa varietas benih tomat (M= Marker 100 bp ladder, A= Isolat Cmm, B= ddH2O, C= Marta, D= Arthaloka, E= Sakura, F= Ratna, G= Cosmonot, H= Idola, I= Viccario, J= lokal Malino)
29 Dengan terdeteksinya keberadaan Cmm pada salah satu varietas benih tomat yang beredar di Indonesia, maka perlu mendapat perhatian khusus. Langkah awal yang perlu dilakukan adalah memonitor keberadaan penyakit ini dengan cara melakukan pemantauan secara rutin di sentra pertanaman tomat di seluruh Indonesia. Apabila ditemukan tanaman tomat yang terserang penyakit kanker bakteri, maka dapat segera diisolasi untuk mencegah penyebaran yang lebih luas mengingat kondisi iklim di Indonesia cocok bagi perkembangan bakteri Cmm. Bakteri Cmm dapat berkembang dengan baik pada suhu 25-30 0C (EPPO 2005). Metode ELISA mampu mendeteksi keberadaan Cmm pada benih yang diinokulasi buatan dengan konsentrasi 106 dan 107, sedangkan uji dengan PCR hanya berhasil mendeteksi keberadaan Cmm 7
buatan dengan konsentrasi 10 .
pada benih yang diinokulasi
Hasil ini bukan berarti bahwa ELISA lebih
sensitif dibandingkan dengan PCR. Pada metode ELISA jumlah ekstrak yang digunakan 6 kali lebih banyak dibandingkan metode PCR. Pengujian dengan metode PCR pada delapan varietas benih tomat yang beredar di pasaran mampu mendeteksi keberadaan Cmm pada salah satu varietas benih tomat, sedangkan pengujian dengan metode ELISA terhadap sampel yang sama menunjukkan hasil negatif.
Hal ini karena teknik PCR
memiliki sensitifitas yang lebih tinggi dibandingkan dengan ELISA sehingga keberadaan Cmm dalam konsentrasi yang rendah pada benih masih mampu terdeteksi. Berdasarkan hasil penelitian secara keseluruhan, maka dapat diambil kesimpulan bahwa metode deteksi berdasarkan PCR lebih sensitif dibandingkan metode deteksi berdasarkan ELISA.
30
KESIMPULAN DAN SARAN Kesimpulan Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis sudah ada di Indonesia dan berhasil diisolasi dari batang tanaman tomat bergejala asal Kabupaten Solok, Sumatera Barat.
Metode ekstraksi DNA dengan metode 2 (Lee et al. 2000)
memberikan hasil terbaik diantara 3 metode lainnya. Metode ekstraksi dengan media cair SCM dengan waktu inkubasi 24 jam memberikan hasil uji ELISA terbaik berdasarkan nilai absorbansi, meskipun secara visual ekstraksi dengan media cair SCM tidak berbeda nyata dengan PBS. Terdapat satu varietas benih tomat yang terdeteksi positif terhadap Cmm dari delapan varietas benih tomat yang diuji berdasarkan metode PCR. Saran Hasil penelitian dapat digunakan sebagai bahan pertimbangan bagi Badan Karantina Pertanian mengenai status Cmm dalam daftar OPTK pada SK Menteri Pertanian No.38/Kpts/HK.060/1/ 2006 tanggal 27 Januari 2006, tentang Jenisjenis Organisme Pengganggu Tumbuhan Karantina (OPTK) Golongan I Kategori A1 dan A2, Golongan II Kategori A1 dan A2, Tanaman Inang, Media Pembawa dan Daerah Sebarnya. Pemantauan mengenai keberadaan Cmm di Indonesia oleh UPT Karantina Pertanian perlu dilakukan, untuk mengetahui penyebarannya, mengingat ditemukannya Cmm pada benih tomat yang beredar bebas di pasaran Indonesia. Penelitian lanjutan perlu dilakukan dengan lama inkubasi di atas 24 jam, mengingat Cmm merupakan bakteri yang pertumbuhannya lambat.
31
DAFTAR PUSTAKA Agdia.
Reagent set DAS http:// www.agdia.com
ELISA,
Alkaline
Phosphatase
Label.
Agrios G.N. 2005. Plant Pathology. Ed ke-5. San Diego, California: Academic Press. Alvarez A., Kaneshiro W. 2007. Virulensi in bacterial plant pathogens: significance in diversity of populations that cause bacterial cancer of tomato. [jurnal on-line]. [18 Desember 2007]. Anwar A. 2004. Deteksi, identifikasi, dan eliminasi Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Smith) penyebab penyakit kanker bakteri pada tomat yang ditularkan melalui benih [disertasi]. Bogor: Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Babaloka O.O. 2003. Minireview: molecular techniques: an overview of methods for the detection of bacteria. African Journal of Biotechnology vo.2 (12): 710-713. Biolog. 2003. Biolog Microlog System, release 4.2 User Guide. Biolog Cabot Blvd. Hayward, CA 94545. [BKP] Badan Karantina Pertanian. 2006. Keputusan Menteri Pertanian No. 38/Kpts/HK.060/1/2006 : Jenis-jenis Organisme Pengganggu Tumbuhan Karantina (OPTK) Golongan I dan Golongan II (Kategori A1). Tanggal 27 Januari 2006. Departemen Pertanian. Burokiene D., Pulawska J., Sobiczewski P. 2005. Genetic diversity of Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis isolates from Lithuania. Pol. Phytopathol. 38:79-90. CAB International. 2007. Crop Protection Compendium [CD-ROM]. Wallingford, Uk: CAB International. 2 CD-ROM dengan penuntun di dalamnya. Chang R.J., S.M. Ries, and J.K. Pataky. 1992. Local sources of Clavibacter michiganensis ssp. michiganensis in the development of bacterial canker on tomatoes. The American Phytopathological Society. Vol. 82 no. 5. Dreier J., Meletzus D., and Eichenlaub. 1997. Characterization of the plasmid encoded virulence region pat-1 of phytopathogenic Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis. MPMI vol.10 no.2. The American Phytopathological Society. [EPPO] European and Mediterranean Plant Protection Organization. 2005. Normes OEPP EPPO Standards Diagnostics Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis.. Bulletin OEPP/EPPO 35: 275-283. Fahy, P.C. and G.J. Persley. 1983. Plant bacterial diseases a diagnostic guide. Academic Press Australia. Fatmi, M. and Schaad N.W. 1995. Detection of Clavibacter michiganense subsp. michiganense in tomato seed. Di dalam: Saettler A.W., Schaad N.W., Roth D.A., editor. Detection of bacteria in seed and other planting material. St. Paul, Minnesota: APS Press.
32 Fatmi, M. and Schaad N.W. 1988. Semiselective agar medium for isolation of Clavibacter michiganense subsp. michiganense from tomato seed. J. Phytopathology: 78; 121-126. Gartemann K.H., O. Kirchner, J. Engenann, I. Grafen, R. Eichenlaub, A. Burger. 2003. Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis : first steps in the understanding of virulence of a Gram-positive phytopathogenic bacterium. J. Of Biotechnology 106: 179-191. Hadas R, Kritzman G., Klietman F., and Manulis S. 2005. Comparison of extraction procedures and determination of the detection threshold for Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in tomato seeds. J. Plant Pathology: 54; 643-649. Hausbeck M.K., Bell J., Medina-Mora C., Podolsky R., Fulbright D.W. 2000. Effect of bactericides on population sizes and spread of Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis on tomatoes in the greenhouse and on disease development and crop yield in the field. J. The American Phytopathological Society. Jahr, H., J. Dreier, Dietmar Meletzus, Rainer Bahro, Rudolf Eichenlaub. 2000. The Endo – β-1,4-glucanase Cel A of Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis is a pathogenicity determinant required for induction of bacterial wilt of tomato. St. Paul, Minnesota: APS Press. MPMI Vol. 13, No. 7, 2000; pp. 703 – 714. Lee I.M., I.M. Bartoszyk, D.E. Gundersen, B. Mogen, and R.E. Davis. 1997. Nested PCR for ultrasensitive detection of the potato ring rot bacterium, Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus. Applied and environmental microbiology vol. 63 No. 7: 2625-2630. Lee I.M., Lukaesko L.A, and Maroon C.J.M. 2001. Comparison of Dig-Labeled PCR, Nested PCR, and ELISA for detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in field-grown potatoes. J. The American Phytopathological Society. Lopez M.M., E. Bertolini, A. Olmos, P. Caruso, M.T. Gorris, P. Llop, R. Penyalver, and M. Cambra. 2003. Innovative tools for detection of plant pathogenic viruses and bacteria. Int Microbiol 6: 233–243. Louws, F.J., J. Bell, C.M. Medina-Mora, C.D. Smart, D. Opgenorth, C.A Ishimaru, M.K. Hausbeck, F.J. de Bruijn, and D.W. Fulbright. 1998. rep-PCRmediated genomic fingerprinting: A rapid and effective method to identify Clavibacter michiganensis. J. The American Phytopathological Society. Vol.88, 8: 862-866. Moffet M.L., P.C. Fahy, and D. Cartwright. 1983. Corynebacterium. Di dalam: Fahy P.C and G.J. Persley, editor. Plant bacterial diseases a diagnostic guide. Sydney, Academic Press. Pastrik K.H. and F.A. Rainey. 1999. Identification and differentiation of Clavibacter michiganensis subspecies by polymerase chain reaction-based techniques. J. Phytopathology 147: 687-693. Sahin F., H. Uslu, R. Kotan, M.F. Donmez. 2002. Bacterial canker, causd by Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis, on tomatoes in Eastern Anatolia region of Turkey. The British Society for Plant Pathology. http://www.bspp.org.uk/NDR/jan2002/2002-2.asp
33 Schaad N.W., J.B. Jones, W. Chun. 2001. Laboratory Guide for Identification of Plant Pathogenic Bacteria. Ed ke-3. St. Paul, Minnesota: APS Press. van Vaerenbergh JPC and Chauveau JF. 1987. Detection of Corynebacterium michiganense in tomato seed lots. Bulletin OEPP/EPPO. Webster C.G., S.J. Wylie, M.G.K. Jones. 2004. Diagnosis of plant viral pathogens. Current Science 12:1604-1607 Werner N.A., Fulbright D.W., Podolsky R., Bell J, Hausbeck M.K. 2002. Limiting populations and spread of Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis on seedling tomatoes in the greenhouse. Plant Dis. 86: 535-542.
34 Lampiran 1 Hasil pembacaan Biolog MicroStation Reader
35 Lampiran 2 Komposisi media untuk isolasi michiganensis subsp. michiganensis
dan
deteksi
Clavibacter
A. Media SCM Komposisi media SCM adalah sebagai berikut : Bahan
Jumlah bahan per liter media
Sucrose
10,00 g
Yeast extract
0,10 g
K2HPO4
2,00 g
KH2PO4
0,50 g
MgSO4.7H2O
0,25 g
Boric acid
1,50 g
Agar
15,00 g Semua bahan ditimbang, kemudian masukkan ke dalam beaker glass
erlenmeyer dan tambahkan akuades hingga volume mencapai 1000 ml, aduk atau dengan magnetic stirer hingga bahan larut secara merata.
Kemudian
0
autoclave pada suhu 121 C dan tekanan 115 psi selama 15 menit. Setelah di autoclave, biarkan media menjadi dingin sampai suhu 45-50
0
C, dan
ditambahkan antibiotik dengan komposisi sebagai berikut : Komposisi antibiotik media SCM Bahan
Jumlah bahan per liter media
Nicotinic acid
100 mg (dilarutkan dalam 20 ml akuades steril)
Nalidixic acid
30 mg (dilarutkan dalam 1 ml NaOH 0,1M)
Potassium tellurite
10 mg (1% difco)
Cycloheximide
200 mg (dilarutkan dalam 1 ml methanol absolut)
36 B. Media Yeast Extract-Dextrose-CaCO3 (YDC) Komposisi media YDC adalah sebagai berikut : Bahan
Jumlah bahan per liter media
Yeast extract
10 g
Dextrose
20 g
Calcium carbonate, USP light powder
20 g
Agar
15 g Semua bahan ditimbang, kemudian masukkan yeast extract, dextrose, dan
agar ke dalam beaker glass erlenmeyer dan tambahkan akuades hingga volume mencapai 1000 ml, aduk atau dengan magnetic stirer hingga bahan larut secara merata, kemudian masukan Calcium carbonate sedikit demi sedikit sambil terus di aduk. Kemudian di autoclave pada suhu 121 0C dan tekanan 115 psi selama 15 menit.
37 Lampiran 3 Komposisi larutan bufer yang digunakan dalam penelitian Coating Buffer •
Sodium carbonate/Na2CO3
: 1.59 g
•
Sodium bicarbonate/NaHCO3
: 2.93 g
•
Sodium azide/NaN3
: 0.2 g
•
dH2O s/d 1 L
pH diatur sampai 9, 6, kemudian disimpan pada 4 oC General Extraction Buffer (GEB) : •
Sodium sulfite (anhydrous)/Na2SO3
: 1.3 g
•
Polyvinylpyrrolidone (PVP) MW 24 – 40,000
: 20.0 g
•
Sodium azide (NaN3)
: 0.2 g
•
Powdered egg (chicken) albumin, Grade II
: 2.0 g
•
Tween-20
: 20.0 g
•
PBST 1x s/d 1 L
pH diatur sampai 7,4, kemudian disimpan pada 4 oC Phosphate Buffered Saline (PBS) : •
Sodium phosphate/Na2HPO4.2H2O
: 1.15 g
•
Potassium chloride/KCl
: 0.2 g
•
Potassium phosphate/KH2PO4
: 0.2 g
•
Sodium chloride/NaCl
:8g
•
Sodium azide/NaN3
: 0.2 g
•
dH2O s/d 1 L; pH diatur sampai 7,4
PBST/ Wash Buffer : •
Sodium chloride/NaCl
:8g
•
Sodium phosphate/Na2HPO4.2H2O
: 1.15 g
•
Potassium phosphate/KH2PO4
: 0.2 g
•
Potassium diHydrogen orthophosphate/KH2PO4
: 0.2 g
•
Potassium chloride/KCl
: 0.2 g
•
Tween-20
: 0.5 g
•
dH2O s/d 1 L
pH diatur sampai 7,4
38 ECM Buffer : •
Nonfat dried milk
•
PBST 1x s/d 100 ml
: 0.4 g
Bahan diaduk menggunakan magnetic stirer selama 30 menit dan pH diatur sampai 7,4, kemudian disimpan pada 4 oC.
Larutan bufer hanya digunakan
untuk pemakaian 1 hari. Substrate Buffer (PNP Buffer) : •
Magnesium chloride (MgCl2)
: 0.1 g
•
Sodium azide / NaN3
: 0.2 g
•
Diethanolamine
: 97 ml
•
dH2O s/d 1 L
pH diatur sampai 9,8, kemudian disimpan pada 4 0C TE Buffer pH 7,5 •
Tris base
: 0,1211 g
•
EDTA
: 0,0372 g
•
dH2O s/d 100 ml
pH diatur sampai7,5, kemudian disimpan pada 4 0C NaOH 0,25N •
NaOH
•
dH2O s/d 100 ml
:1g
NaOH 0,05 M •
NaOH
•
dH2O s/d 100 ml
: 0,2 g
HCl 0,25 N •
HCl
•
dH2O s/d 100 ml
: 0,925 g
Tris-HCl 0,5M •
Tris-HCl
•
dH2O s/d 100 ml
: 7,878 g
39 TEN Buffer •
Tris-base
: 0,12114 g
•
NaCl
: 0,03507 g
•
EDTA
: 0,03722 g
•
dH2O s/d 100 ml
pH diatur sampai 8,0, kemudian disimpan pada 4 0C
LAMPIRAN
