Sledování životaschopnosti Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis pomocí kultivačních a kultivačně nezávislých metod

MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE

Sledování životaschopnosti Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis pomocí kultivačních a kultivačně nezávislých metod Diplomová práce

Lucie Kubíčková

VEDOUCÍ DIPLOMOVÉ PRÁCE: Mgr. Radka Přibylová, Ph.D. BRNO 2011

Bibliografický záznam Autor:

Bc. Lucie Kubíčková Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav experimentální biologie, Oddělení mikrobiologie

Název práce:

Sledování životaschopnosti Mycobacterium avium. subsp. paratuberculosis pomocí kultivačních a kultivačně nezávislých metod

Studijní program:

Obecná biologie – směr Mikrobiologie

Studijní obor:

Biologie

Vedoucí práce:

Mgr. Radka Přibylová, Ph.D.

Rok obhajoby:

2011

Klíčová slova:

MAP, PMA, kultivace, PCR, HPC, antibiotika

Bibliographic entry Author:

Bc. Lucie Kubickova Faculty of Science, Masaryk Univerzity Department of Experimental biology, Department of Microbiology

Title of thesis:

Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis viability determination using culture and culture independent methods

Degree programme: General Biology – Specialization Microbiology

Field of study:

Biology

Supervisor:

Mgr. Radka Pribylova, Ph.D.

Year of defence:

2011

Keywords:

MAP, PMA, cultivation, PCR, HPC, antibiotics

Abstrakt Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) je původcem paratuberkulózy (Johneho choroba), která se vyskytuje nejčastěji u přežvýkavců, ale může vyvolat onemocnění i

u

jiných

zvířat.

Nemocná

zvířata

přenášejí

onemocnění

především

trusem

a kontaminovaným mlékem, přičemž nejvnímavější skupinou jsou mladí jedinci. Důležitá je proto včasná diagnostika, která se provádí nejčastěji z trusu, tkání, příp. mléka zvířat. Významnou součástí diagnostických metod je odstranění kontaminující mikroflóry vzorků pomocí dekontaminačních postupů, které však mohou způsobit snížení detekovatelných MAP ve vzorku. Při pomnožování MAP v tekutém médiu je rizikem kontaminace rychle rostoucími mikroorganismy z prostředí. Cílem této studie bylo určit životaschopnost různých MAP izolátů po třídenním a pětitýdenním ošetření kombinací antibiotik - vankomycinu, amfotericinu B a kyseliny nalidixové (VAN) pomocí metody kultivace na pevných médiích a kultivačně nezávislé PMA F57 real time PCR (qPCR) metody. Následně bylo sledováno potlačení růstu kontaminant při kultivaci trusu na pevných médiích po jedno až třídenní dekontaminaci 0,9% hexadecylpyridinium chloridem (HPC) a přídavkem VAN antibiotik v médiích. Během pětitýdenního ošetření antibiotiky došlo k úbytku živých MAP buněk, oproti ošetření třídennímu, kdy ke snížení MAP ve vzorku došlo pouze minimálně. Za koncentraci antibiotik, od které bylo možné pozorovat po pěti týdnech statisticky významné snížení životaschopnosti buněk, byla koncentrace 100 µg/ml v případě kultivační metody. V případě PMA

F57

qPCR

byl,

po

pětitýdenním

ošetření,

statisticky

významný

rozdíl

v životaschopnosti MAP zaznamenán již při koncentraci 50 µg/ml. Jako nejméně životaschopný se ukázal laboratorní kmen 6381, naopak nejvíce živých MAP buněk bylo prokázáno v případě terénního izolátu 283/08. Kontaminující mikroflóra trusu byla úspěšně potlačena při působení všech kombinací koncentrací VAN antibiotik bez ohledu na délku dekontaminace.

Abstract Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) is the causal agent of paratuberculosis (Johne's disease) afffecting mainly ruminants, but other animals can be infected as well. Infected animals transmit the disease mainly via faeces and contaminated milk whereas young animals belong to the most susceptible group. For this reason, early diagnosis performed mainly from faeces, tissues or milk play a significant role in disease transmission. Removal of contaminating microflora from biological samples using decontamination agents represents crucial part of the diagnostic methods although they can decrease number of detectable MAP cells in the sample. The aim of this study was to determine the viability of different MAP isolates after three-day and five-week treatment with antibiotics - vancomycin, amphotericin B and nalidixic acid (VAN) using cultivation and culture-independent PMA F57 real time PCR (qPCR) method. Subsequently, effect of one to three day decontamination using 0.9% hexadecylpyridinium chlorid (HPC) and VAN antibiotics in solid media to suppression of the contaminating microflora growth during cultivation of bovine faeces was studied. Five-week treatment wiht VAN antibiotic led to more distinct decrease in MAP viability compared to the three-day treatment. 100 mg/ml of antibiotics was the concentration, which statistically significantly reduced the viability of cells after five-week treatment as determined by culture. Using PMA F57 qPCR, 50 mg/ml was considered as a statistically significant after five-week treatment. Laboratory MAP strain 6381 showed the lowest ability to survive antibiotics treatment. Contaminating microflora from faeces was successfully suppressed

in

all

of decontamination.

combinations

of

VAN

concentrations

regardless

the

time

Poděkování Mnohokrát děkuji Mgr. Radce Přibylové, PhD. za odborné vedení práce, trpělivost a čas, který mi věnovala během vypracovávání této diplomové práce. Nemalý dík patří také Mgr. Petru Králíkovi, Ph.D. za cenné rady a připomínky. RNDr. Vladimíru Babákovi velice děkuji za statistickou analýzu získaných dat. Ráda bych poděkovala také celému kolektivu pracovníků z Oddělení bezpečnosti potravin a krmiv Výzkumného ústavu veterinárního lékařství, v.v.i. za příjemné pracovní podmínky, četné rady a pomoc při práci v laboratoři.

Prohlášení Prohlašuji, že jsem tuto diplomovou práci vypracovala samostatně a pouze s použitím pramenů uvedených v seznamu literatury.

V Brně, dne .................................. ...................................................

Lucie Kubíčková

OBSAH

1.

ÚVOD ............................................................................................................................. 10 1.1.

Taxonomické zařazení Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis ................... 10

1.2.

Charakteristika Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis ............................... 11

1.3.

Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis a jeho role při vzniku onemocnění zvířat a lidí ................................................................................................................. 12

1.3.1.

Paratuberkulóza zvířat ........................................................................................ 12

1.3.2.

Crohnova choroba .............................................................................................. 13

1.4.

Identifikace Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis .................................... 14

1.4.1.

Kultivační metody .............................................................................................. 14

1.4.2.

Molekulárně – biologické metody ...................................................................... 18

1.5.

Metody pro stanovení životaschopnosti Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis ........................................................ 19

1.6.

Odolnost Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis k faktorům vnějšímu prostředí ..................................................................................................................... 21

1.6.1.

Odolnost Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis k antibiotikům a dekontaminačním procesům ............................................................................... 22

2.

CÍLE PRÁCE .................................................................................................................. 26

3.

MATERIÁL A METODY .............................................................................................. 27 3.1.

Bakteriální kmeny ...................................................................................................... 27

3.2.

Trus ............................................................................................................................ 27

3.3.

Materiál ...................................................................................................................... 27

3.3.1.

Půdy pro kultivaci mykobakterií ........................................................................ 27

3.3.2.

Chemikálie .......................................................................................................... 28

3.3.3.

qPCR komponenty.............................................................................................. 29

3.3.4.

Software pro vyhodnocení výsledků .................................................................. 30

3.3.5.

Přístroje............................................................................................................... 30

3.3.6.

Pomůcky ............................................................................................................. 32

3.4.

Metody ....................................................................................................................... 32

3.4.1.

Kultivace Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis v tekutém médiu s/bez antibiotik.................................................................................................... 32

3.4.2.

Stanovení životaschopnosti Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis metodou PMA F57 qPCR .................................................................................. 34

3.4.3.

Kultivace Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis na pevném médiu ... 36 7

4.

3.4.4.

Vyhodnocení metody PMA F57 qPCR a kultivace............................................ 36

3.4.5.

Sledování výskytu kontaminující mikroflóry při kultivaci trusu na médiích s antibiotiky a po ošetření HPC .......................................................................... 37

3.4.6.

Statistická analýza .............................................................................................. 39

VÝSLEDKY ................................................................................................................... 40 4.1.

4.1.1.

Stanovení životaschopnosti Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis po krátkodobém ošetření antibiotiky pomocí PMA F57 qPCR .............................. 40

4.1.2.

Stanovení životaschopnosti Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis po dlouhodobém ošetření antibiotiky pomocí PMA F57 qPCR ............................. 43

4.2.

Kultivační metody...................................................................................................... 48

4.2.1.

Stanovení životaschopnosti Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis po krátkodobém ošetření antibiotiky pomocí kultivace na pevných médiích ......... 48

4.2.2.

Stanovení životaschopnost Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis po dlouhodobém ošetření antibiotiky pomocí kultivace na pevných médiích ........ 49

4.3.

5.

Kultivačně nezávislé metody ..................................................................................... 40

Sledování výskytu kontaminující mikroflóry při kultivaci bovinního trusu na médiích s VAN a po ošetření 0,9% HPC ................................................................... 53

DISKUSE ........................................................................................................................ 56 5.1.

Kultivačně nezávislé metody ..................................................................................... 57

5.2.

Kultivační metoda ...................................................................................................... 59

5.3.

Výskyt kontaminující mikroflóry při kultivaci trusu na médiích s antibiotiky a po ošetření 0,9% HPC ..................................................................................................... 61

6.

ZÁVĚR ........................................................................................................................... 63

7.

PŘEHLED LITERATURY............................................................................................. 65

8

SEZNAM NEJČASTĚJI POUŽÍVANÝCH ZKRATEK

ATB

Antibiotikum

CD

Crohnova choroba (Crohn’s disease)

CPC

Cetylpyridinium chlorid

EMA

Ethidium monoazid

HPC

Hexadecylpyridinium chlorid

MAA

Mycobacterium avium subsp. avium

MAC

Komplex Mycobacterium avium

MAH

Mycobacterium avium subsp. hominisuis

MAP

Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis

MAS

Mycobacterium avium subsp. silvaticum

M7H9

Kultivační médium Middlebrook 7H9

PANTA

Směs antibiotik (polymyxin B, amfotericin B, kyselina nalidixová, trimetoprim a azlocilin)

PCR

Polymerázová řetězová reakce (polymerase chain reaction)

PMA

Propidium monoazid

PTB

Paratuberkulóza (onemocnění zvířat)

VAN

Směs antibiotik (vakomycin, kyselina nalidixová a amfotericin B)

qPCR

Kvantitativní PCR (real time PCR)

9

1. ÚVOD 1.1.

Taxonomické zařazení Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis

Doména: Bacteria Kmen: Actinobacteria Třída: Actinobacteria Řád: Actinomycetales Čeleď: Mycobacteriaceae Rod: Mycobacterium

Dle dřívějšího řazení se rod Mycobacterium dělil na rychle rostoucí druhy s optimem růstu dva až sedm dnů a pomalu rostoucí druhy vyžadující více než sedmidenní kultivaci. Mezi rychle rostoucí druhy byly řazeny zejména mykobakterie vyskytující se běžně v prostředí, jako jsou např. M. fortuitum, M. chelonae, M. kansasii, M. xenopi nebo M. gordonae. Tito zástupci rodu Mycobacterium patří většinou mezi potenciální patogeny člověka, kteří vyvolávají onemocnění především u imunokompromitovaných osob nebo jinak oslabených jedinců. Mezi nejznámější zástupce pomalu rostoucích mykobakterií patří především obligátně patogenní mykobakterie M. tuberculosis způsobující tuberkulózu lidí; M. bovis, původce bovinní tuberkulózy a M. leprae, původce lepry. Do skupiny pomalu rostoucích mykobakterií patří také zástupci komplexu M. avium (MAC). Ten je tvořen čtyřmi poddruhy, a to M. avium subsp. avium (MAA), M. a. subsp. paratuberculosis (MAP), M a. subsp. hominisuis (MAH) a M. a. subsp. silvaticum (MAS). Zástupci MAC jsou obligátní patogeny zvířat a oportunní patogeny pro člověka, zejména pro osoby s genetickou predispozicí, imunokompromitované pacienty, děti nebo starší osoby. MAP bylo poprvé popsáno v Německu roku 1896 profesorem Heinrichem Albertem Johnem a jeho asistentem Langdonem Frothinghamem (Johne a Frothingham 1895) a bylo identifikováno jako původce zánětlivého procesu střevního traktu u přežvýkavců. Onemocnění bylo nazváno paratuberkulóza (PTB); v anglosaských zemích je známé pod názvem Johneho nemoc.

10

1.2.

Charakteristika Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis MAP je fakultativně anaerobní, nepohyblivá, 1-2µm velká, nesporulující tyčka

(Obrázek 1). Buněčná stěna je tvořena především kyselinou mykolovou a je bohatá na lipidy, což ji činí odolnou nejen proti mnoha desinfekčním prostředkům, ale také k běžným laboratorním barvivům, např. barvení dle Grama. Buňky mykobakterií je možné barvit ZiehlNeelsenovou metodou, která je založena na nemožnosti vymýt kyselým alkoholem barvivo jednou navázané v buněčné stěně (tzv. acidorezistentní bakterie, „acid-fast bacteria“).

Obrázek č. 1: Buňky Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis ze skenovacího elektronového mikroskopu

(zdroj: http://www.johnes.org/general/_EM_scanning.html)

Růst MAP je velice pomalý a první viditelné kolonie se objevují po nejméně osmi až šestnácti týdnech kultivace. Některé izoláty MAP, nejčastěji z ovcí, mohou růst i mnohem déle, např. až jeden rok (Kopecna a kol. 2008). Kolonie MAP bývají nejčastěji bílé, malé (12mm) a vypouklé; drsné kolonie květákovitého tvaru jsou viditelné na agarovém Löwenstein – Jensenově médiu bez přídavku Tween 80 (Vanboxtel a kol. 1990). Při růstu v tekutém prostředí vytváří MAP shluky („clumps“), které mohou způsobovat problémy v in vitro experimentech. Další charakteristickou vlastností MAP je to, že nedokáže syntetizovat mykobaktin, což je chelatační činidlo, které je nezbytné pro vázání železa a jeho 11

transport do buňky. Z toho důvodu je nutné přidávat při kultivaci MAP mykobaktin do kultivačního média. Znakem, který odlišuje MAP od ostatních mykobakterií, a který se využívá při jeho identifikaci je přítomnost inzerčního elementu IS900, který se v genomu MAP nachází ve 14 až 18 kopiích (Pavlik a kol. 1999) a jednokopiové sekvence F57 (Poupart a kol. 1993).

1.3.

Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis a jeho role při vzniku onemocnění zvířat a lidí

1.3.1. Paratuberkulóza zvířat

Jak již bylo řečeno výše, MAP je původcem chronické enteritidy zvířat, označované jako patauberkulóza, neboli Johneho nemoc (Johne’s disease). Onemocnění se objevuje především u přežvýkavců, nejčastěji u skotu (Good a kol. 2009, Hasonova a kol. 2009), ovcí (Coelho a kol. 2007), koz (Kruze a kol. 2006) a vysoké zvěře (Pribylova a kol. 2010, Stevenson a kol. 2009), ale bylo také popsáno u různých druhů nepřežvýkavých zvířat (Beard a kol. 1999). PTB, zejména u hospodářských zvířat, způsobuje vysoké ekonomické ztráty. Také diagnostika nemoci a ozdravení stáda je velice nákladnou záležitostí. V devadesátých letech PTB způsobila ročně v USA ztráty 200 až 250 miliónů dolarů (Ott a kol. 1999). V Kanadě byla spočítána průměrná ztráta na jedno stádo 2992 dolarů, tj. 49 dolarů na krávu za rok (Tiwari a kol. 2008). Zdrojem PTB pro zdravá zvířata je nejčastěji trus infikovaného jedince vylučovaný do prostředí (van Roermund a kol. 2007). Mláďata se mohou nakazit také sáním kontaminovaného mléka a kolostra (Nielsen a kol. 2008) nebo nitroděložním přenosem z nakažené matky na mládě (Sweeney a kol. 1992). Pravděpodobnost nitroděložní infekce u subklinických případů je však celkově nízká a pohybuje se okolo 9 %, u klinicky infikovaných krav je 39 % (Whittington a Windsor 2009). Zvířata se většinou nakazí v prvních šesti měsících života, avšak klinické příznaky se objevují až po několika letech (Windsor a Whittington 2010). U mladých jedinců do dvou let probíhá časné stádium infekce bez klinických příznaků. V této fázi nedochází k vylučování bakterií v trusu v detekovatelné hladině a MAP lze prokázat pouze v tkáních zvířete. U dospělých jedinců probíhá nejprve tzv. subklinická fáze, kdy pouze 15-25 % nakažených dospělců vylučuje MAP v trusu v detekovatelném 12

množství. V této fázi není možné tato zvířata rozpoznat pomocí serologických metod, které se rutinně používají pro monitorování stád (Sweeney a kol. 1995). Zvířata v subklinické fázi tak zůstávají dál ve stádu s ostatními zvířaty a šíří původce onemocnění mezi další, zdravé jedince. Zvířata v subklinické fázi přecházejí po určité době do fáze klinické, která je spouštěna stresovými faktory, jimiž jsou nejčastěji nedostatečná výživa, porod nebo laktace (Windsor a Whittington 2010). Klinické stádium je charakterizováno průjmy, hubnutím a sníženou dojivostí a ve většině případů končí úhynem. PTB zvířat se neléčí. Možnost ozdravení stáda spočívá v dlouhodobém provádění kontrolního programu, který je založen na průběžném eliminování nakažených jedinců ze stáda a separovaném odchovu telat (Groenendaal a kol. 2002).

1.3.2. Crohnova choroba

Příznaky paratuberkulózy zvířat připomínají příznaky lidí trpící Crohnovou chorobou (CD). CD je chronické, zánětlivé onemocnění zažívacího traktu člověka, které nejčastěji postihuje terminální část tenkého a tlustého střeva. Příznaky onemocnění jsou nespecifické, ale nejčastěji se projevují bolestmi břicha, váhovým úbytkem, celkovou ztrátou energie, průjmem a horečkou. Dodnes není znám způsob, jak CD zcela vyléčit. Pacientům je možné pouze podávat steroidy či antibiotika (ATB) na zmírnění nebo potlačení zánětlivého procesu. U závažných případů může být provedena operace, při níž se odstraní postižená část střeva (Eshuis a kol. 2008). Počet případů CD každým rokem narůstá, a to především v rozvinutých zemích Severní Ameriky a Evropy (Lakatos 2006). CD je multifaktoriální onemocnění, na jehož vzniku se podílí řada genetických, imunologických, environmentálních a infekčních faktorů (Economou a Pappas 2008). Předpokládá se, že MAP by mohlo být jedním z těchto faktorů, ať už v živém či neživém stavu (Naser a kol. 2004). Pro tuto teorii svědčí nález MAP ve střevní tkáni (Bull a kol. 2003), krvi (Naser a kol. 2004) či mateřském mléce CD pacientů (Naser a kol. 2000). Nejrizikovějším zdrojem MAP pro člověka je, dle této teorie, kontaminované mléko (Cheng a kol. 2005, Grant a kol. 2002). Dalším zdrojem může být voda (Whan a kol. 2005) a vodní aerosol (Pickup a kol. 2005) nebo maso (Mutharia a kol. 2010). Pro určitou spojitost mezi CD a MAP svědčí také strmý nárůst publikací zabývajících se původcem PTB a CD u lidí (Kaevska a Hruska 2010). Jiné studie naopak popírají vliv MAP na vznik choroby, a to

13

zejména z důvodu, že u některých CD pacientů nebylo MAP prokázáno (Parrish a kol. 2009) nebo naopak bylo zjištěno ve střevech zdravých lidí (Scanu a kol. 2007).

1.4.

Identifikace Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis Pro potvrzení PTB pozitivních zvířat se používají metody přímého i nepřímého

průkazu. Mezi metody přímé detekce patří mikroskopie, kultivační a kultivačně nezávislé (molekulárně biologické) metody, mezi metody nepřímé pak metody serologické. Zatímco časově náročné a méně citlivé kultivační metody dokáží rozlišit mezi buňkami mrtvými a živými, rychlé, citlivé a specifické metody založené na polymerázové řetězové reakci (PCR) amplifikují DNA jak z mrtvých, tak ze živých buněk. Řešení přináší použití flourescenčních DNA interkalačních barviv, která na základě molekulárně biologického přístupu dokáží rozpoznat buňky živé narozdíl od mrtvých nebo poškozených. V této podkapitole budou blíže popsány pouze metody přímého průkazu MAP, které byly využívány v experimentální části této diplomové práce.

1.4.1. Kultivační metody

Kultivace se považuje za „zlatý standard“ při identifikaci MAP. Kultivační metody vykazují relativně dobrou specificitu a jsou finančně nenáročné. Jejich nevýhodou je však extrémní časová náročnost (měsíce) a nižší citlivost. Navíc vzorky z trusu nebo střeva bývají vysoce kontaminovány střevní mikroflórou a stejně jako např. vzorky jiných tkání, mléka nebo krve, musí být před samotnou kultivací podrobeny dekontaminaci. Nejčastěji se používá 0,75% hexadecylpyridinium chlorid (HPC) pro dekontaminaci tkání a 0,9% HPC pro dekontaminaci trusu (Reddacliff a kol. 2003), případně 0,75% cetylpyridinium chlorid (CPC; Grant a kol. 2003), nebo NaOH s malachitovou zelení či kyselinou šťavelovou (Kalis a kol. 1999). Při tomto ošetření však nedochází pouze k eliminaci kontaminující mikroflóry, ale usmrtí se tak i značné množství MAP, což vede ke snížené citlivosti kultivačních metod (Gao a kol. 2005, Reddacliff a kol. 2003). Negativní vliv na životaschopnost MAP mají také antibiotika (ATB) přidávána do kultivačních médií k potlačení kontaminující mikroflóry (Gao a kol. 2005).

14

Pevné půdy

Pro kultivaci MAP se používají média na vaječné (Löwenstein – Jensen, Herroldova půda) nebo agarové bázi (Middlebrook 7H10 a 7H11) s přídavkem mykobaktinu J (Obrázek 2). Rychlost růstu a vzhled kolonií závisí na typu použitého média. Kolonie na Löwenstein – Jensen médiu jsou malé s nízkým kontrastem, oproti tomu na Middlebrook médiu bývají kolonie jasně zřetelné (Aduriz a kol. 1995). Na Herroldově půdě mívají kolonie různou velikost i transparenci. Výhoda této metody je vysoká specificita (100 %) a především možnost identifikace živých bakterií. Nevýhodu je nízká citlivost, která vyžaduje minimálně 100 CFU MAP/ml pro zdárnou kultivaci. Pro 80 % úspěšnost kultivací je dokonce nutné, aby ve vzorku bylo až 105 MAP buněk na gram trusu (Kralik a kol. 2011).

Obrázek č. 2: Herroldova vaječná půda se zřetelným nárůstem MAP kolonií

15

Obrázek č. 3: MAP v tekutém Middlebrook M7H9 médiu

Tekuté půdy

Pro pomnožení MAP se používá syntetický bujón Middlebrook 7H9 (M7H9; Obrázek 3), případně Dubos médium (Esteban a kol. 2008). Obě média se vyznačují obsahem albuminové frakce séra a Tween 80. Výhodou tekutých médií oproti pevným je jejich nižší vysýchavost; na druhou stranu MAP má tendenci v tekutém médiu, z důvodu hydrofobních vlastností buněčné stěny, tvořit nežádoucí shluky. Pro zrychlení detekce mykobakterií byly vyvinuty automatické tekuté kultivační systémy, jejichž základ tvoří nejčastěji modifikovaný Middlebrook 7H9, a které jsou založeny na radiometrické nebo fluorescenční detekci růstu bakterií. Pro detekci MAP se používají kultivační systémy BACTEC 12B (Whittington a kol. 1998) a BACTEC 460 TB (Gumber a Whittington 2007), které jsou založeny na radiometrické detekci radioaktivního oxidu uhličitého, jenž je uvolňován v průběhu metabolismu bakterií. V současné době se spíše než radiometrická detekce, používají systémy založené na fluorescenční detekci, jako je např. BACTEC MGIT 960 (Gumber a Whittington 2007), který pomocí indikátoru sleduje změny v obsahu kyslíku, oxidu uhličitého a tlaku uvnitř zkumavek. Kultivační technologie systému ESP II (Harris a kol. 2005) je založena na detekci změny tlaku z důvodu spotřeby kyslíku bakteriemi (Tholcken a kol. 1997). Hlavní výhoda těchto systémů oproti standardní kultivaci je vyšší citlivost a kratší doba kultivace. Nevýhodou automatických kultivačních systémů je 16

vysoký

výskyt

falešně

pozitivních

výsledků

z

důvodu nedostatečného

odstranění

kontaminující mikroflóry. Tento problém je možné významně odstranit dekontaminací a přídavkem ATB do média (Gumber a Whittington 2007). Přesto je nutné přítomnost MAP ve vzorku následně potvrdit pomocí PCR (IS900) nebo mikroskopií dle Ziehl-Neelsena (Whittington a kol. 1998). Jako doplňující metoda ke kultivaci MAP ze vzorku se používá přímá mikroskopie (Obrázek 4). Pro zviditelnění bakterií se využívá barvení buněk dle Ziehl-Neelsena, které odhalí acid-alkohol stabilní bakterie ve vzorku. Metoda barvení dle Ziehl-Neelsena však není specifická – obarví se nejen všechny mykobakterie, ale také příbuzné rody (např. Nocardia). Princip metody spočívá v odolnosti MAP k odbarvení kyselým alkoholem a udržení červeného karbolfuchsinu v buněčné stěně, zatímco ostatní bakterie se barví modře nebo zeleně (metylénová modř nebo malachitová zeleň).

Obrázek č. 4: Pozitivní nález infekce Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis ve tkáni mizní uzliny krávy pomocí barvení dle Ziehl-Neelsena

17

1.4.2. Molekulárně – biologické metody

V současné době začínají být stále častěji kultivační metody nahrazovány identifikací MAP na základě molekulárně biologických metod. Jejich použití umožnil objev specifických DNA inzerčních sekvencí, především mnohakopiových sekvencí IS900 (Green a kol. 1989), jednokopiové sekvence F57 (Poupart a kol. 1993), HspX (Ellingson a kol. 1998) a ISMav elementu (Strommenger a kol. 2001). Tyto sekvence jsou amplifikovány a prokazovány pomocí rychlé a senzitivní PCR, která je schopná identifikovat MAP v nejrůznějších vzorcích. Existuje mnoho variant PCR metod pro detekci MAP, přičemž většina využívá inzerční sekvenci IS900. Pro účely kvanitifikace však není mnohokopiová IS900 sekvence vhodná a využívá se spíše jednokopiová F57 sekvence (Slana a kol. 2008). Dříve používané konvenční a nested PCR jsou v současné době vytlačovány kvantitativní metodou real time PCR (qPCR) umožňující amplifikaci v reálném čase s využitím fluorescenčně značených sond. Nejčastěji používaným systémem je qPCR s využitím TaqMan sond s navázanou flourescenční značkou, které se komplementárně váží na cílovou sekvenci. Při amplifikaci cílové sekvence je sonda odbourávána, čímž dochází k uvolnění flourescenční značky a emisi záření, jehož intenzita je přímo úměrná množství cílové sekvence na začátku experimentu. Následně je pomocí počítače získán grafický výstup qPCR (Obrázek 5). Výhodou qPCR metody oproti klasické PCR je možnost kontinuálního monitorování přírůstku produktu během každého cyklu reakce (u klasického PCR je detekován až finální produkt) a zejména možnost kvantifikace produktu. Existují dva typy kvantifikace, a to kvantifikace absolutní a relativní. Absolutní kvantifikace udává přesný počet kopií dané sekvence ve vzorku a je stanovena na základě kalibrační křivky. Relativní kvantifikace naopak porovnává množství kopií dané sekvence v experimentálním oproti kontrolnímu vzorku. Pro kvantitativní detekci MAP byly vyvinuty a jsou používány různé qPCR systémy založené zejména na IS900 (Pribylova a kol. 2010, Slana a kol. 2008) a F57 sekvenci (Slana a kol. 2008, Tasara a Stephan 2005).

18

Obrázek č. 5: Grafický výsledek qPCR

Na obrázku jsou znázorněny fluorescenční křivky standardů (fialově značné) a tři vzorky MAP (červěně značené). Počet cyklů, po kterých je možné fluorescenci vzorku odlišit od fluorescence pozadí, proporcionálně odpovídá počátečnímu množství DNA ve vzorku.

1.5.

Metody pro stanovení životaschopnosti Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis Z důvodu časové náročnosti kultivací mykobakterií a jejich nízké citlivosti byly

hledány jiné, kultivačně nezávislé metody pro rozlišení živých a mrtvých buněk ve vzorku. Jedním z molekulárně biologických principů pro stanovení živých buněk ve vzorku je využití mRNA, která je syntetizována živými buňkami, a její následné pomnožení pomocí reverzně transkripční qPCR (Birmingham a kol. 2008). Tato metoda však nenašla širšího uplatnění, a to zejména z důvodu nestability RNA, jejího krátkého času rozpadu a náchylnosti k degradaci RNázami běžně přítomnými v prostředí (Birch a kol. 2001). Nemožnost molekulárně biologických metod stanovit životaschopnost bakterií byla překonána přidáním barviv modifikujících DNA do qPCR protokolu. Tato barviva jsou schopná proniknout pouze do buněk s narušenými buněčnými stěnami a membránami, zatímco skrz intaktní buněčné membrány živých buněk neprojdou. Jakmile se jednou barvivo dostane do buňky, dojde k jeho navázání na molekulu DNA (Obrázek 6). Při vystavení 19

jasnému světlu dojde k fotoreaktivaci barviva a vytvoření kovalentní vazby mezi barvivem a DNA, čímž je znemožněna následující PCR amplifikace. Expozice světlem současně způsobí inaktivaci zbývajícího barviva, které neprošlo skrz buněčné membrány. Tím je zabráněno navázání barvy na DNA, která se uvolní z intaktních buněk během procesu DNA izolace.

Porovnáním

dat

získaných

z qPCR

experimentu

na experimentálních

a kontrolních vzorcích ošetřených barvivem je možné zjistit informace o množství živých a mrtvých buňkách v jednotlivých vzorcích (Kralik a kol. 2010).

Obrázek č. 6: Selektivní detekce živých patogenů pomocí PMA a qPCR (Nocker a kol. 2006)

První fluorescentní barvivo testované pro zjištění životnosti bakteriálních patogenů byl ethidium monoazid (EMA; Nogva a kol. 2003). EMA efektivně inhibovala PCR amplifikaci DNA u buněk s poškozenou buněčnou stěnou, avšak byl zjištěn její průnik nejen skrz membrány poškozených, ale také živých buněk (Cawthorn a Witthuhn 2008). Kromě toho se ukázalo, že penetrace EMA barviva do intaktních buněk je závislá na druhu bakterie (Nocker a kol. 2009). Z uvedených důvodů začala být hledána jiná alternativa pro sledování životaschopnosti buněk, což vyústilo v nahrazení EMA za jí chemicky podobnou sloučeninu – propidium monoazid (PMA). V porovnání s EMA je průnik PMA do poškozených buněk vysoce selektivní a průnik do živých buněk nebyl doposud zaznamenán. Efektivnější zábrana vstupu PMA přes membrány živých buněk je zřejmě dána vyšším kladným nábojem PMA v porovnání s EMA barvivem (Nocker a Camper 2009). 20

Poprvé byla PMA použita při sledování životaschopnosti lidských patogenů, jako jsou Escherichia coli 0157:H7, Listeria monocytogenes či Staphylococcus aureus (Nocker a kol. 2006).

Dále

následovaly

Staphylococcus

epidermidis

(Kobayashi

a

kol.

2009),

Bacillus subtillis (Rawsthorne a kol. 2009) a houbovité organismy (Vesper a kol. 2008). První důkaz, o tom, že PMA je možné aplikovat na mykobakterie, poskytl v roce 2006 Nocker a kol. na zástupci Mycobacterium avium, kdy sledoval životaschopnost bakterií vystavených teplotnímu stresu při 85°C a 72°C po dobu 15 minut (Nocker a kol. 2006). Následující studie potvrdila vhodnost PMA pro stanovení viability různých bakteriálních druhů, včetně M. avium, po aplikaci různých desinfekčních postupů (Nocker a kol. 2007, Wahman a kol. 2009). Studie zaměřená na stanovení viability MAP pomocí PMA v kombinaci s F57 qPCR byla provedena v nedávné době (Kralik a kol. 2010).

1.6.

Odolnost Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis k faktorům vnějšímu prostředí

Mimo hostitelský organismus se MAP vyznačuje velkou odolností k vnějšímu prostředí. Whittington a kol. zjistili, že MAP je schopno přežít v trusu až 55 týdnů při podmínkách plného zastínění (Whittington a kol. 2004) a ve vodě a vodním sedimentu po dobu 48 týdnů (Whittington a kol. 2005). Schopnost MAP přežít v prostředí je dána jeho značnou rezistencí k různým fyzikálním i chemickým faktorům. Bylo prokázáno, že MAP je za určitých podmínek schopné přežít nízké koncentrace chlóru (Whan a kol. 2001), teploty používané při pasterizaci mléka (Gao a kol. 2005) nebo nízké pH (Sung a Collins 2003). Schopnost přežívání podmínek pasterace mléka byla přiřazena shlukovací vlastnosti MAP (Grant a kol. 2005), kdy buňky v centru shluku jsou chráněny proti nepříznivým vlivům díky buňkám, které je obklopují v okrajích (Rowe a kol. 2000). Tento fenomén s největší pravděpodobností ovlivňuje přežití MAP také v jiných nepříznivých podmínkách (Whan a kol. 2001). Výše zmíněné faktory ovlivňují rozšíření MAP v prostředí, zvyšují úspěšnost přenosu onemocnění a přežívání agens v organismu hostitele a ve vnějším prostředí. Buňky jsou nejvíce odolné, nacházejí-li se ve stacionární fázi růstu, ve fázi exponenciální jsou naopak citlivější (Bodmer a kol. 2000). MAP je schopno v prostředí přežívat také v dormantním neboli živém, ale nekultivovatelném stavu, což negativně ovlivňuje jeho detekci v takovém prostředí (Whittington a kol. 2004). Dormance je geneticky programovaná

21

a může být vyvolána nepříznivými podmínkami prostředí, nejčastěji vyčerpáním esenciálních látek.

1.6.1. Odolnost Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis k antibiotikům a dekontaminačním procesům

Při klinickém testování léčby CD u lidí byla prokázána rezistence MAP, na rozdíl od M. tuberculosis, k většině antituberkulózních ATB, jako jsou např. isoniazid, rifampicin, pyrazinamid nebo ethambutol (Hulten a kol. 2000). Úspěch však přinesly některé případy dlouhodobé léčby CD pacientů pomocí nitroimidazolů (Rutgeerts a kol. 2005), rifambutinu, clofaziminu (Selby a kol. 2007) či ciprofloxacinu (Arnold a kol. 2002). Důvodem komplikovaného průkazu MAP je pomalý růst buněk běhěm kultivace a přítomnost rychleji rostoucích bakterií a plísní v biologických vzorcích (trus, tkáně, méko, apod.). Tyto mikroorganismy jsou při kultivaci MAP příčinou kontaminací a vedou ke snížení diagnostické citlivosti a zvýšení nákladů pro průkaz původce PTB (Whittington 2009). Proto je nutné podrobit biologické vzorky před jejich kultivací na médiích dekontaminačním procesům. Dekontaminace je soubor metod, postupů a prostředků k účinnému odstranění nežádoucích kontaminantů ze vzorku nebo jejich eliminace na akceptovatelnou úroveň. K tomuto účelu se v případě dekontaminace MAP vzorků nejčastěji používají kationaktivní kvartérní amoniové soli, které jsou trvale kladně nabité, nezávisle na pH jejich roztoku. Dále se používají organická barviva s toxickým účinkem nebo různé anorganické sloučeniny. Ve většině

laboratoří

se

nejčastěji

k dekontaminaci

MAP

používá

0,9% HPC

jako

dekontaminační látky. HPC (Obrázek 8D) je chemicky heteroaromatická amonná sůl, která byla dříve přidávána do zubních past pro potlačení nežádoucího zubního plaku (Cutter a kol. 2000). HPC má baktericidní vlastnosti, je schopno negativně ovlivnit funkci cytoplazmatické membrány, zapříčinit denaturaci proteinů a ovlivnit metabolické funkce buněk bakterií. Růst kontaminující mikroflóry při kultivaci biologických vzorků je možné potlačit také přídavkem ATB, která se přimíchavají do médií pro kultivaci mykobakterií. Vedle biologických vzorků se v některých případech ATB přidávají také do tekutých médií pro kultivaci čistých MAP kultur za účelem zabránění vzniku kontaminace během manipulace s médiem a samotnou kulturou (Bull a kol. 2009). ATB jsou organické látky, které jsou schopny bakterie usmrcovat (baktericidní) nebo zastavují jejich množení (bakteriostatická), která však mohou ve vysokých koncentracích mikroorganismy také usmrtit. Po objevu

22

penicilinu se ATB získávaly z plísní, především rodu Streptomyces, nyní je většina ATB vyráběna synteticky. Mechanizmus účinku ATB na bakteriální buňku můžeme rozdělit do pěti skupin (Obrázek 7). 1) ATB inhibující syntézu lipidů a jiných látek pro buněčné stěny; 2) ATB narušující cytoplazmatickou membránu; 3) ATB inhibující syntézu nukleových kyselin; 4) ATB interferující s bakteriální proteinovou syntézou a 5) ATB inhibující syntézu kyseliny listové. Obrázek č. 7: Schematický nákres mechanismu účinku některých antibiotik

(zdroj: http://spsprerov.draksoft.net/rocprace/Leciva/special_farmakologie.html)

K potlačení růstu kontaminující mikroflóry se nejčastěji používá komerční směs ATB s názvem „PANTA“ (polymyxin B, amfotericin B, kyselina nalidixová, trimetoprim a azlocilin; Reddacliff a kol. 2003); kombinace penicilinu, chloramfenikolu a amfotericinu B (Kralik a kol. 2011) nebo směs vankomycinu, amfotericinu B a kyseliny nalidixové (Obrázek 8A) označované v literatuře zkratkou „VAN“ (Gao a kol. 2005). Tato kombinace zajišťuje potlačení růstu maximálního spektra kontaminující mikroflóry, tj. G+, G- bakterií a plísní. Vankomycin je glykopeptidové ATB, které působí ve stádiu růstu a množení buněk. Způsobuje inhibici 23

biosyntézy buněčné stěny, porušuje permeabilitu cytoplazmatické membrány a zabraňuje syntéze RNA. Jeho baktericidní působení je při kultivacích mykobakterií využíváno především k zamezení růstu grampozitivních bakterií. Amfotericin B je řazen mezi makrocyklická polyenová ATB. Má vysokou afinitu k ergosterolu, který je primárním sterolem v cytoplazmatické membráně plísní. Způsobuje poškození této cytoplazmatické membrány, zvyšuje její permeabilitu a může vést až ke smrti buňky. Kyselina nalidixová patří do skupiny chinolonových

ATB

první generace.

Nepůsobí

primárně

na

buněčnou

stěnu,

či

cytoplazmatickou membránu, ale inhibuje funkci enzymu topoizomerázy II (DNA gyrázy), která se uplatňuje v „zavíjení a rozvíjení“ DNA během replikace. Kyselina nalidixová působí baktericidně a potlačuje růst většiny gramnegativních bakterií. ATB však, zejména ve vyšších koncentracích, snižují životaschopnost MAP a způsobují prodloužení doby kultivace až o několik týdnů (Gumber a Whittington, 2007). Vzorky s malým množstvím MAP buněk jsou často kultivačně negativní (falešně negativní výsledky; Reddacliff a kol. 2003). Navíc různé kmeny MAP často neodpovídají na jedno a totéž ATB stejnou mírou rezistence (Whittington 2009).

24

Obrázek č. 8: Chemické vzorce ATB a činidla HPC použitých při dekontaminaci a kultivaci vzorků na přítomnost mykobakterií

A)

B)

C)

D)

A) vankomycin; B) amfotericin B; C) kyselina nalidixová; D) hexadecylpyridinium chlorid (zdroj: http://en.wikipedia.org/wiki)

25

2. CÍLE PRÁCE Cílem předložené diplomové práce bylo stanovit životaschopnost MAP ve vzorcích, které byly podrobeny ošetření ATB (vankomycin, amfotericin B a kyselina nalidixová). Testování životaschopnosti bylo provedeno na třech různých MAP izolátech. Vypracování diplomové práce bylo rozděleno do pěti částí: 1)

Stanovení životaschopnosti MAP izolátů po krátkodobém ošetření buněk ATB pomocí kultivačně nezávislých metod.

2)

Stanovení životaschopnosti MAP izolátů po dlouhodobém ošetření buněk ATB pomocí kultivačně nezávislých metod.

3)

Stanovení životaschopnosti MAP izolátů po krátkodobém ošetření buněk ATB pomocí kultivačních metod.

4)

Stanovení životaschopnosti MAP izolátů po dlouhodobém ošetření buněk ATB pomocí kultivačních metod.

5)

Vliv ATB a doby HPC dekontaminace na výskyt kontaminující mikroflóry během kultivace vzorků trusu.

26

3. MATERIÁL A METODY 3.1.

Bakteriální kmeny V této diplomové práci byly použity následující MAP kmeny a izoláty:

• referenční (sbírkový) kmen o CAMP 6381

(Sbírka

zoopatogenních

mikroorganismů,

Výzkumný

ústav

veterinární lékařství, Česká republika) – původ: ileocekální mízní uzlina, skot • terénní izoláty o 12146 – původ: trus, skot, plemeno Holstein o 283/08 – původ: trus, skot, plemeno červenostrakatý skot

3.2.

Trus Trus, byl sterilně odebrán od tří MAP pozitivních krav ze stáda s diagnostikovaným

výskytem paratuberkulózy (testováno pomocí imunologické metody ELISA, kultivace a qPCR). Trusy byly následně smíchány a výsledná koncentrace MAP byla, pomocí qPCR (IS900), stanovena na 4,54 × 104 buněk.

3.3.

Materiál

3.3.1. Půdy pro kultivaci mykobakterií • Middlebrook 7H9 médium (M7H9; Difco, USA), s přídavkem Middlebrook AODC (Difco, USA) a 2 µg/ml Mykobactinu J (Allied Monitor, USA) • Herroldova půda o Agar (Oxoid, Velká Británie) o Pepton (HiMedia, Indie) o Masový extrakt (Oxoid, Anglie) o Chlorid sodný (Penta, Česká republika) 27

o Glycerin (Lach-ner, Česká republika) o Pyruvát sodný (Penta, Česká republika) o Mykobaktin J (Allied Monitor, USA) o Hydroxid sodný (Penta, Česká republika) o Malachitová zeleň (Merck, USA) Příprava média: Jeden litr média byl připraven smísením 870 ml sterilní destilované vody, 9 g agaru, 9 g peptonu, 2,7 g masového extraktu, 4,5 g NaCl, 1 ml 10% NaOH a 25 ml glycerinu. Směs byla promíchána a autoklávována při 120°C po dobu 25 minut. Zároveň byla smíchána směs10 ml destilované vody s 4 g pyruvátu sodného a opět autoklávována při 120°C po dobu 25 minut. Do 150 ml vaječné směsi připravené z šesti vaječných žloutků bylo přidáno 5,1 ml 2% malachitové zeleně a vzniklá směs byla temperována na 50°C. Všechny tři směsi byly smíchány dohromady a po přidání 2 ml mykobaktinu J byla Herroldova půda byla připravena ke sterilnímu naplnění do Rouxových lahví. Do každé lahve bylo nalito 15 ml Herroldovy půdy.

3.3.2. Chemikálie • 0,9% HPC (hexadecyl pyridinium chlorid: N-cetylpyridinium chlorid monohydrát; Merck, USA) • ATB (Sigma-Aldrich, USA) Jednotlivá ATB byla sterilně navážena na analytických vahách a následně naředěna na tyto zásobní koncentrace: o vankomycin – 10 mg/ml (ředěno ve sterilním PBS; pH 7,2) o amfotericin B – 5 mg/ml (ředěno ve sterilní vodě) o kyselina nalidixová – 10 mg/ml (rozpuštěno v 1M NaOH – do 10 % objemu; zbytek sterilní voda) • destilovaná sterilní voda • propidium monoazid (PMA): 1 mM roztok (Biotium Inc., USA); ředěno ve 20% dimetylsulfoxidu (DMSO; Sigma, USA) • DNA z rybích spermií o koncentraci 50 ng/µl (Serva Electrophoresis, Německo)

28

3.3.3. qPCR komponenty • reakční směs F57 Flash Mastermix (připraveno dle Slana a kol. 2008) obsahující: o DyNAmo Probe qPCR Kit (Finnzyme, Finsko) o 10 pmol specifických primerů F57qPCR/F a F57qPCR/R (VBC Biotech, Rakousko; Tabulka 1) o interní amplifikační kontrolu (IAC) o koncentraci 5 × 101 kopií StTS1 genu (cizorododý gen nevyskytující se v genomu MAP; Tabulka 1) o 1 pmol sondy F57qPCRTM pro F57 fragment značené FAM (VBC Biotech, Rakousko; Tabulka 1) o 4 pmol sondy pro IAC IACqPCRTM, značené Cy5 (VBC Biotech, Rakousko; Tabulka 1) o 0,2 U uracil-DNA-glykosylázy (Sigma, USA) • kalibrační křivka (připraveno dle Slana a kol. 2008) tvořená: o řadou plazmidů s naklonovaným fragmentem genu F57 o koncentraci 5x100, 5x101, 5x102, 5x103, 5x104 a 5x105 kopií o DNA z rybích spermií pro naředění plazmidové řady (50 ng/µl; Serva Electrophoresis, Německo)

Tabulka č. 1. Primery a sondy pro detekci MAP (Slana a kol. 2008)

Název sondy/primeru

Sekvence

F57qPCR/F

GCCCATTTCATCGATACCC

F57qPCR/R

GTACCGAATGTTGTTGTCAC

F57qPCRTM

6FAM–CAATTCTCAGCTGCAACTCGAACACAC–BHQ

IACqPCRTM

Cy5–GGCTCTTCTATGTTCTGACCTTGTTGGA–BHQ

29

Velikost PCR produktu

147 bp

154 bp

3.3.4. Software pro vyhodnocení výsledků • LightCycler 480 software (verze 1.2.0.0625) • Statistica 9 software (StatSoft, USA)

3.3.5. Přístroje • analytické váhy (KERN & Sohn, Německo) • halogenová lampa, 650W žárovka (B & H PhotoVideo, USA) • vortex (Eppendorf, Německo) • horký blok (Eppendorf, Německo) • centrifuga (Thermo Fisher Scientific, USA) • centrifuga 5804 pro stočení qPCR destiček (Eppendorf, Německo) • biohazardní box (Trigon Plus, Česká republika) • třepací termostat INNOVA 4 000 (New Brunswick Scientific, USA) • Spektrofotometr BioPhotometr (Eppendorf, Německo) • LightCycler 480 (Obrázek 9; Roche Molecular Diagnostic, Germany) • termostat komorový (Obrázek 10) • rotátor Stuart (Fisher Scientific, USA) • fotoaparát CANON Powershoot G5 (Canon, Japonsko) • třepačka LT3 (Fisher Scientific, USA)

30

Obrázek č. 9: LightCycler 480 připojený k počítači s programem pro vyhodnocení qPCR

Obrázek č. 10: Komomorový termostat s uloženými vzorky

31

3.3.6. Pomůcky • alobal • šroubovací zkumavky (Sarstedt, Německo) • automatické pipety s nastavitelným rozsahem 0,5 µl až 1 000 µl • plastové kličky (Sarstedt, Německo) • Rouxovy lahve (Becton Dickonson, USA) • NTS lahve • laboratorní lahev se šroubovacím uzávěrem (Simax, Norsko) • teploměr • nádoba na led • centrifugační zkumavky (VWR, Rakousko) • laboratorní sklo, umělohmotné pomůcky, běžný laboratorní materiál a běžné vybavení laboratoře

3.4.

Metody

3.4.1. Kultivace Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis v tekutém médiu s/bez antibiotik

Krátkodobé ošetření antibiotiky • tři kličky o objemu 1 µl od každého MAP izolátu byly sterilně resuspendovány ve 300 µl M7H9. Tato suspenze (300 ul) byla následně sterilně přepipetována do skleněné laboratorní lahve s 50 ml tekutého M7H9 s mykobaktinem J a bez ATB. Kultury byly kultivovány po dobu 5 týdnů v třepacím termostatu při 140 otáčkách/min při 37°C (OD600 0,4) • ze zásobních roztoků vankomycinu, kyseliny nalidixové a amfotericinu B byly odpipetovány příslušné objemy do šroubovacích zkumavek tak, aby byly dosaženy požadované koncentrace ATB (Tabulka 2). Koncentrace 100 µg/ml vankomycinu, 100 µg/ml kyseliny nalidixové a 50 µg/ml amfotericinu B byla považována za „běžně používanou“ koncentrací ATB. Narostlé kultury MAP byly sterilně přidány k ATB

32

tak, aby výsledný objem činil 1 500 µl. MAP suspenze (1 500 µl) bez ATB sloužila jako kontrolní vzorek. Obsah zkumavek byl promíchán několikerým otočením • kultury s ATB byly kultivovány po dobu 72 h, otáčejíce se v rotátoru při 18,5 rpm a při 37°C. Stejný postup byl proveden pro všechny tři MAP izoláty

Tabulka č. 2. Koncentrace ATB vankomycinu (VA), kyseliny nalidixové (NAL) a amfotericinu B (AMF) ve vzorcích MAP izolátů při krátkodobém ošetření ATB

Výsledná koncentrace

Koncentrace jednotlivých ATB VA

AMF

NAL

(µg/ml)

(µg/ml)

(µg/ml)

V100A50N100

100

50

100

V25A50N100

25

50

100

V50A50N100

50

50

100

V200A50N100

200

50

100

V400A50N100

400

50

100

V100A50N25

100

50

25

V100A50N50

100

50

50

V100A50N200

100

50

200

V100A50N400

100

50

400

V100A12,5N100

100

12,5

100

V100A25N100

100

25

100

V100A100N100

100

100

100

V100A200N100

100

200

100

K (bez ATB)

-

-

-

ATB v médiu*

* výsledná koncentrace jednotlivých ATB je uvedena v µg/ml; pořadí jednotlivých ATB je vyjádřeno písmeny V (vankomycin), N (kys. nalidixová) a A (amfotericin B). Např. V100N100A50 znamená, že ve zkumavce bylo 100 µg/ml vankomycinu, 100 µg/ml kyseliny nalidixové a 50 µg/ml amfotericinu B

33

Dlouhodobé ošetření antibiotiky • tři kličky o objemu 1 µl každého MAP izolátu byly sterilně resuspendovány v 300 µl M7H9. Celých 300 µl suspenze bylo sterilně přepipetováno do centrifugační zkumavky s 5 ml tekutého M7H9. Příslušná množství zásobních roztoků ATB vankomycinu,

kyseliny nalidixové a amfotericinu B byla napipetována do

centrifugačních zkumavek tak, aby byly dosaženy požadované koncentrace ATB ve finálním objemu (Tabulka 2). Koncentrace 100 µg/ml vankomycinu, 100 µg/ml kyseliny nalidixové a 50 µg/ml amfotericinu B byla považována za „běžně používanou“ koncentraci ATB. Do každé zkumavky s ATB bylo poté přidáno 300 µl MAP suspenze a objem byl doplněn pomocí média M7H9 na výsledných 10 ml • kontrolní vzorek bez ATB byl připraven z 300 µl MAP suspenze a 9 700 µl M7H9 média • MAP kultury byly kultivovány v třepacím termostatu při 37°C po dobu pěti týdnů • stejný postup byl proveden pro všechny tři izoláty 3.4.2. Stanovení životaschopnosti Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis metodou PMA F57 qPCR • suspenze kultury z krátkodobého/dlouhodobého ošetření ATB byla dvakrát promyta a resuspendována v čistém M7H9 médiu • ke 250 µl promyté suspenze bylo přidáno 250 µl čistého média M7H9. V zatemněné místnosti bylo k suspenzi buněk po ošetření ATB a k buňkám bez ATB (kontrola) přidáno 12,5 µl roztoku fluorescenčního barviva PMA, připraveného dle návodu výrobce. Vzorky byly promíchány na vortexu a krátce stočeny • následně byly vzorky umístěny do stojánku, který byl důkladně obalen alobalem tak, aby bylo zabráněno přístupu světla. Stojánek byl pevně připevněn na vortex, kde byly vzorky míchány při 20 Hz po dobu 5 min • zkumavky byly umístěny diagonálně na led, tak aby se každý vzorek dotýkal ledu. Nádoba s ledem a zkumavkami byla umístěna ve vzdálenosti 20 cm od silného zdroje světla (lampy), kterým byly suspenze buněk ozařovány po dobu 2 min (Obrázek 11) • následně byly zopakovány kroky od přidání roztoku PMA po vystavení vzorků světlu

34

• suspenze byla centrifugována 7 000 g/5 min při pokojové teplotě, poté byl odstraněn supernatant a k peletě bylo přidáno 500 µl DNA z rybích spermií o koncentraci 50 ng/µl • MAP buňky byly lyzovány v horkém bloku po dobu 20 min při teplotě 100°C. Následovala centrifugace 18 000 g/5 min při pokojové teplotě. Každý vzorek byl proveden ve třech opakováních (triplikáty)

Obrázek č. 11: Vzorky MAP osvěcovány lampou po ošetření PMA

Příprava qPCR (připraveno dle Slana a kol. 2008) • do 96 jamkové qPCR destičky bylo napipetováno 15 µl premixu F57 Flash Premix (viz kapitola 3.3.3.) na jamku • do jamky s premixem bylo následně připipetováno 5 µl vzorků ošetřených PMA (viz kapitola 3.4.2.) • do šesti jamek s premixem byly, místo PMA vzorků, přidány qPCR standardy (viz kapitola 3.3.3.) pro vytvoření kalibrační křivky. V jedné jamce byla místo DNA matrice voda (negativní kontrola) • deska byla přelepena průhlednou fólií a centrifugována 2 min při 2 000 g • qPCR probíhala za podmínek uvedených v Tabulce 3. Analýza výsledku byla provedena pomocí programu LightCycler 480 software 35

Tabulka č. 3: qPCR program pro amplifikaci F57 fragmentu MAP

Název programu

Čas /teplota

Počet cyklů

počáteční denaturace

7 min/95°C

1

denaturace

5 s/95°C

amplifikace a extenze

40 s/60°C

chlazení

30 s/40°C

47 1

3.4.3. Kultivace Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis na pevném médiu • vzorky z krátkodobého i dlouhodobého ošetření ATB byly sterilně naředěny 100x a 10 000x médiem M7H9 (v triplikátu pro každé ředění) a promíchány po dobu 3 s na vortexu. 100 µl ředěné i neředěné suspenze každého MAP izolátu bylo sterilně přeneseno na Herroldovu půdu a rozetřeno kličkou • vzorky byly kultivovány v termostatu při 37 °C po dobu tří měsíců • k odečtu kolonií bylo použito nejvyšší ředění (10 000x) z důvodu počitatelného množství kolonií na povrchu média, v případě nízkých počtů buněk (především při dlouhodobém ošetření buněk ATB) v původním vzorku byly odečty kolonií výjimečně provedeny z ředění 100x

3.4.4. Vyhodnocení metody PMA F57 qPCR a kultivace • průměrná životaschopnost MAP buněk byla vypočítána z každého vzorku, který byl relativně porovnán s kontrolním vzorkem (bez ATB) dle rovnice: Živé MAP buňky (%) = Absolutní počet MAP buněk v testovaném vzorku/Absolutní počet MAP buněk v kontrolním vzorku × 100

36

3.4.5. Sledování výskytu kontaminující mikroflóry při kultivaci trusu na médiích s antibiotiky a po ošetření HPC • při přípravě Herroldovy půdy pro kultivaci trusu byla k médiu přidána ATB vankomycin, kyselina nalidixová a amfotericin B (viz kapitola 3.3.2.). Příslušná množství zásobních roztoků ATB byla napipetována do média tak, aby byly dosaženy požadované koncentrace ATB ve finálním objemu (Tabulka 4) • vzorky trusu (příprava viz kapitola 3.2.) byly přeneseny do NTS lahví s 25 ml sterilní destilované vody. Vzorky byly třepány při frekvenci 95 min-1 po dobu 30 min při pokojové teplotě. Z horní části supernatantu bylo 5 ml přeneseno do NTS lahve s 20 ml 0,9% HPC a suspenze byla opět třepána po dobu 30 min při pokojové teplotě. Následně byly lahve uloženy na šikmý stojan a stály v temnu po dobu jednoho, dvou a tří dnů při laboratorní teplotě • po 24, 48 a 72 hod bylo 100 µl sedimentu přeneseno do Rouxových lahví s Herroldovou půdou obsahující příslušné koncentrace ATB (popsáno v prvním bodu této kapitoly, Tabulka 4). Každý vzorek byl připraven ve dvou opakováních (duplikáty). Vzorky byly kultivovány při 37°C a výskyt kontaminant byl kontrolován po dobu osmi týdnů

37

Tabulka č. 4. Koncentrace ATB vankomycinu (VA), kyseliny nalidixové (NAL) a amfotericinu B (AMF) a HPC při ošetření kontaminující mikroflóry

Výsledná koncentrace

HPC

ATB v médiu*

(dny)

V100A50N100

Koncentrace jednotlivých ATB VA

AMF

NAL

(µg/ml)

(µg/ml)

(µg/ml)

1,2,3

100

50

100

V25A50N100

1,2,3

25

50

100

V50A50N100

1,2,3

50

50

100

V200A50N100

1,2,3

200

50

100

V400A50N100

1,2,3

400

50

100

V100A50N25

1,2,3

100

50

25

V100A50N50

1,2,3

100

50

50

V100A50N200

1,2,3

100

50

200

V100A50N400

1,2,3

100

50

400

V100A12,5N100

1,2,3

100

12,5

100

V100A25N100

1,2,3

100

25

100

V100A100N100

1,2,3

100

100

100

V100A200N100

1,2,3

100

200

100

K1 (0,9% HPC)

1,2,3

-

-

-

K2 (bez ATB, HPC)

-

-

-

-

* výsledná koncentrace jednotlivých ATB je uvedena v µg/ml; pořadí jednotlivých ATB je vyjádřeno písmeny V (vankomycin), N (kys. nalidixová) a A (amfotericin B). Např. V100N100A50 znamená, že ve zkumavce bylo 100 µg/ml vankomycinu, 100 µg/ml kyseliny nalidixové a 50 µg/ml amfotericinu B

38

3.4.6. Statistická analýza •

pro zjištění statistické významnosti u sledovaných faktorů (MAP izoláty a koncentracemi VAN ATB) byla použita dvoufaktorová analýza variace (two-way ANOVA)

•

v případě statistické významnosti faktorů byly dále použity post-hoc testy (Tukey’s HSD test)

•

faktory byly považovány za statisticky velmi významné, pokud P < 0,01 (P je hodnota jednotlivých F-testů nebo post-hoc testů)

•

faktory byly považovány za statisticky významné, pokud P < 0,05 (P je hodnota jednotlivých F-testů nebo post-hoc testů)

39

4. VÝSLEDKY

4.1.

Kultivačně nezávislé metody

4.1.1. Stanovení životaschopnosti Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis po krátkodobém ošetření antibiotiky pomocí PMA F57 qPCR

Třídenní působení různých kombinací VAN ATB mělo nejmenší vliv na izolát 283/08. Signifikantně nižší životaschopnost vykazovaly izoláty 12146 a 6381. Celkově největší dopad na životaschopnost MAP v rámci krátkodobého působení VAN ATB měla kombinace „běžně používaných“ koncentrací vankomycinu a kyseliny nalidixové (obě 100 µg/ml). Efekt těchto dvou ATB byl dále umocněn zvyšováním amfotericinu B, a to zejména v nejvyšší koncentraci 200 µg/ml (Obrázek 12B). Obecně ale mezi jednotlivými ATB a v rámci koncentrací jednotlivých ATB nebyl zaznamenán výraznější rozdíl v životaschopnosti (Obrázek 12A-C).

Obrázek č. 12: Graf míry přežívání MAP izolátů po jejich krátkodobém ošetření různými koncentracemi vankomycinu, amfotericinu B a kyseliny nalidixové sledovaná pomocí PMA F57 qPCR

A)

40

B)

C)

Každý izolát byl ošetřen kombinací VAN ATB o koncentraci A) 25 až 400 µg/ml vankomycinu, 50 µg/ml amfotericinu B a 100 µg/ml kyseliny nalidixové; B) 100 µg/ml vankomycinu, 12,5 až 200 µg/ml amfotericinu B a 100 µg/ml kyseliny nalidixové; C) 100 µg/ml vankomycinu, 50 µg/ml amfotericinu B a 25 až 400 µg/ml kyseliny nalidixové. Jednotlivé sloupce grafu vyjadřují % MAP buněk, které přežily dané ošetření vzhledem ke kontrolnímu vzorku bez ATB. Byly použity MAP izoláty 283/08, 6381 a 12146.

Statistická analýza potvrdila, že statisticky velmi významným zdrojem proměnlivosti byly v případě experimentů s proměnlivými koncentracemi vankomycinu a kyseliny nalidixové pouze MAP izoláty (Tabulka 5). Při měnící se koncentraci kyseliny nalidixové a vankomycinu bylo procento přežívajících MAP 12146 izolátů statisticky významně nižší oproti 283/08 izolátu, v případě vankomycinu to samé platilo i pro kmen 6381 (Tabulka 4). U experimentu s proměnlivou koncentrací amfotericinu B byla statisticky velmi významným zdrojem proměnlivosti kromě MAP izolátů, také koncentrace ATB a jeho vzájemná interakce 41

(Tabulka 6). Z důvodu „nepřirozeně odchýlené“ hodnoty kmene 6381 v koncentraci 100 µg/ml amfotericinu B však nelze stanovit koncentraci amfotericinu B, která by efektivně potlačovala životaschopnost buněk.

Tabulka č. 5: Statistická významnost rozdílů mezi izoláty MAP po jejich krátkodobém ošetření různými koncentracemi VAN ATB – metoda PMA F57 qPCR

Zvyšující se koncentrace ATB

MAP Izolát/kmen

vankomycin

283/08 6381 12146 MAP Izolát/kmen

amfotericin B

kyselina nalidixová

283/08 6381 12146

283/08

6381

12146

P < 0,01 P < 0,01 P < 0,01 ns P < 0,01 ns 283/08

6381

12146

P < 0,01 P < 0,01 P < 0,01 P < 0,01 P < 0,01 P < 0,01 -

MAP Izolát/kmen

283/08

6381

12146

283/08 6381 12146

ns P < 0,01

ns ns

P < 0,01 ns -

P < 0,01: statisticky velmi významné (P hodnoty jsou hodnoty Tukey HSD testu) ns: statisticky nevýznamné

42

Tabulka č. 6: Statistická významnost rozdílů mezi koncentracemi amfotericinu B po krátkodobém ošetření MAP izolátů – metoda PMA F57 qPCR

Koncentrace amfotericinu B (µg/ml) 12,5 25 50 100 200

12,5

25

ns ns ns ns P < 0,01 ns ns P < 0,01

50

ns ns ns ns

100

200

P < 0,01 ns ns P < 0,01 ns ns P < 0,01 P < 0,01 -


4.1.2. Stanovení životaschopnosti Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis po dlouhodobém ošetření antibiotiky pomocí PMA F57 qPCR

V případě pětitýdenního ošetření MAP kombinací VAN ATB se oproti třídennímu ošetření objevily významnější rozdíly mezi použitými koncentracemi jednotlivých ATB (Obrázek 13A-C). Podobně jako v případě krátkodobého ošetření (viz 4.1.1.) reagoval nejcitlivěji kmen 6381, jehož životaschopnost, zejména v případě vyšších koncentrací ATB, se blížila nule (Obrázek 13A-C). Naproti tomu izolát 12146 se v tomto experimentu jevil jako nejodolnější, přestože při krátkodobém ošetření vykazoval podobnou citlivost jako kmen 6381 (viz 4.1.1.). Dlouhodobé stresování ATB značně negativně působilo také na izolát 283/08, který výrazněji odolával pouze takové kombinaci VAN ATB, ve které se buď vankomycin (Obrázek 13A) nebo kyselina nalidixová (Obrázek 13C) vyskytovaly v nejnižších koncentracích (25 µg/ml). To, že MAP izoláty a jejich interakce byly statisticky velmi významnými zdroji proměnlivosti, bylo zjištěno také provedením statistické analýzy (Tabulka 7).

43

Obrázek č. 13: Míra přežívání MAP izolátů po jejich dlouhodobém ošetření různými koncentracemi vankomycinu, amfotericinu B a kyseliny nalidixové sledovaná pomocí PMA F57 qPCR

A)

B)

C)

Každý izolát byl ošetřen kombinací VAN ATB o koncentraci A) 25 až 400 µg/ml vankomycinu, 50 µg/ml amfotericinu B a 100 µg/ml kyseliny nalidixové; B) 100 µg/ml 44

vankomycinu, 12,5 až 200 µg/ml amfotericinu B a 100 µg/ml kyseliny nalidixové; C) 100 µg/ml vankomycinu, 50 µg/ml amfotericinu B a 25 až 400 µg/ml kyseliny nalidixové. Jednotlivé sloupce grafu vyjadřují % MAP buněk, které přežily dané ošetření vzhledem ke kontrolnímu vzorku bez ATB. Byly použity MAP izoláty 283/08, 6381 a 12146.

Významným zdrojem proměnlivosti byly také koncentrace jednotlivých ATB a jejich vzájemná interakce (Tabulka 8). Efekt snižování životaschopnosti MAP se u všech tří izolátů projevil především při zvyšující se koncentraci vankomycinu (Obrázek 13A), přičemž za koncentraci, od níž bylo možno pozorovat statisticky významný efekt snížení počtu přežívajících MAP buněk, lze považovat 50 µg/ml (Obrázek 13A). Trend snižování životaschopnosti MAP při změnách koncentrace kyseliny nalidixové a amfotericinu B již nebyl tak patrný (Obrázek 13B, C). V obou případech se navíc vyskytly „nepřirozeně odchýlené“ hodnoty, kvůli kterým byla interpretace výsledků problematická. Přesto za koncentraci, od níž bylo možno pozorovat statisticky významný efekt snížení počtu přežívajících MAP buněk, lze v případě kyseliny nalidixové a vankomycinu považovat koncentraci 50 µg/ml (Obrázek 13A, C); v případě amfotericinu B až koncentraci 200 µg/ml (Obrázek 13B).

45

Tabulka č. 7: Statistická významnost rozdílů mezi izoláty MAP po jejich dlouhodobém ošetření různými koncentracemi VAN ATB – metoda PMA F57 qPCR


MAP Izolát/kmen

vankomycin

283/08 6381 12146 MAP Izolát/kmen

amfotericin B


283/08 6381 12146

283/08

6381

12146

P < 0,01 P < 0,01 P < 0,01 P < 0,01 P < 0,01 P < 0,01 283/08

6381

12146

ns P < 0,01 ns P < 0,01 P < 0,01 P < 0,01 -

MAP Izolát/kmen

283/08

6381

12146

283/08 6381 12146

ns P < 0,01

ns ns

P < 0,01 ns -


46

Tabulka č. 8: Statistická významnost rozdílů mezi koncentracemi jednotlivých ATB – metoda PMA F57 qPCR

Koncentrace vankomycinu (µg/ml)

25

50

25 50 100 200 400

P < 0,01 P < 0,01 P < 0,01 P < 0,01

P < 0,01 ns P < 0,01 P < 0,01

Koncentrace amfotericinu B (µg/ml)

12,5

25

12,5 25 50 100 200

ns P < 0,05 ns ns

ns ns ns P < 0,01

Koncentrace kyseliny nalidixové (µg/ml)

25

50

25 50 100 200 400

P < 0,01 P < 0,01 P < 0,01 P < 0,01

P < 0,01 P < 0,01 P < 0,05 P < 0,01

100

200

P < 0,01 P < 0,01 P < 0,01 P < 0,01 ns ns P < 0,01 P < 0,01

50

100

400

P < 0,01 P < 0,01 P < 0,01 P < 0,01 -

200

P < 0,05 ns ns ns ns P < 0,01 ns P < 0,01 ns P < 0,01 P < 0,01 P < 0,01 -

100

200

P < 0,01 P < 0,01 ns P < 0,05 ns ns P < 0,01 P < 0,01

400

P < 0,01 P < 0,01 P < 0,01 P < 0,01 -

P < 0,01: statisticky velmi významné (P hodnoty jsou hodnoty Tukey HSD testu) P < 0,05: statisticky významné (P hodnoty jsou hodnoty Tukey HSD testu) ns: statisticky nevýznamné

47

4.2.

Kultivační metody

4.2.1. Stanovení životaschopnosti Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis po krátkodobém ošetření antibiotiky pomocí kultivace na pevných médiích

Při kultivační metodě byly po třech měsících počítány jednotlivé kolonie MAP izolátů na Herroldově půdě. Kolonie odpovídaly typickému vzhledu druhu MAP. Velikost kolonií byla při nevyšším ředění v průměru 1 mm, ve vyšších ředěních byly kolonie menší nebo tvořily jednotný povlak na médiu. Barva byla bílá, tvar kruhový, povrch lesklý, hladký, okraje rovné. Profil kolonie byl vypouklý až s vyvýšeným středem. Různé koncentrace kombinací VAN ATB měly na izoláty MAP přibližně stejný účinek; výraznější rozdíl se neukázal ani při vzrůstající koncentraci jednotlivých ATB (Obrázek 14A-C). V případě krátkodobého ošetření ATB nebyly výsledky rozdílů mezi jednotlivými MAP izoláty statisticky významné, stejně jako různé koncentrace jednotlivých ATB. Celkově byla životaschopnost všech izolátů ve všech koncentracích VAN ATB hodně vysoká.

Obrázek č. 14: Graf míry přežívání MAP izolátů po jejich krátkodobém ošetření různými koncentracemi vankomycinu, amfotericinu B a kyseliny nalidixové sledovaná pomocí kultivace na pevných médiích

A)

48

B)

C)


4.2.2. Stanovení životaschopnost Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis po dlouhodobém ošetření antibiotiky pomocí kultivace na pevných médiích

Nejnižší životaschopnost byla metodou kultivace při dlouhodobém ošetření VAN ATB zaznamenána u laboratorního kmene 6381 (Obrázek 15), podobně jako tomu bylo zjištěno metodou PMA F57 qPCR (viz. 4.1.2.). Ostatní dva MAP izoláty byly k dlouhodobému působení ATB odolnější, avšak výrazně méně než v případě krátkodobého 49

ošetření (viz. 4.2.1.). Podle statistického vyhodnocení byly všechny MAP izoláty statisticky významným zdrojem proměnlivosti (Tabulka 9).

Obrázek č. 15: Míra přežívání MAP izolátů po jejich dlouhodobém ošetření různými koncentracemi vankomycinu, amfotericinu B a kyseliny nalidixové sledovaná pomocí kultivace na pevných médiích

A)

B)

C)

50


Vedle MAP izolátů byla statisticky významným zdrojem proměnlivosti také koncentrace jednotlivých ATB a jejich interakce (Tabulka 10). S rostoucí koncentrací vankomycinu a kyseliny nalidixové se u všech MAP izolátů se projevil efekt poklesu přežívajících MAP buněk s rostoucí koncentrací ATB (Obrázek 15A, C). V případě zvyšující se koncentrace amfotericinu B se pokles životaschopnosti projevil pouze u izolátů 12146 a 283/08 (Obrázek 15B). U všech ATB se statisticky významný pokles životaschopnosti buněk projevil při koncentraci 100 µg/ml a vyšší (u kyseliny nalidixové lze hovořit o koncentraci 50100 µg/ml).

Tabulka č. 9: Statistická významnost rozdílů mezi izoláty MAP po jejich dlouhodobém ošetření různými koncentracemi VAN ATB – metoda kultivace

51


MAP Izolát/kmen

vankomycin

283/08 6381 12146 MAP Izolát/kmen

amfotericin B

283/08 6381 12146 MAP Izolát/kmen


283/08 6381 12146

283/08

6381

12146

P < 0,01 P < 0,01 P < 0,01 P < 0,01 P < 0,01 P < 0,01 283/08

6381

12146

P < 0,01 ns P < 0,01 P < 0,01 ns P < 0,01 283/08

6381

12146

P < 0,01 ns P < 0,01 P < 0,05 ns P < 0,05 -


Tabulka č. 10: Statistická významnost rozdílů mezi koncentracemi jednotlivých ATB – metoda kultivace

52

Koncentrace vankomycinu (µg/ml)

25

50

100

25 50 100 200 400

ns P < 0,01 P < 0,01 P < 0,01

ns P < 0,01 P < 0,01 P < 0,01

P < 0,01 P < 0,01 ns P < 0,01

Koncentrace amfotericinu B (µg/ml)

12,5

25 50 100 200 400 Koncentrace kyseliny nalidixové (µg/ml) 25 50 100 200 400

25

ns ns ns ns P < 0,01 P < 0,01 P < 0,01 P < 0,01

25

50

200

400

P < 0,01 P < 0,01 P < 0,01 P < 0,01 ns ns ns -

50

100

200

ns P < 0,01 P < 0,01 ns P < 0,01 P < 0,01 P < 0,01 P < 0,01 P < 0,01 ns P < 0,01 ns -

100

200

400

P < 0,05 P < 0,01 P < 0,01 P < 0,01 P < 0,05 ns P < 0,01 P < 0,01 P < 0,01 ns ns ns P < 0,01 P < 0,01 ns ns P < 0,01 P < 0,01 ns ns -


4.3.

Sledování výskytu kontaminující mikroflóry při kultivaci bovinního trusu na médiích s VAN a po ošetření 0,9% HPC

53

Kontaminující mikroflóra trusu narostla v kontrolních vzorcích bez ATB a bez HPC do druhého dne. Kolonie bakterií se v tomto případě velice rychle rozrostly po celém povrchu média a vytvořily souvislý povlak. Zbarvení povlaku se v čase postupně měnilo z modré či nazelenalé barvy do sytě bílé barvy (obrázek 16A). Ve vzorcích, které byly vystaveny jednodennímu až třídennímu působení 0,9% HPC a naočkovány na média bez ATB, narostly kontaminanty do několika dnů (obrázek 16B). Po jedno a dvoudenním působení HPC narostly kontaminanty pátý den po naočkování. V případě třídenního působení byla doba nárůstu kontaminant prodloužena na osm dní. V tomto případě byly kontaminanty menší a ohraničené. Ze vzorků, které byly vystaveny jednodennímu, dvoudennímu a třídennímu působení 0,9% HPC a následně naočkovány na médium obsahující směs VAN ATB o různých koncentracích, narostly kontaminanty pouze na dvou miskách po dvoudenní dekontaminaci (2,5 % z celkového počtu ošetřených vzorků). První kontaminace narostla po 11-ti a druhá po 24 dnech od naočkování. V obou případech se kontaminující mikroflóra vyskytla pouze na jedné misce z duplikátu. Ostatní vzorky byly bez projevů kontaminace (obrázek 16C).

Obrázek č. 16: Herroldova půda s/bez VAN ATB s naočkovanými vzorky kravského trusu s/bez dekontaminace HPC

A)

54

B)

C)

A) vzorky trusu neošetřeny HPC, naočkovány na médium bez ATB, B) vzorky po dekontaminaci 0,9% HPC, naočkovány na médium bez VAN ATB, C) vzorky trusu po dekontaminaci HPC, naočkovány na médium s VAN ATB

55

5. DISKUSE

Průkaz MAP z biologických vzorků (především tkáně, trus a mléko) bývá znesnadněn úbytkem bakterií ve vzorku během dekontaminačního procesu, který je ale na druhou stranu pro izolaci MAP krokem nezbytným. Při zpracování vzorků na kultivaci se snižuje počet bakterií nejen při samotné dekontaminaci desinfekčními prostředky, ale také vlivem působení ATB přítomných v kultivačních médiích, během centrifugačních nebo sedimentačních kroků a v neposlední řadě během manipulace se vzorky (Reddacliff a kol. 2003). V jednotlivých laboratořích jsou používány a optimalizovány různé postupy dekontaminace, které v krajních případech mohou vést ke kontaminacím v kulturách nebo naopak k falešně negativním výsledkům (Stabel 1997, Eamens a kol. 2000). Bez ohledu na použitou metodu, všechny postupy dekontaminace mohou snížit množství izolovaných MAP. Velký problém představují falešně negativní výsledky zejména v případě vzorků, které obsahují nízké koncentrace agens (Stabel 1997). V některých studiích MAP se využívá k dekontaminaci vzorků trusu a tkání 72 h ošetření pomocí kombinace VAN ATB, po předchozím ošetření 0,75 % nebo 0,9 % HPC (Reddacliff a kol. 2003, Whittington 2009). Z toho důvodu bylo třídenní ošetření MAP buněk ATB zvoleno i v této práci. Pětitýdenní stresování kultur ATB bylo vybráno z toho důvodu, že MAP buňky se při kultivaci 5-6 týdnů nacházejí v exponenciální fázi růstu a nedochází v takové míře k jejich shlukování v porovnání s kultivací po delší dobu (Kralik a kol. 2010). Ze snahy o zabránění kontaminace při manipulaci s MAP kulturami se v některých studiích přidává do médií pro kultivaci čistých MAP kultur ATB (Bull a kol. 2009). V případě použití směsi VAN ATB se nejčastěji používá koncentrace 100 µg/ml vankomycinu, 100 µg/ml kyseliny nalidixové a 50 µg/ml amfotericinu B, která je pro účely této diplomové práce označena pojmem „běžně používaná koncentrace“. Objevují se však také studie požívající koncentrace rozdílné, například 86 µg/ml vankomycinu, 86 µg/ml kyseliny nalidixové a 43 µg/ml amfotericinu B (Gumber a Whittington 2007). Bull a kol. (2009) použili čtyřikrát nižší koncentraci amfotericinu B než ostatních dvou ATB, tj. 100 µg/ml vankomycinu, 100 µg/ml kyseliny nalidixové a 25 µg/ml amfotericinu B.

56

5.1.

Kultivačně nezávislé metody

V případě MAP byly dosud provedeny pouze dvě studie zjišťující vhodnost aplikace této kultivačně nezávislé metody pro použití u MAP, a to po ošetření teplem (Nocker a kol. 2007, Kralik a kol. 2010). Naopak v případě Mycobacterium tuberculosis byla metoda PMA F57 qPCR úspěšně použita pro testování rezistence k ATB první a druhé volby (isoniazid, rifampicin, ethambutol, streptomycin, amikacin, kanamycin, capreomycin, ofloxacin, moxifloxacin, ethionamid, kyselina para-aminosalicylová, linezolid, a cycloserin), se kterými bylo M. tuberculosis kultivováno po dobu tří dnů (Pholwat a kol. 2011). V předložené diplomové práci byla použita kombinace tří ATB – vankomycin, amfotericin B a nalidixová kyselina, jejichž působení na životaschopnost MAP nebylo dosud pomocí metody PMA F57 qPCR sledováno. Hojně se však používá například jako součást metod pevné i tekuté kultivace (Whittington 2009). Z výsledků získaných pomocí PMA F57 qPCR je zřejmý výrazný pokles životaschopnosti MAP buněk při dlouhodobém ošetření VAN ATB oproti ošetření krátkodobému, které životaschopnost buněk nějak zvlášť neovlivnilo (Obrázek 12 a 13). Je nutné nicméně zmínit, že ani v případě dlouhodobého ošetření nevedla přítomnost VAN ATB k extrémnímu snížení počtu MAP buněk. Z hodnot koncentrací, které byly použity pro výpočet procentuální závislosti mezi životaschopností kontrolních a ošetřených VAN ATB vyplývá (data neuvedena), že např. rozdíl mezi nejnižší zaznamenanou mírou přežití (Obrázek 13C, 400 µg/ml kyseliny nalidixové) a kontrolním vzorkem bez ATB byl dva řády. Ve většině případů byl však rozdíl mezi kontrolním a ošetřeným vzorkem pouze jeden řád (pokles z 104 na 103, data neuvedena). Tyto výsledky jsou v souladu ostatními prácemi, které potvrzují negativní efekt VAN ATB na MAP, který ovšem není nijak extrémní (Whittington 2009, Merkal a Richards 1972) v porovnání s jinými bakteriálními rody. Například již koncentrace 5 µg/ml vankomycinu samotného je během 10 - 20 minut schopna potlačit růst citlivých kmenů Streptococcus pneumoniae (Haas a kol. 2005). V případě Escherichia coli představuje již 10 µg/ml kyseliny nalidixové letální koncentraci (Goss a kol. 1965). V rámci krátkodobého ošetření se jako nejúčinnější jevily „běžně používané“ koncentrace

vankomycinu

a

kyseliny

nalidixové,

tj.

100 µg/ml

v kombinaci

s amfotericinem B (Obrázek 12 a 13). Totéž platilo i v případě dlouhodobého ošetření a nižších koncentrací amfotericinu B; ve vyšších koncentracích toto nebylo možné potvrdit a to z důvodu „podivných“ hodnot životaschopnosti u izolátu 12146 (Obrázek 13B). Účinek 57

různých koncentrací amfotericinu B na MAP a další druhy rodu Mycobacterium byl studován také Merkalem a Richardsem (1972). Byly testovány koncentrace 1 000, 500, 100, 50, 10, 5, 1 a 0 µg/ml amfotericinu B, avšak u žádné z těchto koncentrací nebylo zřejmé potlačení viability MAP. Je však nutné podotkout, že ve studii Merkal a Richards (1972) bylo testováno pouze jedno ATB, bez efektu spolupůsobení s dalšími ATB jako v této diplomové práci. Kobayashi a kol. (2010) jako první sledoval pomocí metody PMA F57qPCR výskyt živých buněk po ošetření ATB s rozdílným účinkem na buňky – vankomycinem a gentamycinem, širokospektrálním aminoglykosidem s účinkem na gramnegativní bakterie. Během experimentu byly buňky bakterií ošetřeny těmito ATB maximálně po dobu deseti dní. Vyšší hodnoty letálního účinku na buňky byly prokázány u vankomycinu, který ovlivňuje buněčnou stěnu. U gentamycinu, který naopak působí na syntézu proteinů, bylo ve vzorku mrtvých buněk prokázáno méně. Tento výsledek byl dle autorů způsoben právě nepřímým účinkem gentamycinu na buněčnou stěnu (na rozdíl od vankomycinu), což snížilo průnik barviva PMA do buňky. Nicméně tato metoda je, podle autorů, schopná rozlišit mezi buňkami ošetřenými a neošetřenými gentamycinem a může být tedy aplikována i na ATB, která neúčinkují přímo na buněčnou stěnu. Podobně také v našem experimentu byla použita kyselina nalidixová, ATB, které na rozdíl od vankomycinu a amfotericinu B neúčinkuje přímo na buněčné obaly. V případě této diplomové práce však vyšší životaschopnost v případě kyseliny nalidixové oproti vankomycinu zaznamenána nebyla, a to ani v případě krátkodobého (Obrázek 12) ani dlouhodobého (Obrázek 13) ošetření. To by mohlo být způsobeno rozdílnými vlastnostmi MAP buněk a bakterií rodu Staphylococcus, které použili ve své studii Kobayashi a kol. (2010). Druhou možností je ovlivnění výsledku vlivem působení ostatních ATB spolu s kyselinou nalidixovou, jež naopak permeabilitu buněčných obalů ovlivňují. V případě M. tuberculosis bylo pomocí molekulárních metod dokonce zjišťováno, jaké transkripční odpovědi organismu je dosaženo po působení jednoho z ATB, jež bylo použito také v této diplomové práci – vankomycinu. Pomocí této studie bylo identifikováno několik genů, které se podílejí nebo jsou esenciální pro ochranu buňky proti stresovému působení vankomycinu

(Provvedi a kol. 2009). Snížení životaschopnosti MAP buněk při jejich kultivaci v prostředí ATB prokázané v této práci by mohlo ovlivnit výsledky jiných studií testujících in vitro odpověd MAP na stres pomocí PMA F57 qPCR. Pokud by tato metoda byla použita pro sledování odolnosti MAP buněk na jiný faktor, než je vliv ATB, bylo by vhodné zvážit přípravu experimentální MAP suspenze v médiu s ATB (z důvodu předcházení kontaminací). 58

Při optimalizaci takových experimentů by totiž nebyla zaznamenána shoda mezi absolutním počtem buněk ošetřených

PMA (namnožení DNA jen ze živých buněk, které

přežily/tolerovaly přítomnost ATB v médiu) a bez PMA (namnožení DNA jak ze živých tak mrtvých buněk; ústní sdělení, Dr. Kralik, VÚVeL Brno). Jelikož byl v této práci každý izolát jiného původu, byly pozorovány také rozdíly v životaschopnosti mezi nimi. Celkově se jako nejméně životaschopný jevil laboratorní kmen 6381, což potvrzuje také výsledek kultivace. Tento kmen byl izolován v laboratořích VÚVeL již před mnoha lety a za tuto dobu prošel mnoha pasážemi. To by mohlo souviset s jeho nízkou životaschopností v porovnání s izolátem 283/08. Terénní izolát 283/08 disponoval naopak nejvyšší životaschopností ze všech tří izolátů v případě krátkodobého ošetření. U dlouhodobého stresování byla jeho životaschopnost vyšší v porovnání s 6381 kmenem; ale nižší oproti 12146. Je však nutné podotknout, že křivka životaschopnosti izolátu 12146 je dosti „podivná“ v případě měnící se koncentrace amfotericinu B (Obrázek 13B) a také v některých koncentracích kyseliny nalidixové (Obrázek 13C).

5.2.

Kultivační metoda

Metoda kultivace na pevných médiích se nejčastěji využívá při kontrolních programech pro ozdravování stád skotu od paratuberkulózy (Pavlik a kol. 2000), ale nachází svoje uplatnění také při stanovení mykobakteriálních infekcí u jiných druhů zvířat (Kopecna a kol. 2008, Trcka a kol. 2006) nebo kontaminací ve vzorcích prostředí (Whan a kol. 2001). Kultivace na pevných médiích však někdy bývají nahrazeny kultivacemi v tekutém médiu, a to z důvodu vyšší citlivosti a kratší doby kultivace. Na druhou stranu tekuté kultivace mají nižší specificitu a poměrně častým problémem jsou falešně pozitivní výsledky jako příčina nedostatečného odstranění kontaminující mikroflóry. Z toho důvodu je nutné přidávat do kultivačních médií ATB, jako jsou např. kombinace VAN ATB nebo komerční směs ATB – PANTA (Gumber a Whittington 2007, Reddacliff a kol. 2003). VAN kombinace ATB se však nevyužívá pouze při kultivacích MAP, ale přidává se také do média pro kultivaci gramnegativních bakterií rodu Helicobacter (Fox a kol. 2001), který je ke kyselině nalidixové, oproti jiným gramnegativním bakteriím, přirozeně rezistentní. V laboratořích VÚVeL se k rutinní diagnostice PTB používá standardní kultivace na pevných médiích, především na Herroldově půdě. Pro kultivaci MAP bylo popsáno také použití Löwenstein–Jensen půdy. Nielsen a kol. (2004) však zjistili, že na Löwenstein–Jensen 59

médiu roste lépe kontaminující mikroflóra a růst MAP zde bývá naopak potlačen. Při porovnávání obou médií narostlo MAP s použitím Herroldovy půdy ze 6,9 % vzorků, zatímco při použití Löwenstein–Jensen média pouze ze 3,3 %. Z toho důvodu bylo doporučeno používat pro kultivaci MAP Herroldovu půdu (Nielsen a kol. 2004). Podobně jako u metody PMA F57 qPCR, byly na první pohled zřejmé především rozdíly v životaschopnosti MAP mezi krátkodobým a dlouhodobým ošetřením VAN ATB. Při vyšších koncentracích jednoho ATB “oproti její běžně používané koncentraci“ byl tento efekt, dle očekávání, umocněn. To však platilo pouze při ošetření dlouhodobém, po třídenním působení ATB byla ve všech koncentracích životaschopnost izolátů podobná. V případě kultivační metody došlo u všech ATB při dlouhodobém ošetření k významnému poklesu životaschopnosti buněk až při koncentraci 100 µg/ml a vyšší. Whittington (2009) sledoval odolnost MAP k dvoudenní a třídenní dekontaminaci HPC a následné kultivaci s VAN ATB („běžně používaná koncentrace“) na tekutém (Bactec 12B) nebo pevném médiu. Bylo zjištěno, že takto krátký časový rozdíl v dekontaminaci pomocí VAN ATB nesnižuje počet MAP buněk, ale významně snižuje množství kontaminant ve vzorku. Johansen a kol. (2005) sledovali vliv vankomycinu a natamycinu, fungicidu potlačujícího růst plísní (10,8 a 21,6 µg/ml), na MAP. V případě vankomycinu byly použity výrazně nižší koncentrace než v naší studii, a to 5,2 a 10,4 µg/ml. Při těchto koncentracích vankomycinu ani natamycinu nedošlo po dobu šesti týdnů k poklesu viabilních MAP ve vzorku, a proto byla kombinace těchto dvou ATB doporučena k potlačení kontaminace plísněmi kulturách v MAP. Je však nezbytné zmínit, že v rámci této studie nebyl sledován vliv obou ATB na kontaminující mikroflóru (Johansen a kol. 2005). Pomocí tekuté kultivace byl také sledován vliv vankomycinu

(1 µg/ml) a

PANTA

ATB

na

M. tuberculosis,

zástupce

komplexu

Mycobacterium avium a kontaminující mikroflóru ze vzorků pacientů s dýchacími obtížemi. Výsledky této studie potvrdily účinost vankomycinu na kontaminující mikroflóru, aniž by došlo k potlačení množství izolovaných mykobakterií ve vzorku (Alados a kol. 1998). Vliv kombinace VAN ATB na různé druhy patogenních a potenciálně patogenních mykobakterií (např. M. avium komplex, M. bovis, M. tuberculosis a M. fortuitum) v tekuté kultivaci sledoval také Chang a kol. (2002). VAN kombinace obsahovala vankomycin o koncentraci 10 µg/ml, 10 µg/ml amfotericinu B a 25 µg/ml kyseliny nalidixové. Také v tomto případě nedošlo k poklesu viability mykobakterií, zato byly účinně potlačeny nežádoucí bakterie a plísně.

60

Kultivační metoda neprokázala rozdíl v citlivosti použitých izolátů po třídenním ošetření VAN ATB. Po pětitýdenním ošetření VAN ATB byl však opět nejméně odolným laboratorní kmen 6381, což by mohlo souviset s jeho „oslabením“ z důvodu jeho dlouhodobého předchozího pasážování. Shin a kol. (2007) pomocí tekuté kultivace a při použití VAN kombinace ATB v protokolu zaznamenal pomalejší růst laboratorních kmenů MAP oproti izolátům, které byly pasážovány v menší míře. Z těchto důvodu by při provádění in vitro experimentů stálo za zvážení, zda je vhodné použít laboratorní kmeny k těmto účelům nebo zvolit raději terénní izoláty, které se jeví k VAN ATB odolnější.

5.3.

Výskyt kontaminující mikroflóry při kultivaci trusu na médiích s antibiotiky a po ošetření 0,9% HPC Dekontaminační protokol používaný v laboratořích VÚVeL pro kultivaci MAP z trusu

obsahoval do roku 1996 ošetření buněk 0,75% HPC po dobu 24 h. Z důvodu přetrvávající a časté kontaminace byla doba ošetření posléze prodloužena na tři dny. Tato změna byla provedena po ověření “neškodnosti působení“ 0,75% HPC pro MAP po dobu nejméně pěti dnů dekontaminace (Pavlik a kol. 2000). Později Kopecna a kol. (2008) použila pro třídenní dekontaminaci 0,9% HPC, a tento postup se v současné době používá při dekontaminaci vzorků z trusu nejčastěji. V předložené diplomové práci byl testován účinek 0,9% HPC na kontaminující mikroflóru v trusu po dobu tří, dvou a jednoho dne v kombinaci s VAN ATB v kultivačním médiu. Výsledky ukázaly, že jestliže byl vzorek ošetřen pouze pomocí 0,9% HPC, ale následně nebylo přidáno ATB do média, došlo k nárůstu kontaminant na médiu, nezávisle na počtu dní dekontaminace. Jestliže však byly použity jakékoli koncentrace VAN kombinace ATB po jedno, dvou i třídenní dekontaminaci HPC, pak bylo úspěšně zamezeno růstu kontaminující mikroflóry na médiu (kontaminanty tvořily pouze 2,5 % z celkového počtu vzorků). Johansen a kol. (2006) sledovali efekt působení HPC na kontaminující mikroflóru z trusu krav kultivované na Herroldově půdě. Byly testovány tři rozdílné koncentrace HPC (32,22; 3,22 a 1,07 µg/ml) po dobu 24 h a následně bylo provedeno jednodenní ošetření VAN kombinací ATB (100 µg/ml vankomycinu a kyseliny nalidixové a 50 µg/ml amfotericinu B). Po 24 hodinové dekontaminaci nebyl rozdíl mezi různými koncentracemi HPC nijak významný; větší rozdíl se projevil až po 16-ti týdnech kultivace. Celkově však byl nárůst kontaminant ve studii Johansen a kol. (2006) mnohem vyšší (23 – 27 % po 16-ti týdnech) než 61

v případě této práce. Whittington (2009) sledoval vliv 0,9% HPC na výskyt bakteriálních kontaminant při kultivaci trusu a následně vliv nárůstu kontaminant na odečitatelnost MAP. K dekontaminaci trusu využil 0,9% HPC působící 24 h a přídavek VAN ATB o „běžně používané“ koncentraci v kultivačních médiích. Z celkového množství vzorků se objevila kontaminující mikroflóra v 7 % případů. Je tedy zřejmé, že výsledky potlačení kontaminující mikroflóry pomocí HPC mohou být značně rozdílné. Možný rozptyl výskytu kontaminant po dekontaminačním protokolu s využitím různých metod kultivace může být od 0,3 % až do 41 % (Whittington 2009).

62

6. ZÁVĚR Cílem předložené diplomové práce bylo stanovit životaschopnost MAP buněk po třídenním a pětitýdenním ošetření kombinací antibiotik – vankomycinu, amfotericinu B a kyseliny nalidixové (VAN). Životaschopnost MAP buněk byla stanovena pomocí kultivační metody a metody kultivačně nezávislé – PMA F57 qPCR. Dalším cílem práce bylo určit vliv těchto antibiotik a hexadecylpyridinium chloridu (HPC) na výskyt kontaminující mikroflóry trusu při kultivaci MAP. Výskyt kontaminující mikroflóry byl stanoven pomocí kultivace na pevném médiu. Ze studia vyplynuly tyto závěry: • „Standardně používaná“ kultivace na pevném médiu a PMA F57 qPCR se ukázaly jako vhodné ke stanovení odolnosti MAP k antibiotikům. Až na mírné odchylky se, výsledky výrazně nelišily. • Vedle ATB s primárním účinkem na buněčné obaly se PMA F57 qPCR osvědčila také jako metoda vhodná pro sledování životaschopnosti MAP také u ATB, která poškozují buňky jiným způsobem než poškozením buněčné stěny. • Třídenní ošetření ATB nezpůsobilo výrazné snížení životaschopnosti u izolátů v porovnání s ATB neošetřenými kontrolními vzorky. Koncentrace antibiotik nebyla statisticky významným zdrojem proměnlivosti. Přesto vizuálně nejvyšší snížení životaschopnosti

bylo

zaznamenáno

při

působení

100 µg/ml

vankomycinu

a 100 µg/ml kyseliny nalidixové v kombinaci s amfotericinem B. • Pětitýdenní ošetření ATB vedlo k většímu poklesu životaschopnosti buněk oproti krátkodobému stresování. Přestože se výsledky kultivační a kultivačně nezávislé metody extrémně nelišily, je zde patrná lepší citlivost metody PMA F57 qPCR, u které je již 50 µg/ml antibiotika koncentrací statisticky významně snižující životaschopnost. V případě kultivací byla za tuto hodnotu stanovena koncentrace od 100 µg/ml. • „Běžně používané“ koncentrace VAN ATB způsobují pokles životaschopnosti MAP buněk zejména v případě dlouhodobého ošetření. Při kultivaci MAP s VAN ATB pro zabránění kontaminace média by bylo možné snížit koncentraci vankomycinu a kyseliny nalidixové ze 100 µg/ml na 50 µg/ml. Přítomnost VAN ATB v médiu pro kultivaci trusu se ukázala jako zásadní.

63

• Z důvodu vyšší letality laboratorního kmene 6381, zejména během dlouhodobého ošetření VAN antibiotiky doporučujeme používat terénní izoláty nebo izoláty málo pasážované, které „reálněji“ odrážejí odpověď na stres než „oslabené“ kmeny laboratorní. • V případě kultivace na médiích s VAN ATB nezáležela míra kontaminace na koncentraci ATB ani na počtu dní, po které byl trus dekontaminován HPC (1 – 3 dny). Dle těchto výsledků by bylo možné snížit koncentraci VAN na minimální testované koncentrace, ve spolupůsobení s HPC, což by vedlo ke snížení počtu falešně negativních výsledků.

64

7. PŘEHLED LITERATURY

Alados J.C., Pareja L., de la Rosa M. (1998): Effect of the addition of vancomycin on the performance of an automated nonradioactive system for detection of mycobacteria. Eur. J. Clin. Microbiol. 17: 731-733. Aduriz J.J., Juste R.A., Cortabarria N. (1995): Lack of mycobactin dependence of mycobacteria isolated on Middlebrook 7H11 from clinical cases of ovine paratuberculosis. Vet. Microbiol. 45: 211-217. Arnold G.L., Beaves M.R., Pryjdun V.O., Mook W.J. (2002): Preliminary study of ciprofloxacin in active Crohn's disease. Inflamm. Bowel Dis. 8: 10-15. Beard P.M., Henderson D., Daniels M.J., Pirie A., Buxton D., Greig A., Hutchings M.R., McKendrick I., Rhind S., Stevenson K., Sharp J.M. (1999): Evidence of paratuberculosis in fox (Vulpes vulpes) and stoat (Mustela erminea). Vet. Rec. 145: 612-613. Birch L., Dawson C.E., Cornett J.H., Keer J.T. (2001): A comparison of nucleic acid amplification techniques for the assessment of bacterial viability. Lett. Appl. Microbiol. 33: 296-301. Birmingham P., Helm J.M., Manner P.A., Tuan R.S. (2008): Simulated joint infection assessment by rapid detection of live bacteria with real-time reverse transcription polymerase chain reaction. J. Bone Joint Surg. Am. 90: 602-608. Bodmer T., Miltner E., Bermudez L.E. (2000): Mycobacterium avium resists exposure to the acidic conditions of the stomach. Fems Microbiol. Lett. 182: 45-49. Bull T.J., Mcminn E.J., Sidi-Boumedine K., Skull A., Durkin D., Neild P., Rhodes G., Pickup R., Hermon-Taylor J. (2003): Detection and verification of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in fresh ileocolonic mucosal biopsy specimens from individuals with and without Crohn's disease. J. Clin. Microbiol. 41: 2915-2923. Bull T.J, Linedale R., Hinds J., Hermon-Taylor J. (2009): A rhodanine agent active against non-replicating intracellular Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis. Gut Pathog. 1:25 doi: 10.1186/1757-4749-1-25. Cawthorn D.M., Witthuhn R.C. (2008): Selective PCR detection of viable Enterobacter sakazakii cells utilizing propidium monoazide or ethidium bromide monoazide. J. Appl. Microbiol. 105: 1178-1185. Chang C.L., Park T.S., Oh S.H., Kim H.H., Lee E.Y., Son H.C., Kim C.M. (2002): Reduction of contamination of mycobacterial growth indicator tubes with a modified antimicrobial combination. J. Clin. Microbiol. 40: 3845-3847. Cheng J., Bull T.J., Dalton P., Cen S., Finlayson C., Hermon-Taylor J. (2005): Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis in the inflamed gut tissues of patients with Crohn's disease in China and its potential relationship to the consumption of cow's milk: A preliminary study. World J. Microb. Biot. 21: 1175-1179.

65

Coelho A.C., Pinto M.L., Silva S., Coelho A.M., Rodrigues J., Juste R.A. (2007): Seroprevalence of ovine paratuberculosis infection in the Northeast of Portugal. Small Ruminant Res. 71: 298-303. Cutter C.N., Dorsa W.J., Handie A., Rodriguez-Morales S., Zhou X., Breen PJ., Compadre C.M. (2000): Antimicrobial activity of cetylpyridinium chloride washes against pathogenic bacteria on beef surfaces. J. Food Protect. 63: 593-600. Eamens G.J., Whittington R.J., Marsh I.B., Turner M.J., Saunders V., Kemsley P.D., Rayward D. (2000): Comparative sensitivity of various faecal culture methods and ELISA in dairy cattle herds with endemic Johne's disease. Vet. Microbiol. 77: 357-367. Economou M., Pappas G. (2008): New global map of Crohn's disease: Genetic environmental and socioeconomic correlations. Inflam. Bowel Dis. 14: 709-720. Ellingson J.L.E., Bolin C.A., Stabel J.R. (1998): Identification of a gene unique to Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis and application to diagnosis of paratuberculosis. Mol. Cell. Probe. 12: 133-142. Eshuis E.J., Polle S.W., Slors J.F., Hommes D.W., Sprangers M.A.G., Gouma D.J., Bemelman W.A. (2008): Long-term surgical recurrence, morbidity, quality of life, and body image of laparoscopic-assisted vs. open ileocolic resection for Crohn's disease: A comparative study. Diseas. Colon Rectum. 51: 858-867. Esteban J., Martin-De-Hijas N.Z., Kinnari T.J., Ayala G., Fernandez-Roblas R., Gadea I. (2008): Biofilm development by potentially pathogenic non-pigmented rapidly growing mycobacteria. Bmc Microbiol. 8:184 doi: 10.1186/1471-2180-8-184. Fox J.G., Handt L., Sheppard B.J., Dewhirst F.E., Motzel S., Klein I. (2001): Isolation of Helicobacter cinaedi from the colon, liver, and mesenteric lymph node of a rhesus monkey with chronic colitis and hepatitis. J. Clin. Microbiol. 39: 1580-1585. Gao A.L., Odumeru J., Raymond M., Mutharia L. (2005): Development of improved method for isolation of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis from bulk tank milk: Effect of age of milk, centrifugation, and decontamination. Can. J. Vet. Res. 69: 81-87. Good M., Clegg T., Sheridan H., Yearsely D., O'Brien T., Egan J., Mullowney P. (2009): Prevalence and distribution of paratuberculosis (Johne's disease) in cattle herds in Ireland. Irish Vet. J. 62: 597-606. Goss W.A., Deitz H.W., Cook T.M. (1965): Mechanism of action of nalidixic acid on Escherichia coli. II. Inhibition of deoxyribonucleic acid synthesis. J. Bacteriol. 89: 10681074. Grant I.R., Ball H.J., Rowe M.T. (2002): Incidence of Mycobacterium paratuberculosis in bulk raw and commercially pasteurized cows' milk from approved dairy processing establishments in the United Kingdom. Appl. Environ. Microb. 68: 2428-2435. Grant I.R., Kirk R.B., Hitchings E.I.J., Rowe M.T. (2003): Comparative evaluation of the MGIT and BACTEC systems for the culture of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis from milk. J. Appl. Microb. 95: 196-201. 66

Grant I.R., Williams A.G., Rowe M.T., Muir D.D. (2005): Efficacy of various pasteurization time-temperature conditions in combination with homogenization on inactivation of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in milk. Appl. Environ. Microbiol. 71:285361. Green E.P., Tizard M.L.V., Moss M.T., Thompson J., Winterbourne D.J., Mcfadden J.J., Hermon-Taylor J. (1989): Sequence and characteristics of IS900, an insertion element identified in a human Crohns-disease isolate of Mycobacterium-paratuberculosis. Nucleic Acids Res. 17: 9063-9073. Groenendaal H., Nielen M., Jalvingh A.W., Horst S.H., Galligan D.T., Hesselink J.W. (2002): A simulation of Johne's disease control. Prev. Vet. Med. 54: 225-245. Gumber S., Whittington R.J. (2007): Comparison of BACTEC 460 and MGIT 960 systems for the culture of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis S strain and observations on the effect of inclusion of ampicillin in culture media to reduce contamination. Vet. Microbiol. 119: 42-52. Haas W., Kaushal D., Sublett J., Obert C., Tuomanen E.I. (2005): Vancomycin stress response in a sensitive and a tolerant strain of Streptococcus pneumonia. J. Bacteriol. 187: 8205-8210. Harris N.B., Robbe-Austerman S., Payeur J.B. (2005): Effect of egg yolk on the detection of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis using the ESP II liquid culture system. J. Vet. Diagn. Invest. 17: 554-560. Hasonova L., Trcka I., Babak V., Rozsypalova Z., Pribylova R., Pavlik I. (2009): Distribution of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in tissues of naturally infected cattle as affected by age. Veterinarni Medicina. 54: 257-269. Hulten K., Almashhrawi A., El Zaatari F.A.K., Graham D.Y. (2000): Antibacterial therapy for Crohn's disease: A review emphasizing therapy directed against mycobacteria. Digest. Dis. Sci. 45: 445-456. Johansen K.A., Hugen E.E., Payeur J.B. (2006): Growth of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in the presence of hexadecylpyridinium chloride, natamycin, and vancomycin. J. Food Prot. 69: 878-883. Johne H.A., Frothingham L. (1895): Ein eigenthümlicher fall von tuberculose beim rind. Deutsche Zeitschr. Tierm. Path. 21: 438-454. Kaevska M., Hruska K. (2010): Analysis of publications on paratuberculosis from 1995 to 2009 with emphasis on the period from 2005 to 2009. Veterinarni Medicina. 55: 43-54. Kalis C.H.J., Hesselink J.W., Russchen E.W., Barkema H.W., Collins M.T., Visser I.J.R. (1999): Factors influencing the isolation of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis from bovine fecal samples. J. Veterinary Diagn. Invest. 11: 345-351. Kobayashi H., Oethinger M., Tuohy M.J., Hall G.S., Bauer T.W. (2009): Improving clinical significance of PCR: Use of propidium monoazide to distinguish viable from dead Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis. J. Orthop. Res. 27: 1243-1247. 67

Kobayashi H., Oethinger M., Tuohy M.J., Hall G.S., Bauer T.W. (2010): Distinction between intact and antibiotic-inactivated racteria by Real-Time PCR after treatment with propidium monoazide. J. Orthop. Res. 28: 1245-1251. Kopecna M., Parmova I., Dvorska-Bartosova L., Moravkova M., Babak V., Pavlik I. (2008): Distribution and transmission of Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis in farmed red deer (Cervus elaphus) studied by faecal culture, serology and IS900 RFLP examinations. Veterinarni. Medicina. 53: 510-523. Kralik P., Nocker A., Pavlik I. (2010): Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis viability determination using F57 quantitative PCR in combination with propidium monoazide treatment. Int. J. Food Microbiol. 141: 80-86. Kralik P., Slana I., Kralova A., Babak V., Whitlock R.H., Pavlik I. (2011): Development of a predictive model for detection of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in faeces by quantitative real time PCR. Vet. Microbiol. 149: 133-138. Kruze J., Salgado M., Paredes E., Mella A., Collins M.T. (2006): Goat paratuberculosis in Chile: first isolation and confirmation of Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis infection in a dairy goat. J. Vet. Diagn. Invest 18: 476-479. Lakatos P.L. (2006): Recent trends in the epidemiology of inflammatory bowel diseases: Up or down? World J. Gastroentero. 12: 6102-6108. Merkal R.S., Richards W.D. (1972): Inhibition of fungal growth in cultural isolation of mycobacteria. Appl. Microbiol. 24: 205-207. Mutharia L.M., Klassen M.D., Fairies J., Barbut S., Gill C.O. (2010): Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in muscle, lymphatic and organ tissues from cows with advanced Johne's disease. Int. J. Food Microbiol. 136: 340-344. Naser S.A., Ghobrial G., Romero C., Valentine J.F. (2004): Culture of Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis from the blood of patients with Crohn's disease. Lancet 364: 1039-1044. Naser S.A., Schwartz D., Shafran I. (2000). Isolation of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis from breast milk of Crohn's disease patients. Am. J. Gastroenterol. 95: 10941095. Nielsen S.S., Kolmos B., Christoffersen A.B. (2004): Comparison of contamination and growth of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis on two different media. J. Appl. Microbiol. 96: 149-153. Nielsen S.S., Bjerre H., Toft N. (2008): Colostrum and milk as risk factors for infection with Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis in dairy cattle. J. Dairy Sci. 91: 46104615. Nocker A., Cheung C.Y., Camper A.K. (2006): Comparison of propidium monoazide with ethidium monoazide for differentiation of live vs. dead bacteria by selective removal of DNA from dead cells. J. Microbiol. Meth. 67: 310-320.

68

Nocker A., Sossa K.E., Camper A.K. (2007): Molecular monitoring of disinfection efficacy using propidium monoazide in combination with quantitative PCR. J. Microbiol. Meth. 70: 252-260. Nocker A., Mazza A., Masson L., Camper A.K., Brousseau R. (2009): Selective detection of live bacteria combining propidium monoazide sample treatment with microarray technology. J. Microbiol. Meth. 76: 253-261. Nocker A., Camper A.K. (2009): Novel approaches toward preferential detection of viable cells using nucleic acid amplification techniques. Fems Microbiol. Lett. 291: 137-142. Nogva H.K., Dromtorp S.M., Nissen H., Rudi K. (2003): Ethidium monoazide for DNAbased differentiation of viable and dead bacteria by 5 '-nuclease PCR. Biotechniques. 34: 804813. Ott S.L., Wells S.J., Wagner B.A. (1999): Herd-level economic losses associated with Johne's disease on US dairy operations. Prev. Vet. Med. 40: 179-192. Parrish N.M., Radcliff R.P., Brey B.J., Anderson J.L., Clark D.L., Koziczkowski J.J., Ko C.G., Goldberg N.D., Brinker D.A., Carlson R.A., Dick J.D., Ellingson J.L.E. (2009): Absence of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in Crohn's Patients. Inflamm. Bowel Dis. 15: 558-565. Pavlik I., Horvathova A., Dvorska L., Bartl J., Svastova P., du Maine R., Rychlik I. (1999): Standardisation of restriction fragment length polymorphism analysis for Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis. J. Microbiol. Meth. 38: 155-167. Pavlik I., Matlova L., Bartl J., Svastova P., Dvorska L., Whitlock R. (2000): Parallel faecal and organ Mycobacterium avium subsp paratuberculosis culture of different productivity types of cattle. Vet. Microbiol. 77: 309-324. Pholwat S., Heysell S., Stroup S., Foongladda S., Houpt E. (2010): Rapid first- and secondline drug susceptibility assay for Mycobacterium tuberculosis isolates by use of quantitative PCR. J. Clin. Microbiol. 49:69-75. Pickup R.W., Rhodes G., Arnott S., Sidi-Boumedine K., Bull T.J., Weightman A., Hurley M., Hermon-Taylor J. (2005): Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in the catchment area and water of the river Taff in South Wales, United Kingdom, an its potential relationship to clustering of Crohn's disease cases in the city of Cardiff. Appl. Environ. Microbiol. 71: 2130-2139. Poupart P., Coene M., Vanheuverswyn H., Cocito C. (1993): Preparation of a specific RNA probe for detection of Mycobacterium-Paratuberculosis and diagnosis of Johnes disease. J. Clin. Microbiol. 31: 1601-1605. Pribylova R., Slana I., Lamka J., Babak V., Hruska K., Pavlik I. (2010): Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in a mouflon herd without clinical symptoms monitored using IS900 real-time PCR: a case report. Veterinarni Medicina. 55: 625-630. Provvedi R., Boldrin F., Falciani F., Palu G., Manganelli R. (2009): Global transcriptional response to vancomycin in Mycobacterium tuberculosis. Microbiol. SGM 155: 1093-1102. 69

Rawsthorne H., Dock C.N., Jaykus L.A. (2009): PCR-based method using propidium monoazide to distinguish viable from nonviable Bacillus subtilis spores. Appl. Environ. Microbiol. 75: 2936-2939. Reddacliff L.A., Vadali A., Whittington R.J. (2003): The effect of decontamination protocols on the numbers of sheep strain Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis isolated from tissues and faeces. Vet. Microbiol. 95: 271-282. Rowe M.T., Grant I.R., Dundee L. Ball H.J. (2000): Heat resistance of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in milk. Irish. J. Agr. Food. Res. 39: 203-208. Rutgeerts P., Van Assche G., Vermeire S., D'Haens G., Baert F., Noman M., Aerden I., De Hertogh G., Geboes K., Hiele M., D'Hoore A., Penninckx F. (2005 ): Ornidazole for prophylaxis of postoperative Crohn's disease recurrence: A randomized, double-blind, placebo-controlled trial. Gastroenterology. 128: 856-861. Scanu A.M., Bull T.J., Cannas S., Sanderson J.D., Sechi L.A., Dettori G., Zanetti S., HermonTaylor J. (2007): Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis infection in cases of irritable bowel syndrome and comparison with Crohn's disease and Johne's disease: Common neural and immune pathogenicities. J. Clin. Microbiol. 45: 3883-3890. Selby W., Pavli P., Crotty B., Florin T., Radford-Smith G., Gibson P., Mitchell B., Connell W., Read R., Merrett M., Ee H., Hetzel D. (2007): Two-year combination antibiotic therapy with clarithromycin, rifabutin, and clofazimine for Crohn's disease. Gastroenterology. 132: 2313-2319 Shin S.J., Han J.H., Manning E.J.B., Collins M.T. (2007): Rapid and reliable method for quantification of Mycobacterium paratuberculosis by use of the BACTEC MGIT 960 system. J. Clin. Microbiol. 45: 1941-1948. Slana I., Kralik P., Kralova A., Pavlik I. (2008): On-farm spread of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in raw milk studied by IS900 and F57 competitive real time quantitative PCR and culture examination. Int. J. Food Microbiol. 128: 250-257. Stabel J.R. (1997): An improved method for cultivation of Mycobacterium paratuberculosis from bovine fecal samples and comparison to three other methods. J. Vet. Diagn. Invest. 9: 375-380. Stevenson K., Alvarez J., Bakker D., Biet F., de Juan L., Denham S., Dimareli Z., Dohmann K., Gerlach G.F., Heron I., Kopecna M., May L., Pavlik I., Sharp J.M., Thibault V.C., Willemsen P., Zadoks R.N., Greig A. (2009): Occurrence of Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis across host species and European countries with evidence for transmission between wildlife and domestic ruminants. Bmc Microbiol. 9:212 doi: 10.1186/1471-2180-9-212. Strommenger B., Stevenson K., Gerlach G.F. (2001): Isolation and diagnostic potential of ISMav2, a novel insertion sequence-like element from Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis. Fems Microbiol. Lett. 196: 31-37. Sung N.M., Collins M.T. (2003): Variation in resistance of Mycobacterium paratuberculosis to acid environments as a function of culture medium. Appl. Environ Microbiol. 69: 68336840. 70

Sweeney R.W., Whitlock R.H., Rosenberger A.E. (1992): Mycobacterium-paratuberculosis isolated from fetuses of infected cows not manifesting signs of the disease. Ame. J. Vet. Res. 53: 477-480. Sweeney R.W., Whitlock R.H., Buckley C.L., Spencer P.A. (1995): Evaluation of a commercial enzyme-linked-immunosorbent-assay for the diagnosis of paratuberculosis in dairy-cattle. J. Vet. Diagn. Invest. 7: 488-493. Tasara T., Stephan R. (2005): Development of an F57 sequence-based real-time PCR assay for detection of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in milk. Appl. Environ. Microbiol. 71: 5957-5968. Tholcken C.A., Huang S., Woods G.L. (1997): Evaluation of the ESP culture system II for recovery of mycobacteria from blood specimens collected in isolator tubes. J. Clin. Microbiol. 35: 2681-2682. Tiwari A., VanLeeuwen J.A., Dohoo I.R., Keefe G.P., Weersink A. (2008): Estimate of the direct production losses in Canadian dairy herds with subclinical Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis infection. Can. Vet. J. 49: 569-576. Trcka I., Lamka J., Suchy R., Kopecna M., Beran V., Moravkova M., Horvathova A., Bartos M., Parmova I., Pavlik I. (2006): Mycobacterial infections in European wild boar (Sus scrofa) in the Czech Republic during the years 2002 to 2005. Veterinarni Medicina. 51: 320-332. van Roermund H.J.W., Bakker D., Willernsen P.T.J., de Jong M.C.M. (2007): Horizontal transmission of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in cattle in an experimental setting: Calves can transmit the infection to other calves. Vet. Microbiol. 122: 270-279. Vanboxtel R.M., Lambrecht R.S., Collins M.T. (1990): Effect of polyoxyethylene sorbate compounds (Tweens) on colonial morphology, growth, and ultrastructure of Mycobacteriumparatuberculosis. Apmis 98: 901-908. Vesper S., McKinstry C., Hartmann C., Neace M., Yoder S., Vesper A. (2008): Quantifying fungal viability in air and water samples using quantitative PCR after treatment with propidium monoazide (PMA). J. Microbiol. Meth. 72: 180-184. Wahman D.G., Wulfeck-Kleier K.A., Pressman J.G. (2009): Monochloramine disinfection kinetics of Nitrosomonas europaea by propidium monoazide quantitative PCR and live/dead BacLight methods. Appl. Environ. Microbiol. 75: 5555-5562. Whan L.B., Grant I.R., Ball H.J., Scott R., Rowe M.T. (2001): Bactericidal effect of chlorine on Mycobacterium paratuberculosis in drinking water. Lett. Appl. Microbiol. 33: 227-231. Whan L., Ball H.J., Grant I.R., Rowe M.T. (2005): Occurrence of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in untreated water in Northern Ireland. Appl. Environ. Microbiol. 71: 7107-7112. Whittington R.J., Marsh I., Turner M.J., McAllister S., Choy E., Eamens G.J., Marshall D.J., Ottaway S. (1998): Rapid detection of Mycobacterium paratuberculosis in clinical samples from ruminants and in spiked environmental samples by modified BACTEC 12B radiometric culture and direct confirmation by IS900 PCR. J. Clin. Microbiol. 36: 701-707. 71

Whittington R.J., Marshall D.J., Nicholls P.J., Marsh A.B., Reddacliff L.A. (2004): Survival and dormancy of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in the environment. Appl. Environ. Microbiol. 70: 2989-3004. Whittington R.J., Marsh I.B., Reddacliff L.A. (2005): Survival of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in dam water and sediment. Appl. Environ. Microbiol. 71: 53045308. Whittington R.J. (2009): Factors affecting isolation and identification of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis from fecal and tissue samples in a liquid culture system. J. Clin. Microbiol. 47: 614-622. Whittington R.J., Windsor P.A. (2009): In utero infection of cattle with Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis: A. critical review and meta-analysis. Vet. J. 179: 60-69. Windsor P.A., Whittington R.J. (2010): Evidence for age susceptibility of cattle to Johne's disease. Vet. J. 184: 37-44. Internetové zdroje: http://www.johnes.org/general/_EM_scanning.html http://spsprerov.draksoft.net/rocprace/Leciva/special_farmakologie.html http://en.wikipedia.org/wiki

72

Sledování životaschopnosti Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis pomocí kultivačních a kultivačně nezávislých metod

Recommend Documents