VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V BRNĚ Fakulta elektrotechniky
a komunikačních technologií Ústav biomedicínského inženýrství
Diplomová práce magisterský navazující studijní obor Biomedicínské a ekologické inženýrství
Student: Pavel Hanák Ročník: 2
ID: 98587 Akademický rok: 20012/2013
NÁZEV TÉMATU:
Optická detekce elektrogramů POKYNY PRO VYPRACOVÁNÍ: 1)Proveďte literární rešerši možnosti snímání elektrogramů s využitím napěťově citlivých barviv. 2)Zaměřte se i na problematiku optických senzorů vhodných pro detekci elektrogramů s využitím napěťově citlivých barviv pozornost věnujte i šumovým vlastnostem optických detektorů a také jejich linearitě. 3)Popište souhrnně všechny možné zdroje rušení snímaného signálu a navrhněte metody umožňující potlačení jejich vlivu na snímaný signál. 4)Navržené metody realizujte ve formě programu v prostředí MATLAB. Program by měl umožňovat zobrazení původního signálu a signálu po jeho úpravě. Aby bylo možno jej bezprostředně porovnat. 5)Rozeberte výhody a nevýhody navržených metod s ohledem na možné zkreslení snímaného signálu. DOPORUČENÁ LITERATURA: [1] HAMAMATSU: Photodiode Technical Information, dostupné na: http://sales.hamamatsu.com/assets/applications/SSD/photodiode_technical_information.pdf [2] NIKNEJAD, A. M. Electrical Noise, dostupné na: http://rfic.eecs.berkeley.edu/~niknejad/ee142_fa05lects/pdf/lect11.pdf. [3] FIALOVÁ, K., KOLÁŘOVÁ, J., JANOUŠEK, O., RONZHINA, M., PROVAZNÍK, I., NOVÁKOVÁ, M. Effects of Voltage-Sensitive Dye di-4- ANEPPS on Isolated Rat Heart Electrogram. In Computers in Cardiology. 2011. s. 1-4. ISBN: 978-1-4577-0612- 7. Termín zadání: 11.2.2013 Vedoucí práce: doc. Ing. Milan Chmelař, CSc.
Termín odevzdání: 24.5.2013
doc. Ing. Ivo Provazník, Ph.D.
Předseda oborové rady UPOZORNĚNÍ: Autor diplomové práce nesmí při vytváření diplomové práce porušit autorská práva třetích osob, zejména nesmí zasahovat nedovoleným způsobem do cizích autorských práv osobnostních a musí si být plně vědom následků porušení ustanovení § 11 a následujících autorského zákona č. 121/2000 Sb., včetně možných trestněprávních důsledků vyplývajících z ustanovení části druhé, hlavy VI. díl 4 Trestního zákoníku č.40/2009 Sb.
ABSTRAKT Cílem práce bylo seznámit se s problematikou měření elektrogramů s využitím napěťově citlivých barviv. Dále bylo cílem prostudovat problematiku optických senzorů vhodných pro detekci signálu a s tím spojené rušení. Hlavním cíle práce bylo následné odstranění těchto nežádoucích vlivů. Odstranění rušení bylo provedeno v programovém prostředí Matlab pomocí filtrace dolní propusti a vlnkovou transformací.
KLÍČOVÁ SLOVA Optické měření, Langendorffův model, fotodioda, pohybový artefakt, akční napětí, dolní propust, vlnková transformace, Matlab.
ABSTRACT The aim of the study was focused on problem of electrograms recording with using voltage sensitive dyes. Study of electrograms recording was extended with thema of optical detectors suitable for measurement and noise analysis. Elimination of noise and disturption was made in program Matlab; lowpass filtration and wavelet transformation was used. Application for electrograms analysis was developed in latter part of this work.
KEYWORDS Optical measuring, Langendorff model, photodiode, motion artefact, action potential, lowpass, wavelet transform, Matlab.
HANÁK, P. Optická detekce elektrogramů. Brno: Vysoké učení technické v Brně, Fakulta elektrotechniky a komunikačních technologií, 2013. 59 s. Vedoucí diplomové práce doc. Ing. Milan Chmelař, CSc..
PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že svou diplomovou práci na téma Optická detekce elektrogramů jsem vypracoval samostatně pod vedením vedoucího diplomové práce a s použitím odborné literatury a dalších informačních zdrojů, které jsou všechny citovány v práci a uvedeny v seznamu literatury na konci práce. Jako autor uvedené diplomové práce dále prohlašuji, že v souvislosti s vytvořením této diplomové práce jsem neporušil autorská práva třetích osob, zejména jsem nezasáhl nedovoleným způsobem do cizích autorských práv osobnostních a/nebo majetkových a jsem si plně vědom následků porušení ustanovení § 11 a následujících zákona č. 121/2000 Sb., o právu autorském, o právech souvisejících s právem autorským a o změně některých zákonů (autorský zákon), ve znění pozdějších předpisů, včetně možných trestněprávních důsledků vyplývajících z ustanovení části druhé, hlavy VI. díl 4 Trestního zákoníku č. 40/2009 Sb. V Brně dne: 24. května 2013
.................................... (podpis autora)
PODĚKOVÁNÍ Děkuji vedoucímu diplomové práce doc. Ing. Milanu Chmelařovi za účinnou metodickou, pedagogickou a odbornou pomoc a další cenné rady při zpracování mé diplomové práce.
V Brně dne: 24. května 2013
.................................... (podpis autora)
Obsah 1
Úvod ................................................................................................................................... 1
2
Srdce ................................................................................................................................... 2 2.1
3
4
Mechanická aktivita srdce................................................................................................ 5 3.1
Fáze srdeční revoluce (srdeční cyklus).................................................................................... 5
3.2
Řízení srdeční frekvence ......................................................................................................... 5
Elektrická aktivita srdce .................................................................................................. 7 4.1
5
Buněčná membrána ............................................................................................................... 10
5.1.1
Elektrické jevy na membráně ........................................................................................ 10
5.1.2
Membránové napětí ....................................................................................................... 10
5.1.3
Klidové membránové napětí.......................................................................................... 11
5.2
7
Převodní systém srdce ............................................................................................................. 7
Elektrická aktivita srdeční buňky ................................................................................. 10 5.1
6
Stavba srdce............................................................................................................................. 2
Akční potenciál...................................................................................................................... 12
Možnosti snímání elektrogramů s využitím napěťově citlivých barviv ..................... 15 6.1
Snímání akčního potenciálu pomocí jedné vlnové délky ...................................................... 15
6.2
Snímání akčního potenciálu pomocí dvou vlnových délek ................................................... 16
6.3
Snímání akčního potenciálu pomocí spektrofluorometrie ..................................................... 18
Optické senzory ............................................................................................................... 19 7.1
Princip funkce fotodiody ....................................................................................................... 19
7.1.1
8
9
Charakteristické parametry fotodiod ............................................................................. 22
7.2
Šumové vlastnosti optických detektorů ................................................................................. 26
7.3
Optický senzor pro detekci elektrogramů .............................................................................. 29
Napěťově citlivé barvivo................................................................................................. 32 8.1
Měření změn napětí za použití napěťově citlivých barviv .................................................... 34
8.2
Napěťově citlivé barvivo di-4-ANEPPS ................................................................................ 35
Přehled zdrojů rušení snímaného signálu..................................................................... 38
10 Návrh odstranění rušení v programovém prostředí Matlab ...................................... 45 10.1
Filtrace signálu dolní propustí ............................................................................................... 45
10.2
Filtrace signálu vlnkovou transformací ................................................................................. 48
10.2.1
Stanovení prahu koeficientů DTWT.............................................................................. 50
11 Závěr ................................................................................................................................ 56
12 Seznam použité literatury .............................................................................................. 58
1
Úvod
Srdce patří mezi nejdůležitější orgány lidského těla. Zajišťuje oběh krve v cévách, tepnách a žilách. Rozvádí tak živiny do celého těla. Během jediné minuty dokáže přečerpat až 6 litrů krve. Při zátěži, kdy srdce musí pracovat rychleji, je to i více. Normální tepová frekvence se pohybuje kolem 70 tepů/min. Sportovci mají nižší klidovou tepovou frekvenci, než „netrénovaný“ člověk. Správný rytmus srdce můžou ovlivnit různá onemocnění, jako například infarkt myokardu, různé srdeční arytmie, ischemická choroba srdeční, nedomykavost chlopní. Správná funkce srdce se dá snímat přístrojem zvaným elektrokardiograf, jehož výstupem je tzv. elektrokardiogram (EKG), který zaznamenává srdeční aktivitu. EKG se snímá z povrchu těla. Pro snímání EKG se obvykle užívá 12-ti svodů (6 hrudních, 3 unipolární, 3 končetinové). Kromě klasického snímání EKG, lze snímat elektrickou aktivitu srdce přímo z jeho povrchu. Tento záznam se nazývá elektrogram. Tato práce se zabývá snímáním elektrogramů optickou cestou za pomocí napěťově citlivých barviv, která je výhodnější, než snímat elektrogram pomocí elektrod, připevněných na srdce. Toto snímání je více náchylné na pohybové artefakty spojené s dislokací elektrod. Navíc elektrody (např. přísavné) poškozují tkáň srdce. Dále je práce věnována optickým senzorům, které byly použity pro snímání akčního potenciálu, a je zde také věnována pozornost jejich šumovým vlastnostem. Následně byly sepsány všechny možné zdroje rušení, které mohou ovlivňovat dané měření. V praktické části byla snaha šum, který znehodnocoval užitečný signál akčního potenciálu, vyfiltrovat. Filtrace byla provedena pomocí dvou metod, a to filtrem dolní propusti a filtrací vlnkovou transformací. Na konci práce je zhodnocena kvalita a porovnání obou filtrací.
1
2
Srdce
V této kapitole bude popsán základní princip funkce srdce, choroby srdce, jeho elektrická a mechanická část. Dále bude diskutován akční potenciál a jeho zastoupení v EKG.
2.1 Stavba srdce Srdce je dutý svalový orgán, který se nachází v dutině hrudní mezi pravou a levou plící. Srdce má kuželovitý tvar. Jeho hmotnost se pohybuje v rozsahu 280 – 320g. Srdce je rozděleno na dvě síně a dvě komory. Ty pak tvoří levé a pravé srdce. Levé a pravé srdce je od sebe odděleno přepážkou, zvanou septum. Srdce je důležitý orgán v těle, neboť zajišťuje cirkulaci krve v oběhovém systému. Srdce je složeno z několika vrstev. Tyto vrstvy se nazývají endokard, myokard, epikard, perikard.
Endokard – jedná se nitroblánu, která tvoří vnitřní výstelku srdce; vytváří cípaté srdeční chlopně mezi síněmi a komorami
Myokard – je to střední část srdce; charakterizuje svalovou část srdce, která vykonává jeho stahy
Epikard – povrchová blána, která pokrývá povrch srdce
Perikard – zvaný jako osrdečník; jedná se o zevní obal srdce
Mezi epikardem a perikardem je vytvořen prostor, který je vyplněn tekutinou. Tato tekutina má za úkol chránit srdce před nárazy, před nadměrným třením a usnadňuje tak celkově pohyb srdce. Na obrázku 3 je řez srdcem, kde lze vidět, z čeho je srdce složeno a lze na něm popsat, jak do srdce a ze srdce proudí krev. Princip je tedy následující: Neokysličená krev z těla se dostává do srdce horní a dolní dutou žilou, kde se dostává nejdříve do pravé síně a pak teprve přes trojcípou chlopeň do pravé komory. Neokysličená krev je vedena plicními tepnami do plic, kde dojde k okysličení krve a takto okysličená krev se vrací plicními žilami do levé síně a následně přes dvojcípou chlopeň do levé komory. Z levé komory se pak okysličená krev dostane přes aortu do oběhového systému, kde přivádí živiny do jednotlivých orgánů. Zmíněné poloměsíčité chlopně zde slouží k zabránění zpětnému návratu krve do srdce. Uzavíráním těchto chlopní lze poslechem registrovat tzv. srdeční ozvy. První ozva charakterizuje uzavření cípatých chlopní při systole. Druhá ozva se vyskytuje při uzavření 2
poloměsíčitých chlopní při diastole. Pokud dojde z nějakého důvodu k poruše chlopně a chlopeň není schopna vykonávat svoji funkci, čili dokonale se uzavřít, vzniká patologie zvaná jako nedomykavost chlopní. Tato nedomykavost se projevuje jako srdeční šelest. Krev se tak dostává zase zpět do srdce. Srdce bohužel není nezničitelný orgán a tak se na něm můžou projevovat různé patologie, které ovlivňují správný rytmus (frekvenci) srdce. Mezi onemocnění srdce patří ischemická choroba srdeční, infarkt myokardu, chlopenní vady, infekční endokarditida, srdeční arytmie, vrozené srdeční vady.[7] Ischemická choroba srdeční – dochází k ukládání aterosklerotické pláty v koronárním řečišti, čímž dochází k snížení průtoku v srdci. Infarkt myokardu – k tomuto onemocnění dochází při uzávěru koronární tepny krevní sraženinou, čímž dojde k přerušení zásobování srdce krví. Infekční endokarditida – jedná se o zánětlivé onemocnění povrchu srdce (endokardu). Postihnu obvykle srdeční chlopně. Srdeční arytmie – dochází k poruše frekvence srdce. Srdeční arytmie se dělí podle různých aspektů, např. podle rychlosti srdeční činnosti (tachyarytmie, bradyarytmie), podle místa vzniku v převodním systému (sinusová, supraventrikulární, ventrikulární). Existují taky specifické typy arytmií, jako extrasystoly (předčasné srdeční stahy); (pro názornost je na obrázku 1 uvedena extrasystola síně), fibrilace (velmi rychlé nepravidelné stahy srdce).
Obrázek 1: Síňová extrasystola
3
Obrázek 2: Fibrilace síní (nahoře), normální EKG (dole)
Obrázek 3: Stavba srdce (převzato z [1])
4
3
Mechanická aktivita srdce
Tato podkapitola se věnuje popisu mechanickému řízení srdeční činnosti, které představují stahy srdce. Mechanická aktivita srdce také ovlivňuje snímaný signál optickou metodou (rušení).
3.1 Fáze srdeční revoluce (srdeční cyklus) Mechanická práce srdce se vyznačuje čtyřmi fázemi: diastola komor, systola síní, systola komor, diastola síní. Diastola představuje relaxační část srdečního cyklu, kdy srdce čerpá krev. Systola představuje stah srdce, kdy dochází k vypuzení krve ze srdce. Jednotlivé fáze jsou popsány níže. -
Diastola síní – do pravé síně přitéká krev z velkého tělního oběhu, současně do levé síně přitéká krev z plicních žil.
-
Systola síní – představuje vypuzení krve ze síní do komor. Zde se vyskytují chlopně (dvojcípá, trojcípá), které byly popsány výše.
-
Systola komor – poloměsíčité chlopně jsou uzavřeny a dochází k vypuzení krve z komor do plic a do aorty.
-
Diastola komor – poloměsíčité chlopně jsou otevřeny a do komor proudí krev ze síní.
Délka srdečního cyklu je 0,8 s, cože představuje jeden puls. Frekvence srdce se pohybuje mezi 70-80 tepy za minutu. Když se srdce ocitne v zátěži, může frekvence vzrůst na 150-200 tepů za minutu. Srdce při stahu (systole) dokáže vypudit 60-70 ml krve. Jedná se o tepová objem srdeční. Dalším pojmem je minutový objem srdeční. Je to množství krve vypuzené z komor za 1 minutu. Toto množství je přibližné 5,6 l. Při námaze je toto množství samozřejmě větší (18-40 l). [4][7]
3.2 Řízení srdeční frekvence Frekvence srdce je řízena pomocí autonomních nervů. Mezi autonomní nervy patří:
5
-
Parasympatická nervová vlákna – zpomalují srdeční frekvenci a to tak, že snížení sílu kontrakce a vzrušivost myokardu. Mediátorem je acetylcholin.
-
Sympatická nervová vlákna – zrychlují srdeční frekvenci. Mechanismus je zde opačný než u parasympatických nervových vláken, a to zvýšení síly kontrakce a zvýšení vzrušivosti myokardu. Mediátorem je noradrenalin.
-
Baroreceptorové reflexy – baroreceptory, nacházející se v aortě, snímají tlak krve. Když dojde ke zvýšení tlaku krve, srdeční frekvence se sníží a tím tlak krve poklesne.
6
4
Elektrická aktivita srdce
Tato podkapitola popisuje elektrické projevy na srdci a způsob jejich šíření srdcem.
4.1 Převodní systém srdce Úkolem převodního systému srdce (obrázek 4) je vytvářet a rozvádět vzruchy po srdci. Převodní systém srdce se skládá ze sinoatriálního (SA) uzlu, atrioventrikulárního uzlu (AV), Hisova svazku, Tawarových ramének a Purkyňových vláken. Sinoatriální uzel se nachází v horní části pravé síně. SA uzel je hlavním zdrojem vzruchů a je označován jako pacemaker srdce (udává rytmus srdce). V SA uzlu vzniká nejrychlejší depolarizace z celého srdce. SA uzel udává frekvenci ostatním částem převodního systému. Atrioventrikulární uzel převádí srdeční vzruchy ze síní na komory. Nachází se v dolní části pravé síně. Vzniká zde jisté zpoždění, které je zde k zajištění koordinovaného stahu síně a komory. Obvykle dochází nejdříve ke stahu síní, poté dochází ke zmíněnému zpoždění, a pak teprve dojde ke stahu komor. Působí také jako filtr, který nepustí na komory „předčasné“ vzruchy. Hisův svazek funguje jako vodivá spojnice mezi svalovinou předsíní a komor. Hisův svazek vychází z AV uzlu. Tawarova raménka se dělí na pravé a levé raménko. Tyto raménka vznikly rozdělením Hisova svazku a zajišťují šíření vzruchu na svalovinu srdečních komor. Purkyňova vlákna jsou pokračováním Tawarových ramének a slouží k převodu vzruchu k buňkám pracovního myokardu. Jednotlivé vzruchy, charakterizovány akčními potenciály, tvoří dohromady křivku EKG a lze ji registrovat pomocí elektrokardiografu (viz obr. 5). Na obrázku 5 si lze také povšimnout šíření vzruchů srdcem. [4]
7
Obrázek 4: Převodní systém srdce (převzato z [1])
8
Obrázek 5: Rozložení EKG signálu na jednotlivé akční potenciály (převzato z [3])
Dále je zapotřebí zmínit se, co akční potenciál představuje, neboť tato práce se zabývá snímáním akčního potenciálu. Akční potenciál a jeho vlastnosti budou popsány v následující kapitole.
9
5
Elektrická aktivita srdeční buňky
Předchozí kapitola popisovala globálně elektrické jevy na srdci, zatímco v této kapitole jsou popisovány elektrické jevy na membráně srdeční buňky.
5.1 Buněčná membrána Buněčná membrána je tvořena z fosfolipidové dvojvrstvy. Základem fosfolipidové dvojvrstvy jsou fosfolipidy a cholesterol. Cholesterol zajišťuje tekutý stav membrány. Tloušťka této dvojvrstvy je 7 – 10 nm. Největší zastoupení v buňce mají proteiny (55%), které se podílí na aktivním přenosu Na+ z buňky a K+ do buňky. Přenos iontů se rozděluje dle energetické náročnosti na pasivní transport a aktivní transport. V případě aktivního transportu je vyžadováno dodání metabolická energie. U pasivního transportu iontů je hnací silou koncentrační gradient. Na pasivním transportu se podílí difúze (transport rozpuštěné látky podél koncentračního gradientu) a osmóza (transport rozpouštědla ve směru koncentračního gradientu rozpuštěné látky). V aktivním transportu iontů hraje hlavní roli sodíková pumpa získává energii štěpením adenosin-tri-fosfátu (ATP) na adenosindifosfát (ADP) a volný fosfát. Ke štěpení dochází působením enzymu Na+ /K+ ATP-ázy, které jsou uloženy v buněčné membráně. Rozštěpením jednoho molu ATP na ADP a volný fosfát se uvolní určitá energie, která způsobí přenos iontů z/do buňky. Aktivní transport dává buněčných iontů dává vzniknout membránovému napětí. [4]
5.1.1 Elektrické jevy na membráně Na buněčné membráně se nachází elektrický potenciál, který určuje koncentrace kationtů a anionů uvnitř a mimo buňku. Změně elektrického potenciálu je řízena pomocí přenašečových systémů popsaných výše.
5.1.2 Membránové napětí Membránové napětí je dáno rozdílem potenciálů uvnitř a vně buněčné membrány. Toto napětí lze změřit pomocí dvou elektrod, kde jedna je umístěna vně buňky a druhá uvnitř. Když dojde k dosažení prahové hodnoty napětí, začne buňka vytvářet akční napětí, které má za následek změnu propustnosti membrány. Změny membránového napětí jsou projevem elektrické aktivity srdečních buněk. Buňka se může nacházet buď v klidovém stavu, nebo ve vybuzeném (podrážděném) stavu – akční potenciál. [4]
10
5.1.3 Klidové membránové napětí Napětí na membráně závisí na vodivosti membrány pro ionty K, Na, Ca. Klidové membránové napětí bývá určeno několika způsoby: -
Odlišnou koncentrací iontů vně a uvnitř buňky (uvnitř buňky je vysoká koncentrace K+ iontů, vně buňky je vysoká koncentrace Na+ iontů).
-
Buněčná membrána vykazuje rozdílnou propustnost pro různé ionty. Například K+ ionty jsou membránou propouštěny, kdežto pro Na+ ionty je membrána nepropustná. Existují zde určité množství únikových kanálů, kterými K+ ionty mají snahu opustit buňku ve směru koncentračního gradientu. Tak je vytvořen elektrický gradient, který se snaží tomuto úniku zabránit. Platí zde jednoduché pravidlo, že čím víc K+ iontů opustí intracelulární prostor buňky, tím větší bude elektrický gradient. Až bude elektrický gradient natolik velký, že dojde k vyrovnání koncentračního gradientu, vytvoří se zde rovnováha mezi proudem K+ iontů z/do buňky. Tato vzniklá rovnováha udává velikost klidového membránového napětí. [6][8][9]
Obrázek 6: Ukázka vyrovnání koncentračního gradientu a vznik klidového membránového napětí (převzato z [8])
-
Sodíko-draslíkovou pumpou, která zajišťuje rovnováhu mezi koncentrací Na+ a K+ iontů. Čili čerpá Na+ ionty z buňky a K+ ionty do buňky.
Hodnota klidového membránového napětí se pohybuje v rozmezí -90 mV až -50 mV.
11
5.2 Akční potenciál Akčním potenciálem rozumíme změnu napětí na membráně některých tzv. vzrušivých buněk. Je-li při napěťové změně překročeno určité prahové napětí, dojde k rychlému růstu napětí a následnému přepólování buňky až do kladných hodnot, poté se napětí vrací zpět do klidového stavu. Při přepólování se do záporně nabité buňky dostávají iontovými kanály kladně nabité ionty, čímž se buňka stává kladnější. Toto je označováno jako depolarizace. Přepólování membránového napětí do kladných hodnot se označuje jako transpolarizace. Při návratu napětí zpět ke klidovým hodnotám do buňky vnikají záporné ionty, buňka se tak stává zápornější, a tento děj je nazýván depolarizací. [6][8][9] Na obrázku 7 nahoře je tvar akčního potenciálu, kde čísla popisují jednotlivé fáze polarizace: 0 = depolarizace, 1 = přechod depolarizace, 2 = fáze plató, 3 = repolarizace, 4 = klidové napětí. Pod schématem akčního potenciálu jsou znázorněny iontové proudy vstupující do buňky a iontové proudy, které z buňky vystupují. Jejich směr (nahoru, dolů) je vyobrazen podle toho, zda z buňky vystupují (repolarizační proudy), nebo vstupují (depolarizační proudy). Akční potenciál se ze srdce může snímat dvěma způsoby, a to pomocí mikroelektrod, nebo pomocí napěťově citlivých barviv. Nevýhoda v použití mikroelektrod je, že dochází k porušení tkáně srdce, v důsledku aplikace elektrody na srdce (např. přísavné elektrody), a vyskytuje se zde větší náchylnost signálu na rušení pohybovými artefakty (např. dislokace elektrod). Druhý způsob využívá snímání akčního potenciálu pomocí napěťově citlivých barviv, kde je výhoda v potlačení pohybového artefaktu měřením na dvou vlnových délkách. Tento způsob snímání akčního potenciálu je bezkontaktní, kdy nedochází k porušení tkáně.
12
Obrázek 7: Akční potenciál (nahoře) a pod ním iontové proudy (převzato z [9])
Pozn.: Aby bylo možné elektrogramy měřit, je zapotřebí srdce z těla chirurgicky vyjmout a udržet ho „naživu“. To zajišťuje zařízení, zvané „Langendorffův perfúzní systém“ (obr. 8). Tento systém zajišťuje dopravu nutně potřebných živin do srdce (např. kyslík, vápník), aby srdce správně pracovalo. Tyto živiny se vyskytují ve formě roztoku, který protéká koronárním řečištěm srdce.
13
Obrázek 8: Langendorffův perfúzní systém (LPS)(vlevo): A - dvouplášťová měřicí komůrka, B - snímač teploty, C – snímač teploty v nádobě, D – okysličovaný roztok, E – kanyla s odstraňovačem bublin, F – systém tlakové kontroly, G – přepadový odtok, H – Ag-AgCl elektrody; LPS realizace (vpravo), převzato z [10]
14
6
Možnosti snímání elektrogramů napěťově citlivých barviv
s využitím
V této kapitole budou zmíněny způsoby snímání elektrogramů pomocí napěťově citlivých barviv.
6.1 Snímání akčního potenciálu pomocí jedné vlnové délky V případě snímání akčního potenciálu na jedné vlnové délce je použito halogenové žárovky (150 W), která je používána jako excitační zdroj světla. Zařízení, ze kterého je halogenová žárovka napájena, vyniká dobrými vlastnosti, jako je například stabilní výstup – nedochází ke kolísání světelného toku a tím ke vzniku případného zkreslení užitečného signálu. Zdroj světla obsahuje také infračervený filtr, aby nedocházelo k zahřívání zkoumaného preparátu (srdce) a excitační filtr pásmové propusti (506 ±30 nm). Světlo je vedeno pomocí optických vláken o průměru 2µm, která jsou konstruovány pro vlnové délky od 350 nm do 1100 nm. Světlo je vedeno dvojitým optickým kabelem (jedním kabelem je vedeno světlo na povrch srdce, druhým kabelem je veden odražený signál ze srdce). Excitační světlo je vedeno ze zdroje světla k povrchu srdce přes šest optických vláken a emitované světlo je vedeno zpět ze srdce přes jediné optické vlákno. Emisní světlo před dopadem na fotodiodu, od firmy HAMAMATSU, prochází přes emisní filtr horní propust (>610 nm). Výsledný signál je pak zesílen dvoustupňovým diferenčním zesilovačem. Nevýhodou této metody je pohybový artefakt, který vzniká pohybem povrchu srdce vůči optické sondě během srdečního cyklu. Jedno z možných řešení, jak se vyhnout použití chemických stabilizátorů, je snímání akčního potenciálu pomocí dvou vlnových délek. [11] Na obrázku 11 je uvedeno zapojení pro snímání akčního potenciálu pomocí této metody. Kromě snímání akčního potenciálu se snímá i EKG signál, který je poté porovnáván se signálem ze světelné části k ověření správnosti měření.
15
Obrázek 19: Zapojení pro snímání akčního potenciálu pomocí jedné vlnové délky (převzato z [11])
6.2 Snímání akčního potenciálu pomocí dvou vlnových délek Tento způsob snímání akčního potenciálu snímá emitované světlo, na rozdíl od předchozího měření, na dvou vlnových délkách (červená, zelená). Tato metoda je též označována jako poměrová metoda. Výhoda této metody spočívá v potlačení pohybového artefaktu. Snímání akčního potenciálu spočívá v detekování emitovaného světla na dvou vlnových délkách, které mají charakter úzkého vlnového pásma, a toto světlo je detekováno na obou stranách emisního spektra. Jako detektor je zde použita segmentovaná fotodioda od firmy HAMAMATSU, která byla diskutována v kapitole 7. Jako zdroj excitačního světla je použit laser modré barvy (který generuje světlo na vlnové délce 488 nm). Emitované světlo povrchem srdce je přenášeno optickým kabelem a dopadá na segmentovanou fotodiodu. Detekované modré světlo odpovídá elektrickému signálu MAPB (viz obrázek 12). Podobné značení je uvedeno i pro ostatní segmenty fotodiody (RGB). Dále jsou tyto signály zesíleny příslušnými zesilovači. Emitované světlo modré barvy reprezentuje pohyb srdce. Všechny tyto signály (MAPR, MAPG, MAPB) jsou ovlivněny tzv. pohybovým artefaktem. Pod pojmem „pohybový artefakt“ si lze představit například pohyb srdce vůči optické sondě – dochází tak ke změně vzdálenosti mezi povrchem srdce a optickou sondou, což ovlivňuje velikost snímaného signálu. Dalším jevem, který se považuje za pohybový artefakt, je změna počtu srdečních buněk při kontrakci srdce před optickou sondou. V buňkách se nachází aplikované napěťově citlivé barvivo, které při kontrakci srdce způsobí větší excitaci světla (více molekul před optickou sondou, než ve fázi relaxace srdce). Výsledný signál akčního potenciálu je vypočítán jako poměr signálů MAPG a MAPR. Tímto poměrem je dosaženo eliminace pohybového artefaktu. Na obrázku 13A jsou detekované 16
signály, a to signál červené barvy a signál barvy zelené. Obrázek 13B reprezentuje poměr těchto signálů a výsledný průběh akčního potenciálu bez pohybového artefaktu. [11][13]
Obrázek 110: Zapojení pro snímání akčního potenciálu pomocí dvou vlnových délek (poměrová metoda) (převzato z [11])
Obrázek 111: Záznam signálu červené a zelené barvy a jejich poměr (převzato z [13])
17
6.3 Snímání akčního potenciálu pomocí spektrofluorometrie Zařízení pro spektrofluorometrii se skládá z fluorescenční komory, infuzního setu, optiky pro zpracování světla, spektrografu, 16-prvkové fotodiody, zesilovacího obvodu a ze systému pro sběr dat. Jako zdroj excitačního světla je použit argonový laser (488 nm). Emisní spektrum bylo měřeno směrováním laseru na vzorek v komoře, přibližně 45° k optické ose spektrografu a poté byla emitovaná fluorescence směrována přes systém čoček do spektrografu. Systém čoček byl navržen tak, aby sbíral maximální množství světla a zároveň směroval světlo do požadovaného úhlu spektrografu. Uvnitř spektrografu se nachází ohybová mřížka, která rozděluje světlo do jednotlivých vlnových délek. Pole fotodiod potom převádí fluorescenční spektrum na elektrické signály, které jsou zesíleny, digitalizovány a uloženy v počítači. Šířka pásma fotodiodového pole a zesilovacích obvodů systému je přibližně 500 Hz. Kalibrace vlnové délky se provádí nastavováním úhlu difrakční mřížky tak, aby laserový paprsek dopadl jen na první fotodiodu. Okraj fotodiodového pole potom odpovídá vlnové délce 488 nm. [13]
Obrázek 112: Konstrukce zařízení pro snímání akčního potenciálu pomocí spektrofluorometru (převzato z [13])
18
7
Optické senzory
V této kapitolu budou představeny parametry fotodiod a šumové vlastnosti optických detektorů.
7.1 Princip funkce fotodiody P-vrstva (aktivní materiál) spolu s N-vrstvou tvoří tzv. P-N přechod, který pracuje jako převodník světla na elektrický potenciál. Neutrální oblast mezi P-N přechodem je známá jako ochuzená vrstva. Změnou tloušťky vrstvy P, N a spodní vrstvy N+ lze kontrolovat spektrální a frekvenční odezvu. Pokud energie světla bude vyšší, než energie zakázaného pásma, elektrony se přesunou do vodivostního pásma, takže po nich zůstanou díry ve valenčním pásmu (viz obrázek 15). Tyto elektron-děrové páry se vyskytují v celé P-vrstvě, depletiční (ochuzené) vrstvě a N-vrstvě. Elektrické pole v ochuzené vrstvě urychluje tyto elektrony směrem k Nvrstvě a díry směrem k P-vrstvě. Z elektron-děrových párů generovaných v N-vrstvě, jsou ponechány v N-vrstvě pásma vodivosti elektrony, spolu s elektrony, které dorazily z P-vrstvy. Díry jsou rozptylovány skrz N-vrstvu do ochuzené oblasti, zatímco jsou urychlovány a shromažďovány v P-vrstvě valenčního pásma. Tímto způsobem jsou elektron-děrové páry, generované v poměru k množství dopadajícího světla, shromažďovány v N a P-vrstvě. Výsledkem je pak kladný náboj v P-vrstvě a záporný náboj v N-vrstvě. Když bude vytažena elektroda z P a N-vrstvy a připojena k externímu obvodu, budou elektrony proudit z N-vrstvy a díry z P-vrstvy směrem k opačné elektrodě. Tyto elektrony a díry, generující průtok proudu, jsou nazývány nosiče. V PN přechodu se také vykytuje šum (výstřelový šum, proud za temna), který má podíl na degradaci požadovaného signálu. [14][15]
Obrázek 135: P-N přechod fotodiody (převzato z [14]) 19
Optické senzory jsou složeny z fotodiod, jejichž schopnost tkví v možnosti detekování signálu (světla). Fotodiody jsou polovodičové materiály, které generují proud nebo napětí po ozáření P-N přechodu světlem. Existuje několik materiálů, z nichž jsou fotodiody vyráběny, např. AlGa, GaInAs, InAs, GaN, Gap, Si, Ge, InSb. Dále bude diskutovány pouze fotodiody, jejichž materiálem pro výrobu je křemík. Je to z důvodu používání v oblasti lékařství a měřící technice. [14] Rozdělení fotodiod dle struktury PN přechodu: -
Si fotodioda PIN fotodioda APD (Lavinová fotodioda)
Si fotodiody - jsou vyráběny v různých pouzdrech. Ty mohou být vyrobeny z kovu (opatřeno okénkem, kde dopadá svělo na PN přechod), keramiky (PN přechod je chráněn průhledným okénkem), nebo plastu. Si fotodiody disponují dobrými vlastnostmi, jako je vysoká rychlost odezvy, vysoká citlivost a nízký šum. [14] PIN fotodioda – je dioda, která vznikne vložením intrinsického polovodiče (slabě dotovaný) mezi oblasti P a N. Tímto způsobem vznikne širší ochuzená oblast. Výhody této fotodiody jsou: zvětšení fotocitlivé plochy, zlepšuje se časová odezva fotodiody. Lavinová fotodioda (APD) – princip této diody spočívá v urychlování nosičů náboje, které při srážce s mřížkou krystalu generují další elektrony. Tímto způsobem vzroste citlivost diody. Za nevýhodu lze považovat nutnost vysokého provozního napětí. Dalšími vlastnostmi, které vykazují, jsou: -
Vynikající linearita s ohledem na dopadající světla Nízký šum Široký rozsah spektrální odezvy Dobrá mechanická odolnost Kompaktní a lehké Dlouhá životnost
Dále bude uvedena tabulka s výše zmíněnými fotodiodami, jejich rysy a možnosti uplatnění. [14]
20
Tabulka 1: Vlastnosti fotodiod a jejich použití [14] Typ fotodiody
Možnosti použití
Vlastnosti
Si -
-
Vysoká citlivost Nízký proud za temna Používá se ve fotometrii
-
-
Si PIN -
Si APD
-
PIN fotodiody vykazují vysokorychlostní odezvu v závěrném směru Používány v optických komunikacích Vysokorychlostní odezva Vysoká citlivost Vzniká mechanismus vnitřního zisku
UV až blízká oblast IR Viditelná oblast spektra až blízká oblast IR Viditelné oblast spektra RGB barevný senzor Detekce monochromatického světla Detektor elektronového svazku
-
Mezní frekvence: 1GHz a více Mezní frekvence: 500 MHz do 1Ghz Mezní frekvence: 100 MHz do 500 MHz Mezní frekvence: 10 MHz do méně než 100 MHz Detekce YAG laseru
-
Oblast blízkého IR Pro krátké vlnové délky
-
Pro detekci signálu akčních potenciálů srdce pomocí napěťově citlivých barviv se jeví jako vhodná fotodioda, pracující v oblasti viditelného spektra (400 – 750 nm), která je schopna detekovat světlo více, než jedné barvy. Pro tento účel se jako nejvhodnější jevila RGB fotodioda typ S9032-02 HAMAMATSU, která je schopna detekovat světlo v oblasti tří vlnových délek. Její vlastnosti jsou popsány v kapitole Optický senzor pro detekci elektrogramů. [14] Tento výrobce nabízí k dispozici tři typy fotodiod – S7505-01, S9032-02, S9702, umožňující snímání současně ve třech vlnových délkách, které se od sebe liší vnitřním uspořádáním světlocitlivých segmentů. Z nich se jako nejvhodnější jevila fotodioda S9032-02 HAMAMATSU. Jejich spektrální charakteristiky jsou totožné, jak ukazuje obrázek 16.
21
Obrázek 16: Spektrum RGB fotodiod (S7505-01, S9032-02, S9702) – převzato z [14]
7.1.1 Charakteristické parametry fotodiod Nyní budou popsány parametry, vyskytující se u fotodiod. Spektrální odezva Fotoproud produkovaný danou úrovní dopadajícího světla se mění s vlnovou délkou. Vztah mezi fotoelektrickou citlivostí a vlnovou délkou je označován jako spektrální odezva. [14]
Fotosenzitivita (S) Fotosenzitivita je udávána poměrem dopadajícího světla (uváděno ve W) k výslednému fotoproudu (uváděného v A). Tento poměr může být vyjádřen jako absolutní senzitivita (A/W), nebo jako relativní senzitivita pro citlivost na maximu vlnové délky (udává se v %). Firma HAMAMATSU určuje fotosenzitivitu jako rozsah spektrální odezvy, ve které je relativní citlivost nižší, než 5% špičkové hodnoty. [14][15]
22
Kvantová účinnost (QE) Kvantová účinnost je počet elektronů nebo děr, které mohou být detekovány jako fotoproud, dělené počtem dopadajích fotonů. Kvantová účinnost se vyjadřuje v %.
Kvantová účinnost lze vypočítat jako [14]:
[%]
(1)
S……fotosenzitivita [A/W] λ……vlnová délka [nm]
Zkratový proud (ISC) Zkratový proud je výstupní proud, který existuje, když odpor zátěže je roven nule a je téměř úměrný aktivní ploše fotodiody. Toto je často nazýváno jako citlivost bílého světla s ohledem na spektrální odezvu. Tato hodnota se měří světlem z wolframové žárovky o teplotě 2856 K, která poskytuje osvětlení 100 luxů. [14][15]
Napětí naprázdno (VOC) Napětí naprázdno je napětí, generované, když odpor zátěže je nekonečný a vykazuje téměř konstantní hodnotu aktivní oblasti fotodiody. [14]
Proud za temna (ID) Je to proud, který se vyskytuje při závěrném napětí fotodiody, i když není fotodioda osvětlena. Toto je hlavní zdroj šumu v případech, kdy fotodiodou protéká závěrné napětí (PIN fotodioda). [14]
23
Paralelní náhradní odpor fotodiody (RSH) Tento odpor je dán poměrem napětí ku proudu v blízkosti kolem 0V ve fotodiodě. Je definován jako:
[Ω]
(2)
ID……proud za temna [mA]
Svorková kapacita (Ct) Jde o kondenzátor tvořený v PN přechodu fotodiody. Kapacita kondenzátoru je nazývána kapacitou přechodu a je jedním z parametrů, určujících rychlost odezvy fotodiody. Doba náběhu (tr) Jde o měření časové odezvy fotodiody na vstupní světlo. Je definována jako čas, potřebný pro změnu výstupu maximální úrovně světla z 10% na 90%. Doba náběhu závisí na vlnové délce dopadajícího světla a odporu zátěže. [14][15] NEP (Ekvivalentní šumový výkon) Ekvivalentní šumový výkon udává množství světla, které je ekvivalentní s úrovní šumu zařízení. Jedná se o úroveň světla potřebného k získání shody poměru signálu ku šumu. [14][15]
NEP =
(
√
Bm……….šířka pásma NEP1…….hodnota z katalogu pro konkrétní fotodiodu
24
)
[dBm]
(3)
Náhradní schéma fotodiody a jeho V-A charakteristika Obrázek 17 ilustruje náhradní schéma fotodiody. Z něj lze pak odvodit výsledný proud na výstupu fotodiody. Ten se vypočítá následovně:
(
)
(4)
IL……proud dopadajícího světla [mA] ID……proud diodou [mA] IS……závěrný saturační proud fotodiodou [mA] k…….boltzmanova konstanta [1.38 x 10-23 J / K] T…….absolutní teplota fotodiody [K] q…….náboj elektronu [1,602 × 10-19 C] I0…...proud tekoucí zátěží [mA]
Fotodiodu popisují náhradní prvky a jednotlivé proudy (viz obrázek 17):
IL – proud generovaný dopadajícím světlem ID – proud diodou CJ – kapacita přechodu RSH – paralelní náhradní odpor fotodiody RS – sériový náhradní odpor fotodiody VD – napětí na diodě Io – výstupní proud Vo – výstupní napětí
Obrázek 17: Náhradní schéma fotodiody (převzato z [14])
Na obrázku 18 jsou volt-ampérové charakteristiky fotodiody. Charakteristika fotodiody je rozdělena na čtyři kvadranty, v nichž může pracovat. Z kvadrantu I lze vidět, že fotodioda je málo citlivá na osvětlení – křivky téměř splývají. Z tohoto důvodu se fotodioda v tomto 25
režimu nepoužívá. V kvadrantu III jsou křivky fotodiody lineární. Fotodioda v tomto zapojení pracuje v odporovém režimu – odpor řízený osvětlením. IV. kvadrant pak značí hradlový režim fotodiody – stejnosměrný zdroj elektrické energie.
Obrázek 18: V-A charakteristiky fotodiody (převzato z [16])
7.2 Šumové vlastnosti optických detektorů V této kapitole budou zmíněny šumy, které se vyskytují ve fotodetektorech a nechtěně tak ovlivňují kvalitu signálu.
Výstřelový šum Tento šum patří k mezi šumy, které nelze odstranit. Výstřelový šum je dán fluktuací fotonů dopadajícího světla. Jedná se o náhodný šum. Výstřelový šum může být minimalizován držením stejnosměrné složky na malých proudech, zvláště proud za temna. [17][18] Blíže je tento šum popsán v kap. 9.
26
Lze jej popsat Poissonovým rozdělením:
(5) kde – rozptyl np – střední hodnota
Tepelný (Johnsonův) šum Jedná se o šum generovaný tepelným pohybem elektronů uvnitř elektrického vodiče. Tyto elektrony jsou neustále v pohybu a dochází k srážkám mezi sebou. Každý pohyb elektronu mezi kolizemi představuje malý proud. Součet těchto malých proudů se projevuje ve výsledku jako šum. Při přijmu proudů po dlouhý časový interval je součet proudů nulový, avšak během krátkých časových intervalů výkyvy proudu tvoří tepelný šum. [17][31]
Tepelný šum je dán vztahem:
√
(6)
kB …….Boltzmannova konstranta (1.38 x 10-23 J / K) T………Absolutní teplota (T = 273 K= 0 ºC) …….šumová šířka pásma RSH…… paralelní náhradní odpor fotodiody
Redukování tepelného šumu je možné několika způsoby, a to:
Chlazením snímače zařízení, zvláště odporu zátěže Snížením hodnoty odporu zátěže – to má však za následek snížení amplitudy užitečného signálu
27
Šum pozadí Šum pozadí je ovlivněn zorným polem (detekční oblastí) detektoru a teplotou pozadí. Aby se dal šum pozadí potlačit, je potřeba, aby zorné pole detektoru směřovalo jen do dané oblasti zájmu a detektor tak nedetekoval rušivý signál. Teplotu pozadí také není problémem udržet na únosné hodnotě a to dostatečným chlazením prostředí, ve kterém se nachází dané zařízení. [17] [31]
Proud za temna Tento šum je podrobně rozebrán v kap. věnované šumům. Šum vnějšího obvodu Fotodioda pracuje s převodníkem světla na napětí, který je obvykle tvořen operačním zesilovač a pasivními prvky (odpory), které jsou potřeba k tomu, aby byl potřeba funkce. Tyto pasivní prvky, i sám zesilovač jsou také zdroji šumu.
Šumový ekvivalentní výkon (NEP) Tento šum je popsán v kap. 7.2.1.
Poměr signál/šum (S/N) Je definován jako poměr mezi výkonem signálu a výkonu šumu. Tento poměr je dán vztahem:
|
| |
|
(7)
Z tohoto vztahu plyne, že čím vyšší bude poměr S/N, tím vyšší bude kvalita signálu. Pokud bude poměr S/N <1, nezískáme hodnotitelný signál. V případě S/N>1 bude snadné rozlišit signál od šumu. Šum také závisí na šířce pásma detektoru. K získání lepšího signálu bude potřeba zvýšit dobu integrace, čili zmenšit šířku pásma detektoru. [18] [31]
28
7.3 Optický senzor pro detekci elektrogramů Pro snímání optického signálu měřeného z povrchu izolovaného srdce, za pomoci napěťově citlivých barviv, byla použita dioda od firmy HAMAMATSU a to typ S9032-02. [21] Detekční dioda je uložena do plastového pouzdra (obrázek 25) a má kruhový tvar (viz obrázek 24). Je rozdělena na tři segmenty, kde každý segment je schopen detekovat jednu barvu, typicky RGB (červená, zelená, modrá). Detekční plocha pro detekování signálu má v průměru 2 mm. [21] Pro přivedení signálu na fotodiodu se používá optický kabel o průměru 3 mm.
Obrázek 24: Tvar světlocitlivých segmentů detekční diody S9032-02 (převzato z [21])
Obrázek 25: Detekční dioda chráněná plastovým pouzdrem (převzato z [21])
Tabulka 3: Optické vlastnosti diody S9032-02 [21]
Rozsah spektra
λ
Maximum vlnové délky
λp
Fotosenzitivita
S
Modrá Zelená Červená Modrá Zelená Červená λ= λp
Modrá Zelená Červená 29
Minimum Typicky 400 – 540 [nm] 480 – 600 [nm] 590 – 720 [nm] 460 [nm] 540 [nm] 620 [nm] 0,13 0,18 [A/W] 0,18 0,23 [A/W] 0,11 0,16 [A/W]
Maximum -
Na obrázku 26 lze vidět spektrální odezvu diody S9032-02 pro jednotlivé barvy RGB, která byla použita v zařízení pro detekci signálu z izolovaného srdce. Dioda pokrývá rozsah spektra na vlnových délkách od 400 nm do 720 nm. Největší citlivost diody je pro zelenou barvu, naopak nejnižší citlivost diody je pro barvu červenou.
Obrázek 26: Spektrální odezva diody (převzato z [21])
Obrázek 27: Proud za tmy pro detekční fotodiodu S9032-02 (převzato z [21]) 30
Obrázek 27 ilustruje charakteristiku proudu za tmy v závislosti na závěrném napětí. Je možno si povšimnout, že při rostoucím závěrném napětí proud za tmy roste. Tato závislost je uváděna pro teplotu 25°C.
31
8
Napěťově citlivé barvivo
Tato část práce se bude věnovat napěťově citlivým barvivům obecně. Napěťově citlivé barvivo (di-4-ANEPPS), které bylo použito pro snímání akčního potenciálu, bude probíráno později. Je třeba si uvědomit, jak napěťově citlivá barviva fungují jako napěťové senzory, aby mohly být správně aplikovány a využívány jejich vlastnosti. Barviva reagují určitými změnami v jejich spektrální oblasti na změnu membránového, nebo-li akčního potenciálu. Proto je nutné porozumění fyzikálním jevům, jako je absorpce a emise fotonu. Tento mechanismus bude vysvětlen níže. Základem jakéhokoliv barviva je látka zvaná chromofor. Je to část molekuly, která je schopna pracovat se světlem a reagovat tak na jeho změny. Absorpce fotonu je možná tehdy, když rozdíl v energii mezi relaxovaným stavem chromoforu a excitovaným stavem odpovídá energii fotonu, která je dána:
E = h/λ,
[eV]
(8)
kde h je Planckova konstanta (6,626176 x 10-34 J.s) a λ je vlnová délka dopadajícího světla. Rozsah vlnových délek, které mohou uvést foton do excitovaného stavu, je široký. Když je molekula vyexcitována do vyšší energetické hladiny (trvání řádově nanosekund), například pomocí laseru o určité vlnové délce, dochází tak k absorpci světla. Při návratu molekuly zpět do relaxovaného stavu se uvolňuje fotonové (fluorescenční) záření, které se projeví reakcí v emisním spektru. Foton tak vykazuje emisi na dané vlnové délce. Při změně membránového napětí (UM) dochází k posuvu emisního spektra. Z toho vyplývá, že při různém UM se bude měnit emise barviva v emisním spektru. Je možné, že molekula v excitovaném stavu může podstoupit určitou chemickou změnu, která by mohla chromofor zničit. Tato reakce je známá pod pojmem vybledávání, nebo také bělení, kdy chromofor ztrácí své vlastnosti. Dobrá napěťově citlivá barviva mají chromofory, které jsou jasné (zářivé), a to z důvodu lepší efektivity excitace a emise. Mezi jejich příznivé vlastnosti také patří šetrnost k životnímu prostředí a jejich fotostabilita, která zabraňuje vybledávání barviva. [23][24][32]
32
Napěťově citlivé barvivo by mělo splňovat tyto požadavky: -
Je potřeba, aby se barvivo dobře navázalo na buněčnou membránu a mohlo tak reagovat na změny UM. Barvivo musí kopírovat změnu UM změnou fosforescence, proto se pro snímání akčního potenciálu používá napěťově citlivého barviva s rychlou odezvou. Změna vlastností barviva musí být závislá pouze na změně UM, aby nedocházelo ke zkreslení průběhu akčního potenciálu. Barvivo by nemělo poškozovat měřený preparát. Stabilita barviva, někdy bývá popisována pojmem „vybledávání barviva“.
Napěťově citlivé barvivo musí splňovat i vlastnost rychlé reakce (odezvy) na změnu UM. Je to z důvodu plynulé reakce barviva na změny UM, které mají za následek správného zobrazování časového průběhu akčního potenciálu.
Vyhodnocování změn akčního potenciálu pomocí napěťově citlivých barviv má dvě nevýhody – nemožnost změřit absolutní hodnotu UA a rušení zaznamenávaného signálu vzniklé pohybovým artefaktem. Naměřený signál (UA) je snímán z kontrahujícího srdce a lze jej jednoduše odvodit, neboť je dobře znám. Během kontrakce srdce mění svůj objem a s tím je spojena měnící se vzdálenost srdeční stěny od fotodetektoru.
Obrázek 149: Závislost změny fluorescence na změnách napětí
33
Na obrázku 19 je ilustrace, jak reaguje fluorescence na změny napětí. Ze závislosti lze vidět, že čím menší bude napětí na membráně, tím menší bude fluorescence barviva a s tím spojená emise světla. Z této charakteristiky si lze také povšimnout lineární závislosti fluorescence na napětí v oblasti cca od 0,3 do 0,8 (osa y).
8.1 Měření změn napětí za použití napěťově citlivých barviv Změny napětí na izolovaném srdci jsou nejčastěji měřeny za použití napěťově citlivých barviv (s využitím fluorescence). Tato metoda má výhodu v tom, že je bezkontaktní. (napsat tady problém kontaktních elektrod). Při takovém měření se může objevit napěťově závislý posun v excitačním nebo emisním spektru, který je dán elektrochromním barvivem (viz obr. 20). Velikost spektrálního posunu je lineárně spojena se změnou potenciálu. Většina experimentů, které využívá napěťově citlivá barviva, neustále sleduje určitou část pásma vlnové délky. Je to výhodnější postup, než-li skenovat celé spektrum. [24]
Obrázek 150: Posun excitačního nebo emisního spektra. Relativní změna fluorescence ΔF/F je zobrazena v procentech (převzato z [24]). Výběr vlnové délky podle maximální absorpce nebo emise jsou nejhorší volbou k získání maximální citlivosti. Naopak nejlepší citlivosti je dosaženo na strmých částech spektra (v angl. literatuře označováno jako „křídla“). Měření změny fluorescence ku celkové fluorescenci ΔF/F ovlivňují optimální vlnové délky více na okrajích excitačního a emisního spektra, protože F trvale klesá na jeho okraji. Téměř lineární vztah mezi změnou napětí a změnou fluorescence nebo absorpce se získává na okrajích spektra, dokud zploštění spektra není příliš velké, ať už na vysoké, tak na nízké úrovni. [23][24]
34
Dalším kritériem, podle kterého je dobré se řídit při výběru vhodné vlnové délky je poměr signálu ku šumu (S/N). Jde o to, že detekční systém musí nashromáždit dostatečný počet fotonů za měření tak, aby nedocházelo k přehlušení užitečného signálu šumem. Pro fluorescenční měření může být počet fotonů jednoduše zvýšen použitím silného (intenzivního) excitačního zdroje. Tímto způsobem by mělo být možné vybrat vlnové délky u okraje absorpčního spektra bez omezení signálu, kde ΔF/F je maximální. Malá absorpce při hranách spektra může být kompenzována vyšší intenzitou zdroje světla. Aspektem, který zakazuje použití tohoto způsobu je, že vyšší intenzita světla má za následek vybledávání barviva, tudíž se při měření elektrogramů nemůže na barvivo svítit neomezeně dlouhou dobu. Při detekci úzkého pásma na okraji emisního spektra, bude ztracena většina emitovaných fotonů, neboť dojde na ztrátu většiny excitace. To by pak mělo za následek, že by barvivo pravděpodobněji vybledlo před nashromážděním dostatečného množství fotonů pro dobrý poměr S/N. Jako nejlepší kompromis mezi ΔF/F a S/N je použití intenzivního úzkopásmového excitačního zdroje, který bude aplikován na hranu spektra absorpce. Emitované světlo pak bude procházet filtrem, kterým projdou všechny vlnové délky delší, než je maximum emisního spektra. [13][23][24]
8.2 Napěťově citlivé barvivo di-4-ANEPPS di-4-ANEPPS je barvivo, které bylo použito pro snímání akčních potenciálů z izolovaného srdce optickou cestou. Barvivo di-4-ANEPPS patří do skupiny barviv pod označením ANEP (aminonaphthylethenylpyridinium). ANEP barviva obsahují molekuly, které vykazují fluorescenci, jako reakci na změnu elektrických potenciálů v prostředí ve kterém se nacházejí. Patří mezi barviva s rychlou odezvou, které fungují na principu změny jejich elektronové struktury, a tedy reagují změnou fluorescence na změny v elektrickém poli v jejich okolí. Rychle detekují přechodné změny v dráždivých buňkách, včetně neuronů, srdečních buněk atd. Avšak změna napěťově závislé fluorescence je často malá – barviva s rychlou odezvou obvykle ukazují 2-10% změny fluorescence na 100mV. Kromě toho, tyto barviva zavádí posun excitačního spektra. Velice příbuzné barvivu di-4-ANEPPS je barvivo di-8-ANEPPS. Obě barviva vykazují dobrou fotostabilitu a nízkou toxicitu, avšak barvivo di-8-ANEPPS se projevuje o něco málo fotostabilněji a má menší fototoxicitu, než barvivo di-4-ANEPPS. Barviva ve vodných roztocích v podstatě nevykazují fluorescenci. [19] [32]
35
Obrázek 21: Princip snímání akčního potenciálu pomocí napěťově citlivého barviva di4ANEPPS (převzato z [22]) Na obrázku 21 je ukázáno, jakým principem je snímám akční potenciál barvivem di-4ANEPPS. Změna transmembránového napětí způsobí, že dojde k posunu emisního spektra. Optickým filtrem horní propusti je ovlivněna velikost fluorescence (vystínovaná část spektra). Di-4-ANEPPS vykazuje změnu fluorescence, která se mění lineárně s membránovým napětím.
di-4-ANEPPS V této části bude barvivo di-4-ANEPPS popisováno z chemické stránky a poukáže také na jeho fluorescenční spektrum uváděné na stránkách výrobce (www.invitrogen.com).
Molekulární vzorec: C28H36N2O3S Molekulární hmotnost: 480.66
36
Chemická struktura:
Obrázek 22: Chemická struktura barviva di-4-ANEPPS(převzato z [19])
Spektrum fluorescence:
Obrázek 23:Spektrum fluorescence – modrá křivka značí excitaci, červená křivka značí emisi (převzato z [19])
Maximum absorpce (λAm) a maximum emise (λEm) je pro ethanol stanoveno takto: λAm = 497nm λEm = 710nm Tabulka 2: Srovnání dvou barviv, které jsou si svými vlastnostmi příbuzné [20] Maximum absorpce
Maximum emise
di-8-ANEPPS
467 nm
631 nm
di-4-ANEPPS
475 nm
617 nm
37
9
Přehled zdrojů rušení snímaného signálu
Typy rušení, které ovlivňují snímaný signál, mohou být:
Výstřelový šum – jedná se o šum, který vzniká statickými procesy při rekombinaci jednotlivých proudových nosičů produkujících optická kvanta. Projevuje se kolísáním elektrického proudu, který způsobí nestabilitu toku světla, což má za následek kolísání světelného toku laseru. Výstřelový šum má charakter bílého šumu, který je dán konstantní spektrální výkonovou hustotou. Tento typ šumu lze odstranit např. stabilizací napájecího napětí. [26]
-
Podle Schottkyho je střední kvadrát výstřelového šumového proudu určen vztahem:
I 2 = 2qI B ,
(9)
kde q = 1,602. 10-19 [C] je náboj elektronu, I je stejnosměrný proud procházející PN přechodem, B je šumová šířka pásma.
Obrázek 28: Výstřelový šum
Výstupní signál je ovlivněn nejen výstřelovým šumem, ale na užitečný signál je také nasuperponován tepelný šum, blikavý šum, praskavý šum.
38
Šum fotodetektoru za tmy – zvaný také jako proud za tmy, má větší spektrum než frekvence užitečného signálu. Je to dáno tím, že část proudu za tmy je způsobena použitými operačními zesilovači, které nejsou omezeny šířkou pásma signálu. Proud za tmy je proud, který protéká fotonásobičem při neosvětlené fotokatodě. S rostoucí teplotou se proud zvětšuje. Proud za tmy lze omezit, nebo zmenšit, když bude fotodetektor umístěn v chlazeném prostředí. [25]
(
)
ID ……..Proud fotodiodou za temna [mA] ISAT…...Saturační proud [mA] q………Náboj elektronu (1,602. 10-19 C) VA…….Strmost napětí [V/µs] kB …….Boltzmannova konstranta (1.38 x 10-23 J / K) T………Absolutní teplota (T = 273 K= 0 ºC)
39
(10)
Obrázek 169: V-A charakteristika proudu za tmy
Tepelný (Johnsonův šum) – vyskytuje se ve vodičích i polovodičích. Tepelný šum způsobují volné elektrony, které se pohybují náhodným směrem při teplotě větší než 0K. Z toho plyne, že s vzrůstající teplotou roste tepelný šum. V případě konstantního odporu a teploty, je tepelný šum stacionární proces s Gaussovým rozdělením výkonového spektra. Jedná se tedy o bílý šum.[26][27]
-
Tepelný neboli Johnsonův šum je dán vztahem:
√
kB …….Boltzmannova konstranta (1.38 x 10-23 J / K) T………Absolutní teplota (T = 273 K= 0 ºC) …….šumová šířka pásma RSH…… paralelní náhradní odpor fotodiody 40
(11)
Obrázek 170: Ukázka spektra bílého šumu
Vlastní šum A/D převodníku – může být ovlivněn vlastním šumem použitých součástek při konstrukci, nebo šumem, který vzniká při společném napájení analogové a digitální části A/D převodníku. Vhodným řešením tohoto šumu může být např. použití součástek s malými šumovými vlastnostmi, nebo v případě napájení, napájet zvlášť analogovou a digitální část A/D převodníku.
Kvantovací šum A/D převodníku – vstupní signál může nabývat libovolné úrovně dané vstupním rozsahem. Kvantuje se do určitého počtu kvantovacích úrovní (N = 2n). Zde může vzniknout kvantovací chyba, která způsobuje kvantovací šum. Tento šum lze odstranit použitím více kvantovacích úrovní, nebo použitím filtru dolní propusti, aby nedošlo k aliasingu.
-
Efektivní hodnota kvantovacího šumu je dána vztahem:
√
Um…..maximální napětí 41
[V]
(12)
A/D převodník obsahuje tři hlavní chyby převodní charakteristiky:
-
Chyba nuly o Je způsobena posunem počátku převodní charakteristiky, která je potom o daný posuv kratší, nebo delší.
-
Chyba zesílení o Způsobuje vychýlení převodní charakteristiky o určitý úhel. To se pak ve výsledku projevuje změnou výsledné analogové hodnoty.
-
Kvantovací chyba o Je dána rozlišovací schopností A/D převodníku, která se projeví zkreslením výstupního signálu z A/D převodníku.
Obrázek 31: Ukázka chyb vzniklých během A/D převodu
Rušení elektromagnetického pole – jedná se o různé druhy šumu, jakou jsou např. počítačové monitory, vysokonapěťové a napěťové zdroje, výboje atd. Eliminace takového šumu se může provést např. rozdělením napájecích a signálových zemí nebo stíněním.
42
Vlastní šum zesilovačů – šum může vzniknout několika důvody. Zaprvé vlastní šum tranzistorů na vstupu. Jako další to může být rušení způsobené špatným zemněním a průnikem okolních rušivých signálů, anebo zvlnění zdroje. Pro odstranění těchto zdrojů rušení mohou být použity zesilovače s nízkým šumovým číslem, dodržení vhodného odstupu užitečného signálu od šumu, použití stabilního napájení.[27]
-
V konstrukci zařízení pro snímání akčních potenciálů z živého srdce byl použit operační zesilovač typu OZ TLC272, který se vyznačuje:
o Nízkým odběrem proudu, což je vhodné, pokud je zařízení napájeno bateriemi o Napěťovým offsetem 500 µV při teplotě 25°C; napájecí napětí VDD = 5V o Vstupním napěťovým driftem – obvykle 0,1 µV/měsíc o Pracuje v rozsahu teplot od -55°C do 125°C o Nízkým šumem – obvykle 25 nV/√ při f = 1kHz o Vysokou vstupní impedancí - 1012Ω o Ochranou před elektrostatickým výbojem (ESD) až do napětí 2000V
-
Ve zpětné vazbě OZ TLC272 byly použity vysokoohmové odpory R = 100 MΩ, který jsou charakterizovány následujícími vlastnostmi: o tolerance: ±2% (E48), ±5% (E24), ±10% (E12), ±20% (E6) o teplotní koeficient TK: ±200(10-6/K)
Převodník světlo/napětí (fotodioda) – šum vzniká nedostatečným osvětlením detektoru světla (fotodiody), které se projeví zkreslením signálu. Další důležitou vlastností je ekvivalentní šumový výkon (NEP), který označuje zářivý výkon, při jehož detekci je na výstupu detektoru záření poměr signálu a šumu roven jedné. Z toho plyne, že čím nižší je ekvivalentní šumový výkon, tím lépe příslušný detektor detekuje malé signály vzhledem k přítomnosti šumu. NEP může být tvořen proudem za tmy, výstřelovým šumem, tepelným šumem. [27]
NEP =
( 43
√
)
[dBm]
(13)
Bm……….šířka pásma NEP1…….hodnota z katalogu pro konkrétní fotodiodu
Obrázek 32: Ukázka V-A charakteristik fotodiody a její ekvivalentní obvod
44
10 Návrh odstranění prostředí Matlab
rušení
v programovém
Prvým úkolem bylo zjistit, na kterých frekvencích se nachází užitečný signál a odlišit ho tak od šumu, který znehodnocuje analyzovaný záznam. Signál byl převeden do frekvenční oblasti pomocí Fourierovi transformace (FFT) k získání spektra signálu a kvůli možnosti určit užitečné frekvence (signálové) a odlišit je tak od šumu, jenž má být eliminován. Na signál byly aplikovány dva typy filtrací, a to filtrace dolní propustí a filtrace vlnkovou transformací. Poté následovalo zhodnocení kvality filtrace vstupního a filtrovaného signálu. Filtrace byla aplikována na signál o délce 10 000 vzorků. Naměřený signál akčního potenciálu byl dodán Ústavem biomedicínského inženýrství v Brně.
10.1 Filtrace signálu dolní propustí Spektrální složky užitečného signálu, který měl být vyfiltrován, byly na základě vykresleného spektra odhadnuty na frekvencích od 1Hz do 30 Hz (viz obr. 34). K odstranění šumu ze signálu byla použita dolní propust, která potlačovala frekvence 30 Hz - 1 kHz. Byl použit filtr typu FIR, který má lineární fázovou charakteristiku a používá se k eliminaci takových typů rušení. Jeho amplitudová a fázová charakteristika je na obr. 35. Nelinearita fázové charakteristiky totiž vede k fázovému zkreslení, tudíž ke vzniku artefaktu, který do signálu určitě nechceme zahrnout. Obr. 33 představuje vstupní zašuměný signál a jeho frekvenční spektrum. Na obr. 36 je možno vidět už filtrovaný signál po aplikaci navržené dolní propusti. Z obrázku lze vidět, že navržená filtrace byla úspěšná. Šum, který znehodnocoval signál, byl odstraněn (frekvence od 30 Hz výše). Obr. 37 je srovnáním zašuměného signálu a filtrovaného signálu. Filtrace DP ovlivnila strmost akčního potenciálu ve fázi depolarizace. Důležité je také třeba zmínit zpoždění signálu po průchodu FIR filtrem, které je díky lineární fázové charakteristice konstantní a je rovno (N–1)/2 vzorkovacích intervalů, což odpovídá polovině délky impulzní charakteristiky hn. Zpoždění je dáno také řádem filtru. Při zkoumání nejvhodnější mezní frekvence filtru, změnou hodnoty fmin, která byla nastavována empiricky, se jevila jako nejlepší hodnota 30 Hz. Další zvyšování mezního kmitočtu způsobilo, že se ve filtrovaném signálu začaly objevovat známky šumu.
45
Obrázek 33: Ukázka zašuměného signálu AP a jeho spektra od 0 do 180 Hz
Obrázek 34: Výřez frekvenčního spektra vstupního signálu (0Hz – 40Hz)
46
Obrázek 35: Amplitudová a fázová charakteristika navržené dolní propusti.
Obrázek 36: Ukázka filtrovaného signálu AP filtrem dolní propusti a jeho spektra od 0 do 180 Hz
47
Obrázek 37: Srovnání zašuměného a vyfiltrovaného signálu AP.
10.2 Filtrace signálu vlnkovou transformací Další možností filtrace signálu je vlnková transformace. Pro filtraci byla použita redundantní vlnková transformace s diskrétním časem (DTWT). Podstatou vlnkové transformace je rozklad signálu pomocí banky oktávových filtrů, které tvoří horní a dolní propusti, na pásma. Dolní propust propouští pásmo od 0 do f /4. vz
Horní propust pak f /4 do f /2. Navržený algoritmus používal pětistupňového rozkladu vz
vz
signálu. Pro jednoduchost je na obr. 38 zobrazen třístupňový rozklad signálu. Na obr. 39 a 40 je znázorněn rozklad signálu a jeho následné (inverzní) složení. [31]
48
Obrázek 38: Modulové frekvenční charakteristiky ideálních oktávových filtrů.
Obrázek 39: Třístupňová rychlá redundantní DTWT s rozkladovými dolními propustmi Hd a horními propustmi Hh.
Obrázek 40: Inverzní transformace pro třístupňovou DTWT. Fd (resp. Fh) je rekonstrukční dolní (resp. horní) propust. Rozkladové a rekonstrukční filtry pro ortogonální DTWT musí mít stejně dlouhé impulsní charakteristiky, které nejsou korelované. Vlnková transformace rozkládá signál na frekvenční pásma a v jednotlivých pásmech se snaží o úpravu koeficientů signálu, při kterých potlačuje šumové koeficienty a propouští užitečné koeficienty. Odlišení šumových koeficientů od užitečných se nastavuje prahem koeficientů DTWT. [28]
49
10.2.1 Stanovení prahu koeficientů DTWT Základními typy prahování jsou měkké a tvrdé prahování. Existuje ještě také hybridní prahování, což je v podstatě směs měkkého a hybridního prahování.
Pro tvrdé prahování:
(14) kde λ značí práh, x vstupní signál a λx výstupní signál.
Pro měkké prahování:
(15)
Po aplikaci různých typů prahování se jako nejlepší jevilo měkké prahování.
50
Obrázek 41: Rozklad signálu na pásma (6) a odhad šumu.
Obrázek 42: Výsledek po rekonstrukci DTWT.
51
Obrázek 41 znázorňuje rozklad signálu na jednotlivá pásma a odhad rozptylu šumu v jednotlivých pásmech. V prvních pěti pásmech (1000 Hz – 31,25 Hz) je vidět, že se zde objevuje hodně koeficientů šumu. Až v šestém pásmu (31,25 Hz – 0 Hz) se objevují koeficienty užitečného signálu. Úkol pro vlnkovou transformaci byl, aby tyto koeficienty šumu potlačil. Výsledek potlačení koeficientů šumu je zřejmý z obr. 42. Inverzním rozkladem, čili složením signálu zpět do jednoho pásma, byl vytvořen filtrovaný signál, jenž je zobrazen na obr. 43. Potlačení a propouštění jednotlivých koeficientů se nastavuje prahem, který je uveden v kap. 10.2.1. I v tomto případě došlo filtrací ke zkreslení strmosti akčního potenciálu ve fázi depolarizace.
Obrázek 43: Srovnání zašuměného a vyfiltrovaného signálu AP.
52
Obrázek 44: Ukázka srovnání filtrovaného signálu DP (modrá), vlnková transformace (červená).
Na obr. 44 jsou porovnány obě filtrace, modrá reprezentuje dolní propust (DP), červená vlnkovou transformaci. Pro lepší porovnání obou filtrací byl vytvořen výřez, kde se dají odchylky vyfiltrovaného signálu lépe sledovat (obr. 45). Jak lze sledovat, rychlost/strmost depolarizace je téměř totožná, kdežto ve fázi plató má signál filtrovaný DP výraznější kolísání signálu (v rozmezí 0,9 – 1,1), než signál, který byl filtrovaný vlnkovou transformací. Jak se zdá, repolarizační fáze je u obou filtrací totožná. V oblastech kolem klidového potenciálu vycházejí výsledky filtrace více méně totožné. Signál filtrovaný vlnkovou transformací má menší amplitudu, než je tomu u signálu filtrovaným DP. Z hlediska zhodnocení průběhu akčního potenciálu se nedá přesně určit, která z použitých filtrací byla kvalitnější, neboť jejich průběh je více méně stejný. Zhodnocení kvality signálu lze posoudit pomocí poměru S/N (viz níže).
53
Obrázek 45: Výřez srovnání filtrací DP (modrá) a vlnkovou transformací (červená)
Zhodnocení kvality filtrace z hlediska SNR Lepší výsledky z hlediska kvality filtrací přineslo srovnání jejich poměru S/N. Pro zhodnocení kvality signálu byl vytvořen referenční „čistý“ signál pomocí adaptivního vlnkového Wienerova filtru, který byl vytvořen na fakultě UBMI v Brně. [30] Tento filtr se skládá z bloků vlnkové transformace a bloku odhadu šumu a Wienerova filtru. Poměr S/N se určoval na vstupu filtru, kdy signál byl zašuměný a porovnával se s „čistým“ signálem. Poté proběhlo srovnání poměru S/N na výstupu filtru, kde byl signál už vyfiltrovaný a srovnával se opět s „čistým“ signálem. Poměr SNR byl vypočítán podle následující rovnice:
s(n).……..“čistý“ signál z(n)……….výstupní signál
54
Podle rovnice (14) byl vypočítán poměr SNR na vstupu filtru, který činil přibližně 11.0047 dB. Poměr SNR signálu, který prošel filtrem dolní propusti, činil přibližně 20.2041 dB. Stejným způsobem se provádělo určení poměru SNR i pro filtraci vlnkovou transformací. Poměr SNR na vstupu byl stejný (11.0047 dB). Poměr SNR po filtraci vlnkovou transformací byl přibližně 21.2688 dB. Z tohoto pohledu na kvalitu filtrace lze říci, že filtrace vlnkovou transformací byla úspěšnější, než filtrace filtrem dolní propusti.
55
11 Závěr Cílem diplomové práce bylo seznámení se s optickým snímáním elektrogramů za pomocí napěťově citlivých barviv. Dále proběhlo prostudování problematiky optických detektorů vhodných pro detekci elektrogramů. A v další části byly prozkoumány šumy znehodnocující kvalitu snímaného signálu a v neposlední řadě byl také proveden návrh jejich odstranění. V úvodní části práce jsou uvedeny základní veličiny, které mají spojitost s pojmem elektrogram. Dále je zde představena základní fyziologická funkce srdce a je zde věnována pozornost elektrickým projevům na srdci, které se podílí na vzniku elektrogramu. Obecně je snímání akčního potenciálu možné dvěma způsoby: kontaktně a bezkontaktně. Kontaktní způsob snímání AP používá jako detektor signálu elektrody a má nevýhodu v tom, že porušuje tkáň srdce (např. přísavné elektrody). Bezkontaktní snímání využívá napěťově citlivá barviva, která jsou do srdce vpravena buď injekčně, nebo perfuzí barviva v KH roztoku. Tento způsob snímání akčního potenciálu nemá vliv na porušení tkáně srdce. V kap. 6 jsou uvedeny možnosti snímání elektrogramů s využitím napěťově citlivých barviv. Jedná se o metodu snímání akčního potenciálu na jedné vlnové délce, která má tu nevýhodu, že neumožňuje potlačit pohybové artefakty, vznikající při normální práci srdce. Jako zdroj excitačního světla je zde použita halogenová žárovka (150W) a jako detektor emitovaného světla je zde fotodioda, která detekuje signál pouze na jedné vlnové délce (červená barva). Další metodou bylo snímání akčního potenciálu na dvou vlnových délkách (červená a zelená barva). Tato metoda bývá také označována jako poměrová. Jako zdroj excitačního světla je zde použit laser, který generuje světlo na vlnové délce 488nm. Jako detektor světla je zde použita tří-segmentová kruhová fotodioda (RGB), která umožňuje detekci signálu na více vlnových délkách, což je rozdíl oproti předchozímu způsobu snímání akčního potenciálu. Světlo modré barvy zde reprezentuje pohybový artefakt. Výsledného signálu je zde dosaženo poměrem signálu zelené a červené barvy. Odtud tedy název poměrová metoda. Zmiňovaný pohybový artefakt je způsoben pohybem srdce vůči optické sondě, nebo může být způsoben změnou množství srdečních buněk vlivem kontrakce srdce před optickou sondou. Oba způsoby mají vliv na rušení signálu. Posledním způsobem snímání akčního potenciálu bylo pomocí spektrofluorometrie, která opět používá jako excitační zdroj laser modré barvy (488nm). Jako detektor zde slouží pole fotodiod. Důležitou roli zde hraje optická mřížka, která rozkládá světlo na jednotlivé vlnové délky, které jsou dále zpracovávány. Popisu napěťově citlivých barviv, jejich parametrů a vlastností je věnovaná kapitola 8. Konktrétně se jednalo o použití barviva di-4-ANEPPS. 56
V kapitole 7 jsou rozebírány optické senzory vhodné pro detekci signálu, a to z hlediska použití, jejich spektra, stavby, dle struktury PN přechodu. Dále se kapitola zabývá charakteristickými parametry fotodiod a jednotlivými šumy, které optické senzory provázejí. V této kapitole je také diskutován optický detektor, typ S9032-02 od firmy HAMAMATSU, který byl použit pro detekci akčního potenciálu. Mezi další typy rušení patří například výstřelový šum, rušení ze sítě, fluktuace fotonů ze světelného zdroje, šum fotodetektoru za tmy, vlastní šum A/D převodníku, vlastní šum zesilovačů, rušení elektromagnetického pole, kvantovací šum při digitalizaci signálů. Návrh odstranění těchto šumů je uveden v práci v kap. 9. Další kapitola této práce, konkrétně kap. 10, se zabývá realizací odstranění šumového znehodnocení signálu akčního potenciálu. Tento návrh a samotná realizace probíhala s pomocí programového prostředí Matlab. Signál byl filtrován dvěma typy filtrace, a to filtrací FIR filtrem dolní propusti a filtrací vlnkovou transformací. Mezní frekvence filtru dolní propusti byla nastavována empiricky. Spektrální složky užitečného signálu byly na základě frekvenčního spektra odhadnuty v rozmezí 1 – 30 Hz. Poté následovala konstrukce filtru dolní propusti, který filtroval frekvence 30 Hz – 1 kHz. Navržená metoda se dá považovat za úspěšnou, neboť vyfiltrovaný signál akčního potenciálu má hladký průběh, bez známek rušení. Srovnání filtrovaného signálu se zarušeným ukazuje, že filtr DP ovlivnil strmost akčního potenciálu ve fázi depolarizace. Další filtrace byla filtrace vlnkovou transformací. Vlnková transformace na rozdíl od dolní propusti signál rozkládá do jednotlivých pásem a v jednotlivých pásmech se snaží o korekci koeficientů šumů a užitečného signálu na základě stanoveného prahu. Poté je provedena inverzní transformace, kde se signál opět složí do jediného pásma. I v tomto případě byla navržená metoda filtrace úspěšná, avšak stejně jako v případě filtru dolní propusti filtrace ovlivnila strmost depolarizace akčního potenciálu. Srovnáním obou typů filtrace lze dojít k závěru, že tvar akčního potenciálu je zachován v obou případech, až na drobné odlišnosti, jako je kolísání signálu ve fázi plató u filtrace DP, nebo menší amplituda signálu u filtrace vlnkovou transformací. Ovšem nutno podotknout, že obě filtrace zkreslily strmost akčního potenciálu ve fázi depolarizace. Z hlediska kvality filtrace byly oba filtry porovnávány pomocí poměru S/N. Z tohoto výsledku vyplývá, že kvalita filtrace vlnkovou transformací dala lepší výsledky, než filtrace dolní propustí.
57
12 Seznam použité literatury [1]
Transplantace srdce, dostupné na: http://absolventi.gymcheb.cz/2006/pechrjir/srdce.html.
[2]
Lékařská fakulta UK v Hradci Králové, dostupné na: http://www.lfhk.cuni.cz/patfyz/Intranet/biosignala/bsa/EKG/ekg_gen2.html.
[3]
ŠTEJFA, M., ŠUMBERA, J., BRAVENÝ, P. Základy elektrokardiografie. Masarykova univerzita, lékařská fakulta, 1991.
[4]
LF UK, dostupné na: www.stefajir.cz/files/Fyziologie-UcebniText.doc
[5]
LF UK, dostupné na: http://www.stefajir.cz/?q=sinova-extrasystola-ekg
[6]
HONZÍKOVÁ, N. Biologie člověka. Skripta, FEKT VUT Brno, 2003
[7]
VÍTKOVÁ, J. Biologie člověka, Gymnázium a SOŠPg, Znojmo
[8]
KITTNAR, O., MLČEK, M. Atlas fyziologických regulací, Grada Publishing, 1. vyd, 2009, ISBN 978-80-247-2722-6
[9]
ŠTEJFA, M. Kardiologie, Grada Publishing, 3. vyd, 2011, ISBN 978-80-247-7034-5
[10]
Cardiovascular diseases (CVDs). World Health Organization [online]. 2011 [cit. 2012-02-14]. Dostupné na: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs317/en/index.html
[11]
KOLÁŘOVÁ, J., FIALOVÁ, K., JANOUŠEK, O., NOVÁKOVÁ, M., PROVAZNÍK, I. Experimental Methods for Simultaneous Measurement of Action Potentials and Electrograms in Isolated Heart, S71-S80, 2010
[12] JOHNSON, P.L., SMITH, W., BAYNHAM, T.C., KNISLEY, S. B. Errors Caused by Combination of Di-4 ANEPPS and Fluo3/4 for Simultaneous Measurements of Transmembrane Potentials and Intracellular Calcium, vol. 27, pp. 563-571, 1999 [13]
KNISLEY, S. B., JUSTICE, R. K., KONG, W., JOHNSON, P. L. Ratiometry of transmembrane voltage-sensitive fluorescent dye emission in hearts, Department of Biomedical Engineering of the School of Engineering, Alabama, 2010
[14]
Si Photodiodes, HAMAMATSU www.hamamatsu.com
[15]
Si Photodiodes, HAMAMATSU PHOTONICS K.K., catalog, 1989-90, Dostupné na: www.hamamatsu.com
[16]
GM Electronic: Součástky pro elektroniku. GM Electronic, Praha, 1995.
PHOTONICS
58
K.K.,
2011,
Dostupné
na:
[17] [18]
VASILESKA, D. Photodetectors, Arizona State University Optical technologies, Dostupné na: http://www.optical-tech.com
[19]
Di-4-anepps, Dostupné na: www.invitrogen.com
[20]
Fast-Response Probes, Dostupné na www.invitrogen.com
[21]
RGB color sensor, HAMAMATSU PHOTONICS K.K, Dostupné na: www. hamamatsu.com
[22]
ROSENBAUM, D. S. Optical Mapping, USA, 2002
[23]
WINDISCH, H. Optical Mapping of Cardiac Excitation and Arrhythmias, Futura Publishing Company, Inc., 2001, ch. Optical mapping of Impulse Propagation within Cardiomyocytes, pp. 97112.
[24]
LOEW, L. M. Design and Use of Organic Voltage Sensitive Dyes, ISBN 978-1-44196557-8, 2011
[25]
VRBA, R. Digitální obvody a mikroprocesory, FEKT VUT Brno, 2003
[26]
NYGREN, A., KONDO, C., CLARK, R. B., AND GILES, W. R. Voltage-sensitive dye mapping in Langendorff-perfused rat hearts, 2002
[27]
LAURITA, K., LIBBUS, I. Optics and detectors used in optical mapping, 2001
[28]
ALFAOURI, M., DAQROUQ, K. ECG Signal Denoising By Wavelet Transform Thresholding, Science Publications, 2008, ISBN 1546-9239
[29]
STRANG, G., NGUYEN, T. Wavelets and Filter Banks. Wellesley-Cambridge Press, 1996, 490 p. ISBN 0-9614088-7-1
[30]
SMITAL, L., VÍTEK, M., KOZUMPLÍK, J., PROVAZNÍK, I. Adaptive Wavelet Wiener Filtering of ECG Signals, vol. 60, no. 2, 2013
[31]
NIKNEJAD, A. M. Electrical Noise, dostupné na: http://rfic.eecs.berkeley.edu/~niknejad/ee142_fa05lects/pdf/lect11.pdf.
[32]
FIALOVÁ, K., KOLÁŘOVÁ, J., JANOUŠEK, O., RONZHINA, M., PROVAZNÍK, I., NOVÁKOVÁ, M. Effects of Voltage-Sensitive Dye di-4- ANEPPS on Isolated Rat Heart Electrogram. In Computers in Cardiology. 2011. s. 1-4. ISBN: 978-1-45770612- 7.
59
