Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav biologie rostlin
VLIV ELICITORŮ NA PRODUKCI SEKUNDÁRNÍCH METABOLITŮ U
SCHISANDRA CHINENSIS IN VITRO Diplomová práce
VEDOUCÍ DIPLOMOVÉ PRÁCE:
VYPRACOVALA:
Ing. Helena Vlašínová, Ph.D.
Bc. Veronika Šlancarová Brno 2010
PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma Vliv elicitorů na produkci sekundárních metabolitů u Schisandra chinensis in vitro vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně.
V Brně, dne 30. dubna 2010 podpis diplomanta: ……………………….
PODĚKOVÁNÍ Tímto bych chtěla velmi poděkovat vedoucí mojí diplomové práce Ing. Heleně Vlašínové, Ph.D. za odborné vedení a trpělivou pomoc při řešení zadané problematiky. Dále bych chtěla poděkovat Mgr. Jiřímu Slaninovi, Ph.D. z Masarykovy univerzity za analýzu lignanů a Mgr. Tomáši Kašparovskému, Ph.D. taktéž z Masarykovy univerzity za analýzu salicylové kyseliny ve vzorcích.
ABSTAKT Cílem mé diplomové práce bylo sledovat vliv různých elicitorů, látek spouštějících obrannou reakci v rostlinách, na in vitro kulturu významné léčivé rostliny Schisandra chinensis,
zejména
na
produkci
jejích
hlavních
sekundárních
metabolitů
-
- dibenzocyklooktadienových lignanů. Pro experimenty byly zvoleny elicitory kryptogein, kapsicein, ergosterol, chitosan, metyljasmonát a usmrcená mycelia patogenu Aspergillus niger. Zároveň byl zjištován vliv různého světla na intenzitu elicitace. Lignany byly vyhodnocovány pomocí HPLC, stejně jako obsah endogenní salicylové kyseliny, který sloužil pro zjištění fyziologické odezvy na působení elicitorů. Kultura byla odvozena v roce 2004 a postupně ztratila schopnost produkovat lignany. I v kontrolních vzorcích byl obsah lignanů pod mezí detekce. U nárůstu kultur a obsahu endogenní salicylové kyseliny byly zaznamenány rozdíly v rámci různých elicitorů, jednotlivých linií kultur, rozdílné působení světla při kultivaci i vlivy sezónní. Klíčová slova: Schisandra chinensis, dibenzocyklooktadienové lignany, sekundární metabolity, elicitory, obranná reakce rostlin, in vitro kultury,
ABSTRACT The influence of various elicitors, compounds that trigger plant defense reaction, on the cell culture of an important medicinal plant, Schisandra chinensis was studied. These elicitors: cryptogein, capsicein, ergosterol, chitosan, methyljasmonate and inactivated mycelium of Aspergillus niger were chosen for experiments. Influence of light conditions on elicitation was also studied. Dibenzocyclooctadiene lignans, main secondary metabolites of Schisandra chinensis were analysed by HPLC as well as endogenous salicylic acid content as marker of stress of the cultures. In vitro cultures were induced in 2004 and subsequently losed ability to produce secondary metabolites. In control samples also no lignans were found. Influence of elicitor, strain, light and season on cell growth and salicylic acid content were detected. Keywords: Schisandra chinensis, dibenzocyclooctadiene lignans, secondary metabolites, elicitors, plant defense reaction, in vitro cell culture
OBSAH ABSTAKT........................................................................................................................ 5 ABSTRACT .....................................................................................................................6 SEZNAM ZKRATEK................................................................................................... 10 SEZNAM OBRÁZKŮ................................................................................................... 11 SEZNAM TABULEK.................................................................................................... 11 SEZNAM GRAFŮ......................................................................................................... 12 1 ÚVOD..........................................................................................................................13 2 LITERÁRNÍ PŘEHLED.......................................................................................... 14 2.1 Schisandra chinensis (Turcz.) Baill.................................................................. 14 2.1.1 Systematické zařazení ................................................................................. 14 2.1.2 Nomenklatura............................................................................................... 14 2.1.3 Rozšíření.......................................................................................................15 2.1.4 Stanoviště..................................................................................................... 15 2.1.5 Popis rostliny................................................................................................16 2.1.6 Pěstování...................................................................................................... 17 2.1.7 Obsahové látky............................................................................................. 18 2.1.7.1 Lignany čeledi Schisandraceae.............................................................18 2.1.7.2 Lignany Schisandra chinensis.............................................................. 18 2.1.8 Droga a její příprava.....................................................................................21 2.1.9 Farmakologie................................................................................................21 2.1.10 Somatická embryogeneze...........................................................................23 2.2 Sekundární metabolity...................................................................................... 26 2.2.1 Fenylpropanoidy...........................................................................................26 2.2.1.1 Lignany.................................................................................................28 2.2.1.2 Biosyntéza lignanů............................................................................... 31 2.2.2 Metody zvyšování produkce sekundárních metabolitů................................ 33 2.2.2.1 Selekce vysoce produktivních linií.......................................................34 2.2.2.2 Optimalizace fyzikálně-chemických podmínek kultivace....................34 2.2.2.3 Přidání prekurzorů................................................................................ 35 2.2.2.4 Permeabilizace......................................................................................35 2.2.2.5 Imobilizace buněk ................................................................................36
2.2.2.6 Genetická manipulace...........................................................................37 2.2.2.7 Elicitace................................................................................................ 37 2.3 Elicitace metabolických procesů.......................................................................38 2.3.1 Úloha elicitace v intaktních rostlinách – obrana rostlin............................... 38 2.3.1.1 Kompatibilita a inkompatibilita............................................................38 2.3.1.2 Základní rezistence .............................................................................. 39 2.3.1.3 Rasově specifická rezistence................................................................ 39 2.3.1.4 Rozpoznání........................................................................................... 40 2.3.1.5 Signální transdukce.............................................................................. 41 2.3.1.6 Obranná reakce .................................................................................... 43 2.3.1.7 Obranná reakce mimo místo napadení................................................. 44 2.3.2 Elicitory........................................................................................................ 46 2.3.2.1 Oligosacharidy......................................................................................48 2.3.2.2 Glykopeptidy, glykoproteiny, peptidy a proteiny ................................ 48 2.3.2.3 Lipidy................................................................................................... 51 2.3.2.4 Signální molekuly.................................................................................53 2.3.3 Faktory ovlivňující elicitaci u explantátových kultur.................................. 53 3 CÍL PRÁCE................................................................................................................55 4 MATERIÁL A METODY........................................................................................ 56 4.1 Rostlinný materiál.............................................................................................56 4.2 Patogenní organismy......................................................................................... 57 4.3 Chemikálie.......................................................................................................... 57 4.4 Metodika............................................................................................................. 58 4.4.1 multiplikace.................................................................................................. 58 4.4.1.1 Příprava kultivačního média.................................................................58 4.4.1.2 Pasážování............................................................................................ 59 4.4.2 Předpokus..................................................................................................... 60 4.4.3 Elicitační experimenty..................................................................................60 4.4.3.1 Příprava kultivačního média ..............................................................60 4.4.3.2 Založení pokusu....................................................................................62 4.4.3.3 Vliv světla na elicitaci.......................................................................... 63 4.4.3.4 Vyhodnocení......................................................................................... 63
4.4.4 Analýza lignanů
.....................................................................................63
4.4.4.1 Příprava vzorků – extrakce methanolem.............................................. 64 4.4.4.2 Extrakce na pevnou fázi....................................................................... 64 4.4.4.3 HPLC-UV.............................................................................................64 4.4.5 Analýza kyseliny salicylové
.................................................................... 65
4.4.5.1 Příprava vzorků.................................................................................... 65 4.4.5.2 Analýza pomocí HPLC ........................................................................65 5 VÝSLEDKY A DISKUZE.........................................................................................67 5.1 P ř edpokus........................................................................................................... 67 5.2 Vlastní experiment ............................................................................................ 68 5.2.1 Vliv biotických elicitorů...............................................................................68 5.2.1.1 Metyljasmonát...................................................................................... 69 5.2.1.2 Aspergillus niger...................................................................................70 5.2.1.3 Kapsicein, kryptogein, ergosterol......................................................... 70 5.2.1.4 Chitosan................................................................................................ 71 5.2.2 Výběr linií.....................................................................................................71 5.2.3 sezónní vlivy................................................................................................ 72 5.2.4 Vliv světla.....................................................................................................73 5.2.5 Analýza lignanů ...........................................................................................75 5.2.6 Analýza salicylové kyseliny (SA) ............................................................... 76 6 ZÁVĚR....................................................................................................................... 80 7 PŘEHLED LITERATURY.......................................................................................81
SEZNAM ZKRATEK WV 5 – médium Westvaco 5 2,4-D – 2,4-dichlorfenoxyoctová kyselina ABA – abscisová kyselina XAD-2 – nepolární polystyrenová pryskyřice SAR – získaná systémová rezistence (systemic acquired resistance) ISR – indukovaná systémová rezistence RP- HPLC – vysokoúčinná kapalinová chromatografie na reverzních fázích SPE – extrakce na pevnou fázi UV záření – ultrafialové záření FDA – fluoresceindiacetát PI – propidium jodid CAP – kapsicein CR – kryptogein MeJA – metyljasmonát ERG – ergosterol CHIT – chitosan Chit 1 – hexan AC-chitosan Chit 2 – laktát oligo-chitosanhexan AC-chitosan SA – salicylová kyselina cAMP – cyklický adenosin-3',5'-monofosfát HIV – virus lidské imunodeficience NAD(P)H – nikotinamid adenin dinukleotid (fosfát) PR proteiny – proteiny podmíněné patogenezí (pathogenesis related proteins) RLK (receptor like protein kinase) – skupina rostliných proteinkináz ATPáza – adenosin trifosfatáza
SEZNAM OBRÁZKŮ 1. Schisandra chinensis [online] 2. Základní struktura lignanů Schisandra chinensis (Lu a Chen, 2009; upraveno) 3. Somatická embryogeneze Schisandra chinensis
ze zygotických embryí.
(Převzato ze Smíšková et al., 2005) 4. Schéma biosyntézy základních fenylpropanoidů (Iriti a Farao; 2009; upraveno) 5. Základní struktury lignanů (Umezawa, 2003; upraveno) 6. Schéma biosyntézy některých lignanů (Slanina, 2000; upraveno) 7. Schématické znázornění aktivní základní rezistence a rezistence rasově specifické (Prell a Day, 2001; upraveno) 8. Struktura kryptogeinu (Ponchet et al., 1999; upraveno) 9. Kultura raných somatických embryí Schisandra chinensis 10. Kalusová kultura Schisandra chinensis 11. Stanovení životnosti pomocí barvení FDA+PI
SEZNAM TABULEK 1. Hlavní a některé vedlejší lignany Schisandra chinensis (Lu a Chen; 2009; upraveno) 2. Některé elicitory (Vasconsuelo a Boland, 2007; upraveno) 3. Rozdíly v biologické aktivitě způsobené kryptogeinem a ergosterolem (čerpáno z Kašparovský, 2003) 4. Složení média Westvaco WV 5
SEZNAM GRAFŮ 1. růstová křivka předpokusu na rotátoru – linie IA1 2. vliv vybrané linie kultury na růstovou křivku 3. vliv Aspergillus niger na hmotnost kultury 4. vliv elicitorů na hmotnost kultury IA1 5. rozdílné chování jednotlivých linií 6. sezónní vlivy chování kultury IA1 7. vliv kultivace na světle a ve tmě na hmotnost kultury 8. vliv kultivace na světle, při snížené intenzitě světla a ve tmě na hmotnost kultury 9. porovnání vlivu světla, sníženého světla a UV záření na hmotnost kultury 10. obsah SA při kultivaci na světle 11. obsah SA pro kultivaci na světle a UV 12. růstová křivka pro kultivaci na světle a UV 13. obsah SA u
kryptogeinu a ergosterolu (tma) a kapsiceinu, chitosanu 1,
chitosanu 2 a MeJA (snížené světlo)
1 ÚVOD Schisandra chinensis je léčivá rostlina původem z východní Asie známá více než 4000 let. Má široké spektrum biologických účinků, mezi něž patří hepatoprotektivní, adaptogenní, antioxidační a kardiostimulační vlastnosti. V poslední době se řada prací soustřeďuje také na její virostatické a protirakovinné účinky. Za její farmakologický význam jsou zodpovědné především lignany dibenzocyklooktadienového typu, fenylpropanoidy, které slouží zejména k ochraně rostlin proti patogenům a hmyzu. V rostlinách se nevyskytují v příliš velkých množstvích, proto byly vyvinuty snahy o jejich zvýšení. Pro získávání sekundárních metabolitů se jako vhodné jeví in vitro kultury, které představují možný obnovitelný zdroj farmaceutik, barviv, aromat a dalších látek důležitých pro expandující lidskou populaci. Byla zavedena řada metod, které mohou zvyšovat obsah těchto sekundárních metabolitů. Jednou z významných je i elicitace. Rostliny jsou napadány různými činitely, ať už patogeny nebo herbivory, ale během své evoluce si vyvinuly mechanismy jak se proti takovým útokům bránit. Předpokladem pro úspěšnou obranu je rozpoznání útočníka a nastartování řady fyziologických změn sloužících k jeho potlačení. Pro rozpoznání jsou nezbytné molekuly elicitorů, látek produkovaných patogeny či samotnými rostlinami, ale pouze v souvislosti s napadením. Součástí obranné reakce je tvorba bariér proti šíření patogenů a produkce látek pro patogeny toxických. Mezi ně můžeme zahrnout aktivní formy kyslíku, oxid dusný, obranné enzymy a další. Jednou z obranných strategií rostlin je také produkce sekundárních metabolitů. Toho lze využít při snaze o jejich zvýšenou produkci. Pokud budeme na rostlinu nebo její in vitro kulturu aplikovat inaktivované patogeny, molekuly elicitorů či složky účastnící se signální transdukce při napadení, mohou být aktivovány genů důležité pro produkci námi požadovaných látek.
13
2 LITERÁRNÍ PŘEHLED 2.1 Schisandra chinensis (TURCZ.) BAILL. 2.1.1 Systematické zařazení říše
Plantae
rostliny
podříše
Tracheobionta
cévnaté rostliny
nadoddělení
Spermatophyta
semenné rostliny
oddělení
Angiospermae
krytosemenné rostliny
řád
Austrobaileyales
čeleď
Schisandraceae
klanopraškovité (The Angiosperm Phylogeny Group III; 2009)
Čeleď Schisandraceae zahrnuje dva rody: Schisandra (TURCZ.) BAILL. a Kadsura KAEMPF.
EX
JUSS. Tradičně byly na základě morfologických analýz řazeny do řádu
Illiciales spolu s čeledí Illiciaceae. V roce 2003 byly tyto dvě čeledě spolu s čeleděmi Trimeniaceaea a Austrobaileyaceae zařazeny do řádu Austrobaileyales (Wang, 2006). Toto zařazení je stále platné (The Angiosperm Phylogeny Group III; 2009). 2.1.2 Nomenklatura Jméno „Schisandra“ je odvozeno od dvou slov řeckého původu: „schizein“, které znamená dělit a „andros“ – muž. Bylo zvoleno podle separace prašníkových buněk z tyčinek druhu Schisandra coccinea (Hancke et al., 1999). V Číně je její nejfrekventovanější běžné označení wu wei zi. V Rusku je Schisandra nazývána limonnik, podle citronové vůně rozmáčknutých květů, v Korei se nazývá omicha a v Japonsku gomischi. V USA a Kanadě se nejčastěji používá jméno schisandra, popř. magnolia vine. U nás ji můžeme najít pod názvem schisandra, klanopraška či magnolka, popřípadě čínský citrónovník (Jablonský a Bajer, 2007). Co se týče pravopisu, můžeme se setkat s označením Schisandra i Schizandra, používané jsou obě varianty (McKenna et al., 2002). Jako léčivka se v Číně používá již od pradávna. O schisandře se poprvé zmiňuje čínský spis Shen Nong Ben Cao Jing, který byl sepsán před 4000 lety (Jablonský a Bajer, 2007). V západní botanice bylo pro čínskou rostlinu wu wei zi nejprve zvoleno 14
jméno Kadsura chinensis, a to v publikaci ruského botanika N. S. Turczaninova z roku 1832. Ruský botanik Ruprecht roku 1856 přejmenoval rod Kadsura na počest svého kolegy Maximovicze na Maximowiczia a rostlinu nazval Maximowiczia chinensis. V roce 1866 francouzský botanik H. E. Baillon zařadil rostlinu do rodu Schisandra a od té doby je známá jako Schisandra chinensis (TURCZ.) BAILL. (Hancke et al., 1999). 2.1.3 Rozšíření Rod Schisandra z čeledi Schisandraceae je reprezentován přibližně 25 druhy pocházejícími z tropického, subtropického a mírného pásma východní Asie, včetně jednoho druhu endemického na Tchaj-wanu (Cracker a Simon, 1989). Jeden druh, Schisandra coccinea, se vyskytuje jako vzácná popínavá rostlina v jihovýchodní části USA na Foridě, v Louisianě, Georgii, Arkansasu, Tennessee, a Severní Karolině (McKenna et al., 2002). Schisandra chinensis je představitel původní subtropické flóry, který se udržel na Dálném východě jižně od 51.-54.° severní šířky (Hlava a Valíček, 2005). Přirozeně se vyskytuje v oblasti toku Amuru, na jižním Sachalinu, Kurilských ostrovech, v Japonsku a severní Číně (Jablonský a Bajer, 2007). Jen plocha jejích přirozených porostů se odhaduje na Dálném východě na 6400 km2. Zde liána roste obvykle ve výškách 200-500 m nad mořem, v severozápadní Číně až do výšky 1300 m nad mořem (Valíček a kol., 1998). Z východního Ruska byla schisandra přivezena do evropských botanických zahrad kolem roku 1850. V současné době ji často vidíme v západoevropských zahradách jako okrasnou pnoucí rostlinu (Jablonský a Bajer, 2007). 2.1.4 Stanoviště Rostliny rostou ve smíšených a listnatých lesích, na lehkých naplavených půdách v okolí řek a potoků (Hlava a Valíček, 2005). Vyhovují jí mírně vlhké půdy, ale nesnáší trvalé zamokření a zátopy. Na písčitých a rozbahněných pozemcích neroste. Odolnost rostlin vůči suchu je nízká a zejména mladé rostliny trpí při nedostatku vláhy. Schisandra patří mezi světlomilné rostliny, ale v mladém věku může růst i ve stínu.
15
V dospělosti by ovšem příliš zastíněná nepřinášela žádné plody. V podmínkách přírodního růstu i v kultuře se vyznačuje vysokou odolností vůči chladu (Jablonský a Bajer, 2007). 2.1.5 Popis rostliny Opadavá dřevitá liána s ovíjivým pravotočivým stonkem je 8-15 m dlouhá. Stonek měří v průměru 1,2-1,5 cm (Hancke et al., 1999). Jednoleté výhonky mají hladkou a nažloutlou kůru, u starších výhonů je kůra svraštělá a tmavohnědá a má specifickou příjemnou vůni. V nepříznivých podmínkách nabývá křovitého tvaru a neovíjí se. Pupeny jsou dlouhé 3-5 mm, podélně vejčité, zašpičatělé, odkloněné od výhonu a po třech v uzlině (Jablonský a Bajer, 2007). Listy, dlouhé 7-10 cm, jsou jednoduché, s mírně zubatými okraji a klínovitou bazí. Mají obvejčité či eliptické čepele a červenohnědé řapíky. V létě jsou temně zelené, na podzim se zbarví do citrónově žluté barvy. Jsou střídavé nebo vyrůstají ve svazečcích na zkrácených článcích. Průduchy se nacházejí na spodní straně listů. (Hancke et al., 1999; www.ecosystema.ru; Metcalfe et al., 1950). Biologie kvetení je poměrně složitá. Schisandra má jednopohlavné květy, přičemž v přírodě se setkáváme jak s rostlinami jednodomými, tak i dvoudomými. V některých letech se tvoří jen samčí květy, v jiných samičí i samčí, což velmi často závisí na podmínkách prostředí, především na teplotním režimu, výživě rostlin a vlhkosti půdy. Vliv má také stáří rostliny; při prvním kvetení se často tvoří pouze květy samčí, samičí se objevují až v letech následujících. Bělavé či narůžovělé květy s příjemnou citronovou vůní vyrůstají na stopkách v úžlabí listů. Samčí květy se nacházejí ve spodní a samičí v horní části keře. Koruna je až 15 mm velká, složená ze 6-9 voskovitých okvětních lístků. Samčí květy vyrůstají v úžlabí listů po 2-7 na dlouhých růžových stopkách, tyčinky jsou bílé. Samičí květy mají na krátkém válcovitém květním lůžku velký počet dvouvaječných pestíků s nazelenalými bliznami. Opyluje se hmyzem. Při dozrávání se lůžko 20-50krát zvětší a tak se vytvoří z jediného květu souplodí vzhledem připomínající hrozen rybízu. Obsahuje 15-25 červených nepravidelně okrouhlých měkkých bobulí o průměru 5-7 mm, uvnitř každé
16
bobule jsou zpravidla dvě žlutá ledvinovitá semena asi 3 mm velká. Hmotnost jednoho souplodí je 7-22 g (Hlava a Valíček, 2005; Jablonský a Bajer, 2007; Valíček a kol., 1998).
Obr. 1: Schisandra chinensis [online]
2.1.6 Pěstování Schisandra vyžaduje spíše lehčí, živinami dobře zásobenou a kyselou půdu. Rozmnožování schisandry je možné vegetativní i generativní. Jako vegetativní způsoby rozmnožování uvádí Walter (2001) řízkování v červnu až červenci zelenými řízky z polovyzrálých mezičlánků se třemi listy a vlnovité hřížení letorostů, za předpokladu, že mateřské rostliny pěstujeme v lehčí, humózní půdě. Hejduk (2007) zmiňuje i množení pomocí odkopků s kořeny. Generativní rozmnožování lze provádět po stratifikaci semen. Její podstatou je uložení semen 2 měsíce před výsevem ve vlhkém hrubozrnném písku při teplotě asi 15°C. Mladé semenáče s jemným kořenovým systémem ale velmi špatně rostou (roční přírůstek je asi 8 cm) (Hejduk, 2007). Je vhodné je přistiňovat, abychom zabránili přehřátí kořenů. Druhým nebo třetím rokem je třeba vybudovat k rostlině vhodnou oporu. Sklízí se v době, kdy jsou bobule plně vybarvené, ale ne přezrálé. Zralé plody jsou velmi šťavnaté, mají citrusovou chuť (Hlava a Valíček, 2005; Jablonský a Bajer, 2007; Valíček a kol., 1998) 17
2.1.7 Obsahové látky Plody a semena obsahují lignany (viz kapitola 2.1.7.2), monoterpeny (borneol, 1,8cineol, citral, p-cymol α- a β-pinen), seskviterpeny (seskvikaren, α-yalangen, chamigrenal, α- a β-chamigren, β-bisabolen) a řadu dalších látek (tymoquinol, tymoquinol-5-O-β-glukopyranosid,
kampeferol-3-O-β-D-rutinosid,
5-hydroxymetyl-
-2-furaldehyd aj.) (Opletal et al., 2004) V plodech a oplodí dále obsahuje organické kyseliny (fumarovou, citronovou (11 %), jablečnou (8 %), askorbovou, vinnou (0,8 %), malovou a jantarovou), tanin, flavonoidy, anthokyany a sacharidy. V dužnině bobulí jsou obsaženy i peptidy, vitamíny (zvláště C a E) a minerální látky. Semena obsahují 33 % oleje, který je složen z glyceridů kyseliny linolenové a oleinové, pryskyřici a tuk. Celá rostlina je prostoupena silicí. V kůře je jí kolem 3 %, v semenech 2 % (Jablonský a Bajer, 2007; Valíček a kol.). Huang et al. (2008) z listů a stonku izolovali vysoce oxidované nortriterpenoidy. Prozatím nebyly zjištěny žádné biologické vlastnosti využitelné v lékařství, ale mohou být důležitým markerem pro identifikaci a kontrolu kvality této drogy (Lu a Chen, 2009). 2.1.7.1 Lignany čeledi Schisandraceae Lignany
čeledi
Schisandraceae
mohou
být
klasifikovány
do
čtyř
skupin:
dibenzocyklooktadienové lignany, 4-aryltetralinové lignany, 2,3-dimetyl-1,4-diarylbutanové lignany a 2,5-diaryltetrahydrofuranové lignany (Lu a Chen, 2009). 2.1.7.2 Lignany Schisandra chinensis U Schisandra chinensis uvádějí Lu a Chen (2009) jen lignany dibenzocyklooktadienové a 2,3-dimetyl-1,4-diarylbutanové, přičemž dibenzocyklo-oktadienové lignany jsou v drtivé převaze (viz tab.1). Ze Schisandra chinensis bylo izolováno více než 40 lignanů, ale některé jen v malých množstvích. Na studiích lignanů pracovalo několik nezávislých vědeckých týmů, v důsledku toho mají některé z nich více synonym. Jejich jména jsou ve většině případů převzata z názvů drog v původních jazycích (Opletal et al., 2004). Například schisandrin je často v literatuře uváděn jako schisandrol A, gomisin A jako schisandrol B, deoxyschisandrin jako schisandrin A nebo wuweizu A (Williamson et al., 2009).
18
Deng et al. (2008) uvádějí, že 15 lignanů (v tab.1 označených hvězdičkou) představuje více než 90% celkových lignanů obsažených v plodech Schisandra chinensis. Zastoupení jednotlivých z těchto látek se ale velmi liší (Deng et al., 2008).
dibenzocyklooktadienové lignany
Schisandrin*
Angeloylgomisin H*
Angeloylgomisin O
Isoschisandrin
Benzoylgomisin H
Angeloylisogomisin O
(±)-γ-schisandrin*
Tigloylgomisin H*
Benzoylgomisin O
deoxyschisandrin* Gomisin J *
Benzoylisogomisin O
wuweizisu C*
Gomisin K1*
Epigomisin O
Gomisin A*
Gomisin K2
Angeloylgomisin P
Gomisin B
(+)-Gomisin K3*
Tigloylgomisin P
Gomisin C*
Gomisin L1
Angeloylgomisin Q
Gomisin D*
Gomisin L2
Gomisin R
Gomisin E*
Gomisin M1
Gomisin S
Gomisin F
Gomisin M2
Gomisin T
Gomisin G
Gomisin N*
Schisantherin D
Gomisin H
Gomisin O
Pregomisin
diarylbutanové pregomisin* lignany
meso-dihydroguajaretová nordihydroguajaretová kyselina kyselina
Tab. 1: Hlavní a některé vedlejší lignany Schisandra chinensis (Lu a Chen; 2009; upraveno); lignany ozn. hvězdičkou představují 90% lignanů v plodech
Za hlavní lignany považují Lu a Chen (2009) schisandrin, gomisin A a schisandrin B. Deoxischisandrin už není tak hojně zastoupen, jako v jiných druzích rodu Schisandra. Hlavní podíl lignanů zjistili Schwarzinger a Kranawetter (2004) v semenech, osemení a plodech, kde bylo celkové množství lignanů 3,21%, 1,87% a 1,43%. Listy a kořeny obsahovaly lignany jen v nízkých koncentracích (0,43 a 0,44%). V plodech zaznamenali pětkrát vyšší koncentrace gomisinu N než bylo množství ostatních lignanů, zatímco v semenech a osemení byla vyšší koncentrace gomisinu N a schisandrinu (Schwarzinger a Kranawetter, 2004). V semenech evropských rostlin schisandry byly zjištěny jako hlavní složky schisandrin, gomisin A, deoxyschisandrin, gomisin N a wuweizisu C (Lu a Chen, 2009). Schwarzinger a Kranawetter (2004) uvádějí jako hlavní lignany u evropských semen 19
stejné látky, a to v následujícím množství: schisandrin (0,75-1,86%) gomisin N (0,241,49%), deoxyschisandrin (0,07-1,09%), gomisin A (0,13-0,90%) a wuwezisu C (0,010,34%), ale platí, že distribuce lignanů a jejich zastoupení silně závisí na místě původu a podmínkách růstu konkrétních rostlin (Schwarzinger a Kranawetter, 2004). V semenech schisandry kultivovaných v Jižní Korei byly hlavními složkami schisandrin, gomisin A a tigloylgomisin H (Lu a Chen, 2009). V průběhu vegetačního cyklu se obsah lignanů mění. Největší množství všech deseti lignanů stanovitelných pomocí HPLC (schisandrin, gomisin A, deoxyschisandrin, schisandrin B, schisandrin C, gomisin D, gomisin G, gomisin J, gomisin N a angeloylgomisin H) z japonských rostlin bylo zaznamenáno v plodech sbíraných v srpnu (Lu a Chen, 2009). Po fyzikálně-chemické stránce jsou dibenzocyklooktadienové lignany Schisandra chinensis bezbarvé, obvykle krystalické struktury bez zápachu. Jsou ve formě trojbokých hranolů nebo jehlic. Někdy jsou z roztoků separovány ve formě amorfního prášku (Opletal et al., 2004). Nepolární charakter lignanů umožňuje jejich snadnou prostupnost buněčnými membránami a schopnost ovlivnit v buňkách řadu biologických dějů (Slanina, 2000). Dibenzocyklooktadienové lignany schisandry mohou mít různou stereostrukturu. Bifenyl má buď S nebo R konfiguraci. Struktura těchto liganů je z důvodu přítomnosti několika chirálních center velmi komplexní (Lu a Chen, 2009).
Obr. 2 Základní struktura lignanů Schisandra chinensis (Lu a Chen, 2009; upraveno
20
2.1.8 Droga a její příprava Kresánek a Krejča (1988) zmiňují dvě drogy získávané ze schisandry, a to Fructus schisandrae – plod schisandry a Semen schisandrae – semeno schisandry. V praxi se nejčastěji zhotovuje ze semen anebo celých plodů extrakt, v poměru 1 díl plodů nebo semen na 3 díly 70% etanolu. Denní dávka se udává mezi 6-15 g drogy. Po 1-2 měsících se přefiltruje a užívá se 20 až 30 kapek 2-3krát denně po dobu 20-30 dnů. Je možno požívat i rozemletá semena, a to 0,5-1 g 2krát denně. Také se připravuje odvar z 10 g suchých rozdrcených plodů zalitých 200 ml vody, které se vaří po dobu asi 20 minut. Užívá se jedna polévková lžíce 2krát denně. Tonifikující čaje a extrakty s nižší účinností se připravují i z listů a mladých výhonků. Bobulí se používá také v potravinářském průmyslu, a to k přípravě tonifikujícch neakoholických nápojů, sirupů, kompotů, marmelád a cukrovinek (Valíček a kol., 1998). V kůře se nachází silice, která voní jako citróny, používá se v parfumerii a jako přísada do čajů (Kresánek a Krejča, 1988) . 2.1.9 Farmakologie V tradiční čínské medicíně je droga používána jako antihepatotoxické, antiastmatické, antidiabetické, sedativní a tonizující činidlo. Využívá se její adaptogenní aktivita, tj. schopnost zvýšit odolnost proti nežádoucímu vlivu stresu na živočišný organismus (Lee a Xiao, 2003). Schisandra je léčivá rostlina používaná k léčbě hepatitíd. Zlepšuje jaterní funkce, působí preventivně proti abnormální ploidii jaterních buněk a chrání proti vlivu deoxycholové kyseliny, endogennímu rizikovému faktoru pro vývoj rakoviny jater. Lignany urychlují obnovu poškozené jaterní tkáně. Významným faktorem pro antihepatotoxické
působení
dibenzocyklooktanové
kostry.
konkrétních
lignanů
Hepatoprotektivní
je
účinky
metylendioxyskupina jsou
zprostředkovány
neenzymatickou inhibicí peroxidace lipidů, jiné lignany zvyšují aktivitu superoxid dismutázy a katalázy (Lee a Xiao, 2003; Opletal et al., 2004). Inhibuje aldosoreduktázu a tak může být účinná v léčbě diabetu. Může upravovat metabolismus cholesterolu a lipidů prostřednictvím inhibice enzymů (Opletal et al., 2004). Prášek ze semen normalizuje vylučování žaludečních šťáv a to u pacientů jak se
21
zvýšenou, tak i sníženou sekrecí. Pomáhá také pacientům s chronickými gastritidami s žaludečními i dvanácterníkovými vředy, akutními i chronickými (Panossian a Wikman, 2008) Působí adaptogenně. Adaptogenní látky nespecificky zvyšují rezistenci k stresorům. Zlepšuje tak kvalitu života nemocných i zdravých lidí. Působí jako prevence imunosuprese vzniklé chemoterapií při léčbě rakoviny (Panossian a Wikman, 2008). Byly zaznamenány protirakovinné účinky některých lignanů. Lignany inhibovaly aktivaci časného antigenu viru Epstein-Baarové a způsobily reverzi mnohočetné lékové rezistence v rakovinných buněk způsobené P-glykoproteinem (Lu a Chen, 2009). Lignany schisandry jsou látky s antioxidačními vlastnostmi. Jejich cytoprotektivní aktivita je intenzivně studována. Tyto lignany sice nezháší syntetické organické radikály, jsou však schopny zvýšit hladinu redukovaného glutathionu v buňce a ochránit biologické membrány před lipoperoxidací. Antioxidační aktivita některých liganů je vyšší než u α-tokoferolu. Mechanismus účinku může spočívat mimo jiné v indukci detoxikačních enzymů a zvýšení proliferace endoplazmatického retikula v hepatocytech (Slanina, 2000). Schisandra napomáhá pacientům se zrakovými a nervovými poruchami. Prášek z plodů schisandry zvyšuje periferní senzitivitu sítnice. Zlepšuje vidění v noci a přizpůsobení očí temnotě, pomáhá při astigmatismu a hypermetropii. Mezi kontraindikace použití schisandry k léčbě očních nemocí patří glaukom, vysoký krevní tlak a zánět v přední části oční bulvy. Prášek ze semen má dobrý vliv na motoriku pacientů s poškozením centrálních i periferních nervů. Významná je při léčbě neurastenie, depresí, schizofrenii. Dále je účinná při léčbě astenie, vyčerpání, snížených fyzických a psychických schopnostech (Panossian a Wikman, 2008). Stimuluje činnost myokardu, a to zejména gomisin N. Ten je nejúčinnějším lignanem, který inhibuje cAMP fosfodiesterázu a tím zvyšuje intracelulární koncentraci cAMP a podporuje tak činnost srdečního svalu (Slanina, 2000). Normalizuje krevní pulz a arteriální krevní tlak (Panossian a Wikman, 2008). Je antagonista faktoru aktivujícího krevní destičky. Tento faktor je biologicky aktivní fosfolipid zapojený ve fyziologických a patologických procesech, jakými jsou: alergie, astma, záněty, atopická dermatitida, imunitní reakce a další. Jeho antagonisté působí v léčení vyjmenovaných onemocnění (Lee a Xiao, 2003).
22
Uplatňuje se při infekčních chorobách. Při několikaměsíčním užívání působí preventivně proti chřipce a nachlazení. Její vlastnosti také umožňují použití při léčbě zápalu plic (Panossian a Wikman, 2008). V posledních letech se zvýšený zájem věnuje vlivu lignanů Schisandra chinensis na HIV. Bylo zjištěno, že gomisin J a jeho halogenované deriváty inhibují replikaci viru HIV-1. Tyto sloučeniny inhibovaly reverzní transkriptázu, ale zdá se, že to není jediný mechanismus účinku (Slanina, 2000). Farmakologické účinky plodů jsou obvykle součtem účinků řady lignanů. Tento fenomén komplexity je velmi častý v tradiční čínské medicíně. Různé lignany mají různou míru působení. Některé, obsažené jen v malém množství vykazují velmi silný farmakologický účinek. Takovým lignanem je například gomisin K3, jehož antioxidační potenciál je největší ze všech známých lignanů ze Schisandra chinensis. Může se také stát, že i když látka sama nevyvolává žádné fyziologické odezvy, může zvýšit potenciál jiné bioaktivní složky prostřednictvím interakcí (Deng et al., 2008). 2.1.10 Somatická embryogeneze V průběhu evoluce si řada rostlinných druhů vyvinula mechanismy pro nepohlavní embryogenezi, která překonává různé enviromentální a genetické faktory bránící fertilizaci. Somatická embryogeneze je definována jako proces, při kterém se vyvíjí bipolární struktura podobná zygotickému embryu, ale vzniká z jiných buněk než ze zygot a tato struktura nemá s mateřskými pletivy vaskulární spojení (Arnold et al., 2002). Smíšková et al. (2005) popisují regeneraci Schisandra chinensis, kdy byla ze zygotických embryí prostřednictvím tvorby embryogenního kalusu odvozena kultura somatických embryí, kterou se poté podařilo regenerovat v intaktní rostliny. Převedením do in vitro kultury mohou být odbourány některé problémy jako je nízká klíčivost semen a jejich potřeba stratifikace a explantátová kultura může být dále využita pro biochemické, fyziologické, molekulární a transformační studie (Smíšková et al., 2005). Jako výchozí materiál sloužily nezralé bobule dvou navzájem opylených rostlin pěstovaných v Centru léčivých rostlin lékařské fakulty Masarykovy univerzity v Brně. Bobule byly sbírány v roce 2000. Byla z nich vypreparována semena, která byla podrobena povrchové sterilizaci 70% ethanolem po dobu 30 s, následované povrchovou 23
sterilizací 20% roztokem Sava po dobu 25 minut. Semena byla třikrát propláchnuta sterilní destilovanou vodou, poté byla zbavena testy, podélně rozříznuta a umístěna na médium Murashige a Skoog s přidanými 5 nM thidiazuronu, který v této nízké koncentraci působil pozitivně na zvětšení zygotických embryí. Po týdnu byla zygotická embrya vyříznuta a použita pro tvorbu explatnátových kultur. Pro iniciaci tvorby embryogenního pletiva bylo použito médium Westvaco 5 (WV 5) s přidanou 2,4-dichlorfenoxyoctovou kyselinou (2,4-D), glutaminem, 2 % sacharosy a 0.15 % Gellan gum pro zpevnění. Kalus se vytvořil u 20 % zygotických embryí. Přibližně po dobu jednoho roku byl každý měsíc pasážován na čerstvé médium Westvaco 5 s 2,4-D a benzyladeninem. Následovalo přenesení embryogenního kalusu na prematurační médium, které obsahovalo polyethylenglykol a kyselinu abscisovou (ABA). Z různých koncentrací se jako nejúčinnější ukázal přídavek 30 μM ABA. Po 7 týdnech byla somatická embrya přemístěna na papírové disky impregnované aktivním uhlím a umístěny na maturační médium WV 5 bez přidaných růstových regulátorů. V torpédovitém nebo časném kotyledonárním stádiu byla jednotlivá embrya izolována a přenesena na konverzní médium s aktivním uhlím a indolyl-3-máselnou kyselinou. Došlo k jejich konverzi a posléze k převedení do podmínek ex vitro (Smíšková et al., 2005).
24
Obr. 3: Somatická embryogeneze Schisandra chinensis ze zygotických embryí. A- nezralé zygotické embryo (úsečka = 0,1 cm). B- aktivně rostoucí embryogenní kalus (úsečka = 1 cm). C- somatická embrya v globulárním a srdčitém stádiu vývoje (úsečka = 1 cm). D- torpédovitá a časná kotyledonární embrya (úsečka = 1 cm). E -konvertované rostliny (úsečka = 1,5 cm). F – aklimatizované rostliny rašelinném substrátu (úsečka = 5 cm). (Převzato ze Smíšková et al., 2005)
25
2.2 Sekundární metabolity Rostliny produkují širokou škálu organických látek, ze kterých většina se nepodílí přímo na růstu a vývoji. Tyto látky jsou tradičně řazené mezi sekundární metabolity. Často jsou odlišnými taxonomickými skupinami produkovány různé sloučeniny, jejichž funkce se postupně objasňují (Croteau et al., 2000). Složky živých organismů mohou být rozděleny do dvou hlavních skupin: primární a sekundární metabolity. Primární metabolity jsou spjaty s primárními metabolickými procesy, jakými jsou například glykolýza, citrátový cyklus a fotosyntéza. Naproti tomu sekundární metabolity lze považovat za látky, které nejsou pro růst a vývoj živých organismů nenahraditelné, tak jako je tomu u produktů primárního metabolismu. Nicméně to neznamená, že nejsou důležité. Jsou početnou skupinou látek nacházejících se především ve vyšších rostlinách (Siegler, 1998; Iriti a Farao, 2009). Každý rok je popsáno přinejmenším 1000 nových sekundárních metabolitů. Jsou produkované prostřednictvím biosyntetických drah odvozených od drah primárního metabolismu. Hranice mezi primárními a sekundárními metabolity je ve skutečnosti neostrá. Látky jako rostlinné hormony, skořicová kyselina a lignin považuje Siegler (1998) za látky nacházející se na rozhraní mezi primárním a sekundárním metabolismem. Díky genotypové variabilitě je zajištěna diverzita v kvantitativních i kvalitativních vlastnostech sekundárních metabolitů. Množství metabolitů může být různé v rámci různých částí rostlin, může se lišit jak v rozdílných stádiích vývoje, tak v průběhu roku. Často je zaznamenaná i odlišnost ve složení metabolitů v průběhu dne (Siegler, 1998). Sekundární metabolismus spojuje rostlinu se součástmi jejího ekosystému, tedy s jeho abiotickou i biotickou složkou. Sekundární metabolity vznikají třemi hlavními biosyntetickými dráhami, konkrétně fenylpropanoidovou, isoprenoidovou a alkaloidovou cestou. Hlavní sekundární metabolity Schisandra chinensis jsou součástí produkty první jmenované biosyntézy (Iriti a Farao, 2009). 2.2.1 Fenylpropanoidy Fenylpropanoidy jsou deriváty fenylalaninu. Látky syntetizované z fenylalaninu anebo tyrozinu patří mezi nejrozšířenější sekundární metabolity v rostlinách, bakteriích i houbách (Siegler, 1998). Fenylpropanoidy mají v rostlinách řadu fyziologických úloh. 26
Jako důležité látky fenylpropanoidového charakteru uvádí Croteau et al. (2000) lignin, lignany, suberin, flavonoidy, kumariny, furanokumariny a stilbeny. Polymer lignin zesiluje buněčné stěny a umožňuje tak rostlinám udržet svoji váhu a transportovat vodu a minerální látky z kořenů do listů. Lignany se mohou účastnit obrany proti patogenům nebo působit antioxidačně, a to v různých částech těla. Suberinizovaná pletiva obsahují střídající se vrstvy hydrofóbních (alifatických) a hydrofilních (fenolických) strukturních substancí, slouží například jako ochranná bariéra proti vyschnutí či napadení patogeny. Flavonoidy zahrnují velmi různorodou skupinu skládající se z více než 4500 složek. Patří mezi ně antokyany (barviva), protoantokyanidy a kondenzované taniny (ochrana dřeva) a nakonec isoflavonoidy (obranné produkty a signální molekuly). Kumariny, furanokumariny a stilbeny chrání proti bakteriálním a houbovým patogenům, odpuzují herbivory a inhibují germinaci semen (Croteau et al., 2000). Prekurzory
biosyntézy
fenylpropanoidů
jsou
fosfoenolpyruvát
vzniklý
glykolýzou, a erytrosa-4-fosfát pocházející z pentosofosfátové dráhy. Jejich spojení vede k tvorbě dvou důležitých intermediátů: šikimové a chorismové kyseliny. V dalších krocích jsou syntetizovány fenylalanin a tyrosin. Deaminací fenylalaninu katalyzovanou enzymem fenylalanin amonium lyázou dochází k vytvoření skořicové kyseliny a po sérii hydroxylací benzenového jádra vznikají látky jako kumarová, ferulová a sinapová kyselina (Iriti a Farao, 2009). Hlavní zdroje fenylpropanoidů v rostlinách jsou skořicová kyselina, její étery a estery (Siegler, 1998). Tyto látky jsou dále redukovány přes aldehydové intermediáty na odpovídající alkoholy, souhrnně nazývané monolignoly. Dimerizací nebo polymerizací monolignolů vznikají lignany a lignin (Iriti a Farao, 2009).
27
Obr.4: Schéma biosyntézy základních fenylpropanoidů (Iriti a Farao; 2009; upraveno)
2.2.1.1 Lignany Lignany jsou skupinou sekundárních metabolitů v rostlinné říši široce rozšířených. Druhy z více než sedmdesáti čeledí produkují několik stovek různých lignanů. Vyskytují se u mechorostů, kapraďorostů, nahosemenných i krytosemenných rostlin (Slanina a Glatz, 2004; Willför et al., 2006). Prvními izolovanými lignany u nižších rostlin byly megacerotonická a anthocerotonická kyselina u Anthocerotae (Takeda et al., 1990).
28
Termín lignan byl poprvé použit Harworthem v roce 1936 k popsání skupiny fenylpropanoidových dimerů, jejichž fenylpropanoidové jednotky jsou spojeny centrálním uhlíkem (C8) propylových řetězců (Umezawa, 2003). Ale první zmínka o lignanech byla publikovaná Lindseyem a Tollensem už v roce 1892. Zaznamenali dílčí susbstanci extrahovatelnou dietyletherem ze smrku ztepilého (Picea abies). Její finální konstituce byla stanovena Erdtmanem (1934) a Haworthem et al. v roce 1935 (Holmbom et al., 2003). Název lignany byl odvozen z toho, že tyto sloučeniny byly původně považovány za meziprodukty
při
biosyntéze
ligninu
(C6-C3)n,
polymeru
rovněž
složeného
z fenylpropanových jednotek jako lignany (C6-C3)2. Dnes je zřejmé, že vzhledem ke struktuře ligninu a lignanů pouze některé z nich mohou sloužit k tomuto účelu (Slanina, 2000). Pokud jsou fenylpropanoidové jednotky spojeny jinými uhlíky než C8 a C8', jsou klasifikovány do skupiny neolignanů. Někdy se nevyskytují lignany jen v dimerické podobě, ale i jako trimery a tetramery, poté se nazývají seskvilignany a dilignany, nebo jsou řazeny do obecnější skupiny oligolignanů (Willfőr et al., 2006). Biosyntéza, která kombinuje
fenylpropanoidy
s
látkami
jiného
biogenetického
původu
(např.
s terpenoidy), poskytuje takzvané hybridní lignany (nebo lignoidy) (Harmatha, 2005). Slanina (2000) mezi ně řadí například flavanolignany, kumarinolignany a lignaniridoidy. Z chemického hlediska vykazují lignany nesmírnou strukturní diverzitu, ačkoliv je jejich základní skelet tvořen pouhými dvěmi fenylpropanovými jednotkami (Saleem et al., 2005). Podle způsobu, jakým je do molekuly inkorporován kyslík a podle charakteru cyklizace je Umezawa (2003) rozřazuje do osmi podskupin: dibenzylbutany, dibenzylbutyrolaktony, dibenlocyklooktadieny, dibenzylbutyrolaktoly, arylnaftaleny furofurany, furany a. aryltetraliny. Lignany každé podskupiny se podstatně odlišují v oxidačním stavu obou aromatických kruhů a bočního propylového řetězce. Navíc mohou být také řazeny do tří kategorií v závislosti na oxidačním stavu v pozici C9 (C9'), která je koncovou částí prypylového bočního řetězce: lignany s 9 (9')-kyslíkem bez 9 (9')-kyslíku a lignany odvozené od dikarboxylových kyselin (Umezawa, 2003).
29
Obr. 5: Základní struktury lignanů (Umezawa, 2003; upraveno)
Kromě strukturní diverzity se lignany liší z hlediska chirality. Bylo zjištěno, že přírodní lignany se vyskytují ve formě jednoho enantiomeru či enantiomerních směsí s rozdílným podílem jednotlivých složek. Některé lignany se vyskytují v racemické podobě, ale naprostá většina z nich je opticky aktivní. Umezawa (2003) uvádí, že zastoupení
dominantních
enantiomerů
furofuranových,
furanových
a dibenzyl-
butanových lignanů mezi rostlinnými druhy, jednotlivými rostlinami a někdy dokonce mezi různými orgány téže rostliny, kolísá. Zmiňuje také, že dibenzylbutyrolaktonové lignany jsou opticky čisté a většina těchto lignanů je levotočivá. Lignany se v přírodě vyskytují převážně ve volné formě, zatímco jejich glykosidové deriváty jsou vytvářeny pouze v menšině. Nacházejí se v kořenech, oddencích, stoncích, listech, semenech a plodech. Ne všechny tyto zdroje ale poskytují množství lignanů, které by bylo komerčně využitelné (Slanina a Glatz, 2004). Biologická funkce lignanů zatím ještě nebyla plně identifikována. Existují ovšem důkazy, že lignany hrají nezanedbatelnou roli v chemických interakcích mezi rostlinami a houbami, rostlinami navzájem a rostlinami a hmyzem, a to buď přímo nebo zprostředkovaně, formou synergismu s jinými účinnými rostlinnými látkami. To znamená, že mají svůj význam v obranném systému hostitelských rostlin a ovlivňují tak symbiózu organismů na 30
ekologické úrovni. Prekurzory lignanů jsou také mezi produkty nebo komponenty tvorby ligninu, tudíž mohou hrát určitou roli i v regulaci růstu rostlin (Harmatha a Dinan, 2003). Lignany ovšem vykazují velmi rozmanité spektrum účinků i na vyšší organismy, včetně člověka (Harmatha, 2005). Byly nalezeny i v krvi a moči savců. Tyto živočišné lignany vznikají ve střevech savců mikrobiální transformací rostlinných lignanů. Účinkují v organismu jako fytoestrogeny a pravděpodobně působí preventivně proti vzniku některých nádorových onemocnění (Slanina, 2000). Výzkum lignanů se soustřeďuje především k prozkoumání strukturně aktivitních vztahů, zmapování místa jejich působení a v konečném důsledku i o vývoj nových farmakologických preparátů. Příkladem mohou být lignany yatein a podophyllotoxin a jeho cíleně modifikované deriváty etoposid a teniposid, které dospěly až k aplikaci v klinické medicíně. Tato léčiva působí v širokém spektru chemoterapie rakoviny. Dalším příkladem biologické účinnosti lignanů je jejich antivirová aktivita. Např. lignanový glukosid trachelosid, původně izolovaný z rostlin rodu Trachelospermum, byl spolu s dalšími analogy syntetizován a testován. V testech byla prokázána účinnost série těchto látek proti HIV-1 viru. Dále zmiňuje Harmatha (2005) imunomodulační účinky. 2.2.1.2 Biosyntéza lignanů Biosyntéza lignanů navazuje na tvorbu monolignolů v rámci fenylpropanoidové dráhy. Nejlépe je biosyntéza prostudovaná u skupiny lignanů s kyslíkem v pozici 9(9'). Tyto lignany vznikají enantioselektivní dimerizací dvou jednotek koniferyl alkoholu za pomoci řídícího proteinu. Jeho působením vzniká pinoresinol (furofuranový lignan), který je redukován enzymem pinoresinol/lariciresinol reduktázou přes lariciresinol (furanový lignan) na sekoisolariciresinol (dibenzylbutanový lignan), ten je dále oxidován za vzniku matairesinolu (dibenzylbutyrolaktonový lignan). Konverze koniferyl
alkoholu
na
matainoresinol
je
považována
za
hlavní
lignanovou
biosyntetickou dráhu, ze které posléze vznikají další skupiny lignanů (Umezawa a Suzuki, 2007). Lignany Schisandra chinensis patří do skupiny dibenzocyklooktadienů, tedy nemají kyslík v pozici 9(9'). U takových lignanů nejsou kroky biosyntézy následující po tvorbě monolignolů prostudovány v takové míře jako u lignanů s kyslíkem v pozici 9(9'). Na 31
základě podobnosti mezi fylogenetickou distribucí rostlin produkující lignany bez 9(9') kyslíku a rostlin produkujících alylfenoly a propenylfenoly jako eugenol, safrol a anetol, které nemají kyslík na C9 se uvažuje, že
lignany bez
9(9') kyslíku mohou být
formovány párováním právě takových fenylpropropanoidů jako je isoeugenol či eugenol. Eugenol je rostlinami vytvářen z koniferyl či kumaryl alkoholu. Hlavní biosyntetickou dráhou vzniku eugenolu z koniferyl alkoholu je prostřednictvím koniferyl acetátu. Koniferyl acetát dále podléhá redukci, kterou katalyzuje jeden z enzymů ze skupiny NAD(P)H reduktáz. U Petunia hybrida dochází ke konverzi na isoeugenol, u Ocimum basilicum ke konverzi na eugenol, popřípadě chavikol (Umezawa a Suzuki, 2007). Koeduka et al.(2009) uvádí, že u Pimpinella anisum je substrátem pro reduktázu nejen koniferyl acetát, ale též kumaryl acetát a vytváří se isoeugenol a t-anol.
Obr. 6: Schéma biosyntézy některých lignanů (Slanina, 2000; upraveno)
Jak již bylo výše zmíněno, dimerizace monolignolových jednotek je pod striktní enantioselektivní kontrolou. Rozhodujícím prvkem, který ovlivňuje vznik jen určitých stereospecifických forem lignanů, je usměrnění biosyntézy řídícím proteinem (dirigent protein). Tento názor vznikl právě proto, aby bylo možné vysvětlit situaci, že oxidací vzniklé radikály produkují jen omezené stereoformy a nikoliv všechny možné formy. Spoluúčast řídícího proteinu umožnila nejen vysvětlit tento jev, ale i jeho experimentální potvrzení. Důkaz byl proveden tím, že za účasti takového proteinu 32
vznikl oxidativně vyvolanou radikálovou dimerizací jenom (+)-pinoresinol, kdežto bez účasti řídícího proteinu vznikl racemický pinoresinol a vedle něj i racemický dehydrodikoniferylalkohol a další neolignany. Řídící protein je tedy odpovědný nejen za stereostrukturu, ale i za samotný vznik lignanů. Jiné než lignanové spojení může být totiž důsledkem právě jen neřízených vazeb, jako např. u neolignanů nebo ligninu. Zatím není známo, jak řídící protein váže a orientuje substrát. Jeho součinnost však vysvětluje, proč vzniká jen omezené množství stereospecifických forem lignanů (Harmatha a Dinan, 2003). Poprvé byla aktivita řídícího proteinu pozorována u Forsythia intermedia. Zjistilo se, že řídící protein je dimer o přibližně 50 kDa složený z monomerů o 23-25 kDa (Umezawa a Suzuki, 2007). Davin et al. (2000) uvádějí že řídící protein a jeho homologové jsou přítomny u řady rostlin, například u: Forsythia sp., Pinus taeda, Thuja plicata, Tsuga heterophylla, Eucommia ulmoides, Fraxinus mandschurica, Populus tremuloides, Sesamum indicum, Oryza sativa, Arabidopsis, Schisandra chinensis, Larrea tridentata, Piper futokadsura, Linum usitatissimum a Nicotiana tabacum. Jak lignany, tak lignin jsou v rostlinách syntetizovány ze stejných prekurzorů, a to zejména z koniferyl alkoholu. Jejich základní odlišnost je v optické aktivitě. Lignany jsou opticky aktivní, naproti tomu lignin se skládá z řady podstruktur, každá z nich představuje rovnoměrné zastoupení jednotlivých enantiomerů. Biosyntéza lignanů je pod striktní enantioselektivní kontrolou, zatímco u ligninu tomu tak není (Umezawa a Suzuki, 2007). 2.2.2 Metody zvyšování produkce sekundárních metabolitů Explantátové kultury reprezentují možný obnovitelný zdroj cenných léčiv, aromat, barviv, které nemohou být produkovány mikroorganismy nebo být syntetizovány chemickou cestou. Nicméně jen malé množství explantátových kultur vytváří tyto látky v komerčně využitelných množstvích. Výzkumy v oblasti molekulární biologie, enzymologie, fyziologie a fermentačních technologií těchto kultur ukázaly, že mohou zaujmout své místo v získávání významných přírodních produktů. Bylo zjištěno několik typů explantátových kultur s velkým potenciálem. Zahrnují suspenzní buněčné kultury vhodné díky vysoké produktivitě a vysoké hustotě kultury, kultivaci specifických orgánů. Například pro metabolity syntetizované v kořenech je 33
vhodné použít kořenové kultury, zejména transformované tzv. „hairy root“ kultury. Určité anorganické a organické látky mohou stimulovat syntézu anebo akumulaci. Imobilizované buňky vykazují slibné zvýšení syntézy látek, nicméně jejich výhody mohou být využity pouze jestliže je produkt exkretován do média (DiCosmo a Misawa, 1995; Wink, 2010). Explantátové kultury produkují nižší množství a poněkud jiné zastoupení sekundárních metabolitů než intaktní rostliny. Pouze u několika kultur byla zaznamenána vyšší akumulace významných látek než u intaktních rostlin. Jsou to například: berberin produkovaný Coptis japonica, ginsenosidy u Panax ginseng, rozmarinová kyselina akumulovaná Coleus blumei a další. U většiny rostlin tomu tak ale není. Nízká výtěžnost látek může být vysvětlena aktivatizací a naopak represí specifických enzymů. Nicméně v tomto ohledu byl udělán prokazatelný krok kupředu. K tomu, aby bylo použití buněčných rostlinných kultur ekonomicky přijatelné, je důležité vyvinout metody, kterými budou produkovány stabilně vysoké výtěžky. Abychom získali dostatečnou koncentraci požadovaných metabolitů pro komerční využití, je potřeba stimulovat biosyntetickou aktivitu kultivovaných buněk za použití rozličných metod (DiCosmo a Misawa, 1995). 2.2.2.1 Selekce vysoce produktivních linií Je důležité, aby již rostlina, ze které bude odvozena explantátová kultura produkovala požadovaný metabolit v dostatečné míře. Explantátové kultury reprezentují heterogenní populaci, ve které jsou různé fyziologické charakteristiky jednotlivých buněk. Pro zvýšení obsahu sekundárních metabolitů by slibné mohly být zejména techniky založené na klonování buněk. Selekce může být jednoduše provedena pokud, je produkt zájmu rostlinným pigmentem (DiCosmo a Misawa, 1995; Ramachandra Rao a Ravishankar, 2002). 2.2.2.2 Optimalizace fyzikálně-chemických podmínek kultivace U různých druhů rostlin byly testovány vlivy několika chemických a fyzikálních faktorů na růst in vitro kultury. Mezi tyto parametry patří mezi jinými vliv: nutričních látek, fytohormonů, pH, teploty, O2, CO2, světla a způsobu kultivace (stacionární či pohybující se médium). K ovlivnění buněčného růstu a produkce sekundárních metabolitů je často 34
klíčová koncentrace látek sloužících jako zdroj uhlíku (DiCosmo a Misawa, 1995). Ramachandra Rao a Ravishankar (2002) dále jako důležité prvky zmiňují zdroje dusíku a fosforu, a to nejen jejich množství, ale i například poměr mezi amonnou a nitrátovou formou dusíku. Dalšími důležitými látkami jsou fytohormony. DiCosmo a Misawa (1995) uvádějí, že největší vliv na růst kultury a produkci rostlinných metabolitů mají fytohormony auxiny a cytokininy. Zvýšený obsah auxinů v médiu (např. 2,4-dichlofenoxyoctová kyselina) má za následek dediferenciaci buněk a sníženou akumulaci sekundárních metabolitů, proto je pro zvýšení syntézy látek vhodnější auxiny z média vynechat. Účinek cytokininů byl zaznamenám u buněčné linie Catharanthus roseus, který zapříčinil zvýšenou syntézu alkaloidů (DiCosmo a Misawa, 1995). 2.2.2.3 Přidání prekurzorů Přidání prekurzorů je další způsob, jak je možné zvýšit biosyntézu specifických sekundárních metabolitů. Například pro úspěšné získání vyšších množství tropanových alkaloidů byly do média suspenzní kultury přidány aminokyseliny. Prekurzory mohou být buď přímo inkorporovány do molekul produktů, nebo mohou ovlivnit syntézu nepřímo prostřednictvím degradačního metabolismu a vstupu do příbuzných biosyntetických drah. Pro optimální efekt je ale důležité načasování celého procesu. Pokud jsou do média přidávány látky, které buňky již produkují, je důležité uvážit možnost zpětnovazebné inhibice (DiCosmo a Misawa, 1995). 2.2.2.4 Permeabilizace V řadě případů jsou sekundární metabolity uskladněny ve vakuolách. Aby mohlo dojít k jejich uvolnění, musí být překonány dvě membránové bariéry: plazmatická membrána a tonoplast. enzymů
Permeabilita
primárního
buněk
metabolismu:
může
být
monitorována
hexokinázy,
měřením
aktivity
glukosa-6-fosfát-dehydrogenázy,
izocitrátdehydrogenázy, malát a citrátsyntetázy. V pokusech jak dočasně změnit permeabilitu membrán aniž by byla narušena životnost buněk byla objevena řada organických činidel jako je izopropanol, dimetylsulfoxid a některé polysacharidy, dále
35
metody zahrnující ultrasonikaci, elektroporaci a další. V návaznosti na použití pulzů vysokého elektrického napětí a ultravysokého tlaku bylo zjištěna zvýšená produkce metabolitů (Ramachandra Rao a Ravishankar, 2002). 2.2.2.5 Imobilizace buněk Ve srovnání se suspenzními kulturami, mohou adherentní rostlinné buňky přinášet některé výhody, jako třeba větší viabilita buněk ve stacionární růstové fázi (kdy dochází k produkci metabolitů), umožnění udržení biomasy po delší dobu. Pokud jsou produkty sekretovány, je zjednodušené odnímání látek, jsou potřeba menší bioreaktory, a dochází k větší akumulaci produktu. Techniky používané pro imobilizaci rostlinných buněk jsou nejčastěji spojeny se zachycením buněk v gelu, pěně nebo membráně. Nevýhodou je snadná deformace gelů a pěn ve velkých bioreaktorech, nákladnost membránových systémů, vznik nežádoucích gradientů nutričních látek,
nesnadné uvolnění imobilizovaných buněk, zvýšený
hydrodynamický tlak v průtokových reaktorech a tendence rostoucích buněk během delší kultivace přetrhnout matrix. Tyto problémy jsou odstraněny při použití imobilizace pomocí adsorbce. Pro zachycení buněk v gelu se používá akrylamid, glutaraldehyd, karagenin, algináty. Pro získání alkaloidů se ukázal jako nadějný kalcium-alginátový gel. Tato metoda je vhodná pro nedělící se buňky v kapalném médiu chudém na živiny či hormony (DiCosmo a Misawa, 1995). S těmito technikami souvisí odebírání produktu in situ. Pokud nízkou výtěžnost způsobují zpětnovazebná inhibice, enzymatická nebo neenzymatická degradace produktu v médiu či produkce těkavých metabolitů, v takových případech může být vhodné přidání syntetických prvků (ať už pevného či kapalného skupenství) aby mohly metabolity akumulovat (Ramachandra Rao a Ravishankar, 2002). Mezi vhodné adsorbenty patří polymerní substráty a skleněná, uhlíková nebo keramická vlákna. Výhodou je lepší transport látek, jednodušší odebírání produktu, nižší náklady, schopnost buněčné populace růst ve velmi vysokých hustotách a tím dosáhnout vyššího výtěžku (DiCosmo a Misawa, 1995). Bohatcová (2008) zjistila pozitivní vliv na produkci metabolitů u Schisandra chinensis při použití polymerních pryskyřic, zejména nepolární polystyrenové pryskyřice XAD-2.
36
2.2.2.6 Genetická manipulace Díky molekulárně biologickým metodám je naše poznání regulačních genů v rostlinách a zejména genů zapojených v produkci sekundárních metabolitů za posledních 10 let o mnoho dál. Byla identifikována cDNA, řady genů, významné jsou také studie transkripčních faktorů a jejich úloh stejně jako funkce promotorů anebo jejich zesilovačů. Jako jednu z významných metod uvádí Wink (2010) techniku RNA-interference. Je to první krok k použití molekulárních metod k ovlivnění biosyntézy přírodních produktů. Jako nejčastější způsob transformace zmiňuje Wink (2010) introdukci genů pomocí Agrobacterium tumefaciens a Agrobacterium rhizogenes. Výhodou je, že není potřeba odvodit například suspenzní kulturu, které musejí být dodávány fytohormony, které mohou ovlivnit akumulaci sekundárních metabolitů. Jako příklad uvádí Wink (2010) zvýšení produkce alkaloidů přibližně o 40 % prostřednictvím vnesení genu kódujícího enzym pro produkci salutaridinu u tzv. „hairy root“ kultur u máku setého. 2.2.2.7 Elicitace O problematice elicitace bude podrobně pojednáno dále v textu.
37
2.3 Elicitace metabolických procesů 2.3.1 Úloha elicitace v intaktních rostlinách – obrana rostlin Podobně jako člověk a živočichové, i rostliny jsou napadány viry, bakteriemi, houbami a dalšími parazitickými organismy, které vyvolávají jejich onemocnění a stres. V průběhu koevoluce s parazity si rostliny vytvořily obranné mechanismy, které jim v mnoha případech zajišťují poměrnou odolnost vůči patogenům. 2.3.1.1 Kompatibilita a inkompatibilita K infekci rostliny fytopatogenními mikroorganismy dochází často prostřednictvím přirozených nebo umělých otvorů v rostlinném těle (stomaty, lenticelami, ranami). Již v této etapě dochází k specifickým interakcím mezi hostitelem a patogenem, které rozhodují o dalším průběhu patogeneze (Luštinec a Žárský, 2003). Velká část rostlin není většinou patogenů kolonizována a parazitována, tj. jsou nehostitelskými rostlinami pro tyto patogeny. Patogen není schopný překonat bariéry chránící rostliny. Tyto bariéry zajišťují základní rezistenci či základní (nespecifickou) inkompatibilitu rostliny (Prell a Day, 2001). Patogen sice může rostlinu infikovat, avšak před slabým projevem symptomů nebo po něm je ve svém růstu zabrzděn, popřípadě usmrcen. Tedy je rostlina proti avirulentímu vetřelci rezistentní. Jestliže je rostlina citlivá a patogen agresivní, dochází ke kompatibilní interakci a onemocnění je virulentní (Luštinec a Žárský, 2003). Základním předpokladem pro úspěšné napadení rostliny je produkce příslušných faktorů patogenity patogeny. Základní kompatibilita je na rozdíl od základní inkompatibility vysoce specifický fenomén týkající se části rostlinných druhů a odpovídajících druhů (či nižším taxonomickým jednotkám) patogenů. I když je rostlina s patogenem kompatibilní, začnou rostliny rozvíjet mechanismy obrany. Jsou dvě základní obranné strategie proti útoku patogenů, které mohou vyústit v rezistenci rostliny: •
hypersenzitivní reakce – je-li rostlina napadena avirulentním patogenem je lokální obranná reakce rychlejší a intenzívnější, rostlinné buňky velmi rychle nekrotizují spolu s okolním pletivem a tak oddělí patogen od zdroje výživy (Prell a Day, 2001; Campbell et al., 2007).
38
•
nehypersenzitivní reakce (normosenzitivní reakce) – rostlinné buňky přežívají napadení a indukují tvorbu nových obranných bariér de novo syntézou mRNA a proteinů. Je vyvolána v případě napadení rostliny virulentním patogenem, tedy takovým, proti kterému rostlina nemá genetickou rezistenci, vytváří se i v okolí pletiva nekrotizovaného vlivem hypersenzitivní reakce (Prell a Day, 2001; Campbell et al., 2007).
Obranná reakce aktivuje buď základní rezistenci (odolnost proti širokému spektru patogenů) nebo specifickou rezistenci (přímo proti určité rase patogenu). 2.3.1.2 Základní rezistence Základní rezistence může být pasivní nebo aktivní. Pasivní rezistence je založena na mechanismech obranné bariéry proti napadení. Tato bariéra je přítomná vždy. Jedná se o morfologickou charakteristiku kutikuly či přirozenou syntézu toxických látek. Jestliže je pasivní obrana rostliny překonána, je patogen konfrontován s aktivní základní rezistencí rostliny představující buněčné interakce mezi rostlinou a patogenem. Tyto interakce jsou neodmyslitelně spojeny s rozpoznáním patogenu rostlinou. Základní kompatibilita je výsledkem absence základní rezistence rostliny proti patogenu, tudíž rostlina slouží jako hostitel. Může být navozena několika způsoby: 1) patogen je necitlivý k rostlinným obraným mechanismům (je tolerantní k vysokým koncentracím antimikrobiálních látek produkovaných rostlinami nebo má vyvinutý mechanismus detoxifikace) 2) rostlina nespouští obrannou reakci, nedochází k rozpoznání 3) patogen suprimuje obranou reakci rostliny 4) patogen upravuje rostlinný metabolismus tak, že nemůže nastat obranná reakce (Prell a Day, 2001) 2.3.1.3 Rasově specifická rezistence Specifický elicitor pocházející z patogenu je přijat specifickým senzorem či receptorem umístěným ve většině případů na povrchu rostlinné buňky. (Elicitor odpovídá faktoru avirulence, zatímco senzor či receptor reprezentují faktory rezistence.) 39
Obr. 7: Schématické znázornění aktivní základní rezistence a rezistence rasově specifické (Prell a Day, 2001; upraveno)
2.3.1.4 Rozpoznání K interakcím mezi rostlinou a patogenem dochází prostřednictvím rozpoznání, spočívající ve vazbě signálů na receptory. Signál může být chemické či fyzikální povahy. Chemické signály jsou rostlinou rozpoznávány například v průběhu penetrace hostitelských buněčných stěn, kdy se patogen dostane do těsného kontaktu s plazmatickou membránou a řadou receptorů.
40
Rozpoznání mezi rostlinou a patogenem může zahrnovat dva stupně interakcí. V prvním stupni určitý patogen rozpoznává rostlinu jako hostitele a jestliže má odpovídající geny patogenity, může se stát parazitem rostliny. Pokud má však rostlina specifické geny rezistence vůči konkrétnímu patogenu, ustanoví se druhý stupeň, kdy rostlina rozpozná přítomnost napadajícího patogenu. Začne obranná reakce. Signálem může
být
hypersenzitivní
elicitor
spouštějící
hypersenzitivní
reakci
nebo
nehypersenzitivní elicitor spouštějící nehypersenzitivní reakci, jakou je syntéza fytoalexinů (Prell a Day, 2001). Rozpoznání mezi rostlinou a patogenem je charakteristické signál-receptorovými reakcemi skládajícími se ze tří složek: elicitoru, receptoru, a efektoru. Elicitor je nízkomolekulární látka, která je produkována přímo patogenem nebo vzniká jeho působením. Receptory specificky váží elicitory a efektory zahrnují všechny složky účastnící se signální transdukce spouštějící expresi obranných genů rostlin (Prell a Day, 2001). Mnoho elicitorů slouží jako faktory avirulence. Molekulární rozpoznání a fyzikální interakce mezi molekulami elicitorů a specifickými rostlinnými receptory jsou komplexní procesy a jsou nezbytné pro specifickou signální transdukci. Způsobením změn v konformaci receptoru nebo aktivací receptorových kináz elicitory nepřímo aktivují odpovídající efektory jako iontové kanály, G-proteiny, lipázy a kinázy, které transdukují signál elicitoru na obranné reakce (Zhao, 2005). Příjem signálu je prvním krokem. Bylo dokázáno, že u nespecifických elicitorů jsou přítomny stejné receptory pro zaznamenání signálu napříč různými rostlinnými druhy. Výzkumy také dokázaly přítomnost řady specifických receptorů elicitorů. Interakce mezi elicitorem a receptorem se vyznačuje vysokou afinitou, specifickou reverzibilní a saturovatelnou vazbou (Zhao, 2005). 2.3.1.5 Signální transdukce Po percepci signálu jsou aktivovány rostlinné receptory a následně dojde i k aktivaci efektorů. První reakce detekovatelné několik minut po rozpoznání patogenu jsou cytologické změny v napadené buňce – přesunutí jádra a cytoplazmy směrem k místu penetrace. To probíhá i v sousedních buňkách. Aktivované efektory přenášejí signály druhým poslům, které signál dále rozšiřují. Dochází k reverzibilní fosforylaci 41
a defosforylaci proteinů plazmatické membrány a cytozolických proteinů, k depolarizaci plazmatické membrány jak v rostlině, tak v patogenu (tím se zvýší permeabilita). Dále nastává vzestup hladiny cytozolických vápenatých iontů, efluxu Cl- a K+, influxu H+, extracelulární alkalizace a acidifikace cytoplazmy, aktivace NADPH oxidázy a produkce
aktivních
forem
kyslíku,
např.
superoxidových
aniontů
(O 2-),
perhydroxylových radikálů (HO2·), hydroxylových radikálů (HO·) a peroxidu vodíku, následovaná expresí časných obranných genů, zvýšenou produkcí ethylenu a jasmonátu, expresí genů pozdní obranné odpovědi a akumulací sekundárních metabolitů. Signální transdukce elicitoru je několikasložkový mechanismus s rozdílnými dílčími reakcemi, jehož cílem je navodit účinnou obranu. Jednotlivé složky mohou být paralelní nebo křížící se signální dráhy vedoucí k různým reakcím rostliny (Zhao, 2005; Prell a Day, 2001). Mezi složky procesu signální transdukce patří: •
GTP vazebné proteiny jsou skupinou eukaryotických proteinů zahrnujících heterotrimerické komplexy a monomerické malé G-proteiny. Heterotrimerické komplexy nejsou u rostlin tak důležité jako u savců, zato pro malé G-proteiny mají rostliny velký počet kopií genů. Kromě obranných reakcí rostlin jsou zapojeny i v procesech spojených s růstem a vývojem rostlin a hormonální signalizací. V obranných mechanismech se pravděpodobně párují s receptory aby zprostředkovaly elicitorový signál k efektorům, jako například iontovým kanálům a fosfolipázám.
•
Tok iontů - změna v toku iontů je okamžitá odpověď napadených rostlinných buněk. Objevuje se již 5 minut po aplikaci elicitorů. Nejdůležitějšími ionty jsou vápenaté ionty, které jsou klíčovými druhými posly při řadě fyziologických změn. Množství iontů a rychlost reakce se liší v závislosti na druhu elicitoru.
•
Salicylová kyselina je látka způsobující získanou systémovou rezistenci, ale není univerzálním stimulem pro produkci obranných metabolitů rostlin. V průběhu napadení patogenem se rychle akumuluje v místě infekce a hypersenzitivní reakce a rozšiřuje se do dalších částí rostliny aby
42
indukovala obrannou odpověď v širším rozmezí. Může navodit biosyntézu pouze těch sekundárních metabolitů, které nejsou bezprostředně spojeny s lokální reakcí rostlin. •
Oxid dusný spolu s aktivními formami kyslíku napomáhá vzniku rezistence. Indukuje některé geny signální transdukce spojené se stresem a napadením patogeny a některé obranné geny.
•
Jako důležitým signálem pro syntézu sekundárních metabolitů se ukazují jasmonová kyselina a její deriváty. Indukují syntézu řady různých sekundárních metabolitů jako jsou terpenoidy, flavonoidy, alkaloidy a fenylpropanoidy a mnohé další. Signální dráha jasmonové kyseliny je považována za obecnou cestu pro biosyntézu mnohých sekundárních produktů.
•
Ethylen je fytohormon zapojený v řadě rostlinných procesů, včetně obranných reakcí jak proti abiotickému tak biotickému stresu. Pro obrannou odpověď rostliny je spolu s kyselinou jasmonovou nezbytný, ale už nehraje tak důležitou roli v biosyntéze sekundárních metabolitů. Ve vysokých koncentracích může jejich biosyntézu i inhibovat (Zhao, 2005).
Zdá se, že ethylen a jasmonová kyselina jsou aktivovány po napadení nekrotrofními patogeny, zatímco salicylová kyselina souvisí s atakem biotrofních patogenů. Některé studie prokázaly, že ethylen s jasmonovou kyselinou a salicylová kyselina se vzájemně inhibují (Brugger, 2006). 2.3.1.6 Obranná reakce Proteiny obranné reakce vznikají de novo syntézou, nikoliv aktivací už existujících prekurzorů. Tyto proteiny se označují jako proteiny spojené s obranou. Jejich sekvence byly v mnoha případech identifikovány právě v souvislosti s jejich úlohou v obraně rostlin, ačkoliv, jak se později ukázalo, mnohé z nich jsou dočasně exprimovány během běžného vývoje rostlin. První skupina obranných proteinů se soustředí na zesílení, obnovení a změnu rostlinného apoplastu. Několik druhů proteinů je začleněno přímo do buněčné stěny (např. glykoproteiny bohaté na hydroxyprolin). Dále jsou to enzymy zapojené do de novo syntézy ligninu a suberinu – polymerů buněčné stěny a enzymy
43
stimulující syntézu oxidovaných fenolů. Druhou skupinou obranných proteinů jsou ty, které ovlivňují syntézu lektinů, thioninů a jiných antimikrobiálních látek. Mohou to být také amylázy, proteinázy a další (Prell a Day, 2001). Podskupina obranných proteinů jsou tzv. proteiny spojené s patogenezí (PR proteiny – pathogenesis related proteins). Nacházejí se u rostlin vykazujících specifickou rezistenci po infikaci různými fytopatogeny, nebo po působení biotických či abiotických elicitorů. Řada PR proteinů je lokalizována v buněčných stěnách a vakuolách. Jsou strukturně různorodou skupinou rostlinných proteinů, které jsou toxické pro houbové patogeny napadající rostliny. V rostlinách jsou rozšířeny v malých množstvích, ale jejich koncentrace se zvýší vlivem napadení patogeny či stresem. Různé části rostlinného těla mohou produkovat různé PR proteiny. Bylo identifikováno 17 různých rodin PR proteinů. Proteiny v rámci rodiny mají podobné vlastnosti: molekulovou hmotnost, serologické vlastnosti, sekvenci aminokyselin, enzymatické aktivity, pH a základní izoformy. Každá rodina je kódována několika geny. PR proteiny jsou buď velmi kyselé či velmi zásadité a proto jsou vysoce rozpustné a reaktivní. Z každého kulturního rostlinného druhu byly izolovány různé typy PR proteinů. Ačkoliv zdravé buňky obsahují jen stopová množství některých PR proteinů, infekce patogeny, ošetření elicitory, poranění nebo stres indukuje transkripci řady genů, které kódují PR proteiny. Stávají se součástí masivní změny v celkovém charakteru exprese, během které je produkce normálních proteinů téměř utlumena (Prell a Day, 2001; Agrios, 1997; Profotová, 2006). 2.3.1.7 Obranná reakce mimo místo napadení V sousedních buňkách vzniká normosenzitivní reakce, která je ustanovena mnohem později než reakce hypersenzitivní a vede k tvorbě nových obranných bariér. Zahrnuje zesílení buněčných stěn kalosou, vytvoření papil bránících průniku patogenu, zesílení kutikuly a další zesílení buněčné stěny. Tato obranná reakce je spojena s aktivací genů kódujících enzymy fenylpropanoidového metabolismu a genů kódujících syntézu dalších látek, jako jsou fytoalexiny. Fytoalexiny jsou nízkomolekulární antimikrobiální sloučeniny. Vznikají z fenolů, taninů, flavonoidů, terpenoidů nebo cyanogenních glukosidů. Jejich výskyt je detekovatelný několik hodin po rozpoznání patogenu rostlinou a při hypersenzitivní 44
reakci. Rostliny fytoalexiny syntetizují ve vysokých koncentracích. Většina fytoalexinů působí v širokém rozmení pH a teploty a jejich antibiotické aktivity jsou nespecifické. Syntéza fytoalexinů je typická pro dvouděložné rostliny. Následně jsou produkty zahrnuté v obranné reakci systematicky rozšířeny po celé rostlině. Takto se ale nerozšiřují přímo enzymy, ale signální látky indukující jejich syntézu. Tento jev je označován jako systémová získaná rezistence nebo indukovaná rezistence (Prell a Day, 2001). Získaná systémová rezistence Získaná systémová rezistence (systemic acquired resistance – SAR) je jev, kdy obranná odpověď rostliny není omezená jen na její pletiva, která jsou v přímém kontaktu s patogenem. Rezistentní se v průběhu několika dní stávají také pletiva, která s patogenem nepřišla do styku. K aktivaci získané systémové rezistence dochází v řadě dvouděložných rostlin. Byla však prokázána i u rostlin jednoděložných (Ryals, 1996; Lee et al., 1995; Luštinec a Žárský, 2003; Agrios, 1997). Působí na široké spektrum patogenů (Pieterse et al., 2002), ale nikoliv na všechny. U tabáku byla dokázána rezistence vůči 7 z 9 tabákových patogenů (Ryals, 1996). Jako zprostředkovatele systémové signalizace uvádějí autoři Hedden a Thomas (2006) metylsalicylát, těkavý metabolit kyseliny salicylové. Ukázalo se, že metylsalicylát indukuje rezistenci nejen v nenapadených částech rostliny, ale v sousedních rostlinách. Ale ne u všech rostlin je za vznik získané systémové rezistence odpovědná salicylová kyselina. Například u viru květákové mozaiky u Arabidopsis thaliana se v signalizaci v souvislosti s infekcí zapojují reaktivní kyslíkové radikály a ethylen, ale nikoliv kyselina salicylová (Love et al., 2005). Také rezistence vůči Botrytis cinerea u Arabidopsis thaliana na ní není závislá. Za indukci obranné odpovědi jsou v tomto případě zodpovědné oligogalakturonidy (Ferrari et al., 2007). Indukovaná systémová rezistence Rostliny, jejichž kořeny jsou kolonizovány specifickými kmeny nepatogenní Pseudomonas spp. vyvíjejí fenotypově podobnou obranu jako je získaná systémová rezistence. Je to rhizobakteriemi podnícená indukovaná systémová rezistence – ISR, která také indukuje rezistenci k hmyzu. Rhizobakterie vyvolávají reakci nezpůsobující
45
nekrózy tak, že signální dráha peroxidu vodíku, který indukuje syntézu kyseliny salicylové, může fungovat v lokální rezistenci, ale nemůže se vyskytnout v případě indukované systémové rezistence. Kromě toho ne vždy rezistence koreluje s produkcí PR proteinů. Funkce je obvykle spojena s dráhou kyseliny jasmonové a ethylenu, vedoucí k tvorbě defenzinů a inhibitorů proteáz. Zdá se, že tento typ odolnosti je odlišný od získané systémové rezistence (Věchet a Burketová, 2007; Pieterse, 2002). 2.3.2 Elicitory Termín elicitor byl poprvé použit k popsání molekul, které jsou schopny elicitovat produkci fytoalexinů. Nyní se tento termín používá pro faktory elicitující jakékoliv obranné látky. V širším slova smyslu zahrnují elicitory impulzy z různých zdrojů, které mohou navodit fyziologickou a morfologickou reakci a akumulaci fytoalexinu. Mohou to být abiotické elicitory jako jsou ionty kovů a elicitory biotické původem z hub, bakterií, virů nebo herbivorů, komponenty rostlinných buněčných stěn, stejně jako látky uvolňované rostlinami při napadení patogeny či herbivory. Pokud jsou to látky patogenního původu nazývají se exogenní nebo mikrobiální elicitory, pokud jsou to látky uvolňované rostlinami jako následek napadení patogeny označujeme je jako endogenní elicitory či elicitory hostitelských buněk. V užším slova smyslu se setkáme s elicitory pouze jako s fragmenty komponentů buněčných stěn rostlin a hub, bakteriálními, virovými či herbivorními látkami, či jejich syntetickými analogy s elicitační aktivitou (Vidhyasekaran, 2008; Zhao, 2005). Biotické elicitory mají buď definované složení, kdy jsou známy jejich molekulární struktury nebo mají složení komplexní, kdy se skládají z několika různých součástí tak, že je nemožné jejich konkrétní chemickou povahu postihnout. Abiotické elicitory můžeme rozřadit do skupiny fyzikálních faktorů nebo chemických látek nebiologické povahy (Vasconsuelo a Boland, 2007). Jejich příklady jsou uvedeny v tabulce 2.
46
ELICITOR biotický
abiotický
definované složení
komplexní složení
chemické látky
fyzikální faktory
chitosan
homogenát z hub
ortovanadát sodný
teplotní stres
alginát
kvasinkový extrakt
vanydylsulfát
osmotický stres
pektin
spóry hub
soli těžkých kovů
UV záření
chitin
poranění
elicitiny Tab. 2: Některé elicitory (Vasconsuelo a Boland, 2007; upraveno)
Mikrobiální elicitory mohou být podle rozsahu napadaných rostlin klasifikovány do dvou skupin: na nespecifické a specifické elicitory. Nespecifické elicitory spouštějí obranou reakci v hostitelských i nehostitelských rostlinách. Naproti tomu specifické elicitory indukují obranné odpovědi vedoucí k rezistenci proti patogenům pouze ve specifických hostitelských kultivarech. Specifické elicitory jsou zapojeny v signálních procesech modulovaných prostřednictvím genů rezistence, zatímco nespecifické elicitory mohou zaujímat část v signální dráze základní rezistence. Mohou být produkovány nekrotrofními, hemibiotrofními i biotrofními patogeny. Molekuly elicitorů byly zaznamenány i v některých saprofytech a kvasinkách (Vidhyasekaran, 2008). Je známo, že ošetření rostlin elicitory, nebo napadení inkompatibilními patogeny způsobí řadu obranných reakcí včetně akumulace řady sekundárních metabolitů, spojených s obranou rostlin. Elicitory jsou z hlediska rostlinných patogenů determinanty avirulence (Zhao, 2005). Po chemické stránce patří mezi nejdůležitější elicitory oligosacharidy, dále oligogalakturonidy, proteiny a molekuly derivované z lipidů (Prell a Day 2001).
47
2.3.2.1 Oligosacharidy Oligosacharidy byly první lépe popsané elicitory. Byly identifikovány čtyři hlavní skupiny oligosacharidů, které se chovají jako elicitory: oligoglukany, oligochitiny, oligochitosany ze sacharidů pocházejících z patogenu a oligogalakturonidy jako sacharidy původem z rostliny. β-glukany jsou hlavní komponenty buněčných stěn řady hub. Ebel a Mithöfer (1998) uvádějí jako příklad rozvětvený (1,3-1,6)-hepta-β-glukosid, který je nejmenší molekulou oligoglukosidu schopnou elicitace. Byl izolovaný ze stěny mycelií Phytophthora sojae po enzymatické hydrolýze. Chitin je lineární polymer tvořený 1,4-spojenými jednotkami N-acetyl-β-glukosaminu, hlavní polysacharid buněčných stěn většiny vyšších hub. Je to nerozpustný polymer, ale pokud dojde k jeho degradaci rostlinnými chitinázami, jeho fragmenty mohou sloužit jako elicitory. Bylo zjištěno, že minimální počet jednotek schopný vyvolat biologickou aktivitu jsou čtyři. U rostlin, které jsou necitlivé k chitinu, jako jsou hrách, petržel, rajče nebo barvínek růžový se ukázaly jako biologicky aktivní fragmenty chitosanu – deacetylovaného chitinu. Oligogalakturonidy jsou během napadení patogeny uvolňovány pravděpodobně z homogalakturonanu, pektinového polysacharidu složeného ze zbytků α-D-galaktosaminu a uronové kyseliny spojených 1,4-vazbou, které představují významné komponenty buněčných stěn vyšších rostlin a mohou být endogenními elicitory. Řada rostlin rozpoznává oligogalakturonidy s 8-15 zbytky uronové kyseliny jako signální látky, které se účastní obranné reakce, ale i při vývojových procesech či poranění (Ebel a Mithöfer, 1998). 2.3.2.2 Glykopeptidy, glykoproteiny, peptidy a proteiny Byla izolována řada bílkovinných elicitorů vykazující rozdílný stupeň specifity. V některých případech to mohou být glykopeptidy, glykoproteiny nebo volné N-vázané oligosacharidy odvozené z glykoproteinů. Kromě látek obsahujících v molekule sacharidovou složku, mohou jako elicitory sloužit i peptidy nebo proteiny samotné. Takovými elicitory jsou například složky, které slouží jako elicitory v nehostitelských
48
rostlinách, například harpiny, skupina proteinů sekretovaná z fytopatogenních gramnegativních
bakterií nebo elicitiny,
produkované některými
patogenními
oomycetami (Ebel a Mithöfer, 1998). Elicitiny Elicitiny jsou elicitory, produkované patogenními oomycetami rodu Phytophthora a některými zástupci rodu Pythium. Jsou to vysoce konzervované malé proteiny (>60% sekvencí je identických). Aplikace elicitinů na senzitivní rostliny vede k typické obranné odpovědi jakou je hypersenzitivní reakce, produkce fytoalexinů, exprese PR proteinů, a následný vznik získané systémové rezistence. Indukce hypersenzitivní reakce a získané systémové rezistence elicitiny byla pozorována u většiny druhů rodu Nicotiana, v některých kultivarech Brassica rapa a Raphanus. Takemoto et al.(2005) zařazují elicitiny na pomezí mezi nespecifické a specifické elicitory. Usuzují tak z toho, že elicitiny z různých druhů rodu Phytophthora obvykle indukují hypersenzitivní reakci u stejných rostlin (Takemoto et al., 2005; Svozilová et al., 2009). Jsou to malé (10kDa) hydrofilní holoproteiny obsahující 98 aminokyselin. Jsou klasifikovány do dvou tříd: α-elicitiny (kyselé; pI=3-5) a β-elicitiny (zásadité; pI=7-9). V primární struktuře proteinů chybí tryptofanová, histidinová a argininová rezidua, některých aminokyselin mají zato větší množství. Konkrétně serinu a treoninu (které reprezentují přibližně 30% složení), o něco méně zastoupeného alaninu (více než 10%) a leucinu (10%). Šest cysteinových zbytků se vyskytuje v konzervovaných pozicích a umožňují vznik třem disulfidickým můstkům (Ponchet et al., 1999). Pro biologickou funkci elicitinů je nezbytná hydrofóbní kapsa. Oomycety - druhy rodů Phytophthora a Pythium nesyntetizují steroly. Proto si je musí brát z hostitelských rostlin. Strukturně jsou elicitiny podobné proteinům transportujícím lipidy a přenašečům sterolů, ačkoliv jejich primární struktura je od nich odlišná. Díky hydrofóbní kapse jsou schopny vázat steroly a mastné kyseliny. Nevykazují ani proteázovou, β-glukanázovou, nebo fosfolipázovou ani jinou enzymatickou aktivitu. (Mikeš et al., 1998; Ponchet et al., 1999; Svozilová et al., 2009). K objasnění biologické role hydrofóbní kapsy vázající steroly byla u kryptogeinu získána série mutantů se změněnou schopností vázat steroly a mastné kyseliny. Výsledky ukázaly, že elicitiny mohou aktivovat dvě signální dráhy.
49
První vede k oxidativnímu vzplanutí a změnám pH v závislosti na konformaci ω smyčky. U druhé vedoucí k expresi PR proteinů a nekróze hraje roli celková struktura proteinů a náboj (Svozilová et al., 2009). Kapsicein Kapsicein je α-elicitin. Tři disulfidické můstky jsou zodpovědné za značnou stabilitu. Je to protein o 10,161 kDa a pI 3,5. Sekundární struktura je charakteristická pěti helixy a strukturou skládaného listu. Čtyři helixy jsou antiparalelní, jeden je paralelní ke struktuře skládaného listu (Bouaziz, 1994). Kim et al. (2010) identifikovali protein interagující s kapsiceinem. Ten je homologní k rostlinným RLK (receptor like protein kinase) z Nicotiana glutinosa. RLK jsou ne příliš časté membránové proteinkinázy s domělou extracelulární, transmembránovou a proteinkinázovou doménou (Kim et al., 2010). Kapsicein je asi 100krát méně toxický než zástupci β-elicitinů, ale také působí už v malých množstvích (Bouaziz et al., 1994). Kryptogein Kryptogein je jeden z velmi studovaných zásaditých elicitinů (Svozilová et al., 2009). Je to globulární protein obsahující pět helixů, malý antibaralelní beta-skládaný list a ω smyčku. Všechny tyto struktury jsou spojeny disulfidickými a vodíkovými můstky (Ponchet et al., 1999). Kryptogein interaguje s vysokou afinitou s vazebnými místy na plazmatické membráně tabáku. Jeho receptor je glykosylovaný heterodimerický protein. Percepce je následována aktivací proteinkináz, nebo inhibicí proteinfosfatáz, což má za následek influx vápenatých iontů. V prvních pěti minutách po elicitaci vykazuje téměř 20 fosfoproteinů zvýšenou fosforylaci. Extracelulární influx Ca2+, závislý na aktivaci proteinkináz, spouští produkci aktivních forem kyslíku, dále se zvýší produkce NO, dojde k změnám v toku K+ a Cl-, depolarizaci plazmatické membrány, inhibici příjmu glukosy a depolimerizaci mikrotubulů. Influx Ca2+ může vést i k inhibici H+-ATPáz a okyselení cytosolu. Naměřeny byly změny v genové expresi, ve složení lipidů, produkci ethylenu a fytoalexinů (Brugger, 2006; Svozilová et al., 2009).
50
Obr. 8: Struktura kryptogeinu (Ponchet et al., 1999; upraveno)
2.3.2.3 Lipidy Gen avirulence může být odpovědný nejen za proteinový elicitor, ale i za elicitor jiného chemického charakteru. Jako následek exprese avrD u Phytophthora syringae pv. Tomato bylo zjištěno, že extracelulární produkty, nízkomolekulární C-glykosylované lipidy zvané syringolidy 1 a 2, jejichž syntéza je řízena tímto genem spouštějí hypersenzitivní reakci (Ebel a Mithöfer, 1998). Jako významné lipidové elicitory zmiňují Kašparovský et al. (2003) ergosterol, alkanoly, alkan-1,3-dioly, některé hydroxymastné kyseliny, chitosan, a některé nesaturované mastné kyseliny. Ergosterol Také ergosterol u buněčné suspenze tabáku spouští fyziologické změny typické pro obrannou odpověď, ale probíhající procesy se poněkud liší. Ergosterol způsobuje změny pH v extracelulárním prostoru, oxidativní vzplanutí a syntézu fytoalexinů. Ve srovnání se změnami aktivovanými působením kryptogeinu byla akumulace fytoalexinů vyšší, zatímco změny pH byly méně znatelné. U kryptogeinu dochází k masivnímu odčerpávání vápenatých iontů odpovědných za zesílení buněčné stěny z média. Zatímco u ergosterolu dochází ke stejnému efektu prostřednictvím mobilizace buněčných zásob. Obecně se vápenaté kanály vyskytují v plazmatické membráně, v tonoplastu,
51
v membráně endoplazmatického retikula, jaderné či plastidové membráně. Ergosterol na rozdíl od kryptogeinu neovlivňuje vápenaté kanály nacházející se v plazmatické membráně. Použitím inhibitorů vápenatých kanálů a inhibitorů proteinkináz bylo zjištěno, že elicitace
ergosterolem
zahrnuje
mobilizaci
vnitřích
vápníkových
rezerv
zprostředkovanou 1,4,5-trifosfátem a serinovými/treoninovými proteinkinázami na rozdíl od kryptogeinu, který interaguje s receptory umístěnými na povrchu plazmatické membrány. Přidáním ergosterolu k tabákovým buňkám dojde k tvorbě aktivních forem kyslíku odpovídající asi 10-50 μM H2O2. Tato koncentrace je mnohem nižší než u kryptogeinu, ale přesto je z fyziologického hlediska velmi významná. Zapojení vápenatých kanálů do signální kaskády zahrnuje jiné mechanismy než jaké jsou u kryptogeinu. Gradient pH může vznikat několika způsoby. Acidifikace cytosolu může způsobena oxidací NADPH a odčerpáváním protonů enzymem superoxid dismutázou vedoucí k alkalizaci extracelulárního média. Inhibice nebo aktivace H+-ATPáz jako jeden z důsledků elicitace může také přispívat ke změnám pH (Kašparovský, 2003). Z pokusů vyplývá, že pro zaznamenání ergosterolu buňkami je nezbytná dvojná vazba v B kruhu a boční řetězec ergosterolu pro specifickou vazbu na předpokládaný receptor (Kašparovský, 2003). Rozdíly mezi mechanismy působení kryptegeinu a ergosterolu jsou shrnuty v tab. 3.
kryptogein
ergosterol
nižší
vyšší
znatelnější
méně znatelné
zdroj zvýšeného množství cytosolického Ca2+
extracelulární Ca2+
vnitřní rezervy
produkce aktivních forem kyslíku
vyšší
nižší
částečná závislost
minimální závislost
akumulace fytoalexinu změny pH
závislost oxidativního vzplanutí na odčerpávání H+
Tab. 3: Rozdíly v biologické aktivitě způsobené kryptogeinem a ergosterolem (čerpáno z Kašparovský, 2003)
52
2.3.2.4 Signální molekuly Kyselina jasmonová Kyselina jasmonová a její ester metyljasmonát vznikají rozkladem linolenové kyseliny. Slouží jako sekundární poslové, kteří modulují několik fyziologických procesů v rostlinách, včetně vývoje kořenů, při senescenci a při obranných reakcích rostlin proti napadení patogeny či herbivory. Spouštějí či podporují syntézu řady sekundárních metabolitů. V těchto procesech je velmi důležitý komplex kyselina jasmonováisoleucin, který selektivně reguluje proteolýzu proteinů schopných blokovat účinek transkripčních faktorů aktivujících geny zodpovědné za tvorbu jasmonové kyseliny. Jasmonová kyselina je jeden z často využívaných elicitorů (Yendo, 2010). Kyselina salicylová V rostlinách se vyskytuje salicylová kyselina ve dvou
formách, a to jako volná
a konjugovaná. Konjugované formy v rostlinných pletivech zahrnují metylsalicyláty, glukosidové estery a sloučeniny s aminokyselinami (Vasyukova a Ozeretskovskaya, 2007). Lee et al. (1995) uvádí tyto konkrétní deriváty, se kterými se můžeme u rostlin setkat: 2-O-β-D-glykosid, který je převládajcícím derivátem kyseliny salicylové, 2,5-dihydroxybenzoová kyselina, 2,3-dihydroxybenzoová kyselina, metylsalicylát a glukosový ester kyseliny salicylové. Upozorňuje také, že konjugace může hrát roli při detoxikaci salicylové kyseliny. Salicylová kyselina byla v řadě experimentů použita jako elicitor pro indukci syntézy sekundárních metabolitů. Například Karwasara et al. (2010) uvádějí, že salicylová kyselina v 10 µM koncentraci je jedním z elicitorů, který zvýšil obsah glycyrrhizinu u buněčné kultury Glycyrrhiza glabra. 2.3.3 Faktory ovlivňující elicitaci u explantátových kultur Efektivita elicitace jako zdroj pro zvýšení produkce sekundárních metabolitů závisí na interakci mezi elicitorem a rostlinnou buňkou. Některé hlavní faktory, který tento proces mohou ovlivnit jsou popsány dále. Není překvapením, že jeden elicitor může stimulovat sekundární metabolismus v různých explantátových kulturách a na druhou stranu určitá kultura může být citlivá na řadu elicitorů. Každá in vitro kultura má svoje specifika. 53
Důležité je také zvolit správnou koncentraci elicitoru. Je to jeden z faktorů, který ovlivňuje intenzitu reakce velmi silně. Správná dávka elicitoru pro daný rostlinný druh může být zjištěna jedině empiricky. Vasconsuelo a Boland (2007) jako příklad uvádějí rozdíl mezi účinnou dávkou chitosanu u in vitro kultury Rubia akane Nakai, kdy pro produkci antrachinou byla nejúčinnější koncentrace 20 mg/l, zatímco u Mentha piperita byla ideální koncentrace pro zvýšení syntézy mentholu 10krát vyšší. Doba, po kterou elicitace trvá se také uvádí jako významná. Dalším faktorem, který je potřeba uvážit, je načasování. Jako nejlepší fáze pro přidání elicitoru bývá uváděna exponenciální fáze růstu kultury. V té je enzymatický aparát nejúčinnější a reakce na elicitor je nejefektivnější (Vasconsuelo a Boland, 2007). Výsledek může ovlivnit i přítomnost růstových regulátorů v médiu. Například u explantátové kultury mrkve kultivované na médiu bez obsahu auxinu, nedošlo k reakci na elicitory. Významnou úlohu hrají světelné podmínky. Bylo zjištěno, že syntéza hypericinu zvýšená jasmonovou kyselinou u kultury Hypericum perforatum byla efektivnější pokud byla kultura kultivovaná ve tmě. Vasconsuelo a Boland (2007) také uvádějí, že další studie naopak zmiňují stimulaci produkce sekundárních metabolitů při kultivaci na světle.
54
3 CÍL PRÁCE 1. Prostudovat problematiku působení elicitorů v rostlinných biotechnologiích. 2. Prostudovat současné poznatky o biosyntéze lignanů, hlavních sekundárních metabolitů Schisandra chinensis. 3. Zpracovat literární přehled o Schisandra chinensis a jejích sekundárních metabolitech, využívaných v medicíně. 4. Analyzovat růstové reakce kultur pod vlivem různých elicitorů, vybraných na základě studia literatury. 5. Využít kyselinu salicylovou (SA) jako markeru reakce kultury na elicitor (stanovení SA bude provedeno na Masarykově univerzitě) 6. Porovnat vliv vybraných elicitorů na produkci hlavních lignanů (analýza bude prováděna na Masarykově univerzitě). 7. Výsledky zpracovat formou tabulek a grafů. 8. Na základě výsledků navrhnout optimální postup elicitace.
55
4 MATERIÁL A METODY 4.1 Rostlinný materiál Jako výchozí rostlinný materiál byly použity dva druhy kultur Schisandra chinensis TURCZ (BAILL.): kultury raných somatických embryí, odvozené ze zygotických embryí na ústavu Biologie rostlin Mendelovy univerzity v roce 2004, a kultury kalusové, které byly odvozeny již o rok dříve. K pokusu byly využity následující buněčné linie: •
IA1
•
IIIE3
•
IIIE5
•
LA19
kalusová kultura odvozená ze zygotických embryí
•
LSB
kalusová kultura odvozená z endospermu
kultury raných somatických embryí (odvození viz kap. 2.1.10.)
Obr. 9: Kultura raných somatických embryí Schisandra chinensis (Petriho miska=90 mm)
A
B
56
Obr. 10: Kalusová kultura Schisandra chinensis (A měřítko=1 mm; B měřítko=2 mm)
4.2 Patogenní organismy Pro
doplňkové
pokusy
bylo
jako
elicitoru
použito
usmrcených
mycelií
vřeckovýtrusného patogenu Aspergillus niger, získaných od Ing. Jany Víchové, Ph.D. z Ústavu pěstování, šlechtění rostlin a rostlinolékařství Mendelovy univerzity v Brně.
4.3 Chemikálie •
Benzylaminopurin (Sigma-Aldrich; USA)
•
2,4-dichlorfenoxyoctová kyselina (Sigma-Aldrich; USA)
•
Westvaco WV 5 médium (Duchefa Biochemie; Nizozemí)
•
Sacharosa (Lachema; ČR)
•
salicylová kyselina (Sigma-Aldrich; USA)
•
L-glutamin (Duchefa Biochemie; Nizozemí)
•
Phytagel (Duchefa Biochemie; Nizozemí)
•
kryptogein (Ústav biochemie, Masarykova univerzita; ČR)
•
kapsicein (Ústav biochemie, Masarykova univerzita; ČR)
•
ergosterol (Sigma-Aldrich; USA)
•
metyljasmonát (Sigma-Aldrich; USA)
•
hexan AC-chitosan (Seikagaku Co.; Japonsko)
•
laktát oligo-chitosan (Sigma-Aldrich; USA)
57
4.4 Metodika 4.4.1 multiplikace Nejprve bylo nutné namnožit kulturu tak, aby poskytla dostatek výchozího materiálu pro vlastní pokus. Multiplikace byla prováděna na médiu Westvaco 5 s přídavkem L-glutaminu, benzylaminopurinu a 2,4-dichlorfenoxyoctové kyseliny, zpevněném 0,25% Phytagelem. Pasážování probíhalo v třítýdenním intervalu. 4.4.1.1 Příprava kultivačního média K 1,447 g komerčně dodávaného média Westvaco WV 5, jehož složení je uvedeno v tab. 4, bylo přidáno 40 g sacharosy, 5 g phytagelu a vše bylo deionizovanou vodou doplněno na objem 200 ml. Kádinka s médiem se nechala přibližně 5 minut míchat na magnetické míchačce (Variomax). Pomocí 1M kyseliny chlorovodíkové a 1M hydroxidu sodného bylo upraveno pH roztoku, tak aby se pohybovalo v rozmezí 5,5 – 5,8 (pH-metr Schott CG 842). Médium bylo přelito do reagenční lahve a doplněno na objem 400 ml. Dále následovalo autoklavování (autokláv Tuttnauer, 3870 EA) při teplotě 130°C a tlaku 117 kPa po dobu 15 minut. Další složky média jsou termolabilní, proto je nelze vystavovat teplotám dosahovaných v autoklávu, ale volí se sterilizace přes bakteriologický filtr. My jsme použili bakteriologický filtr Whatman Puradisc 25 Syringe Filter o velikosti pórů 0,2 μm. Takto byly do chladnoucího média přidány tyto látky: L-glutamin (0,583 g), 2,4-dichlorfenoxyoctová kyselina (20 ml zásobního roztoku o koncentraci 1 μM/ml) a benzylaminopurin (8 ml zásobního roztoku o koncentraci 1 μM/ml). Následně bylo médium doplněno deionizovanou vodou na výsledný objem 2 l.
58
SLOŽKY MÉDIA
OBSAH [mg/l]
mikroelementy CoCl2.6H2O
0,025
CuSO4.5H2O
0,25
FeNaEDTA
36.71
H3BO3
31,00
Kl
0,83
MnSO4.H2O
15,16
Na2MoO4.2H2O
0,25
ZnSO4.7H2O
8,60
makroelementy CaCl2
452,88
KCl
718,67
KH2PO4
270,00
KNO3
1084.06
MgSO4
903,79
NH4NO3
700,00
vitamíny myo-inositol
1000,00
thiamin HCl
0,40 Tab.4: Složení média Westvaco WV 5
4.4.1.2 Pasážování Přibližně po třech týdnech kultura vyčerpala velkou část nutričních látek z média, a proto ji bylo potřeba přenést na médium čerstvé. Pasážování probíhalo v aseptickém prostředí laminárního boxu (Holten Lamin Air), který byl před počátkem práce vydezinfikován 70% ethanolem. K přenesení kultury na nové médium bylo použito sterilní pinzety a speciálně upravené lopatky. Nástroje byly během práce sterilizovány žíháním v plameni plynového kahanu. Kultura z každé Petriho misky byla podle svého nárůstu přenesena do jedné až dvou nových Petriho misek s WV 5 médiem a velmi 59
opatrně rozetřena lopatkou po celé ploše média, tak aby mohlo dojít k jejímu rovnoměrnému růstu. Okraje misek byly kvůli zabránění kontaminaci a nadměrnému výparu zapáskovány fólií. Kultivace probíhala v kutlivační místnosti ve tmě, při teplotě 23±2°C. 4.4.2 Předpokus Kultivační médium pro předpokus bylo připraveno obdobným způsobem, jako bylo uvedeno výše (kap. 4.4.1.1). Rozdíl spočíval v absenci Phytagelu a v přidání jednotlivých elicitorů, konkrétně kryptogeinu a kapsiceinu. V přísně sterilních podmínkách v prostředí laminárního boxu (Holten Lamin Air) bylo do 2ml mikrozkumavek Eppendorf naváženo 50 mg kultury a napipetováno 1 ml média WV 5. Takto byly založeny varianty s 25nM a 50nM kryptogeinem; 0,65nM, 1,25nM a 2,5nM kapsiceinem. Kromě kontrolního vzorku byly založeny ještě další dvě kontrolní varianty a to se 100 mg kultury a 1 ml kultivačního média a se 100 mg kultury a 0,5 ml média. Mikrozkumavky byly umístěny do kultivační místnosti na rotátor Biosan Bio RS-24. Rotátor zajišťoval promíchávání média. Kultivace probíhala při teplotě 23±2°C a fotoperiodě 16 hodin po dobu 7 dnů. V průběhu této doby byla hustota kultury měřena na DEN-1 denzitometru (Biosan), aby se zjistil její nárůst. Na
závěr
tohoto
pokusu
byla
zjištěna
životnost
buněk
barvením
fluoresceindiacetátem (FDA) a propidium jodidem (PI). 50 μl promíchaného vzorku bylo smícháno s 10 μl PI a po nějaké době i s 3 μl FDA. FDA je esterázami buněk štěpen na kyselinu octovou a fluorescein způsobující zelené zbarvení živých buněk. PI proniká přes plazmatickou membránu mrtvých buněk a zbarvuje je červeně. Preparáty byly pozorovány fluorescenčním mikroskopem (Olympus IX 70 ). 4.4.3 Elicitační experimenty 4.4.3.1 Příprava kultivačního média Pro experimenty bylo použito tekuté kultivační médium Westvaco WV 5, které bylo připraveno obdobným způsobem jako bylo uvedeno výše (kap. 4.4.1.1). Aby bylo médium v tekutém stavu, nebyl do něj přidáván Phytagel. Pro vlastní pokusy bylo použito nejprve média WV 5 bez přídavku elicitorů, které bylo po 21 dnech nahrazeno stejným médiem, ovšem s již přidanými elicitory. 60
Kryptogein a kapsicein U kryptogeinu a kapsiceinu jsme obdrželi zásobní roztok (mgr. T. Kašparovský Ph.D.) o neznámé koncentraci. Pro účely pokusu byla koncentrace zjištěna změřením absorbance při 265 nm na přístroji Secomam - Anthelie a následným výpočtem dosazením do Lambert-Beerova zákona, podle něhož: A= ε · c · d kde A = absorbance látky ε = molární absorpční koeficient c = koncentraci látky d = tloušťka absorbující vrstvy Po zjištění koncentrace byl připraven zásobní roztok kryptogeinu a kapsiceinu, který byl sterilizován přes bakteriologický filtr (Whatman Puradisc 25 Syringe Filter, velikost pórů 0,2μm) a poté použit v dalších pokusech. Koncentrace kryptogeinu byla použita 10x nižší než u kapsiceinu.Vycházeli jsme z toho, že u α-elicitinů, kam kapsicein patří, je fyziologická aktivita nižší než u β-elicitinů, kam můžeme zahrnout například kryptogein (Bouaziz et al., 1994). Na základě literatury jsme kombinovali elicitor kryptogein s ergosterolem, abychom vyloučili negativní působení kryptogeinu vyvázáním sterolů (viz kapitola 2.3.2.2). Pro zjištění elicitačního vlivu samotného ergosterolu následovaly další pokusy. Ergosterol Ergosterol byl rozpuštěn v 1 ml methanolu, který se posléze téměř nechal odpařit. Jelikož byl pro rozpuštění použit právě methanol, roztok ergosterolu už nebylo potřeba dále sterilizovat. Koncentrace ergosterolu mírně převyšovala koncentraci kryptogeinu. Aspergillus niger Již narostlá mycelia patogenní ascomycety Aspergillus niger jsme získali od Ing. J. Víchové, Ph.D. z Mendelovy univerzity. Aspergillus byl umístěný na médiu v Erlenmeyerově baňce. Aby nedošlo ke kontaminaci laboratoře, byl nejprve autoklavován (autokláv Tuttnauer, 3870 EA) při teplotě 130°C a tlaku 117 kPa po dobu
61
15 minut. Poté byla usmrcená mycelia důkladně promyta destilovanou vodou, kvůli odstranění média, a přefiltrována. Po usušení byla v třecí misce homogenizována na jemný prášek. Tento prášek byl poté přidán do tekutého média WV 5 v takovém množství, aby vznikla požadovaná koncentrace. Použili jsme 3 koncentrace, a to: 50 mg; 100 mg a 200 mg homogenizovaného mycelia na 1 l. Chitosan Byly použity 2 druhy chitosanu: hexan AC-chitosan od firmy Seikagaku Co. (Japonsko) a laktát oligo-chitosan od firmy Sigma-Aldrich (USA). Do média se přidávaly v koncentraci 10 mg/l. Metyljasmonát Methyljasmonát (Sigma Aldrich) byl použit v koncentraci 50 µM (v jednom pokusu doplňkově i 100 µM) a přidáván po filtraci přes bakteriologický filtr. 4.4.3.2 Založení pokusu Do kultivačních nádob Vitro Vent (Duchefa) byla položena buničitá vata (Hartmann) o rozměrech 5,5 x 7 cm. Krabičky byly zavřeny víčky a autoklavovány při teplotě 130°C, tlaku 117 kPa po dobu 15 minut (autokláv Tuttnauer, 3870 EA). Poté byly do krabiček v laminárním boxu (Holten Lamin Air) umístěny již sterilní plastové Petriho misky o průměru 5 cm, které sloužily jako podklad pro vytvoření můstku z buničité vaty. Do krabiček bylo přidáno 25 ml tekutého kultivačního média, nyní ještě bez přidaných elicitorů, připraveného podle návodu zmíněného výše. Na buničinu byl odvážen 1 g kultury Schisandra chinensis raných somatických embryí linií IA1, IIIE1 nebo IIIE5 či kalusové kultury La19, popřípadě LSB. Kultury byly dosud kultivovány v Petriho miskách na stejném médiu, ovšem zpevněném phytagelem. Vše bylo prováděno ve sterilním prostředí laminárního boxu. Kultura byla v krabičkách kultivována po dobu 21 dní při teplotě 23±2°C a světelných podmínkách dle varianty experimentu, jelikož byl u některých vzorků zkoumán vliv světla na elicitaci kultury. Subkultivací bez přidaných elicitorů se snížila pravděpodobnost kontaminace, protože kontaminované krabičky mohly být odchyceny ještě před začátkem vlastního pokusu 62
s elicitory. Tímto postupem byl také eliminován vliv různé schopnosti kultur přizpůsobit se novému prostředí a následná reakce kultury na různé elicitory byla dána jen jejich působením. Po 21 dnech, kdy bylo kultivační médium kulturou značně odčerpáno proběhlo založení vlastního pokusu. Do kultivačních krabiček s kulturou umístěnou na buničité vatě bylo dodáno 20 ml média, již s jednotlivými elicitory. 4.4.3.3 Vliv světla na elicitaci Byl založen i pokus pro určení vlivu světla na úspěšnost elicitace. Varianty experimentu byly čtyři. U prvních dvou byly nádoby s kulturou umístěny do kultivační místnosti (teplota 23±2°C), kde byly kultivovány na světle, přičemž u jedné varianty (snížené světlo) byly nádoby přikryty filtračním papírem. Nádoby třetí varianty byly přeneseny taktéž do kultivační místnosti, ale byly kultivovány ve tmě. Čtvrtá varianta byla založena pro zjištění vlivu UV záření. V tomto případě byly nádoby umístěny do laboratoře s laminárními boxy do vzdálenosti 1 m od germicidní výbojky Sylvania G 30W (Japonsko), která se zapínala pouze přes noc. 4.4.3.4 Vyhodnocení Po uplynutí 28 dnů kultivace na médiu s přídavkem elicitorů (celkem 49 dnů) byl pokus vyhodnocen. Byla zvážena čerstvá hmotnost kultury s přesností na tři desetinná místa (váha APX-153, Denver instrument; USA), přičemž od každé varianty byl odebrán vzorek o hmotnosti přibližně 0,5 g pro analýzu volné a vázané salicylové kyseliny (analýza probíhala na Ústavu biochemie MU). Vzorky pro tuto analýzu byly až do předání uchovávány v hlubokomrazícím boxu. Zbytek vzorků byl lyofilizován a do předání na analýzu lignanů byl uložen do mrazničky při -20°C.
4.4.4 Analýza lignanů Analýza lignanů byla provedena Mgr. Jiřím Slaninou, Ph.D. na Ústavu biochemie Lékařské fakulty Masarykovy univerzity v Brně.
63
4.4.4.1 Příprava vzorků – extrakce methanolem Lyofilizované vzorky byly na ústavu biochemie znovu převáženy a do 25 ml Erlenmeyerových baněk bylo naváženo 50 mg a hmotnost byla zaznamenána. Vzorky byly dále extrahovány 5 ml methanolu na třepačce při 250 ot/min a 47°C 3 hodiny. Následovalo jejich přefiltrování a opětovná extrakce methanolem nejprve znovu 3 hodiny a po následující filtraci 6 hodin při stejných podmínkách jako výše. Filtrační papír byl vypláchnut přibližně 2 ml methanolu. Poté byly vzorky odpařeny v digestoři na vodní lázni a hmotnost odparku byla zaznamenána. 4.4.4.2 Extrakce na pevnou fázi Pro extrakci na pevnou fázi bylo použito kolon Strata C18-E (Phoenomenex), které byly umístěny na SPE manifold (SPE 12-Position Vacuum Manifold Set - Complete ea; Phoenomenex). Kolony byly nejprve aktivovány promytím 1 ml čistého methanolu a poté 2 ml deionizované vody. Ve chvíli, kdy se hladina vody dostala k povrchu absorbční vrstvy, byl aplikován vzorek, který byl rozpuštěn v 10% methanolu a chvíli sonikován (Ultrasonic compact cleaner PS 02000A; Powersonic). Dále byla Erlenmeyerova baňka vymyta 1 ml 40% methanolu a roztok byl převeden přes kolonu. Březinová (2009) zjistila, že v žádné z těchto frakcí se nenacházejí lignany, proto není potřeba je na výstupu z kolony jímat. Do předem zvážených Erlenmeyerových baněk byl jímán až eluát po přidání 100% methanolu, celkem 2 ml, což představuje dostatečné množství rozpouštědla pro získání veškerých lignanů. Eluát byl odpařen na vodní lázni v digestoři a hmotnost odparku byla zaznamenána. 4.4.4.3 HPLC-UV K odparku bylo napipetováno 150 μl methanolu a vzniklý roztok byl přepipetován do mikrozkumavek. Následovala centrifugace při 6000 ot/s po dobu 2 minut. 60 μl roztoku bylo přeneseno do nové mikrozkumavky a bylo přidáno 40 μl deionizované vody. Pro účely analýzy bylo odebráno pouze 20 μl z takto vzniklého roztoku.
64
Pro kvantitativní analýzu majoritních lignanů byla zvolena vysokoúčinná kapalinová chromatografie na reverzní fázi s UV-detekcí (RP- HPLC-UV). Jako mobilní fáze sloužil 50% acetonitril, kolona byla použita monolitická Chromolith Performance RP 18e, 100 x 4,6 mm. Vlnová délka pro detekci byla nastavena na 220 nm (viz Březinová, 2009).
4.4.5 Analýza kyseliny salicylové Analýza kyseliny salicylové byla provedena na Ústavu biochemie Masarykovy univerzity Mgr. Tomášem Kašparovským, Ph.D. 4.4.5.1 Příprava vzorků Vzorky byly homogenizovány v tekutém dusíku a rozpuštěny v 3 ml 90% methanolu. Aby mohla proběhnout analýza pomocí HPLC bylo potřeba dodat vnitřní standard, jako který sloužilo 250 ng o-anýzové kyseliny. Vzorky byly vortexovány, 15 minut sonikovány (Bandelin sonicator) a poté centrifugovány při 2000g po dobu 20 minut. Supernatant byl odebrán a pelety byly reextrahovány 3 ml 90% methanolu. Poté bylo přidáno ke každému vzorku 500 μl 100mM octanového pufru o pH=5,2. Proběhla dvouminutová sonikace na Bandelin sonikátoru na 20% výkon. Bylo přidáno 40 jednotek β-glukosidázy (Fluka), vzorky byly lehce promíchány a inkubovány při 37°C po dobu 90 minut. Následně byly přidáno 2,5 ml 5% trichloroctové kyseliny, byla zopakována sonikace za stejných podmínek jako výše a vzorky byly centrifugovány 15 minut při 1800g. Supernatant byl extrahován 2,5 ml směsi etylacetátu a cyklopentanu v poměru 1:1. Každý vzorek byl resuspendován v 200μl 20% methanolu a před samotnou HPLC analýzou byl vortexován (viz Lochman a Mikeš; 2006). 4.4.5.2 Analýza pomocí HPLC Analýza salicylové kyseliny probíhala za pomoci chromatografického systému HP1100. Bylo použito reverzně fázové kolony LC-18-DB (Supelco) při 25°C s gradientem mobilní fáze jíž bylo rozpouštědlo A (80% acetonitril a 2% octová kyselina) a rozpouštědlo B (2% octová kyselina). Kolona byla napuštěna rozpouštědlem B. Průtok
65
byl nastaven na 1 ml za minutu. Salicylová kyselina byla separována gradientově. V 0.-5. minutě bylo použito 0-6,2% rozpouštědlo A, v 5.-25. minutě 6,2-31,2% rozpouštědlo A a v 25.-30. minutě 31,2-100% rozpouštědlo A. Analyty byly detekovány fluorescenčním detektorem. O-anýzová kyselina byla detekována při 360 nm a kyselina salicylová při 407 nm. Nastřikováno bylo vždy 30 μl resuspendovaného vzorku (viz Lochman a Mikeš; 2006).
66
5 VÝSLEDKY A DISKUZE 5.1 Předpokus Byl sledován vliv elicitorů kryptegeinu a kapsiceinu na růstovou křivku u kultury IA1 kultivované po dobu 7 dnů na rotátoru Biosan Bio RS-24. Nárůst byl vyhodnocován měřením hustoty suspenze buněk. Z grafu 1 vyplývá, že asi 10% buněk kontroly ve stresových podmínkách, které pro ně pokus představoval, po třech a více dnech od založení pokusu odumřelo. Všechny ostatní varianty byly přidanými elicitory částečně stimulovány a vykázaly mírný nárůst hmotnosti. Nejvyšší stimulace růstu byla zaznamenána u varianty s přidaným 50nM kapsiceinem (CAP) v kultivačním médiu, jejíž maximum bylo po třech dnech kultivace. CAP indukoval intenzivní fyziologickou reakci doprovázenou počátečním nárůstem buněk. Při barvení pro zjištění životnosti se ale ukázalo, že téměř všechny buňky byly po 7 dnech již mrtvé (viz obr. 11). U většiny variant
byly zaznamenány velké odchylky (konfidence) mezi
jednotlivými opakováními. U variant s 2,5nM kryptogeinem (CR) reagovaly kultury nejméně vyrovnaně. Tato koncentrace je již natolik vysoká, že některé buňky v jejich růstu inhibuje, jiné zase stimuluje, přičemž rozdíly jsou větší než u nižších koncentrací. 125 120
nárůst hustoty [%]
115 110
K
105
0,65nM CR. 1,25nM CR.
100
2,5 nM CR. 25 nM CAP.
95
50 nM CAP.
90 85 80 2 dny
3 dny
4 dny
7 dnů
graf 1: růstová křivka předpokusu na rotátoru – linie IA1
67
A
B
C
D
Obr. 11: Stanovení životnosti pomocí barvení FDA+PI. A: 25nM koncentrace kapsiceinu. B: 50nM koncentrace kapsiceinu, C: kontrola, D: 1,25nM koncentrace kryptegein.
5.2 Vlastní experiment 5.2.1 Vliv biotických elicitorů Bylo vybráno několik biotických elicitorů, jejichž vliv byl testován. V několika pokusech byl zjištěn efekt elicitace pomocí metyljasmonátu (MeJA), kryptogeinu (CR) (kombinovaného s ergosterolem), kapsiceinu (CAP), ergosterolu (ERG), chitosanu (CHIT) a jako zástupce biotických elicitorů s komplexním složením byla zvolena mycelia patogenu Aspergillus niger.
68
5.2.1.1 Metyljasmonát Největší důraz byl kladen na experimenty s MeJA, jelikož jej v řadě prací můžeme najít jako úspěšný elicitor pro in vitro kultury i intaktní rostliny u mnoha druhů. Z grafu 1 je zřejmé, že na přídavek MeJA linie nereagovaly změnou rychlosti růstu. Výjimkou je ale linie IIIE1, u které byl zjištěn statisticky významný nárůst čerstvé hmotnosti oproti kontrole. U embryogenní suspenze Eleutherococcus sessiliflorus kultivované v bioreaktorech zjistili Shohael et al. (2008) jako optimální pro růst a produkci metabolitů koncentraci 200µM MeJA. U koncentrace 50µM MeJA ani 100µM MeJA kterou jsme použili i my také nepozorovali nárůst hmotnosti kultury oproti kontrolní variantě, ale zato tyto koncentrace podporovaly zvýšenou produkci sekundárních metabolitů, a to přibližně 2krát a 3krát. K velmi podobných výsledkům dospěli i Harisaranraj et al. (2009) u somatických embryí Rauwolfia serpentina. 9
9
8
8
7
7
6
6
5
5
4
4
3
3
2
2
1
1
0
0 kontrola
MeJa
Erg
erg+crypt
IIIE5K 1
cap
IIIE5 MeJA 1
IIIE1 K 1
IIIE1 MeJA 1
9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 LA19 K
LA19 MeJa
lsb K1
lsb Meja
graf 2: vliv vybrané linie kultury na růstovou křivku (vlevo nahoře linie IA1; vpravo nahoře linie IIIE1 a IIIE5; dole neembryogenní linie)
69
5.2.1.2 Aspergillus niger Vystavení in vitro kultury Schisandra chinensis tomuto biotickému elicitoru nemá na růstovou křivku vliv, jak vyplývá z grafu 3. Kaffková (2009) zkoumala u Schisandra chinensis vliv jiného patogenního organismu, Agrobacterium tumefaciens, taktéž na linii IA1 a zjistila, že ten tento patogen působil na její růst spíše inhibičně, a to o 10-40 % oproti kontrole. 9
hmotnost kultury [g]
8 7 6 5 4 3 2 1 0 IA1K
IA1MeJA
IA1 A.niger
graf 3: vliv Aspergillus niger na hmotnost kultury
5.2.1.3 Kapsicein, kryptogein, ergosterol Pod vlivem žádného z těchto elicitorů nedošlo k statisticky významnému nárůstu kultury oproti kontrolním vzorkům. 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 k
cap
erg
erg+krg
50MeJA
100MeJA
graf 4: vliv elicitorů na hmotnost kultury IA1
70
Chit1
Chit2
5.2.1.4 Chitosan V pokusech byl zkoumán vliv dvou druhů chitosanů: hexan AC-chitosan od firmy Seikagaku Co. (Japonsko) označený jako Chit 1 a laktát oligo-chitosan od firmy SigmaAldrich (USA) označený jako Chit 2. Z hlediska nárůstu hmotnosti nebyli mezi jednotlivými preparáty zaznamenány statisticky průkazné rozdíly. Mezi kontrolní variantou a variantou ovlivněnou laktát oligo-chitosanem byla patrná mírná inhibice růstu (graf 4). Oproti tomu u suspenzní kultury Cistanche desertiocola elicitovaných chitosanem zjistili Cheng et al. (2006) jeho pozitivní vliv na růst buněk, jejichž nárůst byl 3,4krát vyšší než u kontrolní varianty bez elicitace. Kromě pozitivního ovlivnění růstu kultury došlo také k zvýšené akumulaci sekundárních metabolitů prostřednictvím zvýšení aktivity enzymu fenylalaninamoniumlyázy, což je enzym zapojený i do biosyntézy ligananů. Bohužel v našem případě byla kultura ve stádiu, kdy nebyly žádné lignany produkovány. 5.2.2 Výběr linií Z grafu 5, kde jsou srovnávány kontrolní varianty a varianty s přidaným MeJA v médiu u různých linií kultury Schisandra chinensis je patrné, že výběr správné linie je velmi důležitý, protože rozdíly mohou být značné. Jelikož linie reagují odlišně, lze předpokládat, že mohou mít různou schopnost produkce sekundárních metabolitů. Kontrolní varianta kalusové buněčné linie La19 nejen že nevykázala žádný nárůst, ale dokonce byla po skončení pokusu zjištěna hmotnost nižší než byla startovací, na rozdíl od druhé kalusové kultury LSB. U té se na konci experimentu pohybovala hmotnost průměrně okolo šestinásobku počáteční hodnoty, i když se kultura nechovala příliš vyrovnaně, jak je patrné z velké odchylky (konfidence). Ani u embryogenních linií IA1, IIIE1 a IIIE5 nebyl nárůst příliš razantní. Po 7 týdnech kultivace došlo pouze ke zdvojnásobení až ztrojnásobení hmotnosti kultur. Tato hodnota není maximum limitované uspořádáním pokusu, jak je vidět u varianty s přidaným MeJA u kultury IIIE1.
71
V bakalářské práci jsem zjistila, že u linie IIIE1 v rozmezí 21-35 dnů kultivace se hmotnost jednotlivých kultur u kontrolní varianty pohybovala okolo 2 g, bez další tendence nárůstu (Šlancarová, 2008), což bylo pozorováno i nyní. 9 8
hmotnost kultury [g]
7 6 5 4 3 2 1 LSB MeJA
La19 MeJA
IIIE5 MeJA
IIIE1 MeJA
IA1 MeJA
LSB K
La19 K
IIIE5 K
IIIE1 K
IA1 K
0
graf 5: rozdílné chování jednotlivých linií
5.2.3 sezónní vlivy Při porovnání hmotnosti kultury u kontroly a u varianty s přidaným MeJA v dřívějších a pozdějších experimentech je vidět, že datum založení pokusu má také velký vliv. U dřívějšího experimentu (duben 2009) byla v závěru zjištěna 2,97násobná čerstvá hmotnost v případě kontroly a 2,57násobná hmotnost, zatímco u pozdějšího experimentu (červenec 2009) nedošlo k žádnému nárůstu, ale kultura byla naopak mírně inhibovaná. Kaffková (2009) zjistila u kultury IA1 kultivované podobným způsobem jako v našem případě, tedy ve stejných kultivačních nádobách s Petriho miskami a můstky z buničité vaty, ale s 75 ml kultivačního média a 0,5 g startovací hmotnosti kultury, byl po šesti týdnech kultivace průměrný nárůst čerstvé hmotnosti na 2,35 g, což představuje přibližně 4,7násobek původní hmotnosti. Při zopakování experimentu přibližně za 2 měsíce ale zjistila průměrný nárůst už jen na 0,63 g, tedy o pouhý 1,3násobek startovací hmotnosti kultury.
72
9 8
hmotnost kultury [g]
7 6 5
14.4.2009
4
23.7.2009
3 2 1 0 IA1 K
IA1 MeJA
graf 6: sezónní vlivy chování kultury IA1
5.2.4 Vliv světla Vasconsuelo a Boland (2007) Uvádějí, že k ovlivnění elicitace může dojít pod vlivem různé světelné intenzity. Proto byly založeny pokusy pro potvrzení nebo vyvrácení této teorie u in vitro kultury Schisandra chinensis. Například Walker et al. (2002) pozorovali u kultury Hypericum perforatum dramatický nárůst hmotnosti buněk a produkci hypericinu pokud byla kultura ovlivněná jasmonovou kyselinou. Pokud byly kultury kultivovány ve tmě, byly růst i produkce hypericinu vyšší než v případě kultivace na světle. Byl zjišťován efekt snížené světelné intenzity, kultivace ve tmě a růst ovlivněný 8h kultivací pod UV zářením. Při porovnání vlivu tmy a sníženého světla se jinak chovaly kultury ovlivněné elicitorem chitosanem a jinak kultury ovlivněné kryptogeinem s ergosterolem. V prvním případě nebyl vliv kultivace na různých světelných podmínkách zaznamenán, pouze u kontroly byla hmotnost při kultivaci ve tmě nižší, u varianty s přidaným chitosanem k ovlivnění růstu nedošlo. V druhém případě byl zjištěn pozitivní vliv na buněčný růst při kultivaci za tmy. Tento rozdíl může být způsoben delší dobou kultivace. Ta byla v případě zjišťování vlivu světla na elicitaci ergosterolem a kryptogeinem prodloužena na 65 dní oproti původním 49 dnům.
73
9 8
hmotnost kultury [g]
7 6 5
tma snížené světlo
4 3 2 1 0 IA1 K
IA1 chit 1
IA1 chit 2
graf 7: vliv kultivace na světle a ve tmě na hmotnost kultury 9 8
hmotnost kultury [g]
7 6 5
světlo
4
snížené světlo
3
tma
2 1 0 IA1 K
IA1 ERG
IA1 ERG+CR
graf 8: vliv kultivace na světle, při snížené intenzitě světla a ve tmě na hmotnost kultury
Jako faktor brzdící růst kultury se logicky ukázalo být UV záření, které ale ovlivnilo kontrolní vzorky i vzorky s MeJA stejným způsobem. Kultury si v tomto případě zachovaly startovací hmotnost, tedy inhibice nebyla natolik vysoká, aby způsobila odumření kultury. Holley et al. (2003) zjišťovali vliv UV-B záření na signální dráhy pod vlivem elicitoru systeminu a oligosacharidových elicitorů (mimo jiné i chitosanu) u suspenzní kultury Lycopersicon peruvianum. Zjistili, že při předošetření elicitory a následném vystavení UV-B záření dochází k snížení odpovědi buněk prostřednictvím mitogenem
74
aktivovaných protein kináz, ale pokud byly vynechány elicitory, způsobí UV záření zvýšenou odpověď mitogenem aktivovaných protein kináz a tedy intenzivnější obrannou reakci. Tomu odpovídá i výsledek analýzy salicylové kyseliny (SA) u našeho experimentu, který ukázal, že u varianty s MeJA pod vlivem UV je množství SA přibližně 2krát nižší, což značí menší obrannou odpověď kultur ovlivněných MeJA, než u kontrolních vzorků. 9 8
hmotnost kultury [g]
7 6 5
světlo
4
snížené světlo
3
UV záření
2 1 0 IA1 k
IA1 MeJA
graf 9: porovnání vlivu světla, sníženého světla a UV záření na hmotnost kultury
5.2.5 Analýza lignanů Pomocí HPLC nebyly detekovány ve vzorcích žádné lignany, respektive jejich množství byla pod hladinou stanovitelnosti. Jako mez stanovitelnosti použité metody uvádí Březinová (2009) množství 1,2 ng schisandrinu, 1,5 ng gomisin A, 7 ng deoxyschizandrinu, 9 ng γ-schisandrinu a gomisinu N a 13 ng u wuweizisu C. Žádné lignany nebyly detekovány ani u kontrol, což ukazuje na fakt, že jednotlivé linie schisandry ztratily schopnost produkovat lignany. Totéž zjistila i Kaffková (2009), která zkoumala vliv Agrobacterium tumefaciens na jejich produkci u linie IA1, ale negativní výsledek si vysvětlovala tím, že pro tento patogen není schisandra hostitelskou rostlinou.
75
Ztrátu schopnosti produkce sekundárních metabolitů pozorovali i Qu et al. (2005) u dlouhodobého pokusu se suspenzní kulturou Vitis vinifera L. var. Gamay Fréaux. V průběhu 33 pasáží (přes 231 dní) bylo zaznamenáno snížení akumulace antokyanů až o 84%. Výchozí kultury pro naše pokusy byly odvozeny již v roce 2004, respektive v roce 2003 u kalusových linií, a přibližně každé tři týdny byla kultura pasážována. Některé linie musely být z pokusů vyřazeny, protože nejenže přestaly produkovat metabolity, ale došlo i k jejich odumírání. Tesaříková (2009) zjistila, že u linie LAT 10 bylo zastoupení mrtvých buněk přibližně 90%. 5.2.6 Analýza salicylové kyseliny (SA) Byl analyzován obsah celkové SA ve vzorcích. Tato SA se skládala z 10 % z volné SA a z 90 % z vázané SA. 900 800
obsah SA [ng/g FW]
700 600 500 400 300 200 100 LA19 MeJA
LA19 K
LSB MeJA
LSB K
IIIE5 MeJA
IIIE5 K
IIIE1 MeJA
IIIE1 K
IA1 CAP
IA1ERG
IA1ERG+CR
IA1 MeJA
IA1 K
0
graf 10: obsah SA při kultivaci na světle
U variant s přidaným MeJA v médiu byl zaznamenán u všech linií jen velmi mírný nárůst SA oproti kontrole. Odlišně se chovaly kalusové kultury. Pouze u kultury LSB obsah SA v kontrole několikrát převyšoval její obsah u vzorku s MeJA. To může být způsobeno endogenní kontaminací těchto kultur, která je pod vlivem MeJA potlačena spouštěnou obrannou reakcí. U linie La19 byl zaznamenán 2,7krát vyšší obsah SA
76
u varianty s MeJA než u kotroly. Při opakování tohoto pokusu byly v tomto případě zjištěny opačné výsledky, kdy obsah SA u kontroly dvojnásobně převyšoval obsah SA u varianty s MeJA. Zde se pravděpodobně uplatnily sezónní vlivy. Pokud porovnáme graf nárůst kultury s obsahem SA u variant kultivovaných na světle nebo pod vlivem UV, zjistíme, že u varianta s Aspergillus niger vykazuje mírně zvýšený obsah SA proti kontrole, což odpovídá obranné reakci vyvolané usmrcenými patogeny. U kontroly vystavené UV záření je obsah SA přibližně dvojnásobný. Což dokládá, že UV záření indukuje akumulaci SA. Už Yalpani et al. (1994) zaznamenali, že rostliny, konkrétně rostliny tabáku reagují na UV záření podobně jako na napadení patogeny, tedy akumulací SA. Nejvyšší akumulace SA byla zjištěna u kalusových kultur LSB a LA19, a to jak u kontrol, tak u variant s MeJA. Zajímavá je linie IIIE1, u které je při kultivaci na světle nárůst buněk u kontroly i MeJA stejný, ale rozdíl v akumulaci SA je 8násobný. 900 800 700 500 400 300 200 100
graf 11: obsah SA pro kultivaci na světle a UV
77
LA19MeJA
LA19K
LSB29/2MeJA
LSB29/2K
IIIE1MeJa
IIIE1K
IA1MeJAUV
IA1KUV
IA1MeJA
IA1-1A.niger
0 IA1K
obsah SA [ng/g FW]
600
9 8 7 6 5 4 3 2 1 LA19MeJA
LA19K
LSB29/2MeJA
LSB29/2K
IIIE1MeJa
IIIE1K
IA1MeJAUV
IA1KUV
IA1-1A.niger
IA1MeJA
IA1K
0
900
900
800
800
700
700
obsah SA [ng/g FW]
obsah SA [ng/g FW]
graf 12: růstová křivka pro kultivaci na světle a UV
600 500 400 300 200 100
600 500 400 300 200 100 0
0 IA1 ERG+CR
IA1 ERG
cap
IA1 K
IA1K
Chit2 Chit1
50MeJA 100MeJA
graf 13: obsah SA u kryptogeinu a ergosterolu (tma) a kapsiceinu, chitosanu 1, chitosanu 2 a MeJA (snížené světlo)
U analýzy SA byl potvrzen rozdíl mezi elicitací vlivem hexan AC-chitosanu (Chit 1) a laktát oligo-chitosanu (Chit 2). Druhý jmenovaný akumuloval v buňkách SA v 3krát vyšším množství. Elicitor ergosterol ve všech pokusech koreloval se sníženým množstvím endogenní SA. U analýzy SA u variant s přidaným kapsiceinem, kryptogeinem či ergosterolem nebylo zjištěno zvýšené množství SA. Kultura na tyto elicitory nereagovala ani změnou rychlosti růstu. Může to být způsobeno tím, že schisandra pravděpodobně nemá receptory pro příjem těchto patogenních faktorů. Jak již bylo zmíněno v kap. 2.3.2.2, 78
indukce hypersenzitivní reakce a získané systémové rezistence elicitiny byla zatím pozorována u většiny druhů rodu Nicotiana, v některých kultivarech Brassica rapa a Raphanus (Takemoto et al., 2005). Schisandra tedy pravděpodobně nepatří mezi druhy ovlivnitelné těmito elicitory.
79
6 ZÁVĚR Cílem mé diplomové práce bylo především nalézt vhodný elicitor, který by podporoval syntézu lignanů u Schisandra chinensis v in vitro podmínkách s výhledem na vhodnost metody pro aplikaci v praxi. Toto se bohužel nezdařilo, jelikož kultura přestala lignany zcela syntetizovat. Bylo zjištěno, že elicitiny kryptegein a kapsicein nejsou pro elicitaci Schisandra chinensis vhodné. Kultura pravděpodobně nemá potřebné receptory k rozpoznání těchto elicitorů. Naopak jako nadějný elicitor byl zjištěn metyljasmonát. Při jeho použití byl zaznamenán velký vliv zejména na linii IIIE1 a na neembryogenní kalusové linie LSB a La19. Ty vykazovaly také rychlejší nárůst buněk a ze všech linií nejvyšší akumulaci salicylové kyseliny. Zkoumali jsme, který ze dvou komerčně získaných chitosanů bude mít u in vitro kultury větší fyziologickou odezvu. Jako vhodnější se jeví laktát oligo-chitosanu, pod jehož vlivem docházelo k výraznější akumulaci salicylové kyseliny. Byl zaznamenán velký sezónní vliv na experimenty. V rozmezí 3 měsíců byl opakován pokus s metyljasmonátem jako elicitorem a zjistili jsme že rozdíl mezi hodnotami zjištěnými v prvním a druhém experimentu byly přibližně trojnásobné. Analýza salicylové kyseliny jako markeru rostlinného stresu se jeví jako vhodná metoda. Zejména pro patogenní elicitory. Použití UV záření jako abiotického elicitoru vedlo sice ke zbrždění nárůstu kultury, ale fyziologická odpověď kultury zaznamenaná prostřednictvím množství salicylové kyseliny byla patrná. Kombinací UV záření s použitím biotického elicitoru dochází k vzájemnému ovlivňování a celkově nižší fyziologické odpovědi, proto je vhodné použití UV už nekombinovat s biotickou elicitací. Bylo zjištěno, že pro elicitační pokusy u Schisandra chinensis je vhodnější kultivace na světle, než při snížených světelných podmínkách či dokonce ve tmě.
80
7 PŘEHLED LITERATURY 1. AGRIOS, G. N. Plant pathology. San Diego: Academic Press. 1997. 4. vydání. ISBN 0-12-044564-6. 635 str. 2. ANDO, V. - ČÍŽEK, H. - POTUŽÁK, M. - VALÍČEK, P. Léčivé rostliny tradiční čínské medicíny. SVÍTÁNÍ. Hradec Králové. 1998. 1.vyd. ISBN 8086198-01-4 3. BOHATCOVÁ, I. Biotechnologické aspekty produkce sekundárních mev in vitro kultuře klanoprašky čínské. Brno, 2008. 89 s. Diplomová práce. Agronomická fakulta Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně. 4. BOUAZIZ, S. - HEIJENOORT, C. V – GUITTET, E. - HUET, J. C. PERNOLLET, J. C. Resonance assignment, cysteine-pairing elucidation and secondary-structure determination of capsicein, an α-elicitin, by threedimensional 1H NMR. European Journal of Biochemistry. 1994. vol. 220, pp. 427-438. ISSN: 1432-1033 5. BŘEZINOVÁ, L. Izolace a analýza lignanů Schisandra chinensis. Brno, 2009. 116 s. Dizertační práce. Masarykova Univerzita. 6. BRUGGER, A.G. - LAMOTTE, O. - VANDELLE, E. - BOURQUE, S. LECOURIEUX, D. - POINSSOT, B. - WENDEHENNE, D. - PUGIN, A. Early Signaling Events Induced by Elicitors of Plant Defenses. Molecular PlantMicrobe Interactions. 2006. vol. 19, no. 7, pp. 711-724. ISSN: 0894-0282 7. CAMPBELL, N. A. - REECE, J. B. Biologie. první vydání. Brno: Computer Press, 2008. 1332 s. ISBN 80-251-1178-4. 8. CHENG, X. Y. - ZHOU, H.Y. - CUI, X. - NI, W. - LIU, C. Z. Improvement of phenylethanoid glycosides biosynthesis in Cistanche deserticola cell suspension cultures by chitosan elicitor. Journal of Biotechnology. 2006. Vol. 121, is. 2, pp. 253-260 9. CRAKER, Lyle E. - SIMON, James E. Herbs, Spices, and Medicinal Plants: Recent Advances in Botany, Horticulture, and Pharmacology. Binghamton: Food Products Press , 1989. 242 s. ISBN 1560228571. 10. CROTEAU, R. - KUTCHAN, T. M. - LEWIS, N. G. Natural Products (Secondary Metabolites). Biochemistry & Molecular Biology of Plants. Wiley. 2000. 1.ed., chaper 24, pp. 1250-1318 ISBN 0943088399 11. DAVIN, Laurence B. - LEWIS, Norman G. Dirigent Proteins and Dirigent Sites Explain the Mystery of Specificity of Radical Precursor Coupling in Lignan and Lignin Biosynthesis. Plant Physiology. 2000, Vol. 123, 2, s. 453-462. ISSN 15322548.
81
12. DENG, X. - CHEN, X. - CHENG, W. - SHEN, Z. - BI, K. Simultaneous LC-MS Quantification of 15 Lignans in Schisandra chinensis (Turcz.) Baill. Fruit. Chromatographia. 2008. vol. 67, pp.559-566. ISSN 1612-1112 13. DICOSMO, F. - MISAWA, M. Plant cell and tissue culture: alternatives for metabolite production. Biotechnology Advances. 1995. vol. 13, pp. 425-453. ISSN: 0734-9750 14. EBEL, Jürgen - MITHÖFER, Axel. Early events in the elicitation of plant defence Early events in the elicitation of plant defence. Planta. 1998, Vol. 206, 3, s. 335-348. ISSN 1432-2048. 15. FERRARI, S. - GALLETTI, R. - DENOUX, C. - DE LORENCO, G. AUSUBEL, F. M. - DEWDENEY, J. Resistance to Botrytis cinerea Induced in Arabidopsis by Elicitors Is Independent of Salicylic Acid, Ethylene, or Jasmonate Signaling But Requires phytoalexin deficient3. Plant Physiology. 2007. sv. 144, str. 367-379. ISSN 1532-2548. online 16. HANCKE, J. L. - BURGOS, R. A. - AHUMADA. F. Schisandra chinensis (Turcz.) Baill. Fitoterapia. sv. 70, č. 5, str. 451 – 471. ISSN: 0367-326x 17. HARISARANRAJ, R. - SURESH, K. - BABU, S. S. Production of Reserpine in Somatic Embryos of Rauwolfia serpentina Cultured in Bioreactors by the Induction of Elicitor (Methyl Jasmonate). Global Journal of Biotechnology and Biochemistry. 2009. Vol. 4, pp. 143-147. 18. HARMATHA, J. - DINAN, L. Biological activites of lignans and stilbenoids associated with plant-insect chemical interactions. Phytochemistry Reviews. 2003. vol. 2, pp. 321-330. ISSN 1568-7767 19. HARMATHA, J. Strukturní bohatství a biologický význam lignanů a jim příbuzných rostlinných fenylpropanoidů. Chemické listy. 2005. sv. 99, str. 622632. ISSN 1213-7103 20. HEDDEN, P. - THOMAS, S. G. Plant Hormone Signaling. Annual Plant Reviews, Vol. 24. Oxford: Blackwell Publishing. 2006. 348 p. ISBN: 1405138874 21. HEJDUK, J. Klanopraška čínská (Schisandra chinensis) – podivuhodná rostlina z Dálného východu. [online]. poslední aktualizace 7.11.2007 citováno 9.11. 2007. Dostupné z: http://www.pelargonie.cz 22. HLAVA, B. - VALÍČEK, P. Rady pěstitelům - Léčivé byliny. Aventinum nakladatelství, s.r.o. Praha. 2005. 2. vyd. ISBN 80-7151-249-4
82
23. HOLLEY, S. R. - YALAMANCHILI, R. D. - MOURA, D. S. - RYAN, C. A. STRATMANN, J. W. Convergence of Signaling Pathways Induced by Systemin, Oligosaccharide Elicitors, and Ultraviolet-B Radiation at the Level of MitogenActivated Protein Kinases in Lycopersicon peruvianum Suspension-Cultured Cells. Plant Physiology. 2003. Vol. 132, pp. 1728-1738. ISSN 1532-2548 24. HOLMBOM, B. - ECKERMAN, CH. - EKLUND, P. - HEMMING, J. NISULA, L. - REUNANEN, M. - SJÖHOLM, R. - SUNDBERG, K. - WILFÖR, S. Knots in trees – A new rich source of lignans. Phytochemistry Reviews. 2003. vol. 2, pp. 331-340. ISSN 1568-7767 25. HRIČOVSKÝ, I. - SMATANA, L. - JURČÁK, S. Menej známe ovocné a tonizujúce rastliny. Vyd. Zahrádka, ÚV SZZ, 1993. ISBN 80-7125-010-4 26. HUANG, S. X. - HAN, Q. B. - LEI, CH. - PU, J. X. - XIAO, W. L. - YU, J. L. YANG, L. M. - XU, H. X. - ZHENG, Y. T. - SUN, H. D. Isolation and characterization of miscellaneous terpenoids of Schisandra chinensis. Tetrahedron. 2008. vol. 64, pp 4260-4267. ISSN 0040-4020 27. IRITI, M. - FARAO, F. Climate Change and Crops. Ozone-Induced Changes in Plant Secondary Metabolism. Německo: Springer, 2009., s. 245-268. ISBN 9783-540-88246-6. 28. JABLONSKÝ, I. - BAJER, J. Rostliny pro posílení organismu a zdraví. Grada Publishing a. s. 2007. edice Česká zahrada – svazek 86, 104 s. ISBN 802471745X 29. KAFFKOVÁ, K. - Vliv elicitace mikroorganismy na produkc sekundárních metabolitů embryogenní kultury klanoprašky čínské in vitro. Lednice, 2009, 58 s. Bakalářská práce. Agronomická fakulta Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně. 30. KARWASARA, V. S. - JAIN, R. - TOMAR, P. - DIXIT, V. K. Elicitation as yield enhancement strategy for glycyrrhizin production by cell cultures of Abrus precatorius Linn. In Vitro Cellular & Developmental Biology – Plant. 2010. ISSN: 1475-2689 31. KAŠPAROVSKÝ, T. - MILAT, M. L. - HUMBERT, C. - BLEIN, J. P. - HAVEL, L. - MIKEŠ, V. Elicitation of tobacco cells with ergosterol activates a signal pathway including mobilization of internal calcium. Plant Physiology and Biochemistry. 2003. vol. 41, pp. 495-501. ISSN: 0981-9428 32. KIM, Y. T. - OH, J. - KIM, K. H. - UHM, J. Y. - LEE, B. M. Isolation and characterization of NgRLK1, a receptor-like kinase of Nicotiana glutinosa that interacts with the elicitin of Phytophthora capsici. Molecular Biology Reports. 2010. vol. 37, pp. 717-727. ISSN: 1573-4978 83
33. KOEDUKA, T. - BAIGA, T. J. - NOE, J. P. Biosynthesis of t-Anethole in Anise : Characterization of t-Anol/Isoeugenol Synthase and an O-Methyltransferase Specific for a C7-C8 Propenyl Side Chain. Plant Physiology. 2009, vol. 149, pp. 384-394. ISSN 1532-2548. 34. KRESÁNEK, J. Atlas liečivých rastlín a lesných plodov. Martin: Vydavateľstvo Osveta. 3. vyd. 1988. 400 s. 35. LEE, H. - LEÓN, J. - RASKIN, I. Biosynthesis and metabolism of salicylic acid.1995. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. sv. 92, p. 4076-4079. Colloquium Paper 36. LEE, K. H. - XIAO, Z. Lignans in treatment of cancer and other diseases. Phytochemistry Reviews. 2003. vol. 2, pp. 341-362. ISSN 1568-7767 37. LOCHMAN, J. - MIKEŠ, V. Ergosterol treatment leads to the expression of a specific set of defense-related genes in tobacco. Plant molecular biology. 2006. vol. 62, pp. 43-51. ISSN: 1573-5028 38. LOVE, J. - WOOK YUN, B. - LAVAL, V. - LOAKE, G. J. - MILNER, J. J. Cauliflower mosaic virus, a Compatible Pathogen of Arabidopsis, Engages Three Distinct Defense-Signaling Pathways and Activates Rapid Systemic Generation of Reactive Oxygen Species. Plant Physiology. 2005. sv. 139, str. 935-948. ISSN 1532-2548. 39. LU, Y. - CHEN, D. F. Analysis of Schisandra chinensis and Schisandra sphenanthera. Journal of Chromatography A. 2009. vol. 1216, pp. 1980-1990. ISSN 0021-9673 40. LUŠTINEC, J. - ŽÁRSKÝ, V. Úvod do fyziologie vyšších rostlin. Praha:Univerzita Karlova v Praze – Nakladatelství Karolinum. 2003. ISBN 80246-0563-5 41. MC KENNA, D. J. - JONES, J. - HUGHES, K.-HUMPNEY, S. Botanical Medicines: The desk reference for Major Herbal Supplements. 2rd edition. Binghamton: The Haworth Herbal Press. 2002. 1138 s. ISBN 07890-1265-0 42. METCALFE, C. R – CHALK, L. Anatomy of the dicotyledons: leaves, steam, and wood in relation to taxonomy with notes on economic uses. Oxford: Claredon Press.1950. 806 s. 43. MIKEŠ, V. - MILAT, M. L. - PONCHET, M. - PANABIERES, F. - RICCI, P. BLEIN, J. P. Elicitins, Proteinaceous Elicitors of Plant Defense, Are a New Class of Sterol Carrier Proteins. Biochemical and Biophysical Research Communications. 1998. vol. 245, pp. 133-139. ISSN: 1090-2104
84
44. OPLETAL, L. - SOVOVÁ, H. - BÁRTLOVÁ, M. Dibenzo[a,c]cyclooctadiene lignans of the genus Schisandra: importance, isolation and determination. Journal of Chromatography B. 2004. vol. 812, pp 357-371. ISSN 1570-0232 45. PANOSSIAN, A. - WIKMAN, G. Pharmacology of Schisandra chinensis Bail.: An overview of Russian research and uses in medicine. Journal of Ethnopharmacology. 2008. vol. 118, pp. 183-212. ISSN: 0378-8741 46. PIETERSE, C. M. J. - van WEES, S. C. M. - TON, J. - van PELT, J. A. - van LOON, L. C. Signalling in Rhizobacteria-Induced Systemic Resistance in Arabidopsis thaliana. Plant Biology. 2002. vol. 4, n. 5, pp. 535-544. ISSN: 1435-8603. 47. PONCHET, M. - PANABIERES, F. - MILAT, M. L. - MIKEŠ, V. MONTILLET, J. L. - SUTY, L. - TRIANTAPHYLIDES, C. - TIRILLY, Y. BLEIN, J. P. Are elicitins cryptograms in plant-Oomycete communications? Cellular and Molecular Life Sciences. 1999. vol. 56, pp. 1020-1047. ISSN: 1420-9071 48. PRELL, H. H. - DAY, P. R. Plant-Fungal Pathogen Interaction: A Classical and Molecular View. Německo : Springer, 2001. 224 s. ISBN 3-540-66727-X. 49. PROFOTOVÁ, B. - BURKETOVÁ, L. - NOVOTNÁ, Z. - MARTINEC, J. VALENTOVÁ, O. Involment of phospholipases C and D in early response to SAR and ISR inducers in Brassica napus plants. Plant Physiology and Biochemistry. 2006. sv. 44, str. 143-151. ISSN: 0981-9428 50. RAMACHANDRA RAO, S. - RAVISHANKAR, G. A. Plant cell cultures: Chemical factories of secondary metabolites. Biotechnology Advances. 2002. vol. 20, pp. 101-153. ISSN: 0734-9750 51. RYALS, J. A. - NEUENSCHWANDER, U. H. - WILLITS, M. G. - MOLINA, A. - STEINER, H. - HUNT, M. D. Systemic Acquired Resistance. The Plant Cell. 1996. sv. 8, str. 1809-1819. ISSN 1531-298X, online 52. SALEEM, M. - KIM, H. J. - ALI, M. S. - LEE, Y. S. An update on bioactive plant lignans. Natural Product Reports. 2005. vol. 22, pp. 696-716. ISSN 14604752 53. SCHWARZINGER, C. - KRANAWETTER, H. Analysis of the Active Compounds in Different Parts of the Schisandra chinensis Plant by Means of Pyrolysis-GC/MS. Monatshefte für Chemie. 2004. vol. 135, pp. 1201-1208. ISSN 1434-4475 54. SHOHAEL, A. M. - MURTHY, H. N. - HAHN, E. J. - LEE, H. L. - PAEK, K. Y. Increased eleutheroside production in Eleutherococcus sessiliflorus embryogenic suspension cultures with methyl jasmonate treatment. Biochemical Engineering Journal. 2008. Vol. 38. is. 2, pp. 270-273 85
55. SIEGLER, D. S. Plant secondary metabolism. Němeco: Springer. 1998. 759 s. ISBN: 9780412019814. 56. ŠLANCAROVÁ, V. Vliv kyseliny salicylové na kulturu klanoprašky čínské in vitro, Brno, 2008, 52 s. Diplomová práce. Agronomická fakulta Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně. 57. SLANINA, J. - GLATZ, Z. Separation procedures applicable to lignan analysis. Journal of Chromatography B. 2004. vol. 812, pp. 215-229. ISSN 1570-0232 58. SLANINA, J. Biologická a farmakologická aktivita lignanů. Chemické listy. 2000. sv. 94, str. 111-116. ISSN 1213-7103 59. SMÍŠKOVÁ, A – VLAŠÍNOVÁ, H. - HAVEL, L. Somatic embryogenesis from zygotic embryos of Schisandra chinensis. Biologia Plantarum. 2005.vol. 49. n. 3, pp. 451-454. ISSN: 1573-8264 60. SVOZILOVÁ, Z. - KAŠPAROVSKÝ, T. - SKLÁDAL, P. - LOCHMAN, J. Interaction of cryptogein with its binding sites in tobacco plasma membrane studied using the piezoelectric biosensor. Analytical Biochemistry. 2009. vol. 390, pp. 115-120. ISSN: 0003-2697 61. TAKEDA, R. - HASEGAWA, J. - SHINOZAKI, M. The first isolation of lignans, megacerotonic acid and anthocerotonic acid, from non-vascular plants, anthocerotae (hornworts) . Tetrahedron Letters. 1990, 31, 29, s. 4159-4162. ISSN 0040-4039. 62. TAKEMOTO, D. - HARDHAM, A. R. - JONES, D. A. Differences in Cell Death Induction by Phytophthora Elicitins Are Determined by Signal Components Downstream of MAP Kinase Kinase in Different Species of Nicotiana and Cultivars of Brassica rapa and Raphanus sativus. Plant Physiology. 2005. vol. 138, n. 2, pp. 1491-1504. ISSN 1532-2548. 63. TESAŘÍKOVÁ, Z. Vliv iontů těžkých kovů na kulturu léčivé rostliny klanoprašky čínské in vitro, Brno, 2009, 58 s. Diplomová práce. Agronomická fakulta. Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně. 64. THE ANGIOSPERM PHYLOGENY GROUP III. An update of the Angiosperm Phylogeny Group classification for the orders and families of flowering plants: APG III. Botanical Journal of the Linnean Society. 2009. vol. 161, pp. 105-121. ISSN 1095-8339 65. UMEZAWA, T. - SUZUKI, S. Biosynthesis of lignans and norlignans. Journal of Wood Science. 2007. vol. 53, pp. 273-284. ISSN 1435-0211 66. UMEZAWA, T. Diversity in lignan biosynthesis. Phytochemistry Reviews. 2003. vol. 2, pp. 371-390. ISSN 1568-7767
86
67. VASCONSUELO, A. - BOLAND, R. Molecular aspects of the early stages of elicitation of secondary metabolites in plants. Plant Science. 2007. vol.172, pp.861-875. ISSN 0168-9452 68. VASYUKOVA, N. I. - OZERETSKOVSKAYA, O. L. Induced Plant Resistance and Salicylic Acid. Applied Biochemistry and Microbiology. 2007. vol. 43, ISSN 1608-3024 69. VĚCHET, L. - BURKETOVÁ, L. Indukovaná rezistence rostlin. Indukovaná rezistence pšenice k padlí travnímu Blumeria graminis f.sp. tritici.. In VĚCHET, L. Interakce mezi rostlinami a patogenními mikroorganizmy. Praha : Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., 2007. s. 54. 70. VIDHYASEKARAN, P. Fungal pathogenesis in plants and crops : molecular biology and host defense . 2nd ed. Boca Raton : CRC Press, 2008. 536 s. ISBN 0849398673. 71. von ARNOLD, S. - SABALA, I. - BOZHKOV, P. - DYACHOK, J. FILONOVA, L. Developmental pathways of somatic embryogenesis. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 2002. vol. 69, pp. 233-249. ISSN: 1573-5044 72. WALKE, T. S. - BAIS, H. P. - VIVANCO, J. M. Jasmonic acid-induced hypericin production in cell suspension cultures of Hypericum perforatum L. (St. John's wort). Phytochemistry . 2002. Vol. 60, n. 3, pp. 289-293. ISSN 00319422. 73. WALTER, V. Rozmnožování okrasných stromů a keřů. Praha: Nakladatelství Brázda, 2001. ISBN 80-209-0268-6 74. WANG, Y. H. - ZHANG, S. Z. - GAO, J. P. - CHEN, D. F. Phylogeny of the Schisandraceae Based on cpDNA mat-K and rpL16 Intron Data. Chemistry & Biodiversity. 2006. vol. 3. ISSN 1612-1880 75. WILFÖR, S. M. - SMEDS, A. I. - HOLMBOM, B. R. Chromatographic analysis of lignans. Journal of Chromatography A. 2006. vol. 1112, pp. 64-77. ISSN 0021-9673 76. WILLIAMSON, E. – DRIVER, S. – BAXTER, K. Stockley´s Herbal Medicines Interactions. Cornwall. Pharmaceutical Press. 2009. 1. vyd. ISBN 978 0 85369 760 2 77. WINK, M. Annual Plant Reviews, Functions and Biotechnology of Plant Secondary Metabolites. Functions and Biotechnology of Plant Secondary Metabolites. Vol. 39. vydání 2. John Wiley and Sons. 2010. 424 s. ISBN: 9781405185288
87
78. YENDO, A. C. A. - COSTA, F. - GOSMANN, G. - FETT-NETTO, A. G. Production of Plant Bioactive Triterpenoid Saponins: Elicitation Strategies and Target Genes to Improve Yields. Molecular Biotechnology. 2010. ISSN: 10736085 79. ZHAO, J. - DAVIS, L. C. - VERPOORTE, R. Elicitor signal transduction leading to production of plant secondary metabolites. Biotechnology Advances. 2005. vol. 23, pp. 283-333. ISSN: 0734-9750 80. ЛИМОННИК КИТАЙСКИЙ — Schisandra chinensis (Turcz.) Baill. Dostupné z http://www.ecosystema.ru/08nature/trees/92.htm. Získáno 12.4.2008
88
