Bevezetés Az intenziv fizikai terhelés hatására fellépo reverzibilis légúti szukületet terhelés indukálta bronchokonstrictionak nevezzük. A bronchiális hiperreaktivitás az asztma legfontosabb jellemzoje, a legtöbb beteg esetében különféle provokáló tényezok a légutak igen gyors kaliberváltozását hozzák létre. A fizikai terhelés ilyen akut rohamot kiváltó inger lehet. A bronchokonstrikcióhoz vezeto legfontosabb tényezo a terhelés alatt fellépo hiperventilláció, melynek során a légutak lehulnek és kiszáradnak, és az ebbol adódó ozmotikus eltérések asztmások esetében a bronchokonstriktor mediátorok kiáramlásához vezetnek. A legtöbb krónikus gyulladásos tüdobetegségben - mint például az asztma és a COPD - kimutatható a légutak hiperreaktivitása az olyan aspecifikus triggerekkel szemben, mint a hisztamin vagy a metak olin inhaláció. Az asztmás betegek légutainak a fizikai terhelésre bekövetkezo túlérzékenysége azonban úgy tunik, hogy különbözik az aspecifikus provokáló szerekre adott választól, a légúti szukület patomechanizmusa ugyanis komplexebb. A legtöbb asztmásnál a bronchokonstrikció nem a fizikai terhelés alatt következik be, hanem annak abbahagyása után, típusosan a testedzés befejezése után 5-10 perccel. A roham általában 30-45 percen belül spontán szunik. Az érintettek egy részénél az elsodleges bronchospazmust követoen kb. 3 órás refrakter periódus figyelheto meg, ilyenkor az ismételt fizikai terhelés kisebb mértéku bronchokonstrikciót vált ki. Terhelés hatására olyanoknál is kialakulhat bronchokonstrikció – többnyire rendszeresen hidegben sportoló fiataloknál – akiknek egyébként nincsenek asztmás tüneteik. Ennek hátterében az állhat, hogy a hideg, száraz levegon végzett rendszeres edzés következtében a hörgokben krónikus gyulladás alakul ki. Az adenozin a szervezetben általánosan jelenlévo nukleozid, melyet a sejtek normál körülmények között is folyamatosan termelnek, azonban szöveti sérülés vagy hipoxia hatására a képzodés e fokozódik.
1
Elsoként Cushley és munkatársai mutatták ki 1983-ban az adenozin bronchokonstriktor hatását. Az adenozin és monofoszfátja, a vízoldékonyabb adenozin-5-monofoszfát (AMP) inhalációja asztmásoknál dózisfüggo reverzibilis bronchokonstrikciót váltott ki, az egészségesek légúti kaliberét azonban nem befolyásolta. Azóta több vizsgálat igazolta, hogy az adenozin nem csak asztmásoknál, hanem egyéb, krónikus légúti gyulladással jellemezheto betegségben is (pl. allergiás rinitisz, dohányzó COPD-s betegek) bronchokonstrikciót vált ki. Az inhalált adenozin asztmásoknál a légúti simaizomzat számára kontrakciót kiváltó indirekt ingert jelent, melynek konstriktor hatása a gyulladásos sejtek felszínén található adenozin receptorok közvetítésével alakul ki.
Célkituzések Vizsgálatunkban arra a kérdésre kerestünk választ, hogy a fizikai terheléskor képzodo endogén adenozin hozzájárulhat-e a bronchokonstrikcióhoz. A kutatómunka három részbol állt:
1.
Asztmásoknál és egészséges önkénteseknél vizsgáltuk, hogy a fizikai terhelés hatására változik-e az adenozin koncentrációja a plazmában, valamint hogy kimutatható-e összefüggés az asztmásoknál bekövetkezett FEV1 csökkenés és a plazma adenozin szint változása között.
2.
Vizsgáltuk, hogy a kilégzett levego kondenzátumban is mérheto-e az adenozin tartalom, és ha igen, akkor van-e különbség az egészségesek, a szteroiddal nem kezelt atópiás asztmások, és a szteroiddal kezelt atópiás asztmások kilégzett levego kondenzátumainak adenozin tartalma között.
2
3.
Mivel az adenozin mérhetonek bizonyult a kilégzett levego kondenzátumban, egészséges önkénteseknél és asztmásoknál összehasonlítottuk a terheléses provokáció elott és után gyujtött kilégzett levego kondenzátum mintákban lévo adenozin koncentrációkat. Meghatároztuk az adenozin változás és a bronchospazmus mértéke közötti összefüggést. Az asztmásokat metakolinnal provokálva vizsgáltuk, hogy az adenozin szint növekedését okozhatja-e önmagában a légúti simaizomzat aspecifikus konstrikciója.
Módszerek 1. vizsgálat (terhelés+plazma adenozin) 9 nem dohányzó, stabil enyhe asztmás beteget és 9 nem atópiás, nem dohányzó önkéntest vontunk be a vizsgálatba. Mind az asztmás, mind a kontroll csoportnál terheléses provokációt végeztünk futószalagon, normál szobalevegon. A terhelés intenzitását úgy állítottuk be, hogy a szívfrekvencia elérje az életkornak megfelelo maximális érték 90%-át, a vizsgált személyek emellett a terhelési intenzitás mellett futottak 6 percig. Az oxigén szaturációt pulzoximéterrel mértük a vizsgálat elott és a terhelés befejezésekor. FEV1 mérést végeztünk a terhelés elott, majd a terhelés befejezése után 6 perccel. Ugyanezekben az idopontokban két -két elohutött csobe az alkarból vénás vért vettünk. Adenozin, inozin, hipoxantin mérése: 2 ml jéghideg stop-oldatot szívtunk fel a vérvételi fecskendobe, ehhez 6 ml vért vettünk. A stop-oldattal az adenozinnak a vérvételt követo koncentrációváltozását gátoltuk meg. A vérmintákat elohutött centrifuga csövekben centrifugáltuk, majd a plazmát 25000 dalton membránszuron fehérjementesítettük. Az így kapott mintákat -20°C-on tároltuk a mérés idopontjáig. A fehérjementesített mintákat nagy nyomású folyadékkromatográfiás, UV detektoros méro rendszerrel (HPLC-UV) analizáltuk. A stopoldat elkészítéséhez és a kromatográfiás méréshez SIGMA
3
(Chemie GmbH, Németország) vegyszereket használtunk.
és
Chemolab
(Budapest)
2. vizsgálat (kondenzátum+ adenozin) 40 nem dohányzó egészséges, és 43 nem dohányzó atópiás asztmás beteg vett részt a vizsgálatban. Az asztmás betegek egy része szteroid kezelést nem kapott, más része szteroid terápiában részesülo beteg volt. Az ismételhetoség vizsgálathoz a kilégzett levego kondenzátum (EBC) mintákat két egymást követo napon ugyanabban az idopontban gyujtöttük 20 egészséges személytol. Ellenoriztük, hogy a kondenzátum minták adenozin koncentrációját nem befolyásolja-e a nyállal való esetleges szennyezodés. Egyrészt amiláz koncentráció meghatározást végeztünk az összes kondenzátumban, másrészt 15 egészségestol és 10 asztmás betegtol a kondenzálást követoen gyujtött nyálmintákban meghatároztuk a nyál adenozin koncentrációját. A vizsgálat idején a betegek releváns allergén expozíciónak voltak kitéve, és többségükben allergiás, illetve asztmás tünetfokozódás miatt keresték fel intézetünk asztma ambulanciáját. A FEV1 mérését elektronikus spirométerrel végeztük, a kilégzett NO mérése kemilumineszcenciás alapelven méro analizátorral történt (Model LR2000, Logan Research, London). Kondenzáláskor a be-, és kilégzés szájrészen keresztül, kétutas szelep közbeiktatásával történt (EcoScreen kondenzátor, Jaeger, Németország). Fehérjementesítést követoen a kondenzátum és a nyálminták adenozin koncentrációját HPLC-val határoztuk meg.
3. vizsgálat (terhelés+ kondenzátum adenozin) A vizsgálatban 7 enyhe stabil asztmás beteg és 8 egészséges kontroll vett részt. Terheléses provokációt végeztünk az 1. vizsgálatnál ismertetett módon. A vizsgált személyek a terhelés elott FEV1 mérést és kilégzett levego kondenzálást végeztek, majd
4
a terhelés után kb. minden 7. percben újabb FEV1 mérés, majd 5 percig tartó kondenzálás következett. A méréseket a FEV1 normalizálódásáig folytattuk, egészségeseknél 4x5 perces kondenzálás történt. A kondenzálást és az adenozin meghatározását a 2. vizsgálatban ismertetett módon végeztük. Metakolin provokációt végeztünk standardizált doziméteres módszerrel.
Eredmények 1. vizsgálat (terhelés+plazma adenozin) A terhelés után mért adenozin, adenozin metabolit, és laktát koncentrációk szignifikánsan magasabbak voltak az asztmás csoportnál, mint az egészséges kontroll esetében (adenozin: 86+/35 nmol/L vs 59+/-16 nmol/L [p<0,001], inozin + hipoxantin: 8,5+/2,9 vs 4,4+/-2,4 µmol/L [p<0,01], laktát: 9,6+/-3,9 vs 5,8+/-2,0 mmol/L [p<0,01]). A terhelés hatására kialakuló oxigén szaturáció csökkenés az asztmás betegek csoportjában jelentos mértéku volt (p<0,001), és a terhelést követoen a SaO2 értéke szignifikánsan alacsonyabb volt, mint az egészségesekben (91,9+/- 4,5% vs 95,3+/-1,4% [p<0,01]). Az egészségeseknél nem találtunk összefüggést a SaO2, plazma adenozin és FEV1 értékek terhelés hatására kialakuló változásai között. Ezzel szemben az asztmásoknál mért adenozin szint növekedés összefüggött mind az oxigén szaturáció, mind a FEV1 csökkenés százalékos változásaival (1.ábra).
5
A 100
? Adenozin, nmol/L
90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 -16
-14
-12
-10
-8
?
SaO
-6 2
-4
-2
0
%
B 0
? FEV 1 %
-10
-20
-30
-40
-50 0
10
20
30
40
50
60
70
80
? Adenozin, nmol/L
1.ábra 2. vizsgálat (kondenzátum+adenozin) A 20 egészségestol egymást követo napokon gyujtött mintákban mért adenozin koncentrációk között szignifikáns összefüggést találtunk, az elso napon mért értékek átlaga 8,8 nmol/L, a második napon mért értékek átlaga 8,9 nmol/L volt. Bland-Altman teszttel számolva a különbségek átlaga -0,1 nmol/L volt +/-3,7nmol/L-es ismételhetoségi koefficienssel. Az egyénenkénti különbségek belül estek a +/- 2SD tartományon. A nyálban mért adenozin koncentráció tíz-tizenötszöröse volt a kondenzátumban mért koncentrációknak egészségesekben és asztmás betegekben egyaránt. Az azonos személytol gyujtött EBC és nyál mintákban az adenozin koncentrációk nem korreláltak. Az amiláz aktivitás összesen 5 EBC mintában volt mérheto. A nyálban 5 két személyben ellenoriztük az amiláz aktivitását, ennek értéke 10 U/L nagyságrendu volt.
6
Szteroid naiv betegekben az adenozin koncentráció szignifikánsan magasabb volt, mint az egészségesekben és a szteroiddal kezelt betegek csoportjában (15 nmol/L, 9 nmol/L, 10 nmol/L, p<0,01 és p<0,05). Egészségesek és szteroiddal kezelt asztmások adenozin koncentrációja nem különbözött. Azonos FEV1 értékek mellett az asztmás tünetfokozódással jelentkezo betegek és a stabil állapotban lévok kilégzett NO szintjében és adenozin koncentrációjában szignifikáns eltérést találtunk (1.táblázat). Stabil állapot Betegek
Asztma tüneti fokozódása
20
23
17/6
6/14
FEV1 %
83 ( 79 - 87 )
84 ( 80 - 88 )
eNO, ppb
11.6 (7.6 - 15.7)
19.1 (13.1 - 25.2) *
Adenozin nmol/L 1. táblázat
9.5 ( 7.1 - 11.8 )
15.5 ( 12.4 -18.5 ) * *
SztN/SztT
3. vizsgálat (terhelés+kondenzátum adenozin) 3 egészséges önkéntes terhelés után vett EBC mintáiban az adenozin koncentráció a kiindulási érték alá esett, a többi mintában kisfokú ( = 30%) adenozin szint emelkedés volt mérheto. Az asztmásoknál egy kivételével a terhelés után jelentosen megemelkedett EBC adenozin értékeket mértünk (57-375%), és az adenozin koncentrációk idobeni változása jelentos egyéni különbözoségeket mutatott (2.ábra). Metakolin provokáció hatására =20% -os FEV1 csökkenést követoen a vizsgált asztmás betegeknél nem nott meg a kilégzett levego kondenzátum adenozin koncentrációja.
7
b: Asztmás betegek (n=7)
? FEV1 and ? EBC-ADO, % 100
160 140 120 100 80 60 40 20 0 -20 -40 -60 -800
140
80
120
60
100 80
40
60
20
40
0
20 0
-20
-20 -40 0
-40 10
20
30
0
40
280 240
10
20
ß 2-agonist 10
20
30
120
200
100
180
40
0
10
20
30
40
160
200 160
80
140
60
120 100
40
120 80
20
40
0
0
-20
-40
-40
-80
30
400 360 320 280 240 200 160 120 80 40 0 -40 -80
ß2 -agonist 0
10
20
30
40
50
-60
60
0
80 60 40 20 0 -20
ß2 -agonist
-40 -60
10
20
30
40
? FEV 1%
50
60
0
10
? ADO%
20
30
40
50
60
idõ, perc
2.ábra
A terhelés nem volt hatással az egészségesek FEV1 értékeire, asztmásoknál terhelést követoen azonban szignifikáns FEV1 csökkenést mértünk (97+/-16% vs 71+/-21%, p<0,001). Egészségeseknél a terhelés nem okozott adenozin szint növekedést, asztmásoknál ellenben azokban a kondenzátum mintákban, melyeket a regisztrált legalacsonyabb FEV1 érték elotti 5 percben gyujtöttek a betegek, az adenozin szignifikáns emelkedését mértük. (12+/-7 nmol/L vs 21+/-7 nmol/L, p<0,01). Az egészségeseknél nem találtunk összefüggést a terhelés utáni FEV1 értékek és a kilégzett levego adenozin koncentrációjának változásai között. Asztmás betegeknél azonban
8
az EBC-adenozin koncentráció változások és a kapcsolt FEV1 változások lineáris összefüggést mutattak (3.ábra). 20
? FEV1%
0 -20 -40 -60 -80 -100 -50
0
50
100 150 200 250 300 350 400
? ADO% 2
r =0.595, p<0.001
3.ábra
Megbeszélés Az asztmásoknál észlelt plazma adenozin koncentráció emelkedés azt jelzi, hogy a terheléses provokáció során bekövetkezo folyamatok az adenozin képzodés vonatkozásában eltérnek az egészségesekétol. A mért adenozin szint emelkedés önmagában feltehetoleg nem elegendo a bronchokonstrikció kiváltásához. Az adenozin koncentráció és a kilégzett NO szint emelkedése a szteroiddal nem kezelt betegekben a légutakban jelenlévo gyulladásos sejtek számának, ill. aktivitásának a növekedésére utal. A tünetes asztmások kondenzátumának adenozin koncentrációja magasabb volt, mint a stabil asztmásoké, ez alapján felvetheto, hogy a kilégzett levego adenozin a légúti gyulladás markere lehet. Emellett szól az is, hogy inhalációs szteroid hatására az adenozin koncentráció és kilégzett NO szint csökkent.
9
Asztmás betegeknél a terhelést követoen a kilégzett levego kondenzátum adenozin konc entrációjának idobeli változása és a légúti obstrukció mértéke paralel lefutást mutatott, az adenozin emelkedés és a FEV1 csökkenés megközelítoleg ugyanabban az idoben következett be. A koncentráció változások és a bronchokonstrikció közti összefüggés alapján felvetheto, hogy az adenozin részt vesz a terhelés indukálta bronchokonstrikció során lejátszódó folyamatokban. Az endogén adenozin bronchokonstriktor szerepét egy szelektív adenozin receptor antagonista protektív hatásával lehetne igazolni. Vizsgálatainkban több irányból igazoltuk, hogy az asztmához a légúti adenozin szint emelkedése társul. A terhelés indukálta bronchospazmus esetén szisztémásan, illetve lokálisan egyaránt az adenozin szint emelkedése mérheto, és ennek mértéke arányos a bronchospazmus súlyosságával. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a terhelés indukálta bronchospazmus pathomechanizmusában az adenozinnak szerepe van.
Az új tudományos eredmények összefoglalása 1.
Vizsgálatunk során kimutattuk, hogy a fizikai terhelés asztmás betegeknél szignifikánsan nagyobb mértékben növelte meg a plazmában az adenozin és metabolitjainak a koncentrációját, mint az egészségesek esetében. Az észlelt adenozin szint emelkedés mértéke korrelált az oxigénszaturáció csökkenéssel, valamint a FEV1 értékek csökkenésével.
2.
Igazoltuk, hogy a kilégzett levego kondenzátum egészségeseknél és asztmásoknál egyaránt tartalmaz adenozint, melynek koncentrációja az alkalmazott analitikai módszerrel jó reprodukálhatósággal mérheto. A kilégzett levego kondenzátum adenozin koncentrációja szignifikánsan magasabb volt a szteroiddal nem kezelt asztmásoknál, mint az egészségeseknél. Az asztmás csoporton belül az adenozin koncentrációja magasabb volt a szteroiddal nem kezelt és az
10
exacerbációban lévo asztmás betegeknél, mint a szteroiddal kezelt, stabil állapotban lévo betegeknél. 3.
Kimutattuk, hogy asztmásoknál a fizikai terhelés hatására a kilégzett levego kondenzátum adenozin koncentrációja szignifikáns mértékben növekedett, míg az egészségesek adenozin koncentrációja nem változott. Az asztmásoknál észlelt adenozin koncentráció emelkedés százalékos változása összefüggést mutatott a bronchokonstrikció mértékével.
Köszönetnyilvánítás Szeretnék köszönetet mondani Dr.Huszár Évának, az Országos Korányi Tbc. és Pulmonológiai Intézet Kórélettani Osztálya kutatójának a munkatársi kapcsolatban megszokottnál önzetlenebb és jelentosebb mértéku segítségéért, témavezetoimnek, Dr.Horváth Ildikónak és Dr.Herjavecz Irénnek a bátorításért, és a sok kincset éro praktikus jó tanácsért, intézetünk Kórélettani Osztálya és az Asztma ambulancia asszisztenseinek a minták levételéért és kezeléséért, valamint fonökömnek, Prof.Dr.Böszörményi Nagy Györgynek nagyvonalúságáért, mellyel lehetové tette a kutatásban való részvételt.
Saját publikációk: Az értekezés témájával összefüggo közlemények
1.
2.
Huszár É., Vizi É., Csoma Zs. Böszörményi Nagy Gy., Horváth I., Kollai M., Herjavecz I.: Az endogén adenozin szint növekedés szerepe fizikai terhelés hatására kialakuló légúti obstrukcióban. Med.Thor. 1998;51:213-220. É. Vizi, É. Huszár, Zs. Csoma, Gy. Böszörményi Nagy, E. Barát, I. Horváth, I. Herjavecz, M. Kollai: Plasma adenosine concentration increases during exercise: a posibble
11
3.
4.
5.
6. 7.
contributing factor to exercise-induced bronchoconstriction in asthma. J Allergy Clin Immunol 2002; 109:446-448. É. Huszár, G. Vass, É. Vizi, Zs. Csoma, E. Barát, Gy. Molnár Világos, I. Herjavecz, I. Horváth. Adenosine in exhaled breath condensate in healthy volunteers and in patient with asthma. Eur Resp J 2002;20:1-6 É. Huszár, É. Vizi, I. Horváth. Reply to correspondence (Exercise-induced asthma and plasma adenosine: Is there a causative link? – by L. Spicuzza, G.U. Di Maria, R. Polosa) J Allergy Clin Immunol 2002; 110:537-538. Huszár É., Vass G., Csoma Zs., Vizi É., Barát E., Herjavecz I., Horváth I. Adenozin koncentráció egészségesek és atópiás asztmás betegek kilégzett levego kondenzátumában. Med Thor 2002;55:186-192. Vizi É.,Csoma Zs., Huszár É. Terhelés indukála bronchokonstrictio. LAM 2003;13:620-624. Csoma Zs, Huszár É, Vizi É, Vass G, Szabó Zs, Herjavecz I, Kollai M, Horváth I. Exhaled breath condensate adenosine concentration increases in association with exercise-induced bronchoconstriction in asthmatic patients. J Allergy Clin Immunol 2004; közlésre beadva
Az értekezés témájával összefüggo könyvfejezetek
8.
Vizi É., Huszár É. Terhelés indukálta asztma. In: Herjavecz I. (szerk.): Légúti allergológia. Asztma és társbetegségei. Melania. Megjelenés alatt.
12
Az értekezés eloadáskivonatok 9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
témájával
összefüggo
E. Barát, É. Vizi, I. Horváth, E. Puskás, M. Kollai: Hypoxemic state increases plasma adenosine and its metabolites’ level. Eur Resp J 1998;12.Suppl.29:45s. É. Huszár, É. Vizi, I. Horváth, M. Kollai: Dysfunction of adenosine buffer system in exercise-induced asthma. Eur Resp J 1998;12.Suppl.29:47s. É. Vizi, É. Huszár, Zs. Csoma, Á. Jakab, Gy. Böszörményi Nagy, I. Herjavecz. Exercise induced airway obstruction is related to the change of plasma adenosine concentration. Eur Resp J 1998; 12.Suppl.29:47s. Vizi É., Huszár É., Csoma Zs., Jakab Á., Böszörményi Nagy Gy., Herjavecz I. Terhelés indukálta légúti obstrukció és a plazma adenozin szint változásának összefüggése asztmásoknál. MAKIT kongresszus (1999. Szeged) É. Vizi, É. Huszár, Zs. Csoma, E. Baráth, Gy. Böszörményi Nagy, I. Herjavecz., M. Kollai: Role of adenosine in exerciseinduced asthma. Eur Resp J 2000; Suppl.31.Vol.16:459s. É. Huszár, G. Vass, É. Vizi, Zs. Csoma, E. Baráth, I. Herjavecz, I. Horváth. Measurement of adenosine in exhaled breath condensate in healthy volunteers and patients with asthma. Eur Resp J 2002; 20.Suppl.38p:423s. Zs. Csoma, É. Vizi, É. Huszár. Post-exercise changes in FEV1 values and adenosine concentrations in exhaled condensate in healthy subjects and patients with exercise-induced asthma. Eur Resp J 2002; 20.Suppl.38.p:290s. Huszár É., Vass G., Vizi É., Csoma Zs., Barát E., Molnár Világos Gy., Herjavecz I., Horváth I. Adenozin koncentráció egészségesek és asztmás betegek kilégzett levego kondenzátumában. Med Thor 2002;55.Suppl.2 K10
13
