VÍRUSOK-I
Vírusok – I: általános I. 1
Bevezetés
Mi egy vírus? A vírusok sejtparaziták, ami azt jelenti, hogy (1) a sejten kívül nem képesek élettevékenységet folytatni. (2) Továbbá, a vírusok a fertőzött sejtben átveszik a sejt irányítását: a sejt molekuláris mechanizmusait a saját szaporodásukhoz használják, s gátolják a csak a sejt számára szükséges folyamatokat (celluláris RNS-ek és fehérjék előállítása, stb.). (3) A vírusok gátolják a sejt és a szervezet különféle védekezési mechanizmusait (apoptózis, immunvédekezés, stb.) A vírusok genetikai paraziták is egyben, mivel (1) tk. génbevitelre specializálódott biológiai szerkezetek; ill. (2) vírus genom kódolja a sejt működésének átprogramozásához szükséges algoritmusokat. Változatosság és hasonlóság A vírusok minden sejt-alapú életformát képesek megfertőzni: eukariótákat (gerinces- és gerinctelen állatokat, növényeket, ill. gombákat) és prokariótákat (eubaktériumokat és archaeákat egyaránt). A baktériumokat megfertőző vírusokat bakteriofágoknak, vagy röviden fágoknak nevezzük. A vírusok sok emberi betegséget okoznak, kezdve az enyhe tünetekkel járó náthától (rhinovírusok) a halálos veszettségig (veszettségvírus). Továbbá, egyes rákos megbetegedéseket is vírusok okoznak (retrovírusok, papilloma vírusok, stb.). A vírusok komoly társadalmi problémákat idézhetnek elő: bizonyos járványok sok emberi életet követelhetnek, s az ellenük való védekezés is költséges lehet. Korábban a fekete himlő (poxvírus) okozott nagy járványokat, ma pedig a HIV (retrovírus) szed órási számú áldozatot. A vírusok nagyon változatos szervezetek. Más élőlényektől eltérően, sok vírus RNS genommal rendelkezik. Mind az RNS, mind a DNS örökítő anyaggal rendelkező vírusok rendelkezhetnek egy- vagy kétszálú nukleinsavval. A vírusok örökítőanyaga lehet lineáris vagy cirkuláris. A legtöbb vírus egyetlen nukleinsavat tartalmaz, de pl. az influenza vírusok 7 vagy 8 RNS molekulával rendelkeznek. A vírusok rendszerint egyszeres (haploid) genommal rendelkeznek, de pl. a HIV diploid (két azonos RNS molekulát tartalmaz). Vannak olyan vírusok, amelyek beépülnek a gazdasejt genomjába (retrovírusok), a többség azonban nem integrálódik. A vírus nukleinsav elhelyezkedhet a sejtmagban (herpeszvírusok, adenovírusok, influenza vírusok), vagy a citoplazmában (poxvírusok, RNS vírusok többsége). A citoplazmában elhelyezkedő vírusoknak maguknak kell megoldaniuk a sokszorozódásukat, mert a gazdasejt replikációs apparátusa a sejtmagban található. A vírusfertőzés lehet produktív (sok vírus részecske keletkezik), látens (a vírus elbújik az immunrendszer elől), ill. abortív (sikertelen). Egyes vírusok fertőzőképessége más vírusok jelenlététől függ (pl. az adenoasszociált vírusok szaporodásához adeno-, vagy herpesz segítővírusok által termelt komponensek szükségesek). A vírusok által okozott betegségek lehetnek gyors lefolyásúak (influenza), vagy évekig tartóak (HIV). A vírusok lehetnek csupaszok (csak kapszid veszi körül a nukleinsavat) vagy köpennyel rendelkezők. Látható, hogy a vírusok szerkezeti felépítése és replikációs stratégiái szintén nagyon változatosak. Van azonban a vírusoknak két közös sajátságuk: (1) 200 nanométernél kisebb méretűek (kivéve a nemrég felfedezett mimivírusok és mamavírusok); (2) kizárólag a gazdasejtben képesek replikálódni (obligát paraziták, szemben a fakultatív parazitákkal, melyek parazitizmus nélkül is képesek létezni). A vírusok mindig a gazda sejtét használják: (a) építőanyagok, pl. aminosavak és nukleotidok; (b) fehérje szintetizáló apparátus (riboszómák, tRNS-ek, stb.); (c) energia, ATP formájában. A vírusok egy alapvető sajátságban különböznek a gazdasejtektől: egy új sejt mindig egy előzőleg létező sejtből származik, egy virion (érett vírus) azonban mindig újraépül a sejtben képződő komponenseiből az összeszerelődés folyamata során. A vírus a sejtműködést módosítja annak érdekében, hogy növelje a saját replikációs hatékonyságát. Ez a módosítás magában foglalja az új membrán struktúrák képzését, a gazdasejt gének kifejeződésének gátlását, ill. bizonyos sejtfolyamatok serkentését.
ALAPKÖVETELMÉNY
11. Előadás
Boldogkői Zsolt ©
1
VÍRUSOK-I A viroszféra A vírusok óriási számban és sokféleségben fordulnak elő a természetben, ezért, a vírusok összességét - a bioszféra analógiájaként,- viroszférának nevezzük. Az óceánok a levegő, a talaj, és minden más környezet óriási számú és típusú vírust tartalmaz. Becslések szerint minimum 100 millió vírusfaj létezik a Földön. 2
Élőlények-e a vírusok?
3
A vírusok felfedezése
4a
A vírusok eredete
Általánosan elterjedt vélekedés, hogy a vírusok nem élőlények, ugyanis a sejten kívül nem produkálják az életre jellemző életjelenségeket. Azonban a baktérium spórákkal is ugyanez a helyzet, s mégsem soroljuk emiatt a spóra állapotú baktériumokat az élettelenek közé. A vírusok létezésére vonatkozó első bizonyítékot két kutató (a holland Martinus Beijerinck és az orosz Dimitrij Ivanovszki) szolgáltatta egymástól függetlenül a kései XIX. században. Beteg dohánylevelekből kivonatot készítettek, amit átszűrtek egy baktérium sejttől kisebb méretű lyukakat tartalmazó szűrőn, majd ezzel az oldattal sikeresen megfertőztek egészséges növényeket. A fertőzési kísérletet többször egymás után elvégezték (minden új fertőzéshez az előzőleg fertőzött növényből vett mintát használtak), hogy kizárják azt a lehetőséget, hogy toxin okozza a betegséget (a toxin felhígult volna a passzálások során, a vírus viszont nem hígul, mivel szaporodik). A vírust később dohány mozaik vírusként (TMV: tobacco mosaic virus) azonosították. Beijerinck használta először a „vírus” szót. Ugyanebben az időben fedezték fel az első állati vírust, a száj és körömfájás vírusát. Friedrich Löffler és Paul Frosch képesek voltak a betegséget állatról állatra átvinni beteg állatból származó átszűrt vérszérummal. Négy fő elmélet próbálja magyarázni a vírusok eredetét. Az első két (esetleg három) elmélet nem feltétlenül egymást kizáróak; valószínűleg, bizonyos vírus családok keletkezését az egyik, más családokét egy másik elmélet magyarázza helyesen. A Regresszív Hipotézis – Sejt-alapú szervezetek maradványai – A vírusok degenerált életformák, melyek elvesztették az önálló élethez szükséges funkciók jelentős részét, s parazitákká váltak. Valószínűleg, a poxvírusok prokarióta sejtek leegyszerűsödése által jöttek létre. A Progresszív Hipotézis – Megszökött nukleinsavak – A vírusok a gazdaszervezet genomjából szakadtak ki, annak több elemét összekombinálva. Valószínűleg a legtöbb (ha nem minden) vírus így keletkezett. A Szimbionta Hipotézis - Intracelluláris mikroorganizmusok – A feltételezések szerint, a vírusok ősei, hasonlóan a mitokondriumokhoz és a kloroplasztiszokhoz, a sejttel szimbiózisra lépő sejtes szervezetek voltak, amelyek, később letértek az együttműködés útjáról, s parazitákká váltak. Ez az elmélet azt a problémát kívánja megoldani, hogy hogyan keletkezett a vírusok genetikai anyaga. A válasz a szimbionta „sejtszervecskéből”. Feltételezések szerint, a legnagyobb ismert vírus, a mimivírus* keletkezhetett ilyen módon (mások a regresszív hipotézis alapján magyarázzák e vírusok eredetét). A Vírus-először Hipotézis – Sejttől független eredet – A vírusok az ősi RNS világ idejében keletkeztek, megelőzve a sejtes életformákat, vagy azokkal párhuzamosan létezve. Nem tudjuk azt sem, hogy a vírusok egyetlen őssel rendelkeznek-e (LUCA: last universal common ancestor), amely létrehozott egy ősi viroszférát, s a mai vírusok mind a LUCA leszármazottai, vagy egymástól függetlenül több alkalommal keletkeztek-e.
4b
A vírusok leszármazása
5
A vírusok rendszertana
6
A Baltimore rendszer
A magasabbrendű élőlények evolúcióját gyakran rekonstruálni lehet az ősmaradványok (fossziliák) alapján. A vírusokból azonban nem keletkeznek fossziliák. Sőt, a vírusok rendkívül gyors evolúciója miatt, nem tudjuk a távoli rokonsági kapcsolataikat sem feltérképezni, - másszóval, evolúciós törzsfát felépíteni -, mivel a hasonlóság genetikai nyomai mára már elvesztek. Ez a helyzet azt eredményezi, hogy, legalábbis jelenleg, csupán spekulálni tudunk a vírusok eredetét és leszármazási viszonyait illetően. 1966-ban megalakult a Vírus Rendszertan Nemzetközi Bizottsága (International Committee on Taxonomy of Viruses; ICTV) azzal a szándékkal, hogy rendet tegyen az addigi kaotikus viszonyoknak a vírus rendszerezés és elnevezés területén. A virológusok hosszú ideig ellenálltak bizonyos rendszertani kategóriák, pl. család, genus és faj, használatának. Mára azonban, ezek az élőlények rendszerezésben használatos kategóriák, a virológiában is meghonosodtak. A probléma a magasabb rendszertani kategóriák, rend, osztály, törzs, megalkotásában van, mivel a távoli csoportok leszármazási viszonyai nem ismertek (a vírusok evolúciós törzsfája gyökértelen, mivel a víruscsaládok közös őseit nem ismerjük). Az alacsonyabb rendszertani kategóriákba (család, genus) való besorolást korábban morfológiai alapon, vagy a vírusfertőzés hasonlóságai alapján végezték. Mára a genom szekvenálási technikák sokkal pontosabb módszereket biztosítanak a rokonság megállapítására. A vírusokat a genomuk (DNS, RNS, egyszálú, kétszálú) és a replikációs stratégiájuk alapján osztályozza. A David Baltimore által alkotott rendszerben az ugyanabba az osztályba tartozó vírusok nem feltétlenül rokonok egymással. Hét Baltimore osztályt különböztetünk meg:
ALAPKÖVETELMÉNY
11. Előadás
Boldogkői Zsolt ©
2
VÍRUSOK-I I: II: III: IV: V: VI: VII:
dsDNS vírusok (pl. Adenovírusok, Herpeszvírusok, Poxvírusok) ssDNS vírusok (+)DNS (pl. Parvovírusok) dsRNS vírusok (pl. Reovírusok) (+)ssRNA vírusok (pl. Pikornavírusok, Togavírusok) (-)ssRNS vírusok (pl. Orthomyxovírusok, Rhabdovírusok) (+)ssRNS vírusok DNS intermedierrel (pl. Retrovírusok) dsDNS-RT vírusok (pl. Hepadnavírusok)
Megjegyzés: intermedier = átmeneti forma; Rövidítés: ds: duplaszálú; ss: egyszálú; RT: reverz transzkriptáz
7
Tolvaj vírusok
A vírusokra jellemző, hogy géneket képesek lopkodni egymástól és a gazdaszervezettől is. Egyszerűbb ugyanis egy már működő gént elvenni mástól, mint egy újat kifejleszteni. Példaként a herpesz szimplex vírust mutatjuk be. Ez a vírus a gazdasejtekéhez nagyon hasonló szekvenciájú géneket is tartalmaz. E gének termékei a DNS replikációban vesznek részt vagy közvetlenül, mint pl. a DNS polimeráz, vagy az új DNS szál szintéziséhez szükséges nukleotidok előállításában, mint a timidin kináz és a ribonukleotid reduktáz enzimek. Ismert az is, hogy az influenza vírus újabb és újab szerotípusai különféle törzsek ekveredésével jönnek létre.
Vírusok és rák
Azokat a vírusokat, amelyek rákot képesek okozni onkogén vírusoknak nevezzük. A tumor képzésben való feltételezett szerepet a vírus tumorokban való jelenléte bizonyíthatja. Bizonyos tumorképző vírusok beépülnek a gazda genomjába (retrovírusok), míg mások kovalensen zárt gyűrű alakban a kromoszómán kívül helyezkednek el a sejtmagban (papilloma vírusok, hepatitis B vírus, Epstein-Barr vírus). Az onkogén vírusokról a „Rákképződés Molekuláris Biológiája” c. előadásban lesz részletesen szó.
Vírusok, vakcinák, antivirális szerek
Erről a témáról a „Biotechnológia és Rekombináns
Géntechnológia” c. előadásban lesz szó.
II.
A vírusok szerkezete
A gazdasejten kívül a vírust virionnak, a sejtben lévő vírust pedig vegetatív vírusnak nevezzük. A provírusnak a gazdasejt DNS-be épült vírust nevezzük. A vírus lényegében egy gének bevitelére specializálódott biológiai szerkezet. A vírus örökítőanyagát körülvevő fehérjék szerepe a genom védelme, ill. annak bejuttatása a sejtbe. A genomot közvetlenül borító fehérjékből álló burok neve kapszid; a kisebb morfológiai egységek pedig a kapszomerek, amelyek fehérjékből állnak. Sok vírus rendelkezik még egy külső membrán komponenssel is, melyet köpenynek nevezünk. A köpeny a gazdasejt sejtmembránjából, a Golgi komplex membránjából (ez tk. a transzport vezikulum membránja), vagy ritkán a magmembránból származik, s különféle vírus fehérjéket tartalmaz. A köpennyel rendelkező vírusoknál rendszerint a külső membrán és a kapszid között egy különféle fehérjéket (esetleg RNS-eket is) tartalmazó réteg is elhelyezkedik, melynek neve mátrix (a herpeszvírusoknál tegument). 8
Vírus genomok A virionok egy vagy több genomot tartalmazhatnak. Szemben más életformákkal, a vírusok nem csupán DNS, hanem RNS genommal is rendelkezhetnek. A vírusok további különlegessége, hogy nem csak két-, hanem egyszálúak is lehetnek, mind a DNS, mind az RNS vírusok esetében. Ezek a különbségek a vírusok többféle eredetére utalnak (polifiletikus eredet, szemben a monofiletikus eredettel). További változatosságot jelent a nukleinsavak lineáris vagy gyűrű alakú szerkezete. A vírus genom mérete is nagy variabilitást mutat. Az RNS vírusok rendszerint kis genommal rendelkeznek, a DNS vírusok között pedig vannak kicsik és nagyok is. A nagy genommal rendelkező vírusok közé tartoznak a herpeszvírusok és poxvírusok. Az újonnan felfedezett mimivírusok és mamavírusok pedig „hatalmasak” (több mint egymillió nukleotidból állnak), nagyobb DNSel rendelkeznek, mint néhány mikoplazma faj (baktériumok), melyek a legkisebb sejtes szervezetek. A legtöbb vírus egyetlen nukleinsav molekulát tartalmaz, de vannak 2 vagy több nukleinsavból álló vírusok is. A szegmentált genom előfordulása jóval gyakoribb az RNS vírusoknál. A szegmentált genommal rendelkező vírusok tipikus példájaként az influenza vírusok szolgálnak. Az influenza vírusok 7 vagy 8 negatív-szálú RNS molekulát tartalmaznak egyetlen virionban. Érdekesség, hogy a rozsnok mozaik vírus más-más virionba pakolja az örökítőanyag szegmenseit, így azoknak egyszerre kell fertőznie egy adott sejtet, hogy a
ALAPKÖVETELMÉNY
11. Előadás
Boldogkői Zsolt ©
3
VÍRUSOK-I vírus működőképes legyen. A szegmentált genom azért előnyös, mert a hagyományos
mechanizmusok (mutáció, genetikai rekombináció) mellett egy új lehetőséget teremtenek a genetikai változékonyság növelésére, nevezetesen, a vírus szegmensek különböző vírustörzsek közötti cseréjét. Ezért képesek az influenza vírusok rendkívül gyors genetikai változásra, ami pl. a viszonylag könnyű gazdaváltás képességükben is megmutatkozik. Az AIDS vírusa, a HIV két kópiában tartalmazza az örökítőanyagát, s így tk. diploid RNS genommal rendelkezik (mivel itt két azonos kópiáról van szó, a genomot nem nevezzük szegmentáltnak). Egyes RNS vírusok átmenetileg DNS-t képeznek az RNS molekuláikból egy RNS-függő DNS polimeráz (reverz transzkriptáz) segítségével. Más vírusok (pl. influenza- és poliovírusok) az RNS-t közvetlenül írják át RNS-sé RNS-függő RNS polimeráz enzimek segítségével. A genomba nem-beépülő vírusok genetikai anyaga rendszerint a sejtmagban helyezkedik el, a lassú vírusok esetén ún. extrakromoszómális DNS-ként, melyet más szóval episzómának is neveznek. Bizonyos vírusok (pl. poxvírusok) DNS-e a citoplazmában helyezkedik el. A gazdasejt genomjába épülhetnek RNS vírusok (pl. HIV, miután DNS-sé másolták az örökítő anyagukat) és DNS vírusok is (pl. lambda fág). Sok vírus genomja ismétlődő szekvenciákat tartalmaz, melyek rendszerint szabályozó szerepet töltenek be: promóterek, enhanszerek, replikációs origók, stb. A lineáris genommal rendelkező vírusok rendszerint a nukleinsavak végein tartalmaznak ismétlődő szekvenciákat, melyeket ezért terminális ripíteknek nevezünk. Ha az ismétlődések ugyanabban az irányban állnak, akkor direkt ripítről, ha egymással ellenkező orientációban állnak, akkor inverz ripítről beszélünk.
9
Kapszidok A virionban a genom egy fehérje burokban helyezkedik el, melyet kapszidnak
10
Virion membránok (köpeny) Sok vírus kapszidját egy kettős lipid-rétegből álló
nevezünk. Néhány vírusnál a genom és a kapszid (együtt: nukleokapszid) alkotja a viriont (csupasz vírusok, pl. adenovírusok), míg másoknál köpeny borítja a kapszidot (burkos vírusok). A kapszid nélküli vírus genom jóval könnyebben inaktiválódik, mint a kapsziddal rendelkező virion. Ez a tény jelzi a kapszid egyik funkcióját: a védelem. A kapszid egy másik funkciója a csupasz vírusoknál a célsejt felismerése, és az ahhoz való kapcsolódás (a burkos vírusoknál a köpeny fehérjéi végzik ezt a feladatot). A kapszid fontos a sejten belüli transzportban is. A kapszidot sok fehérje molekula alkotja, mely fajtól függően, lehet egy- vagy többféle. Az egyedi fehérjék aszimmetrikusak, de szimmetrikus szerkezetté állnak össze. A vírusok túlnyomó többsége a kapszid szimmetriája alapján két típusra osztható: helikális és ikozaéder (megjegyzés: a „helikális=csiga” elnevezés, a DNS-hez hasonlóan, itt is helytelen; a „spirális” kifejezés lenne megfelelő). (1) Helikális szimmetria Sok egyszálú RNS vírus kapszidjának szerkezete mutat ilyen típusú szimmetriát. Az RNS spirál alakú, amelyhez a fehérjék úgy kapcsolódnak, hogy megtartják ezt a szerkezetet. Több egyszálú RNS-t tartalmazó vírus (pl. kanyaró és influenza vírus) helikális kapszidját köpeny borítja, de pl. a dohány mozaik vírus kapszidja csupasz, nem fedi köpeny. Csupán kevés számú DNS vírus rendelkezik helikális szimmetriájú kapsziddal (fonalas fágok). (2) Ikozaéder szimmetria Az ikozaédert 20 egyenlő oldalú háromszög alkotja. A legtöbb vírusnak ikozaéder alakú kapszidja van. (3) Kúp- és bot-alakú kapszidok A fentiek mellett léteznek jóval ritkábban előforduló kapszid formák. Például, a HIV-1 kúp-alakú, a bakulovírusok (rovar paraziták) pedig bot-alakú kapszidokkal rendelkeznek. Mindkét vírus csoport virionjai köpennyel borítottak. membrán veszi körül. A legtöbb esetben, a membránban a vírus genom által kódolt fehérjék találhatóak. Ezek a fehérjék a vírusfertőzést segítik, főként a célsejtek felszínének felismerésében. A legtöbb vírus esetében a köpeny gömb alakú, de más formák is előfordulnak. Az állatok és növények vírusainál gyakori a köpeny, de a bakteriofágok rendkívül ritkán burkoltak külső membránnal. A legtöbb membrán fehérje glükozilált transz-membrán protein (glükoproteinek). Sok glükoprotein funkciója a vírus köpeny és a sejtmembrán fúziójának a véghezvitele. De a megfelelő gazdasejtek felismerése (faj- és sejtspecifikus receptorok felismerése) is a glükoproteinek dolga. A legtöbb virion membrán a citoplazma vagy a Golgi transzport vezikulumainak membránjából származik, amelybe virális proteinek épülnek be. ALAPKÖVETELMÉNY
11. Előadás
Boldogkői Zsolt ©
4
VÍRUSOK-I 11
III. Vírusfertőzés A vírus “célja” ugyanaz, mint az összes többi szervezeté: az információhordozó anyagának utódokba való juttatása. A vírusnak, e cél érdekében, be kell kerülnie sejtbe, ott megsokszoroznia a genomját, összeszerelni a képződő virionokat, kijutni a sejtből, majd az egész folyamat kezdődhet elölről. A vírusfertőzés lépései vázlatpontszerűen a következők: 1. Kapcsolódás a sejthez 2. Bejutás a sejtbe (penetráció) 3. A vírus gének transzkripciója mRNS-ekké 4. A mRNS-ek transzlációja fehérjékké 5. Genom replikációja 6. A genom és a fehérjék virionná való összeszerelődése 7. A virionok kijutása a sejtből Nem mind a 7 folyamat megy azonban végbe minden vírusnál; valamint, az egyes lépések nem mindig a fenti sorrendben mennek végbe, ill. bizonyos vírusoknál egyéb lépések is előfordulnak (pl. reverz transzkripció). Sok vírusnál a transzkripció, a transzláció, a genom replikáció, az összeszerelődés és a sejtből való kijutás egyidőben zajlik.
12
A vírus sejthez való kapcsolódása A virion egy vagy több sejtfelszíni receptor
13
Sejtbe való bejutás (penetráció) A receptorhoz való kötődést követően a vírusnak a
fehérjéhez kapcsolódik. A receptorok virionok általi felismerése nagyon specifikus. Néhány vírus sejtet való fertőzéséhez egy második receptorhoz (ko-receptor) való kapcsolódás is szükséges. A vírus által felismert receptorok és ko-receptorok rendszerint glükoproteinek, melyek különféle funkciót töltenek be a sejtben. A receptorokhoz való kapcsolódás biztosítja azt, hogy a vírus a megfelelő faj megfelelő sejttípusát fertőzze meg. A csupasz vírusok kapcsolódási helye a kapszid felszínén van, néha mélyedésekben (pl. poliovírus), máskor pedig az éleken (pl. száj- és körömfájás vírus). Más csupasz vírusok specializált molekuláris szerkezeteket használnak a sejtfelszínhez való kötődéshez (pl. adenovírusok, rotavírusok) sejtmembránon keresztül be kell jutnia a citoplazmába. Ezt a feladatot kétféle mechanizmussal oldhatják meg a vírusok: (1) Fúzió: a vírusköpeny és a sejtmembrán összeolvadásával (pl. herpeszvírusok), melynek eredményeként a nukleokapszid bekerül a sejtbe, a köpeny viszont nem. (2) Endocitózis: a vírusok penetrációjának (sejtbe való bejutásának) másik módja az endocitózis, melynek során a sejtmembrán körbe fogja a viriont, majd azzal együtt fűződik le, s így egy endoszóma képződik (ld. dia). Endocitózissal jutnak be a csupasz vírusok, s több köpennyel rendelkező vírus is. Megjegyzés: az endocitózis a sejt természetes folyamata, melynek segítségével tápanyagokat és kórokozókat vesz fel, ez utóbbit megsemmisítés céljából. Többféle endocitózis típus létezik, melyek közül a két leggyakoribb a klatrin- és a kaveolin-közvetített endocitózis. Sok vírus kihasználja ezeket a celluláris mechanizmusokat a sejtbe való bejutásra. A vírus ezt követő feladata az endoszómából történő kijutás. Az endoszóma fuzionálhat egy lizoszómával, amely megsavanyítja az endoszóma belsejét. A pH-t tovább csökkentheti a sejt H+-ok bepumpálásával. Ez a savasodás jelenti sok vírus (pl. retrovírusok) számára azt a jelet, melynek hatására a köpenyük fuzionál az endoszóma membránjával, s így a nukleokapszid kijut a citoplazmába.
„Vetkőzési stratégiák” (A) Néhány burkos virus, mint pl. a HIV (és a herpeszvírusok), a gazdasejt
membránjával fuzionálnak (receptor-közvetített módon) a genomuk (kék) és a kapszidjuk (narancs) citoplazmába való juttatása végett. Ezt követően a nukleinsav kikerül a kapszidból. (B) Más burkos vírusok, mint pl. az influenza vírus, egy receptorhoz kötődik, majd endocitózissal jut a sejtbe. Az endoszóma elsavasodását követően, a vírus köpeny fuzionál az endoszóma membránnal, ami a virus genom (RNS; kék) és a kapszid proteinek (narancssárga) citoszólba való bejutását eredményezi. (C) A poliovírusok nem rendelkeznek köpennyel (csupaszok). Első lépésben a receptorhoz (zöld) kapcsolódnak, majd endocitózissal jutnak be a sejtbe, ahol az endoszóma membránjában lyukakat képeznek, s ezeken keresztül kerül az RNS genomuk (kék) a citoplazmába. (D) Az adenovírusok, egy másik csupasz vírus család, bonyolultabb stratégiát folytatnak. A virion endocitózissal az endoszómába kerül, ahonnan az endoszóma membrán dezintegrációjával jut ki a citoplazmába. A vírus DNS (piros) innen közvetlenül a sejtmagba jut.
ALAPKÖVETELMÉNY
11. Előadás
Boldogkői Zsolt ©
5
VÍRUSOK-I 14 Intracelluláris transzport Amint a vírus (virion, nukleokapszid, vagy nukleinsav) bekerült a citoplazmába, el kell jutnia a replikáció helyszínére, amely a sejtmag, vagy a citoplazma meghatározott helyei lehetnek. A vírusok egy része a sejt transzport rendszerét (motorfehérjék, mikrotubulusok) veszi igénybe erre a feladatra. A legtöbb RNS vírus a citoplazmában replikálódik; a többségüknek nincs szüksége a sejtmagban lévő enzimekre, mert saját maguk kódolják azokat. Az influenza vírusok kivételek ezalól, mivel szükségük van a sejtmagban lévő splicing apparátusra, ezért a genomuk a nukleuszba transzportálódik. A retrovírusok szintén a sejtmagba törekszenek, hiszen a reverz transzkriptázuk által képzett DNS a gazdagenomba épül be. A legtöbb retrovírus DNS megvárja a mitózist, mert ilyenkor a magmembrán ideiglenesen szétesik, s így a vírus a gazda genom közelébe juthat. Ezek a vírusok tehát csak osztódó sejteket képesek fertőzni. A retrovírusok családjába tartozó lentívírusok (pl. a HIV) DNS-e azonban, a genomuk által kódolt fehérjék segítségével, képesek átjutni a magmembrán pórusokon, s így ezek a vírusok nem-osztódó sejteket is képesek megfertőzni. A DNS vírusok túlnyomó többsége a sejtmagban replikálódik. Kivételek pl. a poxvírusok, melyek DNS-e a citoplazmában szintetizálódik. A sejtmagba kerülő vírus genomnak a magmembrán közelébe kell szállítódnia, majd át kell haladnia a magpórusokon. Több vírus szerkezeti fehérjéin olyan szekvenciák vannak, amelyek a motor proteinekhez való kapcsolódást teszik lehetővé. A hepeszvírusok, az adenovírusok, a parvovírusok és a retrovírusok felhasználják a sejt e transzport mechanizmusát a nukleokapszidjuk perifériáról a sejtmag közelébe való szállításához. A kis vírusok (pl. parvovírusok) átférnek a magpórusokon, a nagyobbaknak azonban teljesen vagy részlegesen el kell távolítaniuk a kapszidjukat ahhoz, hogy a nukleinsavuk átjusson a póruson. 15
Módosított Centrális Dogma
16
Transzkripció
Francis Crick 1958-ban javasolta a molekuláris biológia Központi (centrális) Dogmáját egy olyan elvként, amely megmagyarázza a genetikai anyag replikációját és kifejeződését. A Központi Dogma szerint a genetikai információ DNS RNS fehérje irányban fejeződik ki; valamint, DNSről DNS-re való másolódás útján adódik át generációról generációra. A sejt-alapú életformákra érvényes is a dogma minden állítása, a vírusok azonban két pontban is megszegik a szabályt: az RNS genommal rendelkező vírusok egy része DNS-sé másolódik (retrovírusok), mások pedig DNS intermedier nélkül, közvetlenül RNS-t képeznek (influenza vírusok). Megjegyzés: az eukarióta sejtekben is végbemegy az RNS DNS átalakulás a retroelemek által kódolt reverz transzkriptáz enzim segítségével.
(1) Az eukarióta sejtek transzkripciója a már ismert mechanizmus szerint megy végbe: a transzkripciós faktorok a DNS-en elhelyezkedő cis-szabályozó szekvenciákhoz kapcsolódva segítik az RNS polimeráz-II molekula által végzett RNS szintézist. A továbbiakban a premRNS 5’ végére egy cap, 3’-végére egy poliA farok kerül, s végül az intronok, különböző mintázatokban (alternatív splicing) kivágódnak. (2) Vírusok A sejtmagba kerülő egy- vagy kétszálú DNS vírusok transzkripciója ugyanígy a gazdasejt traszkripciós apparátusának felhasználásával - megy végbe. A gazda genomba integrálódó RNS vírusok, mivel DNS formában épülnek be, szintén ugyanezt a celluláris mechanizmust használják, mivel a genomban DNS formában vannak jelen. Más, sejtmagba kerülő, RNS vírusok (pl. az influenza vírus) azonban saját kódolású egyszálú (ss)RNS-függő RNS polimeráz enzimet használnak a mRNS képzésére. A sejtmagon kívül replikálódó vírusok azzal a problémával találják magukat szembe, hogy a sejtplazmában nincsenek meg a transzkripcióhoz (sem a replikációhoz) szükséges fehérjék, ezért azokat maguknak kell előállítaniuk: az RNS-ként replikálódó vírusok RNS-függő RNS polimerázokat, a DNS vírusok pedig DNS-függő RNS polimeráz enzimeket szintetizálnak. Megjegyzés: a DNS vírusok DNS-függő DNS polimeráz enzimet kódolnak a replikációjukhoz.
ALAPKÖVETELMÉNY
11. Előadás
Boldogkői Zsolt ©
6
VÍRUSOK-I 17
Transzláció (a) A celluláris mRNS-ek a már ismertetett módon olvasódnak le. A riboszómák kis alegységei ún. capfüggő módon kapcsolódnak az mRNS 5’ végéhez, s onnan egy szkennelő mechanizmus révén megtalálják a kezdő aminosav kodonját (metionin - AUG), majd elkezdik a transzlációt a kapcsolódó nagy riboszómális alegység és iniciátor tRNS-Met segítségével.
(b) Virális mRNS-ek a legtöbb esetben alapvetően ugyanúgy olvasódnak le, mint a celluláris mRNS-ek. Van azonban néhány vírusokra jellemző, ill. vírusok által sokkal gyakrabban alkalmazott mechanizmus, melyek a következők. (1) IRES Sok vírus mRNS nem tartalmaz cap-et, s ezért cap-független módon olvasódik le, melyet az ún. IRES (internal ribosome entry site; belső riboszóma felismerő hely) szekvenciák biztosítanak. Az IRES rendszerint a mRNS-ek 5’ végéhez közel helyezkedik el, s speciális másodlagos szerkezetét a riboszómák képesek felismerni. Több vírus is alkalmazza az IRES-alapú transzlációs mechanizmust, pl. poliovírusok, hepatitis A és C, a száj- és körömfájás vírusa, stb. A hepatitis C vírus mRNS-ei a kis riboszómális alegységet kötik magához. A poliovírusok mRNS-ei azonban nem közvetlenül vonzzák a 40S riboszóma alegységet, hanem egy iniciációs faktoron, az eIF-4G-n keresztül. Más vírusok degradálják az eIF-4G-t, ugyanis ez a faktor, az eIF-4E-el együtt a cap és poliA kapcsolódását idézik elő, mely lépés nélkülözhetetlen feltétele a transzláció elindulásának. Az IRES-alapú stratégia lényege tehát az, hogy a vírusok így gátolni képesek a celluláris mRNS-ek transzlációját a cap blokkolásán keresztül (mivel a virális transzláció cap-független), vagy egy másik stratégiaként- a vírus mRNS-ek nagyobb affinitással magukhoz tudják vonzani az iniciációs faktorokat. Nemrégen fedezték fel, hogy egyes, főként a stressz válaszban szerepet játszó, celluláris gének is használnak IRES szekvenciát, melynek lehetséges oka talán éppen az, hogy ne gátolják a vírusok e gének működését, hiszen sokuk éppen a vírusok elleni védekezésben játszik szerepet. (2) Bi- és policisztronos mRNS-ek Minden celluláris és a legtöbb vírus mRNS egyetlen gént tartalmaz monocisztronos; gén = cisztron). Léteznek azonban olyan vírusok, amelyek mRNS-ei két vagy több gént (ORF: open reading frame; nyílt leolvasási keret) tartalmaznak. Sok bicisztronos mRNS-en az ORF-ek átfednek, másokon a kisebbik ORF a nagyobbikon belül helyezkedik el. Ezeknek az elrendeződéseknek két értelme is lehet: egyrészt, a helytakarékosság, másrészt, a transzláció sebességének a szabályozása. A második ORF leolvasása többféle mechanizmus által történhet: (i) Gyenge (leaky = szivárgó) szkennelés esetén a riboszóma néha „elnézi” a transzláció kezdő (AUG) szekvenciát, továbbhalad a következő AUG kodonig, s a 2. ORF-nél kezdi a leolvasást (nem csak az AUG tripletet „nézi”, hanem az előtte lévő Kozak szekvenciát is). A két ORF eltérő leolvasási keretben található, tehát a két fehérje nem tartalmaz közös aminosavakat. (ii) Megcsúszott termináció, amikor a riboszóma nem ismeri fel a stop kodon, s tovább folytatja a transzlációt, melynek eredménye az eredetitől hosszabb fehérje molekula keletkezése. A riboszóma azért halad túl a stop kodonon, mert egy ún. kereteltolódásos szignál a mRNS-en bizonyos gyakorisággal megcsúszást okoz, s az új leolvasási keretben a stop kodon helyett egy aminosav kódja keletkezik. (iii) IRES Egyes vírusoknál (pikornavírusok, hepatitis C, stb.) a bicisztronos mRNS két ORF-je között található az IRES szekvencia; tehát ezek a vírusok a cap-függő mechanizmus mellett a belső génről függetlenül is képesek transzlációt kezdeményezni.
18
Az újonnan szintetizált vírusfehérjék transzportja
Az újonnan képződött molekulákat is meghatározott helyekre kell szállítani a sejten belül. A mRNS-ek a sejtmagból a citoplazmába szállítódnak (amennyiben a magban képződtek); a vírus proteinek pedig főként a sejtmagba vagy a sejtmembránba kerülnek. A különféle membránokba beépülő fehérjék szignál szekvenciákat tartalmaznak, melyek specifikus hidrofób aminosavakat tartalmazó szekvenciák, s főként a fehérjék N-terminális részén lokalizálódnak, de a fehérjék belsejében is elhelyezkedhetnek. A durva-felszínű ER-ban szintetizálódott fehérjék többsége a Golgiba kerül, ahol glükozilálódnak, s beépülnek a sejtmembránba (vagy magmembránba is, a sejtmagban replikálódó vírusoknál). Az exocitózissal kijutó vírusok köpenyét a vírus proteineket tartalmazó citoplazma membrán alkotja. Ha a vírus a sejtmagban replikálódik, akkor sok virális fehérje is ide transzportálódik. Ezek a fehérjék NLS (nuclear localization signal) szekvenciákat tartalmaznak. A sejtmagból citoplazmába kerülő fehérjék szintén tartalmaznak szignál szekvenciákat, melyek neve NES (nuclear export signal). A HIV Rev proteinje
NLS és NES szekvenciákat is tartalmaz. Az NLS a Rev sejtmagba jutását, míg a NES a Rev és a hozzákapcsolódó RNS citoplazmába jutását biztosítja. Az RNS-ek különféle exportin fehérjék segítségével jutnak ki a sejtmagból a magpórusokon keresztül.
19 20
A vírus genom replikációja A DNS vírusok általában közvetlenül DNS-sé, az RNS vírusok pedig közvetlenül RNS-sé másolják magukat. Van azonban két kivétel a fenti szabály alól: (1) a retrovírusok RNS genomukat reverz transzkriptáz enzim segítségével DNS-sé alakítják; (2) a Hepadnavírusok, melyek ugyan DNS vírusok, mégis RNS intermediert használnak a replikációjukhoz. A plusz szálú genomok a mRNS-el megegyező szekvenciájúak, míg a negatív szálú vírusok az mRNS szekvenciával komplementerek. Az egyszálú DNS vírusok a replikáció előtt kétszálúvá válnak. A (+)RNS vírusoknak két típusa van: (i) a IV-es osztályú vírusok a (+)RNS genomukat (−)RNS intermedieren keresztül replikálják, míg, a VI-os osztályú vírusok a (+)RNS genomukat DNS intermedieren keresztül. A VII-es típusú vírusok érdekes módon, a DNS genomjukat RNS intermediereken keresztül állítják elő. A DNS szintézis a replikációs origónál kezdődik, s a replikációs villa mentén halad. Ez a klasszikus szemikonzervatív replikációs mód. Néhány vírus azonban konzervatív módon
ALAPKÖVETELMÉNY
11. Előadás
Boldogkői Zsolt ©
7
VÍRUSOK-I képzi az örökítőanyagát. Egyes DNS genomok linárisak, mások köralakúak (cirkuláris). Néhány eredetileg lineáris genom a replikáció előtt köralakúvá válik. A cirkuláris formában való replikációnak két fő típusa van: teta (θ) és szigma (σ) replikáció. A szigma replikációs módot gördülő (forgó) gyűrű módnak is nevezik. Több vírus a két stratégiát kombinálja: a korai fertőzési stádiumban a teta módszerrel felszaporítja a DNS gyűrűk számát, melyek a kései fázisban replikációs módot váltanak, s a gördülő gyűrű mechanizmussal ún. konkatamereket (sok vírus genomot tartalmazó DNS) hoznak létre, amelyeket a vírus specifikus enzimjei egységnyi darabokra vágnak, s azonnal becsomagolnak a kapszidba (pl. herpeszvírusok és T4 fág).
21 22
Összeszerelődés és kijutás a sejtből (1) A nukleokapszid összeszerelődése A helikális szerkezetű egyszálú RNS vírusok összeszerelődését a kapszid fehérjék spirális nukleinsav molekulához való kapcsolódása jelenti. Az ikozaéder szimmetriával rendelkező vírusok először rendszerint egy üres kapszidot (pro-kapszid = elő-kapszid) állítanak elő. A kapszid spontán összeáll az elemeiből a sejtben, sőt, gyakran egy sejtmentes oldatban is. Ezt követően a pro-kapszidba bekerül a vírus genom egy kópiában; ezzel egyidőben, vagy ezt követően, a pro-kapszid módosulásokon megy keresztül, s kialakul az érett kapszid. A genom egy csatornán keresztül jut be a kapszidba, rendszerint egy vagy több enzim segítségével. Különösen az RNS vírusok esetében érdekes az a kérdés, hogy honnan tudja a kapszid megkülönböztetni a vírus RNS-t a celluláris RNS-ektől. Például, egy retrovírus által fertőzött sejtben az RNS molekulák kevesebb mint 1%-át teszi ki a vírus genom. A nukleinsavakon található egy pakoló szignál, amit az összeszerelésben résztvevő enzimek felismernek. Az egyszálú vírusokon a pakolási szignált gyakran a genomon lévő másodlagos szerkezetek jelentik, a nagyobb duplaszálú vírusoknál pedig szekvenciálisan kódolt ez a jel. Ezeknek a komplex vírusoknak kémcsőben nem áll össze a kapszidjuk, ehhez szükségük van ún. állványozó (scaffolding) fehérjékre, amelyek nem vesznek részt a virion felépítésében, a feladatuk elvégzése után eltávolítódnak a pro-kapszidról. A komplex vírusok nagyon szorosan csomagolják a DNS-üket, egy herpeszvírus kapszidjában kb. tízszer akkora a nyomás, mint egy pezsgős üvegben. (2) A köpeny kialakulása A legtöbb burkos vírus a citoplazma membránt ölti magára a kijutáskor (exocitózis). A plazmamembrán a kijutás előtt vírus fehérjékkel (glükoproteinek) rakódik tele, s így ezek a fehérjék a köpeny részeivé válnak. A herpeszvírusok köpenye a transzport hólyagocskák membránjából, tehát végső soron a Golgi apparátus membránjából származik (membránfúzióval jut ki). Néhány vírus köpenye a magmembránból keletkezik (egyes Rhabdovírusok). (3) Kijutás a sejtből A bakteriofágok, enzimjeik segítségével megemésztik a fertőzött baktériumokat (lízis = feloldás). Az állati vírusok nem lizálják a sejtet, bár a fertőzés nagyon kései szakaszában így is kijuthatnak a sejtből. Ez utóbbi esetben viszont nem biztos, hogy fertőzőképesek lesznek, mivel vagy köpenyt kell szerezniük a sejtmembránból exocitózissal, vagy más vírusoknál (herpeszek) éppen fordítva, le kell vetniük a transzport vezikulumokból származó külső membránt a sejtmembránnal való fúzió által.
Stratégiák a vírusköpeny megszerzésére (A) Herpeszvírusok nukleokapszidja a sejtmagban áll össze, majd magára öltve a belső magmembránt bekerül a két membrán közötti térbe. A vírus ezt az ideiglenes köpenyt használja a magból (ill. az ER-ből) a citoszólba való kijutásra, azáltal, hogy fuzionál a külső magmembránnal. Ezt követően, a nukleokapszid (amely már virális tegument fehérjékkel borított) bejut a Golgi készülékbe, s ezáltal egy köpenyt ölt magára, majd kijutván a Golgi-ból egy transzport vezikulumba kerül, s így már két membránja lesz. A citoplazmából a vírus a plazmamembránnal való fúzió útján jut ki, s közben a külsőköpenyét a membránban hagyja. (B) Poxvírusok a citoszólban, ún. “replikációs gyárakban” szerelődnek össze. Az első összeálló szerkezet két Golgiból származó membránt tartalmaz. Ezt követően, még egy dupla rétegű membrán kerül a vírus köré, s így az 4 membránból álló köpenyt tartalmaz. A plazamembránnal való fúziót követően, a vírus 3 membránrétegű köpennyel hagyja el a sejtet.
ALAPKÖVETELMÉNY
11. Előadás
Boldogkői Zsolt ©
8
VÍRUSOK-I 23
A fertőzés kimenete • Produktív fertőzés Az eddigiek során a vírusfertőzés azon forgatókönyvéről volt szó, amikor a vírus replikálódik a sejtben, s végül a keletkezett virionok elhagyják a sejtet. Ez a produktív fertőzés, amely, ha a sejt pusztulásával jár (rendszerint ez a helyzet), akkor litikus fertőzésről beszélünk. A sejtek túlélhetik a vírusfertőzést rövid (HIV) vagy hosszabb (hepatitis B) ideig a virionok sejtből valótávozását követően. Néha a vírusfertőzés nem produktív, melynek több oka is lehet. • Látens fertőzés esetén (pl. az -herpeszvírusok bizonyos idegsejtekben) a vírus genom jelen lehet a sejtben akár élethossziglan is anélkül, hogy érett virionok képződnének. A vírus ilyenkor rendszerint elbújik az immunrendszer elől, s csak bizonyos hatásokra (pl. stressz) aktiválódik. • Az abortív fertőzés lényegében sikertelen fertőzést jelent.
24
A gazda és a parazita harca A gazda és a vírus hosszútávú küzdelme tulajdonképpen egy fegyverkezési verseny, melynek során a vírusok bonyolult trükkökkel tudnak túljárni a gazdaszervezet „eszén”. A gazdaszervezet az immunrendszer segítségével védekezik a vírusok ellen. A vírusoknak rendszerint nem érdeke a túlzott virulencia, azaz a gazda elpusztítása. Ez utóbbi helyzet gyakran a gazdaváltásnál figyelhető meg: pl. a HIV rokona a SIV (simian immunodeficiency virus) (ebből származik) nem okozza a csimpánz pusztulását. Az influenzánál ugyanez a helyzet, az újonnan létrejött törzsek a különösen veszélyesek. Az influenzának az az érdeke, hogy az ember talpon maradjon, s terjessze a kórt. Azok a kórokozók (nem csak vírusok), amelyeket valamilyen vektor (pl. rovarok) terjesztenek, viszont abból profitálnak, ha minél nagyobb számban vannak jelen a gazda testében (vér), s ezért ezek a kórokozók „könyörtelenek” lesznek a gazdával szemben, gyakran halálos kimenetelű fertőzést okoznak.
Szójegyzék Endémia: egy bizonyos területre korlátozódó betegség. Epidémiáról (az epi jelentése "között"; a démosz-é pedig "nép") akkor beszélünk, ha egy bizonyos betegség előfordulása a korábbi előfordulásához képest, adott idő alatt egy populációban megnő. A betegség nem feltétlenül fertőző. A rák, szívbetegség, sertésinfluenza mind az epidémia egy-egy példái. Az epidémia korlátozódhat egy régióra, vagy lehet globális, ez utóbbi esetben pandémiáról beszélünk. Nyílt leolvasási keret (open reading frame; ORF): a gén fehérjét kódoló szakasza, ATG-vel (metionint kódol) kezdődik és a 3 stop kodon valamelyikével végződik. ORF-ekről csak intronmentes gének esetében beszélhetünk, hiszen az intronok rendszerint stop kodonokat tartalmaznak. A baktérium gének és az érett eukarióta mRNS-ek tartalmaznak ORF-et. A pandémia (a görög pan "minden" + demos "ember") egy fertőző betegség elterjedése a nagyobb régiókon, kontinenseket vagy az egész világon. A széleskörű epidémia még nem pandémia, meg van határozva, hogy hány megbetegedés felett nevezzük a járványt pandémiának. A történelem során rengeteg pandémiával találkoztunk, például a himlővel vagy a tuberkulózissal; ill. a mostani járványok közül a HIV-et és a 2009-es influenzát érdemes megemlíteni. Természetes rezervoár: az a faj, amelyben egy vírus hosszútávon képes létezni; azaz egy fertőző betegég kórokozójának hosszú-távú hordozója, gazdája. A vírus a rezervoárokban általában szubklinikai fertőzést okoz, tehát a kórokozót tünetmentesen hordozza. Ha felfedeznek egy ilyen rezervoárt, akkor ki tudják deríteni a fertőző betegség és a patogén teljes életciklusát, így pedig könnyebb megelőzni és kontrollálni a betegséget.
ALAPKÖVETELMÉNY
11. Előadás
Boldogkői Zsolt ©
9
VÍRUSOK-I JEGYZETEIM:
10
ALAPKÖVETELMÉNY
11. Előadás
Boldogkői Zsolt ©
