UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE Academiejaar 2011-2012
VERGELIJKENDE PATHOGENESE VAN NEUROPATHOGENE EN NIETNEUROPATHOGENE INFECTIES MET EQUINE HERPESVIRUS-1 BIJ HET PAARD Door Eline VAN DE WATER
Literatuurstudie in het kader Promotor: Prof. Dr. H. Nauwynck
van de Masterproef
De auteur en promotor geven de toelating deze studie als geheel voor consultatie beschikbaar te stellen voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting de bron uitdrukkelijk te vermelden bij het aanhalen van gegevens uit deze studie. Het auteursrecht betreffende de gegevens vermeld in deze studie berust bij de promotor. Het auteursrecht beperkt zich tot de wijze waarop de auteur de problematiek van het onderwerp heeft benaderd en neergeschreven. De auteur respecteert daarbij het oorspronkelijke auteursrecht van de individueel geciteerde studies en eventueel bijhorende documentatie, zoals tabellen en figuren. De auteur en de promotor zijn niet verantwoordelijk voor de behandelingen en eventuele doseringen die in deze studie geciteerd en beschreven zijn.
VOORWOORD De problematiek rond EHV-1 en EHV-4 (rhinopneumonie) interesseerde mij al een tijdje, vooral de neurologische aspecten, omdat daaromtrent nog de meeste vragen zijn. Ik was dan ook blij dat Prof. Nauwynck bereid was om mij te begeleiden tijdens de uitwerking van dit eigen Masterproefonderwerp. Graag wil ik hem dan ook in de eerste plaats bedanken. Hij gaf me de vrijheid om met EHV-1 eender welke richting uit te gaan. Wanneer mijn literatuurstudie wat meer vorm kreeg, stond hij, ondanks zijn drukke agenda en kostbare tijd, klaar met tips en vooral waardevolle, opbouwende kritiek. Daarnaast wil ik ook alle anderen bedanken die mij, zowel fysiek als mentaal, hebben bijgestaan bij de uitwerking van mijn literatuurstudie. In het bijzonder denk ik dan aan, mijn moeder, mijn zus Emilie, mijn grootvader, mijn vriend Wauter, Ines en Wilfried. Wauter, vooral als mentale steun, moeke, vava, Ines en Wilfried als ‘nalezers’ en Emilie als mijn persoonlijke taaladviseur: allemaal bedankt voor jullie tijd en moeite!
INHOUDSOPGAVE VOORWOORD
INHOUDSOPGAVE
SAMENVATTING .................................................................................................................. p. 1
INLEIDING ............................................................................................................................ p. 2
LITERATUURSTUDIE........................................................................................................... p. 3
1. Pathogenese van een infectie met EHV ......................................................................... p. 3 1.1. Primaire replicatie t.h.v. het ademhalingsstelsel.................................................... p. 3 1.2. Viremie................................................................................................................... p. 3 1.2.1. Celgeassocieerde viremie van EHV-1 in leukocyten .................................. p. 3 1.2.2. Identificatie van geïnfecteerde PBMC ......................................................... p. 6 1.2.3. Viremie bij infectie met EHV-4 .................................................................... p. 7 1.3. Secundaire replicatie t.h.v. inwendige organen ..................................................... p. 7 1.3.1. EHV-1 en het tropisme voor endotheelcellen.............................................. p. 7 1.3.2. Infectie van endotheelcellen in de drachtige uterus .................................... p. 8 1.3.3. Infectie van endotheelcellen in het centraal zenuwstelsel .......................... p. 8 1.4. Latentie ................................................................................................................ p. 11 2. Symptomen................................................................................................................... p. 11 2.1. Door infectie in het ademhalingsstelsel........................................................ p. 11 2.2. Door infectie in de drachtige uterus ............................................................. p. 13 2.3. Door infectie in het centraal zenuwstelsel .................................................... p. 13 3. Bescherming door vaccinatie........................................................................................ p. 14
BESPREKING ..................................................................................................................... p. 16
REFERENTIELIJST ............................................................................................................ p. 19
SAMENVATTING Equine herpesvirus-1 (EHV-1) en equine herpesvirus-4 (EHV-4) zijn belangrijke virussen die enzoötisch voorkomen in de paardenpopulatie. De primaire replicatie van beide virussen vindt plaats ter hoogte van de bovenste ademhalingswegen, waar de pathogenese van EHV-4 reeds grotendeels ophoudt. EHV-1 daarentegen infecteert individuele mononucleaire leukocyten die de basale membraan kruisen, met een celgeassocieerde viremie in die cellen tot gevolg. Ter hoogte van inwendige organen leidt infectie van endotheelcellen tot een vasculitis. Het tropisme voor endotheelcellen lijkt meer uitgesproken in de drachtige uterus en het centraal zenuwstelsel en geeft in die organen aanleiding tot ernstige symptomen, respectievelijk abortus en zenuwstoornissen. Opvallend is dat sommige stammen van EHV-1 meer in staat zijn zenuwsymptomen te veroorzaken dan andere. Die neuropathogeniteit blijkt sterk gecorreleerd te zijn met een puntmutatie in het viraal DNA-polymerasegen, die aanleiding geeft tot een verhoogde invasiekinetiek ter hoogte van het respiratoir epitheel. Zo zijn stammen met een neuropathogeen genotype in staat sneller en meer mononucleaire leukocyten te infecteren ten opzichte van stammen met een niet-neuropathogeen genotype. Dat leidt tot een sterkere viremie, die het risico op zenuwstoornissen verhoogt. Eventuele verschillen in de respiratoire replicatie op zich tussen verschillende EHV-1-stammen blijken onafhankelijk te zijn van neuropathogeniteit. De correlatie tussen neuropathogeniteit en de genoemde puntmutatie is echter niet absoluut en de invloed van andere factoren is nog niet geheel bekend. Het virus ontsnapt door een directe cel-tot-celtransmissie aan de uitschakeling door antistofgeïnduceerde cellyse en dieren met systemische antistoffen zijn dus niet voldoende beschermd. Daarom moet vaccinatie gericht zijn op het voorkomen van viremie door inductie van lokale immuniteit ter hoogte van het ademhalingsstelsel.
Keywords: EHV-1, mutation, neuropathogenicity, pathogenesis, symptoms
INLEIDING Equine herpesvirus-1 (EHV-1), is een belangrijke oorzaak van ademhalingsaandoeningen bij paarden, met eventuele complicaties zoals neonatale problemen bij veulens en abortus en zenuwstoornissen tot gevolg (Kohn en Fenner, 1987; Donaldson en Sweeney, 1997; Sutton et al., 1998; Van der Meulen et al., 2000; Slater et al., 2006). Samen met equine herpesvirus4 (EHV-4) komt het virus wereldwijd enzoötisch voor in de meeste paardenpopulaties (Wilson, 1997; Allen, 2002; Van Maanen, 2002; Harless en Pusterla, 2006). De meerderheid van de paarden wordt gedurende het eerste levensjaar geïnfecteerd met EHV-1 en/of EHV-4 (Ostlund, 1993; Wilson, 1997; Donaldson en Sweeney, 1997). Waarschijnlijk is er bij 80 tot 90% van de paarden infectie voor de leeftijd van 2 jaar (Allen, 2002). In tegenstelling tot infectie met EHV-1, blijft een EHV-4-infectie meestal beperkt tot de ademhalingswegen (Patel et al., 1982 Edington et al., 1986; Van Maanen, 2002; Patel en Heldens, 2005). Equine herpesvirus myeloencephalopathie (EHM) is een reeds lang erkende zeer ernstige aandoening die veroorzaakt wordt door neuropathogene stammen van EHV-1 (Meyer et al., 1987; Wilson, 1997; Nugent et al., 2006; Goodman et al., 2007). Een uitbraak van EHM kan beperkt blijven tot enkele geïsoleerde klinische gevallen, of kan meerdere paarden in een groep treffen (Ostlund, 1993). Vroeger werd slechts een klein percentage, meestal zo’n 10%, van de geïnfecteerde volwassen paarden bij een uitbraak van EHV-1 door EHM getroffen (Goehring et al., 2006). Er wordt echter een toenemende prevalentie van neuropathogene stammen van EHV-1 waargenomen in paardenpopulaties (Smith et al., 2010) en hoe langer hoe meer ook een hogere incidentie van EHM (Van Maanen et al., 2001; Henninger et al., 2007; Grijspeerdt et al., 2011). Grijspeerdt et al. (2011) beschreven nog een ongewoon grote uitbraak van EHM in België in 2009, waarbij een hoog percentage (43%) van de geïnfecteerde paarden neurologische symptomen ontwikkelde. In combinatie met het normaal slechts sporadische voorkomen van deze aandoening, wijst dat erop dat EHM een emerging disease is (Grijspeerdt et al., 2011). Bovendien waren er onlangs (respectievelijk in februari en maart 2012) nog uitbraken van EHM in Frankrijk (RESPE, 2012) en Nederland (Sectorraad Paarden Nederland, 2012). Dit alles illustreert het toenemende belang van kennis over en inzicht in deze aandoening. In deze literatuurstudie zal ik het eerst algemeen hebben over de pathogenese van EHV-1 en EHV-4 en de verschillen tussen beide virussen. Daarnaast zal ik dieper ingaan op het tropisme van EHV-1 voor het centraal zenuwstelsel en op de vraag waarom sommige stammen er, in tegenstelling tot andere, veel meer in slagen erge zenuwstoornissen te veroorzaken.
2
LITERATUURSTUDIE 1. PATHOGENESE VAN EEN INFECTIE MET EHV 1.1. Primaire replicatie t.h.v. het ademhalingsstelsel De infectie met equine herpesvirus (EHV) gebeurt langs aërogene weg (Gibson et al., 1992), vooral door direct contact met geïnfecteerde paarden die viruspartikels uitscheiden in nasaal secreet of door indirecte virustransmissie (Allen, 2002). Eventueel is ook aërosolvorming mogelijk voor virusoverdracht over korte afstand (Allen, 2002). De primaire replicatie van EHV vindt plaats in het epitheel van de bovenste ademhalingswegen en daarmee geassocieerd lymfoïd weefsel (Van Maanen, 2002; Slater et al., 2006). Er is een oppervlakkige spreiding van virusplaques met EHV over het respiratoir epitheel gedurende een drie- tot vijftal dagen (Grijspeerdt et al., 2010). Een direct resultaat van die replicatie is virusuitscheiding van EHV in nasaal secreet, die bij primo-infecties kan duren tot 14 dagen post-inoculatie (Gibson et al., 1992; Allen, 2002). Meestal is dit echter korter, namelijk een tiental dagen (Gibson et al., 1992). Bij infectie met neuropathogene stammen van EHV-1 werd een langere virusuitscheiding in nasaal secreet aangetoond door Allen en Breathnach (2006), Nugent et al. (2006) en Goodman et al. (2007), maar niet door Grijspeerdt et al. (2010). Goodman et al. (2007) schreven dat verschil echter niet toe aan een verschil in replicatie ter hoogte van het ademhalingsstelsel,
maar
wel
aan
een
efficiëntere
immuunrespons
tegen
niet-
neuropathogene stammen. Ook Vandekerckhove et al. (2010) konden wat betreft replicatie ter
hoogte
van
de
bovenste
ademhalingswegen
geen
verschil
aantonen
tussen
neuropathogene en niet-neuropathogene stammen EHV-1. Wel kon een verschil in replicatie waargenomen
worden
tussen
verschillende
stammen,
onafhankelijk
van
de
neuropathogeniteit (Vandekerckhove et al., 2010). Tot zover is de pathogenese van EHV-1 en EHV-4 gelijklopend. Ondanks een grote genetische en antigenische gelijkenis tussen beide virussen is het verdere verloop zeer verschillend (Allen, 2002; Osterrieder en Van de Walle, 2010). Een infectie met EHV-4 blijft meestal beperkt tot de ademhalingswegen, in tegenstelling tot een infectie met EHV-1 (Patel et al., 1982; Slater et al., 2006; Vandekerckhove et al., 2011). Er kan dus gesteld worden dat het verloop van de respiratoire infectie zeer bepalend is voor de verdere pathogenese (Prof. Dr. H. Nauwynck, persoonlijke mededeling). 1.2. Viremie 1.2.1. Celgeassocieerde viremie van EHV-1 in leukocyten Door een tropisme voor periferal blood mononuclear cells (PBMC) slaagt EHV-1 erin nasale mucosale leukocyten te infecteren, die vervolgens migreren doorheen de basale membraan en zo diepere weefsels bereiken (Harless en Pusterla, 2006; Grijspeerdt et al., 2010; Vandekerckhove et al., 2011; Steukers et al., 2012). Enerzijds leidt dat rechtstreeks tot een celgeassocieerde viremie in PBMC (Edington et al., 1986; Meyer et al., 1987; Ostlund, 1993; Harless en Pusterla, 2006; Grijspeerdt et al., 2010; Osterrieder en Van de Walle, 2010),
3
anderzijds tot migratie van geïnfecteerde cellen naar de regionale lymfeknopen, waardoor een specifieke immuunrespons wordt opgewekt (Grijspeerdt et al., 2010). De viremie treedt meestal 4 tot 10 dagen na de primaire respiratoire infectie op (Smith et al., 1996; Van der Meulen et al., 2000; Hussey et al., 2006; Goehring et al., 2010b; Soboll et al., 2010), maar kon reeds gedetecteerd worden vanaf dag 1 post-infectie (Goodman et al., 2007; Grijspeerdt et al., 2010). De viremische fase is noodzakelijk voor virustransport naar inwendige organen, waar een secundaire replicatie kan plaatsvinden (Osterrieder en Van de Walle, 2010), die centraal staat in de pathogenese van EHV-1-geïnduceerde abortus en EHM (Patel et al., 1982; Edington et al., 1986; Ostlund 1993; Soboll et al., 2010; Goehring et al., 2011). Opvallend is dat enkel individuele EHV-1-geïnfecteerde cellen in staat zijn de basale membraan te kruisen (Fig. 1) (Edington et al., 1986; Grijspeerdt et al., 2010; Vandekerckhove et al., 2010). Op geen enkel tijdstip post-infectie konden geïnfecteerde plaques onder de basale membraan waargenomen worden (Grijspeerdt et al., 2010; Vandekerckhove et al., 2010). In tegenstelling tot bijvoorbeeld het pseudorabiesvirus (PrV) bereikt EHV-1 de diepere weefsels dus niet door het rechtstreeks doorbreken van de basale membraan (Grijspeerdt et al., 2010; Vandekerckhove et al., 2010; Steukers et al., 2012).
Fig. 1 Verschillende virale interacties met de basale membraan: sommige virussen kruisen de basale membraan in volledige virusplaques d.m.v. een proteaseactiviteit (vb. pseudorabiësvirus (PrV)), andere virussen (zoals EHV-1 en humaan immunodeficiëntievirus (HIV)) gebruiken individuele geïnfecteerde cellen als transporters en sommige oncogene virussen zoals humaan papillomavirus (HPV) kunnen de basale membraan zelfs volledig vernietigen (uit Steukers et al., 2012).
Vandekerckhove et al. (2010) merkten een verschil op in kinetiek wat betreft invasie van de basale membraan tussen neuropathogene en niet-neuropathogene isolaten van EHV-1, wat eerder reeds gesuggereerd werd door Goodman et al. (2007). Voor neuropathogene isolaten konden reeds 24 uur post-infectie individueel geïnfecteerde cellen aangetoond worden onder de basale membraan. Voor niet-neuropathogene isolaten was dat slechts 36 uur post-infectie (Vandekerckhove et al., 2010). Bovendien was het aantal individueel geïnfecteerde cellen
4
onder de basale membraan groter bij infectie met neuropathogene isolaten (Fig. 2) (Vandekerckhove et al., 2010). In hetzelfde experiment werden ook een neuropathogene en niet-neuropathogene
referentiestam
en
hun
respectievelijke
niet-neuropathogene
en
neuropathogene mutant geïnoculeerd op nasale mucosale explantaten. Daaruit bleek dat bij infectie met stammen met een neuropathogeen genotype sneller individueel geïnfecteerde cellen onder de basale membraan aanwezig waren dan bij infectie met stammen met een niet-neuropathogeen
genotype.
Bovendien
konden
voor
de
stammen
met
een
neuropathogeen genotype ook in dit deel van het experiment significant meer geïnfecteerde cellen onder de basale membraan waargenomen worden (Vandekerckhove et al., 2010) (Fig. 3).
A
B
Fig. 2 Het totale aantal individuele EHV-1-geïnfecteerde cellen in nasale mucosale explantaten voor verschillende (A) neuropathogene en (B) niet-neuropathogene EHV-1 isolaten, 48 uur post-infectie (naar Vandekerckhove et al., 2010).
A
B
Fig. 3 De totale hoeveelheid individueel EHV-1-geïnfecteerde cellen onder de basale membraan, 48 uur post-infectie, voor (A) een neuropathogene stam (rAb4) en de neuropathogene mutant van een niet-neuropathogene stam (mNY03) en (B) een niet-neuropathogene stam (rNY03) en de niet-neuropathogene mutant van een neuropathogene stam (mAb4) (naar Vandekerckhove et al., 2010).
5
Naast een verschil in invasiekinetiek is er ook een verschil in de veroorzaakte viremie tussen neuropathogene
en
niet-neuropathogene
stammen.
Die
treedt
bij
infectie
met
neuropathogene stammen vroeger op na infectie en blijft voor een langere periode behouden (Allen en Breathnach, 2006; Goodman et al., 2007). In een experiment van Allen en Breathnach (2006) kon, met behulp van PCR, viremie gedetecteerd worden tussen 2 en 21 dagen post-inoculatie voor neuropathogene isolaten van EHV-1 en tussen 4 en 14 dagen post-inoculatie voor niet-neuropathogene. In een experiment van Goodman et al. (2007) piekte de viremie eveneens eerder en hield langer aan bij infectie met een neuropathogeen isolaat dan bij infectie met zijn niet-neuropathogene mutant. Daarnaast werd ook de magnitude van de veroorzaakte viremie groter geacht bij infectie met neuropathogene isolaten (Allen en Breathnach, 2006). Onder meer op basis van die gegevens wordt aangenomen dat een hogere en langere blootstelling van het endotheel in het centraal zenuwstelsel aan EHV-1 het risico op EHM zou verhogen (Allen en Breathnach, 2006; Goodman et al., 2007; Wilsterman et al., 2011). Bij infectie met een neuropathogene stam is het echter niet zo dat dieren die EHM ontwikkelen een hogere viremie vertonen dan dieren zonder EHM (Allen en Breathnach, 2006). 1.2.2. Identificatie van geïnfecteerde PBMC Wilsterman et al. (2011) toonden aan dat in een EHV-1-geïnduceerde viremie alle subpopulaties van PBMC een rol spelen, hoewel er verschillen zijn tussen stammen (Van der Meulen, 2000; Goodman et al., 2007; Grijspeerdt et al., 2010; Vandekerckhove et al., 2010). In in-vitrostudies werd initieel aangetoond dat neuropathogene stammen van EHV-1 voornamelijk een tropisme hebben voor equine T-lymfocyten (Goodman et al., 2007). Nietneuropathogene stammen infecteren vooral monocyten (Van der Meulen et al., 2000; Goodman et al., 2007) en B-lymfocyten (Goodman et al., 2007). Na mitogene stimulatie worden T-lymfocyten gevoeliger voor infectie door EHV-1 (Van der Meulen et al., 2000; Van der Meulen et al., 2001), wat verklaard kan worden door verschillende mechanismen (Van der Meulen et al., 2001). Activatie van T-lymfocyten gebeurt in-vivo door een EHV-1-infectie (Van der Meulen et al., 2000). In een latere in-vivostudie van Grijspeerdt et al. (2010) werd geen verschil opgemerkt in celtropisme tussen neuropathogene en niet-neuropathogene stammen tijdens viremie (Grijspeerdt et al., 2010). Met behulp van immunofluorescentie kon in die studie in beeld gebracht worden dat de meerderheid van geïnfecteerde cellen bij infectie met EHV-1 CD172a+ mononucleaire cellen, waarschijnlijk dendritische cellen, zijn gevolgd door CD5+ T-lymfocyten, onafhankelijk van de neuropathogeniteit van de stam (Grijspeerdt et al., 2010). Wel kon een proportioneel verschil gezien worden tussen de neuropathogene en nietneruopathogene stam (Grijspeerdt et al., 2010). In een in-vitrostudie aan de hand van equine nasale mucosale explantaten van Vandekerckhove et al. (2010) konden de bevindingen van Grijspeerdt et al. (2010) bevestigd worden.
6
1.2.3. Viremie bij infectie met EHV-4 EHV-4 heeft geen opmerkelijk tropisme voor PBMC (Patel et al., 1982; Slater et al., 2006; Vandekerckhove et al., 2011). Geïnfecteerde cellen onder de basale membraan werden bij infectie met dat virus zelden opgemerkt (Fig. 4) (Vandekerckhove et al., 2011). Een EHV-4geïnduceerde viremie komt dan ook zelden voor (Patel et al., 1982; Edington et al., 1986; Harless en Pusterla, 2006; Osterrieder en Van de Walle, 2010). Pusterla et al. (2005) toonden aan dat de hoeveelheid viraal DNA in PBMC bij een EHV-4 infectie laag is en van kortere duur dan bij infectie met EHV-1 (Pusterla et al., 2005). Later zagen Osterrieder en Van de Walle (2010) op hun beurt dat bij infectie met EHV-4 een significant kleiner percentage geïnfecteerde PBMC aanwezig is. Die bevindingen wijzen erop dat het verschil in pathogenetisch potentieel tussen EHV-1 en EHV-4 te wijten is aan de slechts beperkte mogelijkheid van EHV-4 om PBMC te infecteren (Osterrieder en Van de Walle, 2010). Toch werden enkele gevallen van EHV-4-geïnduceerde abortus gepubliceerd (Meyer et al., 1987; Gerst et al., 2003; Ostlund, 1993; Pusterla et al., 2005) en ook een geïsoleerd geval van EHV-4-geïnduceerde EHM (Meyer et al., 1987). Verheyen et al. (1998) meldden eveneens een mogelijk geval van EHV-4-geïnduceerde ataxie in een vierjarige warmbloedmerrie, maar hiervan kon geen definitieve diagnose gesteld worden (Verheyen et al., 1998). A
B
Fig. 4 Confocale microscopieopnames die virale plaques (groen) in het epitheel illustreren, 72 uur post-infectie. (A) de situatie bij infectie met EHV-1, met duidelijk individuele EHV-1-geïnfecteerde cellen, onder de basale membraan (rood) en (B) de situatie bij infectie met EHV-4, waarbij geïnfecteerde cellen onder de basale membraan afwezig zijn (uit Vandekerckhove et al., 2011).
1.3. Secundaire replicatie t.h.v. inwendige organen 1.3.1. EHV-1 en het tropisme voor endotheelcellen Naast het tropisme voor PBMC heeft EHV-1 ook een specifiek tropisme voor endotheelcellen, volgens vele onderzoekers vooral ter hoogte van de drachtige uterus en het centraal zenuwstelsel (Thorsen en Little, 1975; Patel et al., 1982; Edington et al., 1986; Smith et al., 2002). Endotheliale infectie met EHV-1 kon echter gedetecteerd worden in uiteenlopende weefsels (Thorsen en Little, 1975; Patel et al., 1982; Edington et al., 1986; Donaldson en Sweeney, 1998). EHV-1 kon namelijk geïsoleerd worden uit de thymus en de dunne darm (Patel et al., 1982) en met behulp van immunofluorescentie konden EHV-1-antigenen aangetoond worden in het ademhalingsstelsel, lymfeknopen, de conjunctiva, de thymus en de
7
dunne darm (Thorsen en Little, 1975; Patel et al., 1982), evenals in de milt (Edington et al., 1986). Een EHV-1-geïnduceerde uveïtis kon eveneens bevestigd worden (McCartan et al. 1995; Donaldson en Sweeney 1998). De secundaire replicatie in endotheelcellen resulteert in een vasculitis met belangrijke gevolgen (Edington et al., 1986; Kohn en Fenner, 1987; Edington et al., 1991; Donaldson en Sweeney, 1998). Smith et al. (2001, 2002) stelden vast dat een in-vivo-infectie van endotheelcellen door EHV-1 gebeurt na direct contact tussen met virus geïnfecteerde PBMC en endotheelcellen, en niet als gevolg van een extracellulaire vrije virale fase (Smith et al., 2001; Smith et al., 2002). Van de Walle et al. (2008) bevestigden dat. 1.3.2. Infectie van endotheelcellen in de drachtige uterus De vasculitis in endometriale bloedvaten resulteert in een ischemische necrose met thrombose, perivasculaire cuffing van mononucleaire cellen en perivasculair oedeem (Edington et al., 1991; Smith et al., 1993; Smith et al., 1996). Ook de foetus kan geïnfecteerd worden, maar dat is niet noodzakelijk om tot abortus te leiden (Edington et al., 1991; Smith en Borchers, 2001). Een wijdverspreide infectie van endotheelcellen in de drachtige uterus zal leiden tot abortus met een virusnegatieve foetus, terwijl er bij een minder uitgebreide infectie overdracht van virus kan zijn naar de foetus (Patel en Heldens, 2005). Een studie van Smith et al. (1996) toonde aan dat bij infectie met EHV-1 tijdens vroege dracht het percentage vasculitis en antigeenexpressie in de drachtige uterus veel kleiner is dan bij infectie tijdens late dracht. In die studie werd ook gezien dat bij een merrie in vroege dracht thrombose en ischemie in de uterus ten gevolge van infectie met EHV-1 zelden voorkomen (Smith et al.,1996). Wat betreft het tropisme voor endotheelcellen in de drachtige uterus, vooral tijdens late dracht, konden Smith et al. (2001, 2002) een verband leggen tussen het tropisme voor die cellen en een verhoogde expressie van bepaalde geactiveerde adhesiemoleculen. De expressie van die specifieke adhesiemoleculen is normaal in de drachtige uterus en komt daar tenminste voor tijdens late dracht (Smith et al. 2001). 1.3.3. Infectie van endotheelcellen in het centraal zenuwstelsel Veroorzaakte letsels. In het centraal zenuwstelsel ontstaat er bij infectie met EHV-1 een multifocale vasculitis (Edington et al., 1986; Kohn en Fenner, 1987; Donaldson en Sweeney, 1998) met lokale hemorrhagieën en microthrombi (Thorsen en Little, 1975; Patel et al., 1982; Edington et al., 1986; Stierstorfer et al., 2002), perivasculaire cuffing van mononucleaire cellen (Thein, 1981; Edington et al., 1986; Van Maanen et al., 2001; Stierstorfer et al., 2002; Allen en Breathnach, 2006; Goodman et al., 2007) en axonale zwelling (Edington et al., 1986; Stierstorfer et al., 2002; Van Maanen et al., 2001). Ook werd door sommige onderzoekers degeneratie van de myelineschede waargenomen (Thein, 1981; Edington et al., 1986), maar dit kon in een studie van Stierstorfer et al. (2002) echter moeilijk onderscheiden worden van secundaire schade aan de myelineschede door hypoxie (Stierstorfer et al., 2002). De neurologische letsels worden geïllustreerd in Fig. 5 en 6.
8
Fig. 5 Vasculitis in een bloedvat ter hoogte van. het Fig. 6 Perivasculaire cuffing van mononucleaire cervicale ruggenmerg. De pijl duidt een gezwollen cellen in de grijze stof van het ruggenmerg (uit Stierstorfer et al., 2002). axon aan (uit Stierstorfer et al., 2002).
In neuronen en andere neuronale cellen kan geen virus gedetecteerd worden (Patel et al., 1982; Smith, 1997), wat erop wijst dat EHM niet het resultaat is van een virale infectie van neuronale
cellen,
maar
wel
degelijk
van
een
vasculitis
met
een
ischemische
myeloencephalitis tot gevolg (Edington et al., 1986; Allen en Breathnach, 2006). Dat staat in contrast met andere α-herpesvirussen die wel een encefalitis veroorzaken door neuronale infectie (Edington et al., 1986; Goodman et al., 2007), zoals het herpes simplex virus, het boviene herpesvirus-1 en het pseudorabiesvirus (Van Maanen, 2002). Ook circulerende immuuncomplexen werden vroeger in verband gebracht met het ontstaan van EHM (Thein, 1981; Edington et al., 1986; Meyer et al., 1987). Edington et al. (1986) konden met behulp van immunofluorescentie de letsels in het ruggenmerg echter steeds associëren met geïnfecteerde endotheelcellen en toonden zo aan dat immuuncomplexen slechts van secundair belang zijn in de pathogenese (Edington et al., 1986). Wel werd gezien dat de hoeveelheid circulerende immuuncomplexen groter was in merries die zenuwstoornissen vertoonden (Edington et al., 1986). Affiniteit
van
EHV-1
voor
endotheelcellen
in
het
centraal
zenuwstelsel.
Het
onderliggende mechanisme van de affiniteit van EHV-1 voor endotheelcellen in het centraal zenuwstelsel is nog niet geheel gekend (Smith et al., 2001; Smith et al., 2002; Wilsterman et al., 2011). Aan de hand van een in-vitrostudie over gevoeligheid van bepaalde endotheelcellen voor EHV-1, kon het tropisme nog niet verklaard worden (Goehring et al., 2011). Het is echter niet uitgesloten dat die situatie in-vivo anders is. In principe kan elk deel van het centraal zenuwstelsel aangetast worden (Kohn en Fenner, 1987; Goehring et al., 2006; Goodman et al., 2007), maar vooral endotheelcellen in het ruggenmerg worden getroffen (Patel et al., 1982; Kohn en Fenner, 1987; Goodman et al., 2007). De laesies zijn hierbij voornamelijk laag-thoracaal en hoog-lumbaal gelokaliseerd (Goodman et al., 2007). Daarnaast kunnen zowel de witte als grijze stof aangetast zijn (Patel et al., 1982; Edington et al., 1986; Stierstorfer et al., 2002). In een studie van Stierstorfer et al. (2002) werd echter gezien dat de axonale zwelling die optreedt bij EHM, veel uitgebreider is in de witte dan in de grijze stof (Stierstorfer et al., 2002).
9
Puntmutatie in het DNA-polymerasegen bepaalt de neuropathogeniteit. Meyer et al. (1987) wezen reeds in 1987 het voorkomen van neuropathogene stammen aan als hypothetische oorzaak voor de zeldzame invasie van het centraal zenuwstelsel door EHV-1, wat later ook bevestigd kon worden door Nugent et al. (2006) en Goodman et al. (2007). Nugent et al. (2006) slaagden erin een variatie in het genoom van EHV-1 aan te tonen, die rechtstreeks gecorreleerd is met neuropathogeniteit (Nugent et al., 2006). Meer specifiek gaat het om een puntmutatie in het virale DNA-polymerasegen (ORF30) op nucleotidenpositie 2254, namelijk een mutatie van adenine (A2254) naar guanine (G2254) (Nugent et al., 2006). Dit single-nucleotidepolymorfisme (SNP) leidt tot een aminozuursubstitutie van asparagine (N, codon AAC) door asparaginezuur (D, codon GAC) op aminozuurpositie 752 (Nugent et al., 2006). N752-stammen hebben over het algemeen een duidelijk kleiner potentieel om neurologische
symptomen
te
veroorzaken
(Goodman
et
al.,
2007).
Wat
betreft
groeikarakteristieken in endotheelcellen konden Tearle et al. (2003) en Chiam et al. (2006) geen verschil waarnemen tussen EHV-1-stammen met hoge en lage neuropathogeniteit. Verschillen in virulentie tussen stammen zouden dus niet daaraan toegewezen kunnen worden (Tearle et al., 2003, Chiam et al., 2006). Wat dan wel de oorzaak ervan lijkt te zijn is, zoals hoger reeds vermeld, een verschil in de invasiekinetiek en veroorzaakte viremie tussen neuropathogene (D752) stammen en niet-neuropathogene (N752) stammen (Allen en Breathnach, 2006; Nugent et al., 2006; Goodman et al., 2007; Vanderkerckhove et al., 2010). Goodman et al. (2007) vermoedden dat door het lager niveau van viremie waarmee nietneuropathogene (N752) stammen geassocieerd worden, een geringere endotheliale schade veroorzaakt wordt in de bloedvaten van het centraal zenuwstelsel, die eventueel ook verklaard kan worden door een minder efficiënte transmissie van virus van circulerende PBMC naar endotheliale cellen (Goodman et al. 2007). De meerderheid van de EHV-1 stammen die in circulatie zijn, coderen voor N752 (Nugent et al., 2006), al neemt de prevalentie van neuropathogene stammen wel toe (Smith et al., 2010). In een studie van Nugent et al. (2006) kon ongeveer 95% van de niet-neuropathogene stammen getypeerd worden als N752, naast ongeveer 86% van de neuropathogene stammen als D752. De specificiteit van de besproken genetische merker voor neuropathogeniteit is dus zeker niet 100% (Nugent et al., 2006; Pusterla et al., 2009). Ondanks de grote correlatie tussen het viraal genotype van het virus en het optreden van EHM, is het bijgevolg logisch dat er af en toe gevallen zijn van EHM bij paarden die geïnfecteerd werden met het zogenaamde niet-neuropathogene genotype N752 (Perkins et al., 2009). Een mogelijk verband tussen het optreden van EHM en andere puntmutaties kon nog niet uitgesloten worden (Nugent et al., 2006; Yamada et al., 2008). Het aandeel van andere virale factoren die het ontstaan van EHM in de hand kunnen werken, zoals bijvoorbeeld infectiedosis, mag echter ook niet vergeten worden (Ostlund, 1993; Perkins et al., 2009), evenals gastheerfactoren, zoals leeftijd, immuniteitsstatus en hormonale status van de gastheer (Nugent et al., 2006; Henninger et al., 2006). Immers, paarden van elke leeftijd, elk geslacht en elk ras kunnen EHM ontwikkelen, onafhankelijk van hun vaccinatiestatus (Ostlund, 1993; Allen en Breathnach,
2006),
maar
bepaalde
rassen,
zoals
warmbloeden,
thoroughbreds,
10
standardbreds en trekpaarden, lijken gepredisponeerd te zijn, net als paarden ouder dan 3 jaar (Goehring et al., 2006). Daarnaast worden drachtige of lacterende merries frequenter getroffen dan merries zonder veulen (Thein, 1981; McCartan et al., 1995), in een studie van McCartan et al. (1995) was de incidentie bij die groepen respectievelijk 38% en 2%. Conclusie is dat beide genotypes die betrekking hebben op het viraal DNA-polymerasegen, het endotheel van het centraal zenuwstelsel kunnen infecteren, maar dat D752-stammen eventueel efficiënter zijn in het infecteren van PBMC (Perkins et al., 2009; Vandekerckhove et al., 2010) en eventueel ook in de transmissie van PBMC naar endotheelcellen (Goodman et al., 2007). Het belang van glycoproteïnen in de neuropathogeniteit. Bij de directe cel-totceltransmissie zijn verschillende glycoproteïnen betrokken (Osterrieder en Van de Walle, 2010; Goehring et al., 2011), waarvan voornamelijk glycoproteïne D (gD) essentieel is (Van de Walle et al., 2008; Osterrieder en Van de Walle, 2010), ook voor het ontwijken van antilichamen waaraan vrij virus zou worden blootgesteld (Goehring et al., 2011). Naast de mutatie in het DNA-polymerasegen, lijkt er tussen neuropathogene en niet-neuropathogene stammen ook een verschil te zijn wat betreft die belangrijke glycoproteïnen. Het gD van neuropathogene stammen lijkt potenter dan dat van niet-neuropathogene stammen met een minder efficiënte cel-tot-celtransmissie van die laatste tot gevolg (Van de Walle et al., 2008). Zo kunnen verschillen in glycoprotëinen een belangrijke rol spelen in virulentieverschillen tussen verschillende stammen van EHV-1 (Osterrieder en Van de Walle, 2010). De mogelijkheid tot een betere immuno-evasie kan het pathogenetische potentieel van een virusstam immers alleen maar ten goede komen. 1.4. Latentie EHV-1 en EHV-4 kunnen een latente infectie veroorzaken met levenslange persistentie van virus in de gastheer (Foote et al., 2006). Reactivatie van latent virus kon aangetoond worden na toediening van dexamethasone aan eerder geïnfecteerde en herstelde paarden (Gibson et al., 1992; Slater et al., 1994; Pusterla et al., 2010). In een studie van Slater et al. (1994) bleek de voornaamste site van latentie van EHV-1 het ganglion trigeminale te zijn, maar latent virus kon ook aangetoond worden in lymfoïd weefsel (Slater et al., 1994). Andere onderzoekers (Taouji et al., 2002) vernoemen echter lymfoïd weefsel als voornaamste plaats van latentie van EHV-1 en Chesters et al. (1997) konden zelfs alleen in lymfoïd weefsel latent EHV-1 aantonen. Voor EHV-4 werd latent virus ook aangetoond in het ganglion trigeminale (Borchers et al., 1999; Taouji et al., 2002).
2. SYMPTOMEN 2.1. Door infectie in het ademhalingsstelsel De incubatieperiode van de ademhalingssymptomen bedraagt 2 tot 10 dagen (Gibson et al., 1992; Sutton et al., 1998; Harless en Pusterla, 2006). De ademhalingsinfectie beperkt zich
11
meestal tot de hogere luchtwegen en uit zich dan in een meestal milde acute rhinitis en faryngitis (Allen et al., 2002). De symptomen die waargenomen kunnen worden, zijn koorts, sereuze tot muceuze neus- en oogvloei, lymfadenopathie en eventueel ook sporadisch hoesten (Gibson et al., 1992; Ostlund, 1993; Smith et al., 1996; Sutton et al., 1998; Harless en Pusterla, 2006; Grijspeerdt et al., 2010). De koorts heeft vaak een bifasisch verloop (Gibson et al., 1992; Ostlund, 1993), waarbij de tweede koortspiek geassocieerd wordt met de viremische fase (Harless en Pusterla, 2006; Goehring et al., 2010b). Uitbreiding van de infectie naar de diepere luchtwegen met ernstige pathologie als gevolg is mogelijk (Del Piero et al., 2000). Het klinisch beeld verschilt dus van individu tot individu en kan variëren van klinisch nagenoeg normaal tot een levensbedreigende primaire virale pneumonie (Gibson et al., 1992; Del Piero et al., 2000; Allen, 2002).
Fig. 7 Data uit een klinische studie waarbij een groep pony’s en paarden geïnfecteerd werden met een neuropathogene (D752) stam (●) van EHV-1 en zijn nietneuropathogene N752-mutant (○). De asterix duidt een significante p-waarde aan (p<0,05). (A en B) De gemiddelde klinische scores van de ademhalingsinfectie (neusvloei, hoest en lymfadenopathie). (C en D) De gemiddelde rectale temperatuur (°C) (uit Goodman et al., 2007).
Bij infectie met neuropathogene stammen blijkt de koortspiek in sommige studies hoger en van langere duur te zijn dan bij infectie met niet-neuropathogene stammen (Fig. 7) (Allen en Breathnach, 2006; Goodman et al., 2007). Mogelijkerwijs treedt de koorts bij infectie met nietneuropathogene stammen wel vroeger op (Grijspeerdt et al., 2010). Daarnaast is de ernst van de respiratoire symptomen zoals neusvloei, hoest en lymfadenopathie, volgens sommige onderzoekers groter bij infectie met neuropathogene stammen (Allen en Breathnach, 2006; Goodman et al., 2007). In de studie van Goodman et al. (2007) werd gezien dat een neuropathogene D752-stam significant ernstigere respiratoire symptomen en een hogere
12
rectale temperatuur veroorzaakte dan zijn N752-mutant, wat impliceert dat het D/Npolymorfisme aan de basis ligt daarvan. In een experiment van Grijspeerdt et al. (2010) werd echter geen significant verschil waargenomen in de ontwikkelde respiratoire symptomen bij infectie met een neuropathogene of niet-neuropathogene stam. Integendeel, er werd zelfs een ergere en pijnlijkere lymfadenopathie waargenomen bij infectie met de nietneuropathogene stam (Grijspeerdt et al., 2010). 2.2. Door infectie in de drachtige uterus Abortus vindt meestal plaats tijdens de laatste vier maanden van de dracht (Smith, 1997; Gerst et al., 2003; Smith et al., 2003), na een sterk variërende incubatieperiode (Smith, 1997; Van Maanen, 2002). Slechts één of enkele merries kunnen getroffen worden of er kan een abortusstorm zijn (Smith, 1997). De abortus treedt meestal snel en spontaan op, zonder veel retentio secundinarum (Van Maanen, 2002). Voorafgaande respiratoire symptomen bij de merrie zijn gewoonlijk niet aanwezig of worden niet opgemerkt (Smith, 1997). Foeti die geaborteerd worden voor 6 maanden dracht zijn meestal autolytisch (Smith, 1997; Van Maanen, 2002). Bij late abortus zijn de foeti meestal vers (Smith, 1997) en kunnen er subcutaan oedeem, pleurale effusie, pulmonair oedeem, splenomegalie en multifocale necrosehaardjes op de lever waargenomen worden (Smith, 1997; Van Maanen, 2002). Merries die zeer laat in de dracht geïnfecteerd worden, kunnen het leven geven aan een zwak, geïnfecteerd veulen met ademhalingsproblemen dat meestal sterft binnen enkele dagen na de partus (Smith, 1997; Murray et al., 1998; Smith et al., 2003; Patel en Heldens, 2005). 2.3. Door infectie in het centraal zenuwstelsel De neurologische symptomen treden acuut op (Kohn en Fenner, 1987; Ostlund, 1993; Donaldson en Sweeney, 1997; Donaldson en Sweeney, 1998), 6 tot 10 dagen na de primaire respiratoire infectie (Edington et al., 1986; Mumford en Edington, 1980; Patel et al., 1982; Kohn en Fenner, 1987) en een aantal dagen na het optreden van viremie (McCartan et al., 1995). Een intensiteitspiek vindt plaats na ongeveer twee dagen (Ostlund, 1993; McCartan et al., 1995; Donaldson en Sweeney, 1997). Opvallend is dat bij merries het verloop van EHM vaak ernstiger is dan bij hengsten of ruinen (Thein, 1981; Van Maanen et al., 2001; Goehring et al., 2006). Volledig herstel is mogelijk, maar kan meerdere weken tot zelfs maanden duren (Ostlund, 1993; McCartan et al., 1995; Wilson, 1997; Donaldson en Sweeney, 1998; Van Maanen, 2002). Naar analogie met de voornaamste lokalisatie van de laesies wordt de achterhand het meest aangetast (Thein, 1981; Patel et al., 1982; Edington et al., 1986; Kohn en Fenner, 1987; Wilson, 1997; Donaldson en Sweeney, 1998; Henninger et al., 2007). De symptomen kunnen variëren van parese, over een meestal symmetrische (Kohn en Fenner, 1987; Donaldson en Sweeney, 1998) ataxie, tot paralyse en totale paraplegie (Thein, 1981; Kohn en Fenner, 1987; Ostlund, 1993; McCartan et al., 1995; Wilson, 1997; Stierstorfer et al., 2002; Goehring et al., 2010a). Wanneer decubitus optreedt, is dit vaak een voorbode voor een fatale afloop (Ostlund, 1993; McCartan et al., 1995; Wilson, 1997; Van Maanen et al.,
13
2001). De aanwezigheid van spierspasmen en normale buigreflexen is een klinische aanwijzing dat de witte stof waarschijnlijk meer aangetast wordt dan de grijze (Kohn en Fenner, 1987). Aantasting van de cauda equina, gepaard gaande met hypotonie van staart en anus en urinaire incontinentie, kan eveneens voorkomen (Kohn en Fenner, 1987; Meyer et al., 1987; Henninger et al., 2007; Pusterla et al., 2009), alsook aantasting van kopzenuwen (Kohn en Fenner, 1987; Donaldson en Sweeney, 1998). Vaak komen er voorafgaandelijk aan de neurologische symptomen ademhalingssymptomen, abortus of neonatale sterfte voor in de groep paarden die door EHM getroffen wordt (Kohn en Fenner, 1987; Ostlund, 1993; Wilson, 1997). Dat kan bijgevolg een belangrijk gegeven zijn in de anamnese. In verschillende studies konden door experimentele infectie met neuropathogene EHV-1stammen vreemd genoeg geen (ernstige) zenuwsymptomen gereproduceerd worden (Gibson et al., 1992; Allen en Breathnach, 2006; Goodman et al., 2007; Grijspeerdt et al., 2010). In de meeste van die studies werden jonge dieren gebruikt en in de studie van Goodman et al. (2007) werd bij de inoculatie van oudere dieren een duidelijk hoger percentage door EHM getroffen. De reden waarom EHM zo moeilijk reproduceerbaar is, voornamelijk in jonge dieren,
is
nog
steeds
onduidelijk.
Wel
zijn
er
vermoedens
dat
niet-specifieke
immuunresponsen, die bij jonge dieren van groot belang zijn, een rol spelen (Gibson et al., 1992). Voorbeelden daarvan zijn snel stijgende interferonlevels in de nasale mucosa en een hoge activiteit van natural killer-cellen (Gibson et al., 1992; Grijspeerdt et al., 2010). Daarnaast zou een voorafgaande blootstelling aan EHV een mogelijke risicofactor kunnen zijn voor het ontstaan van EHM (Donaldson en Sweeney, 1997).
3. BESCHERMING DOOR VACCINATIE Paarden met hoge titers systemische antilichamen zijn niet beschermd tegen EHM en abortus (Van Maanen, 2002; Goodman et al., 2006), vermits de infectie van PBMC en endotheelcellen primair gebeurt via directe cel-tot-celtransmissie en het virus dus niet wordt blootgesteld aan systemische antilichamen (Van de Walle et al., 2008; Osterrieder en Van de Walle, 2010; Goehring et al., 2011). Bescherming tegen EHV-1 is dus vooral gebaseerd op een cellulaire immuniteit (Goehring et al., 2010b). Na vaccinatie wordt een vermindering van de klinische symptomen en nasale virusuitscheiding waargenomen (Vandekerckhove et al., 2011; Goehring et al., 2010b), alsook een reductie van viremie (Goehring et al., 2010b). De bescherming tegen viremie is echter niet volledig (Goehring et al., 2010b) en het risico op het ontwikkelen van EHM en/of abortus blijft dus wel degelijk nog steeds aanwezig (Stierstorfer et al., 2002; Van Maanen, 2002; Goodman et al., 2006; Goehring et al., 2010b). Een viremie zou theoretisch voorkomen kunnen worden, wanneer verhinderd wordt dat EHV-1 de basale membraan kruist. Dat kan het beste bereikt worden door inductie van lokale immuniteit ter hoogte van het ademhalingsepitheel door intranasale vaccinatie met verzwakte EHV-1stammen (Vandekerckhove et al., 2011). Het bleek reeds succesvol te zijn tegen viremie in een studie van Patel et al. (2003), maar is echter niet zonder gevaar, wegens het risico op mutatie naar mogelijks erg virulente neuropathogene EHV-1-stammen en de verspreiding
14
ervan. Het gebruik van minder gevaarlijke verzwakte EHV-4-stammen kan geen oplossing bieden, vermits kon aangetoond worden dat er geen antigenische kruisreactiviteit is tussen EHV-1 en EHV-4 (Edington en Bridges, 1990). Vaccinatie verhoogt ook niet de titers maternale EHV-1-antistoffen in colostrum (Foote et al., 2006) en infectie met EHV-1 en EHV4 werd aangetoond in slechts enkele weken oude veulens van gevaccineerde merries (Foote et al., 2004; Foote et al., 2006). De maternale immuniteit is dus verre van voldoende. Dat is eveneens een belangrijk gegeven in de strijd tegen EHV, vermits infectie van jonge naïeve veulens de circulatie van EHV-1 en EHV-4 in de populatie in stand houdt, vooral wanneer ze later, latent geïnfecteerd, als fokmerries aangewend worden (Foote et al., 2006).
15
BESPREKING De laatste jaren hebben verschillende onderzoeken vele nieuwe dingen over EHM aan het licht gebracht, maar toch zijn er ook nog steeds heel wat onduidelijkheden. Het pathogenetisch verschil tussen EHV-1 en EHV-4 lijkt in de literatuur grotendeels uitgeklaard te zijn. Wel kan de vraag gesteld worden of de enkele gevallen van abortus en zenuwstoornissen na infectie met EHV-4 (1) veroorzaakt werden door isolaten van EHV-4 die werkelijk toch de potentie ontwikkeld hebben om PBMC te infecteren of (2) het gevolg waren van een louter toevallige infectie van PBMC met EHV-4. Over de replicatie ter hoogte van de bovenste ademhalingswegen zijn er in de literatuur een paar tegenstrijdigheden. Allen en Breathnach (2006), Nugent et al. (2006) en Goodman et al. (2007) zagen bij infectie met neuropathogene stammen een langere virusuitscheiding. Grijspeerdt et al. (2010) merkten echter het tegenovergestelde op, namelijk een langere virusuitscheiding bij infectie met nietneuropathogene stammen. Gebaseerd op Vandekerckhove et al. (2010) lijken verschillen tussen stammen wat betreft de respiratoire replicatie niet afhankelijk van het D/N752polymorfisme in het virale DNA-polymerase, maar eerder stamafhankelijk. Dat zou betekenen dat een neuropathogeen isolaat dus niet automatisch aanleiding geeft tot de meeste ademhalingspathologie en langste virusuitscheiding. Het verschil in invasiekinetiek, dat opgemerkt werd tussen neuropathogene en niet-neuropathogene stammen, lijkt daarentegen niet stamafhankelijk, maar lijkt wel degelijk geassocieerd te zijn met het D/N752-polymorfisme (Vandekerckhove et al., 2010). Conclusie is dat het verschil in neuropathogeniteit tussen verschillende EHV-1-stammen mogelijkerwijs niet bepaald wordt door de replicatie ter hoogte van het ademhalingsstelsel op zich, maar wel door een verhoogde invasiekinetiek van neuropathogene stammen waarvan het D/N752-polymorfisme in het virale DNA-polymerase aan de basis ligt. Een hogere invasiekinetiek kan leiden tot een langere en hogere viremie en voorlopig wordt aangenomen dat die langere, en eventueel grotere, blootstelling van het endotheel in het centraal zenuwstelsel aan EHV-1 het ontstaan van EHM in de hand zou werken. Hoewel de resultaten uit de studies van Allen en Breathnach (2006) en Goodman et al. (2007) dat argument ondersteunen, konden daartoe echter nog geen sluitende bewijzen geleverd worden. De incidentie van zenuwstoornissen was, zoals in vele andere studies, ook in die studies immers laag, zodat het moeilijk is een causaal verband aan te tonen tussen de sterkere viremie en het ontstaan van zenuwstoornissen. Bovendien rijst bij mij de vraag waarom de sterkere viremie bij infectie met neuropathogene stammen aanleiding geeft tot een groter risico op zenuwstoornissen, maar niet tot meer abortus. Er moet toch meer aan de hand zijn. Dat bovendien de correlatie tussen de neuropathogeniteit van bepaalde EHV-1stammen en de aanwezigheid van het D/N752-polymorfisme duidelijk niet absoluut is (Nugent et al., 2006; Perkins et al., 2009; Pusterla et al., 2009), duidt daar eveneens op en onderstreept het belang van verder onderzoek naar andere factoren die neuropathogeniteit van EHV-1 in de hand werken, zowel viraal als gastheerafhankelijk. Aangaande de pathogenese van abortus en EHM, wordt in de literatuur vooral gesproken over een tropisme van EHV-1 voor endotheelcellen in de drachtige uterus en het centraal
16
zenuwstelsel. Een reden voor dit specifiek tropisme werd echter nog niet gevonden en mogelijks is het er zelfs ook helemaal niet. Daarvoor haal ik verschillende argumenten aan, namelijk (1) een gelijkaardige vaststelling als de link tussen het tropisme voor endotheelcellen en het voorkomen van bepaalde adhesiemoleculen zoals in de drachtige uterus (Smith et al., 2001; Smith et al., 2002), kon voor het centraal zenuwstelsel nog niet gedaan worden, (2) met EHV-1 geïnfecteerde endotheelcellen konden in uiteenlopende weefsels gedetecteerd worden (Thorsen en Little, 1975; Patel et al., 1982; Edington et al., 1986; Donaldson en Sweeney, 1998) en (3) wat betreft de gevoeligheid van endotheelcellen van verschillende oorsprong voor EHV-1 kon, althans in-vitro, nog geen verschil aan het licht gebracht worden (Goehring et al., 2011). Wat het klinische aspect van EHV-1 betreft, is verder onderzoek naar ontwikkeling van een goed vaccin dat wel voldoende beschermt tegen viremie, en dus ook tegen abortus en EHM, van uitermate belang om nieuwe uitbraken van abortus en EHM te voorkomen of sterk te reduceren. Daarbij moet ook aandacht geschonken worden aan veulens die vaak reeds zeer vroeg in het leven geïnfecteerd worden en latent geïnfecteerd blijven. Wanneer deze veulens later in de fokkerij ingeschakeld worden, kunnen zij immers een bron van infectie zijn voor hun nakomelingen en zo de infectiecyclus in stand houden. Op de eerste plaats is vermindering van de infectiedruk waaraan veulens blootgesteld worden uiterst belangrijk. Een tweede belangrijk punt is het verhogen van de immuniteit van de veulens. Vermindering van de infectiedruk voor veulens kan gebeuren door vaccinatie van fokmerries, maar ook door scheiding van leeftijdsgroepen, zoals bijvoorbeeld (1) fokmerries en hun veulens, (2) jonge paarden en (3) volwassen (sport)paarden. De meeste paarden maken immers in de loop van de eerste twee levensjaren een primo-infectie door, die gepaard gaat met een relatief hoge en lange virusuitscheiding. Daarnaast komen volwassen sportpaarden veel in contact met andere, eventueel geïnfecteerde, paarden, waardoor herinfectie en opnieuw virusuitscheiding kan optreden, echter zonder veel symptomen. Bovendien ondervinden sportpaarden doorgaans ook meer stress, wat kan leiden tot reactivatie van het virus. Verhoging van de immuniteit bij veulens is moeilijk. Vermits ze reeds zeer vroeg in het leven geïnfecteerd kunnen worden, is parenterale vaccinatie weinig succesvol wegens interferentie met de maternale immuniteit en bovendien beschermen systemische antilichamen onvoldoende. Eventueel zou gewerkt kunnen worden met intranasale vaccinatie van jonge veulens, met de bedoeling een lokale immuniteit te induceren. Daarbij dient, net zoals hoger in deze literatuurstudie, de opmerking gemaakt te worden over het mogelijke risico op mutatie van de verzwakte stammen die gebruikt worden voor intranasale vaccinatie naar mogelijks erg virulente neuropathogene stammen. Een verhoging van maternale antistoffen in colostrum zou eveneens beoogd kunnen worden, maar zal hoogstwaarschijnlijk ook weinig resultaat opleveren, wederom vermits systemische antilichamen onvoldoende bescherming bieden. Een probleem bij in-vivostudies naar EHM is de kleine steekproef, soms te klein om goed onderbouwde conclusies te maken. De lange generatietijd van paarden, de omvang van de dieren, het dure onderhoud, de vereiste isolatiemaatregelen wegens risico op uitbraken, en
17
het ethische aspect, maken het moeilijk om experimenteel onderzoek te doen op een voldoende grote steekproef. Daardoor worden vaak slechts één neuropathogene (D752) en één niet-neuropathogene stam (N752) gebruikt. Gevolgen daarvan zijn de soms tegenstrijdige resultaten uit gelijkaardige studies, die misschien louter toeval zijn. Stamverschillen, onafhankelijk van neuropathogeniteit, kunnen zo immers niet onderscheiden worden van verschillen veroorzaakt door het D/N-polymorfisme. Ook worden vaak veulens of jonge paarden gebruikt, maar het is gebleken dat die niet steeds representatief zijn voor infectie van volwassen paarden met EHV-1 (Gibson et al., 1992; Allen en Breathnach, 2006; Goodman et al., 2007; Grijspeerdt et al., 2010). Wel zijn ondertussen goede in-vitromodellen ontworpen, zoals het model met mucosale explantaten van Vandekerckhove et al. (2010). Ook casestudies kunnen een oplossing bieden, maar het aantal onbekenden daarbij is steeds vrij groot, wat de interpretatie bemoeilijkt. Tot slot blijkt het zeer moeilijk om EHM experimenteel te reproduceren, hoewel uitbraken jaarlijks voorkomen en er bij die uitbraken toch hoge percentages paarden getroffen kunnen worden. Misschien heeft dat te maken met de meestal jonge leeftijd van de dieren die gebruikt worden in experimentele onderzoeken. Misschien is de incubatietijd waarop de aangewende dieren geëuthanaseerd worden soms te vroeg voor de ontwikkeling van EHM. Misschien speelt voorafgaand contact met EHV een belangrijkere rol dan gedacht wordt en is de pathogenese nog ingewikkelder dan gedacht. Moge het in ieder geval duidelijk zijn dat er over EHM, ruimer gesproken over EHV-1, nog veel onduidelijkheden zijn. Vooral hoe het virus exact de sprong maakt van het respiratoir epitheel naar PBMC en van PBMC naar endotheelcellen, welke factoren die transmissie bepalen en wat de neuropathogene stammen daarin onderscheidt van de niet-neuropathogene, is nog van belang voor verdere onderzoeken. Het inzicht in de cel-tot-celtransmissie van het virus en de extra potentie die neuropathogene stammen daarvoor bezitten, is immers belangrijk voor de ontwikkeling van succesvolle methoden die viremie kunnen voorkomen en zo de kans op EHM (en abortus) drastisch kunnen verminderen. Ook epidemiologisch onderzoek naar onder andere het ontstaan van de zogenaamde neuropathogene D752-stammen, kan belangrijk zijn, vooral in de preventie van EHM-uitbraken.
18
REFERENTIELIJST RESPE (2012). Un foyer de myeloencéphalite à HVE1 (MHVE) dans le Finistère (29) – France. Internetreferentie: http://www.respe.net/node/1196 (geconsulteerd op 10 april 2012). Sectorraad Paarden Nederland (2012). Sectorraad Paarden adviseert om zo min mogelijk paarden te vervoeren. Internetreferentie: http://www.sectorraadpaarden.nl/persberichten.hml?news_item_id=53 (geconsulteerd op 10 april 2012). Allen G.P. (2002). Respiratory infections by equine herpesvirus 1 and 4. In: Lekeux P. (Ed.), Equine
Respiratory
Diseases.
International
Veterinary
Information
Service,
Ithaca,
www.ivis.org. Allen G.P., Breathnach C.C. (2006). Quantification by real-time PCR of the magnitude and duration of leucocyte-associated viraemia in horses infected with neuropathogenic versus non-neuropathogenic strains of EHV-1. Equine Veterinary Journal 38(3), 252-257. Borchers K., Wolfinger U., Ludwig H. (1999). Latency associated transcripts of equine herpesvirus type 4 in trigeminal ganglia of naturally infected horses. Journal of General Virology 80, 2165-2171. Chesters P.M., Allsop R., Purewal A., Edington N. (1997). Detection of latency-associated transcripts of equid herpesvirus 1 in equine leukocytes but not in trigeminal ganglia. Journal of Virology 71, 3437-3443. Chiam R., Smid L., Kydd J.H., Smith K.C., Platt A., Davis-Poynter N.J. (2006). Use of polarised equine endothelial cell cultures and an in vitro thrombosis model for potential characterisation of EHV-1 strain variation. Veterinary Microbiology 113, 243-249. Donaldson M.T., Sweeney C.R. (1997). Equine herpes myeloencephalopathy. Compendium on Continuing Education for the Practicing Veterinarian, 19(7), 864-882. Donaldson M.T., Sweeney C.R. (1998). Herpesvirus myeloencephalopathy: 11 cases (19821996). Journal of American Veterinary Medical Association 213, 671-675. Edington N., Bridges, C.G. (1990). One way protection between equidherpesvirus 1 and 4 in vivo. Research in Veterinary Science 48, 235–239. Edington N., Bridges C.G., Patel J.R. (1986). Endothelial cell infection and thrombosis in paralysis caused by equid herpesvirus-1: equine stroke. Archives of Virology 90, 111-124.
19
Edington N., Smyth B., Griffiths L. (1991). The role of endothelial cell infection in the endometrium, placenta
and foetus of equid herpesvirus-1 (EHV-1) abortions. Journal of
Comparative Pathology 104, 379-387. Foote C.E., Love D.N., Gilkerson J.R., Wellington J.E., Whalley J.M. (2006). EHV-1 and EHV4 infection in vaccinated mares and their foals. Veterinary Immunology and Immunopathology 111, 41-46. Foote C.E., Love D.N., Gilkerson J.R., Whalley J.M. (2004). Detection of EHV-1 and EHV-4 DNA in unweaned Toroughbred from vaccinated mares on a large stud farm. Equine Veterinary Journal 36, 341-345. Gerst S., Borchers K., Gower S.M., Smith K.C. (2003). Detection of EHV-1 and EHV-4 in placental sections of naturally occuring EHV-1 and EHV-4 related abortions in the UK: use of the placenta in diagnosis. Equine Veterinary Journal 35, 430-433. Gibson J.S., Slater J.D., Awan A.R., Field H.J. (1992). Pathogenesis of equine herpesvirus-1 in specific pathogen-free foals: primary and secondary infections and reactivation. Archives of Virology 123, 351-366. Goehring L.S., Hussey G.S., Ashton L.V., Schenkel A.R., Lunn D.P. (2011). Infection of central nervous system endothelial cells by cell-associated EHV-1. Veterinary Microbiology 148, 389-395. Goehring L.S., Van Maanen C., Berendsen M., Cullinane A., De Groot R.J., Rottier P.J.M., Wesseligh J.C.M., Sloet van Oldruitenborg-Oosterbaan M.M. (2010a). Experimental infection with neuropathogenic equid herpesvirus type 1 (EHV-1) in adult horses. Veterinary Journal 186, 180-187. Goehring L.S., Van Winden S.C., Van Maanen C., Sloet van Oldruitenborgh-Oosterbaan M.M.
(2006).
Equine
herpesvirus
type
1-associated
myeloencephalopathy
in
The
Netherlands: a four-year retrospective study (1999-2003). Journal of Veterinary Internal Medicine 20, 601-607. Goehring L.S., Wagner B., Bigbie R., Hussey S.B., Rao S., Morley P.S., Lunn D.P. (2010b). Control of EHV-1 viremia and nasal shedding by commercial vaccines. Vaccine 28, 52035211. Goodman L.B., Loregian A., Perkins G.A., Nugent J., Buckles E.L., Mercorelli B., Kydd J.H., Palù G., Smith K.C., Osterrieder N., Davis-Poynter N. (2007). A point mutation in a herpesvirus polymerase determines neuropathogenecity. PLoS Pathog 3(11): e160. doi:10.1371/journal.ppat.0030160.
20
Goodman L.B., Wagner B., Flaminio M.J.B.F., Sussman K.H., Metzger S.M., Holland R., Osterrieder N. (2006). Comparison of the efficacy of inactivated combination and modified-live virus vaccines against challenge infections with neuropathogenic equine herpesvirus type 1 (EHV-1). Vaccine 24, 3636-3645. Grijspeerdt A.C., Vandekerckhove A.P., Garré B., Barbé F., Van de Walle G.R., Nauwynck H.J. (2010). Differences in replication kinetics and cell tropism between neurovirulent and non-neuroviruent EHV1 strains during the acute phase of infection of horses. Veterinary Microbiology 142, 242-253. Grijspeerdt A.C., Vandekerckhove A., Van Doorsselaere J., Van de Walle G.R., Nauwynck H.J. (2011). Descripiton of an unusually outbreak of nervous system disorders caused by equine herpesvirus 1 (EHV1) in 2009 in Belgium. Vlaams Diergeneeskundig Tijdschrift 80, 147-154. Henninger R.W., Seed S.M., Saville W.J., Allen G.P., Hass G.F., Kohn C.W., Sofaly C. (2007). Outbreak of neurologic disease caused by equine herpesvirus-1 at a university equestrian center. Journal of Veterinary Internal Medicine 21, 157-165. Harless W., Pusterla N. (2006). Equine herpesvirus 1 and 4 respiratory disease in the horse. Clinical Techniques in Equine Practice 5, 197-202. Hussey S.B., Clark R., Lunn K.F., Breathnach C., Soboll G., Whalley J.M., Lunn D.P. (2006). Detection and quantification of equine herpesvirus-1 viremia and nasal shedding by real-time polymerase chain reaction. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation 18, 335-342. Kohn C.W., Fenner W.R. (1987). Equine herpesvirus myeloencephalopathy. Veterinary Clinics of North America, Equine practice 3, 405-419. McCartan C.G., Russell M.M., Wood J.L.N., Mumford J.A. (1995). Clinical, serological and virological characteristics of an outbreak of paresis and neonatal foal disease to equine herpesvirus-1 on a stud farm. Veterinary Record 136, 7-12. Meyer H., Thein P., Hubert P. (1987). Characterization of two equine herpesvirus (EHV) isolates associated with neurological disorders in horses. Journal of Veterinary Medicine Series B 34, 545-548. Mumford J.A., Edington N. (1980). EHV1 and equine paresis. Veterinary Record 106(12), 277.
21
Murray M.J., Del Piero F., Jeffrey S.C., Davis M.S., Furr M.O., Dubovi E.J., Mayo J.A. (1998). Neonatal equine herpesvirus type 1 infection on a thoroughbred breeding farm. Journal of Veterinary Internal Medicine 12, 36-41. Nugent J., Birch-Machin I., Smith K.C., Mumford J.A., Swann Z., Newton J.R., Bowden R.J., Allen G.P., Davis-Poynter N. (2006). Analysis of equid herpesvirus 1 strain variation reveals a point mutation of the DNA polymerase strongly associated with neuropathogenic versus nonneuropathogenic disease outbreaks. Journal of Virology 80(8), 4047-4060. Osterrieder N., Van de Walle G.R. (2010). Pathogenic potential of equine alphaherpesviruses: the importance of the mononuclear cell compartment in disease outcome. Veterinary Microbiology 143, 21-28. Ostlund E.N. (1993). The equine herpesviruses. Veterinary Clinics of North-America, Equine Practice 9, 283-294. Patel J.R., Edington N., Mumford J.A. (1982). Variation in cellular tropism between isolates of equine herpesvirus-1 in foals. Archives of Virology 74, 41-51. Patel J.R., Földi J., Bateman H., Williams J., Didlick S., Stark R. (2003). Equid herpesvirus (EHV-1) live vaccine strain C147: efficacy against respiratory diseases following EHV types 1 and 4 challenges. Veterinary Microbiology 192, 1-17. Patel J.R., Heldens J. (2005). Equine herpesviruses 1 (EHV-1) and 4 (EHV-4) – epidemiology, disease and immuoprophylaxis: a brief review. Veterinary Journal 170, 14-23. Perkins G.A., Goodman L.B., Tsujimura K., Van de Walle G.R., Kim S.G., Dubovi E.J., Osterrieder N. (2009). Investigation of the prevalence of neurologic equine herpes virus type 1 (EHV-1) in a 23-year retrospective analysis (1984-2007). Veterinary Microbiology 139 375378. Pusterla N., Hussey S.B., Mapes S., Johnson C., Collier J.R., Hill J., Lunn D.P., Wilson W.D. (2010). Molecular investigation of the viral kinetics of equine herpesvirus-1 in blood and nasal secretions of horses after corticosteroid-induced recrudescence of latent infection. Journal of Veterinary Internal Medicine 24, 1153-1157. Pusterla N., Leutenegger C.M., Wilson W.D., Watson J.L., Ferraro G.L., Madigan J.E. (2005). Equine herpesvirus-4 kinetics in peripheral blood leukocytes and nasopharyngeal secretions in foals using quantitative real-time TaqMan PCR. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation 17, 578-581.
22
Slater J.D., Borchers K., Thackray A.M., Field H.J. (1994). The trigeminal ganglion is a location for equine herpesvirus 1 latency and reactivation in the horse. Journal of General Virology 75, 2007-2016. Slater J.D., Lunn D.P., Horohov D.W., Antczak D.F., Babiuk L., Breathnach C., Chang Y.-W., Davis-Poynter N., Edington N., Ellis S., Foote C., Goehring L., Kohn C.W., Kydd J., Matsumura T., Minke J, Morley P., Mumford J., Neubauer T., O’Callaghan D., Osterrieder K, Reed S., Smith K., Townsend H., Van der Meulen K., Whalley M., Wilson W.D. (2006). Report of the equine herpesvirus-1 Havermeyer Workshop, San Gimignano, Tuscany, June 2004. Veterinary Immunology and Immunopathology 111, 3-13. Smith K.C. (1997). Herpesviral abortion in domestic animals. The Veterinary Journal 153, 253-268. Smith K.L., Allen G.P., Branscum A.J., Frank Cook R., Vickers M.L., Timoney P.J., Balasuriya U.B.R. (2010). The increased prevalence of neuropathogenic strains of EHV-1 in equine abortions. Veterinary Microbiology 141, 5-11. Smith K.C., Blunden A.S., Whitwell K.E., Dunn K.A., Wales A.D. (2003). A survey of equine abortion, stillbirth and neonatal foal death in the UK from 1988 to 1997. Equine Veterinary Journal 35, 496-501. Smith K.C., Borchers K. (2001). A study of pathogenesis of equid herpesvirus-1 (EHV-1) abortion by DNA in-situ hybridization. Journal of Comparative Pathology 24, 304-310. Smith D.J., Hamblin A.S., Edington N. (2001). Infection of endothelial cells with equine herpesvirus-1 (EHV-1) occurs where there is activation of putative adhesion molecules: a mechanism for transfer of virus. Equine Veterinary Journal 33(2), 138-142. Smith D.J., Hamblin A.S., Edington N. (2002). Equid herpesvirus 1 infection of endothelial cells requires activation of putative adhesion molecules: an in vitro model. Clinical & Experimental Immunology 135, 281-287. Smith K.C., Mumford J.A., Lakhani K. (1996). A comparison of equid herpesvirus-1 (EHV-1) vascular lesions in the early versus late pregnant equine uterus. Journal of Comparative Pathology 114, 231-247. Smith K.C., Whitwell K.E., Mumford J.A., Gower S.M., Hannant D., Tearle J.P. (1993). An immunohistological study of the uterus of mares following experimental infection by equid herpesvirus 1. Equine Veterinary Journal 25, 36–40.
23
Soboll G., Breathnach C.C., Kydd J.H., Hussey S.B. (2010). Vaccination of ponies with the IE gene of EHV-1 in a recombinant modified live vaccinia vector protects against clinical and virological disease. Veterinary Immunology and Immunopathology 135, 108-117. Steukers L., Glorieux S., Vandekerckhove A.P., Favoreel H.W., Nauwynck H.J. (2012). Diverse microbial interactions with the basement membrane barrier. Trends in Microbiology 20(3), 147-155. Stierstorfer B., Eichhorn W., Schmahl W., Brandmuller C., Kaaden O.R., Neubauer A. (2002). Equine herpesvirus type 1 (EHV-1) myeloencephalopathy: a case report. Journal of Veterinary Medicine Series B 49, 27-41. Sutton G.A., Viel L., Carman P.S., Boag B.L. (1998). Pathogenesis and clinical signs of equine herpesvirus-1 in experimentally infected ponies in vivo. Canadian Journal of Veterinary Research 62, 49-55. Taouji S., Collobert C., Gicquel B., Sailleau C., Brisseau N., Moussu C., Breuil M.-F., Pronost S., Borchers K., Zientara S. (2002). Journal of Veterinary Medicine Series B 49, 394-399. Tearle J.P., Smith K.C., Platt A., Hannant D., Davis-Poynter N.J., Mumford J.A. (2003). In vitro characterisation of high and low virulence isolates of equine herpesvirus-1 and -4. Research in Veterinary Science 75, 83-86. Thein P. (1981). Infection of the central nervous system of horses with equine herpesvirus serotype 1. Journal of South African Veterinary Association 52, 239-241. Thorsen J., Little P.B. (1975). Isolation of equine herpesvirus type 1 from a horse with an acute paralytic disease. Canadian Journal of Comparative Medicine 39, 358-359. Van de Walle G.R., Peters S.T., Vanderven B.C., O’Callaghan D.J., Osterrieder N. (2008). Equine herpesvirus 1 entry via endocytosis is facilitated αV integrins and an RSD motif in glycoprotein D. Journal of Virology 82(23), 11859-11868. Van der Meulen K.M., Nauwynck H.J., Buddaert W., Pensaert M.B. (2000). Replication of equine herpesvirus type 1 in freshly isolated equine peripheral blood mononuclear cells and changes in susceptibility following mitogen stimulation. Journal of General Virology 81, 21-25. Van der Meulen K.M., Nauwynck H.J., Pensaert M.B. (2001). Mitogen stimulation favours replication of equine herpesvirus-1 in equine blood mononuclear cells by inducing cell proliferation and formation of close intercellular contacts. Journal of General Virology 82, 1951-1957.
24
Van Maanen C. (2002). Equine herpesvirus 1 and 4 infections: an update. Veterinary Quarterly 24, 58-78. Van Maanen C., Sloet van Oldruttenborgh-Oosterbaan M.M., Damen E.Q., Derksen A.G. (2001). Neurological disease associated with EHV-1 infection in a riding school: clinical and virological characteristics. Equine Veterinary Journal 33, 191-196. Vandekerckhove A.P., Glorieux S., Grijspeerdt A.C., Steukers L., Duchateau L., Osterrieder N., Van de Walle G.R., Nauwynck H.J. (2010). Replication kinetics of neurovirulent versus non-neurovirulent equine herpesvirus type 1 strains in equine nasal mucosal explants. Journal of General Virology 91, 2019-2028. Vandekerckhove A.P., Glorieux S., Grijspeerdt A.C., Steukers L., Van Doorsselaere J., Osterrieder N., Van de Walle G.R., Nauwynck H.J. (2011). Equine alphaherpesviruses (EHV1 and EHV-4) differ in their efficiency to infect mononuclear cells during early steps of infection in nasal mucosal explants. Veterinary Microbiology 152, 21-28. Verheyen K., Newton J.R., Wood J.L.N., Birch-Machin I., Hannant D., Humberstone R.W. (1998). Possible case of EHV-4 ataxia in warmblood mare. Veterinary Record 143(16), 456. Wilson W.D. (1997). Equine herpesvirus 1 myeloencephalopathy. Veterinary Clinics of North America, Equine Practice 13, 53-72. Wilsterman S., Soboll-Hussey G., Lunn D.P., Ashton L.V., Callan R.J., Hussey S.B., Rao S., Goehring L.S. (2011). Equine herpesvirus-1 infected peripheral blood mononuclear cell subpopulations during viremia. Veterinary Microbiology 149, 40-47. Yamada S., Matsumura T., Tsujimura K. Yamaguchi T., Ohya K, Fukushi H. (2008). Comparison of the growth kinetics of neuropathogenic and nonneuropathogenic equid herpesvirus type 1 (EHV-1) strains in cultured murine neuronal cells and the relevance of the D/N752 coding change in DNA polymerase gene (ORF30). Journal of Veterinary Medical Science 70(5), 505-511.
25
