HET INVRIEZEN VAN EICELLEN EN EMBRYO S BIJ HET PAARD

UNIVERSITEIT GENT

FACULTEIT DIERGENEESKUNDE

Academiejaar 2014 - 2015

HET INVRIEZEN VAN EICELLEN EN EMBRYO’S BIJ HET PAARD door

Kitty DE CLERCQ

Promotor: Dr. Katrien Smits Co-promotor: Prof. Dr. Ann Van Soom

Literatuurstudie in het kader van de masterproef

© 2015 Kitty De Clercq

VRIJWARINGSCLAUSULE

Universiteit Gent, haar werknemers of studenten bieden geen enkele garantie met betrekking tot de juistheid of volledigheid van de gegevens vervat in deze masterproef, noch dat de inhoud van deze masterproef geen inbreuk uitmaakt op of aanleiding kan geven tot inbreuken op de rechten van derden.

Universiteit Gent, haar werknemers of studenten aanvaarden geen aansprakelijkheid of verantwoordelijkheid voor enig gebruik dat door iemand anders wordt gemaakt van de inhoud van de masterproef, noch voor enig vertrouwen dat wordt gesteld in een advies of informatie vervat in de masterproef.

UNIVERSITEIT GENT

FACULTEIT DIERGENEESKUNDE

Academiejaar 2014 - 2015

HET INVRIEZEN VAN EICELLEN EN EMBRYO’S BIJ HET PAARD door

Kitty DE CLERCQ

Promotor: Dr. Katrien Smits Co-promotor: Prof. Dr. Ann Van Soom

Literatuurstudie in het kader van de masterproef

© 2015 Kitty De Clercq

INHOUDSOPGAVE INLEIDING .............................................................................................................................................................................. 2 LITERATUURSTUDIE .......................................................................................................................................................... 4 I. DE TECHNIEKEN VAN INVRIEZEN ................................................................................................................... 4 1. Definities ......................................................................................................................................................... 4 2. Een korte vergelijking van beide technieken .................................................................................................. 4 3. Werkwijze ........................................................................................................................................................ 5 3.1. Conventioneel invriezen........................................................................................................................... 5 3.1.1. Het verloop .................................................................................................................................... 5 3.1.2. Soorten cryoprotectantia .............................................................................................................. 7 3.2. Vitrificatie ................................................................................................................................................. 8 3.2.1. Het verloop .................................................................................................................................... 8 3.2.2. Vitrificatieoplossingen ................................................................................................................. 10 3.2.3. Soorten carriersystemen ............................................................................................................. 11 4. Enkele belangrijke oorzaken van schade bij het invriezen ............................................................................ 13 4.1. Toxiciteit van cryoprotectantia .............................................................................................................. 13 4.2. Koudeletsels ........................................................................................................................................... 13 4.3. Intracellulaire vorming van ijskristallen ................................................................................................. 14 4.4. Osmotische zwelling ............................................................................................................................... 14 4.5. Breukschade ........................................................................................................................................... 14 II. EICELLEN..................................................................................................................................................... 15 1. Het verzamelen en het gebruik van eicellen ................................................................................................. 15 2. Invloed van het maturatiestadium en het cumuluscomplex van de eicel .................................................... 17 2.1. Invloed van het maturatiestadium ......................................................................................................... 17 2.2. Invloed van het cumuluscomplex ........................................................................................................... 18 3. Het invriezen van eicellen bij het paard ........................................................................................................ 20 III. EMBRYO’S ................................................................................................................................................. 22 1. Het verzamelen en het gebruik van embryo’s .............................................................................................. 22 2. Invloed van het glycoproteïnenkapsel en de grootte van het embryo ......................................................... 23 2.1. Invloed van het glycoproteïnenkapsel ................................................................................................... 24 2.2. Invloed van de grootte van het embryo ................................................................................................. 25 3. Het invriezen van embryo’s bij het paard ..................................................................................................... 26 BESPREKING ...................................................................................................................................................................... 29 REFERENTIELIJST ............................................................................................................................................................ 31

SAMENVATTING De bewaring van eicellen en embryo’s bij zeer lage temperatuur is van belang voor het behoud van de vrouwelijke genetica. Het invriesproces kan schade aan de eicellen en embryo’s veroorzaken door de vorming van ijskristallen of de toxische effecten van cryoprotectantia. De ijsvorming wordt gedeeltelijk voorkomen door conventionele, trage invriezing met een lage concentratie cryoprotectantia. De voorbije decennia werd deze methode steeds meer vervangen door de nieuwe techniek van vitrificatie. Hierbij wordt door snelle afkoeling, na de blootstelling aan hoge concentraties cryoprotectantia, een glasachtige structuur gevormd. De schade door de hoge concentraties toxische cryoprotectantia wordt beperkt door stapsgewijze blootstelling aan deze cryoprotectantia, verhoging van de afkoelings- en opwarmingssnelheden en de minimalisatie van het volume van de cryopreservatieoplossing. De beperkte studie bij eicellen geeft de invloeden weer van de rijping van de eicel, de cumulusmorfologie en de gebruikte invriezingstechniek. Verder onderzoek is nodig voor het opstellen van standaardprotocollen. Bij het embryo zijn de grootte en het kapsel belangrijk voor het slagen van de cryopreservatie. Embryo’s kleiner dan 300 µm worden succesvol ingevroren, blastocysten groter dan 300 µm kunnen via micromanipulatie een blastocoelreductie ondergaan waardoor het invriezen van deze grote embryo’s mogelijk wordt. Methoden die toepasbaar zijn in de praktijk moeten verder worden uitgewerkt. Deze literatuurstudie bespreekt de twee technieken van cryopreservatie - de conventionele invriezing en de vitrificatie - met hun verschillen, gelijkenissen, de schade die ze toebrengen en oplossingen om deze beschadiging te beperken. Verder wordt het gebruik en de moeilijkheden bij invriezen voor enerzijds eicellen en anderzijds embryo’s toegelicht. Sleutelwoorden: Conventioneel invriezen – Cryoprotectant - Eicel – Embryo - Vitrificatie

INLEIDING Reeds lange tijd wordt er onderzoek gedaan naar het invriezen van eicellen en embryo’s, ook bij paarden. In 1982 werd het eerste veulen geboren uit een ingevroren embryo (Yamamoto en Hachinohe, 1984). Gedurende de jaren die volgden werden de procedures continu onderzocht, gewijzigd en verbeterd, maar toepassing in de praktijk was gering. Aanpassingen in de registratie van paardenrassen wekte opnieuw interesse voor cryopreservatie in de paardenwereld (Carnevale, 2008). Er zijn verschillende voordelen verbonden aan het invriezen van eicellen en embryo’s bij het paard. Bij merries die geen embryo’s meer kunnen produceren omwille van plotse sterfte, euthanasie of subfertiliteit door onder andere chronische endometritis, kunnen eicellen worden ingevroren voor de in vitro productie van embryo’s. Op deze manier kan de keuze van het sperma worden uitgesteld, is er voldoende tijd om een receptormerrie uit te kiezen en kunnen er bij subfertiliteitsproblemen toch veulens worden geproduceerd (Leemans et al., 2012; Hinrichs, 2013). De cryopreservatie van oöcyten leidt ook tot uitbreiding van de genetische pool bij bedreigde paardenrassen waardoor heterozygositeit wordt gegarandeerd (Leemans et al., 2012). Daarnaast zou het invriezen van eicellen nuttig zijn voor het onderzoek in artificiële reproductietechnieken bij paarden vermits er weinig eicellen ter beschikking zijn (Hinrichs, 2013). Ook het invriezen van embryo’s gaat gepaard met vele voordelen. De spoeling en het overplanten van embryo’s bij embryotransplantatie kunnen losgekoppeld worden van elkaar in tijd en plaats waardoor het management van de receptormerries vereenvoudigt. Er is geen synchronisatie meer nodig van donor- en receptormerrie voor de embryospoeling, waardoor de kosten verlagen en de verspreiding van genetisch materiaal vergemakkelijkt (Stout, 2012). Door de cryopreservatie van embryo’s kunnen waardevolle merries, die tot late leeftijd presteren, veulens voortbrengen tijdens hun sportcarrière zonder deze te moeten onderbreken voor de dracht (Vandenberghe et al., 2012). Bovendien zorgt embryotransfer ervoor dat één waardevolle merrie meerdere nakomelingen kan produceren per jaar (Squires, 2009). Ook ‘tijdelijke genetische banking’ wordt mogelijk gemaakt. Embryo’s van jonge merries met veelbelovende bloedlijnen worden ingevroren op jonge, vruchtbare leeftijd en later aangewend mits goede prestaties (Stout, 2012). Aangezien ingevroren embryo’s makkelijker transporteerbaar zijn zullen hoge transportkosten wegvallen en is er minder kans op virusoverdracht dan bij het transport van de volwassen dieren (Carnevale, 2008). Cryopreservatie van embryo’s zorgt ook voor genetische instandhouding (Carnevale, 2008), maakt het mogelijk een embryobank voor bedreigde paardenrassen aan te leggen (Leemans, 2012) en kan het generatie-interval verkorten doordat twee-jarige merries nakomelingen kunnen krijgen (Vanderwall, 2000). Tenslotte kunnen embryo’s die via biopsie worden getest op erfelijke ziekten, ingevroren worden tot de testresultaten bekend zijn waardoor enkel embryo’s die vrij zijn van genetische defecten gebruikt worden voor embryotransfer (Choi et al., 2010).

2

Bovengenoemde argumenten zijn een goede stimulans voor gedreven onderzoek in verband met het invriezen van eicellen en embryo’s. Bij het invriezen van eicellen en embryo’s bij het paard zijn er heel wat factoren die in aanmerking moeten genomen worden. Door het lage aantal eicellen dat ter beschikking is voor onderzoek, zijn slechts enkele studies omtrent de cryopreservatie van eicellen uitgevoerd. De aan- of afwezigheid en de morfologie van het cumuluscomplex enerzijds en het maturatiestadium en de aanwezigheid van de kwetsbare spoelfiguur anderzijds zijn de twee belangrijkste factoren waar rekening mee moet gehouden worden bij eicellen. Ook de cryopreservatie van embryo’s bij het paard heeft een trage ontwikkeling. Het invriezen van kleine embryo’s geeft reeds aanleiding tot acceptabele drachtresultaten maar bij grote embryo’s zorgen het kapsel en de grote hoeveelheid blastocoelvloeistof voor moeilijkheden.

3

LITERATUURSTUDIE

I. DE TECHNIEKEN VAN INVRIEZEN Er bestaan twee technieken voor de cryopreservatie of het invriezen van eicellen en embryo’s: het traag invriezen of conventioneel invriezen en de verglazing of vitrificatie (tabel 1, figuur 1).

1. Definities De definitie van conventioneel invriezen is “de stapsgewijze blootstelling van het embryo aan cryoprotectantia, voorafgaand aan een zorgvuldig gecontroleerde afkoeling in fasen” (Stout, 2012). Fahy et al. (1984) beschreef vitrificatie als “het stollen van een vloeistof, niet veroorzaakt door kristallisatie maar door een extreme verhoging van de viscositeit tijdens het koelen” en tientallen jaren later werd vitrificatie gedefinieerd als “ het ultrasnel bevriezen om een directe overgang te induceren van zowel de intra- als extracellulaire vloeistoffen, vanaf de vloeistoffase naar een vaste, glasachtige fase (‘stolling’) zonder ijsvorming”

(Stout, 2012). Cryoprotectantia zijn “kleine moleculen die vrij

penetreren in cellen en het percentage water dat tijdens afkoeling wordt omgezet in ijs limiteren” (Orief et al., 2005).

2. Een korte vergelijking van beide technieken

CONVENTIONEEL INVRIEZEN

VERGLAZING

Extracellulaire ijsvorming

Totale eliminatie van ijsvorming, zowel extracellulair als intracellulair

Lagere concentratie cryoprotectantia (1 tot 2 M): lagere toxiciteit

Hogere concentratie cryoprotectantia (6 tot 7M): hogere toxiciteit

Gecontroleerde trage afkoeling (0,1 – 0,3 °C/min)

Ultrasnelle afkoeling (15000°C/min tot 20000°C/min)

Gebruik van standaard rietjes (over het algemeen)

Verschillende carriers beschikbaar, zoals standaard rietjes, cryotop, cryoloop, OPS, cryotip…

Langdurig (1,5 tot 5 uur)

Snel (enkele minuten)

Dure programmeerbare vriesinstallatie vereist

N.v.t.

Tabel 1: Vergelijking van conventioneel invriezen en verglazing (Naar: Orief et al, 2005; Pereira en Marques, 2008; Lieberman, 2012; Mukaida, 2012; Stout, 2012)

4

Ondanks het feit dat er bij verglazing een hogere toxiciteit heerst door de hogere concentratie aan cryoprotectantia (tabel 1), is deze techniek van invriezen sneller en goedkoper dan de conventionele invriezingstechniek (Stout, 2012).

3. Werkwijze Volgens Liebermann (2012) zijn er zes belangrijke stappen voor de cryopreservatie van biologisch materiaal:1) primaire blootstelling aan cryoprotectantia; 2) snelle of trage afkoeling tot -196 °C; 3) opslag bij lage temperatuur; 4) opwarming of ontdooiing met geleidelijke rehydratatie; 5) stapsgewijze verwijdering van de cryoprotectantia; 6) terugkeer naar een fysiologische omgeving met herstel.

Figuur 1: Schematische voorstelling van een embryo (cirkel) tijdens conventioneel invriezen en vitrificatie; = ijskristallen; de concentratie cryoprotectantia wordt aangetoond door het donkerder worden van de grijze kleur (Naar: Mukaida et al., 2002)

3.1. Conventioneel invriezen 3.1.1. Het verloop Bij het invriezen van eicellen of embryo’s op de conventionele manier (figuur 2), worden deze eerst in een basisoplossing gebracht. Deze basisoplossing bestaat doorgaans uit een fosfaatgebufferde zoutoplossing waaraan onder andere foetaal bovien serum kan worden toegevoegd. Vervolgens worden de eicellen of embryo’s blootgesteld aan cryoprotectantia, dit zijn kleine moleculen die de vorming van ijs verhinderen (Orief et al., 2005). Deze cryoprotectantia worden frequent in meerdere stappen toegevoegd, met een geleidelijke verhoging van de concentratie tot gevolg, waardoor abrupte osmotische veranderingen worden verhinderd (Carnevale, 2008). Nadien wordt de eicel of het embryo in een kleine hoeveelheid van de oplossing met de hoogste concentratie cryoprotectantia opgeslagen in een rietje, waarna dit rietje wordt verzegeld.

5

Tijdens het conventionele invriezen maakt men gebruik van een programmeerbare vriesinstallatie (Stout, 2012). Dit toestel zorgt voor een geleidelijke afkoeling tot -6°C, met een typische koelsnelheid van -0,5°C per minuut (Seidel, 1996). Superkoeling (afkoeling tot onder het normale vriespunt zonder ijsvorming) wordt verhinderd door ‘seeding’ (Stout, 2012). Hierbij raakt een pincet, na onderdompeling van de pincet in vloeibare stikstof, het rietje aan om zo de ijskristalvorming bij -6°C te induceren (Carnevale, 2008). Vervolgens vindt een gecontroleerde afkoeling plaats tot -33°C, gevolgd door de onderdompeling in vloeibare stikstof (met een temperatuur van -196°C) (Hochi et al., 1994b). Door de blootstelling van een embryo aan cryoprotectantia en stapsgewijs afnemende temperaturen worden er ijskristallen gevormd in het extracellulaire milieu. De cryoprotectant oplossing wordt meer hypertoon door deze extracellulaire ijskristalvorming met verplaatsing van water uit het embryo tot gevolg (Carnevale, 2008).

INVRIEZEN Eicel of embryo: in basisoplossing (bv. fosfaatgebufferde zoutoplossing met foetaal bovien serum)  Blootstelling aan cryoprotectantia (stapsgewijze verhoging van de concentratie)  Opslaan in een rietje en verzegeling  In een programmeerbare vriesinstallatie: afkoeling tot -6°C  Inductie van ijsvorming in het extracellulaire milieu (‘seeding’)  Gecontroleerd koelen tot -33°C  In vloeibare stikstof (-196°C)

OPWARMEN (na bewaringsperiode) Rietje snel ontdooien in waterbad van 37°C  Cryoprotectantia verwijderen (in meerdere stappen), met een sucroseoplossing  Eicel of embryo: in basisoplossing Figuur 2: Het verloop van het conventioneel invriezen (Naar: Slade et al., 1985; Hochi et al., 1994b)

Na de bewaringsperiode van de eicel of het embryo in vloeibare stikstof vindt de opwarming plaats. Allereerst wordt het rietje snel ontdooid in een warmwaterbad. Vervolgens worden de cryoprotectantia verwijderd aan de hand van oplossingen met afnemende concentraties cryoprotectantia en sucrose. Ten slotte bevindt de eicel of het embryo zich in de basisoplossing (Slade et al., 1985; Hochi et al., 1994b). 6

Tijdens de verschillende stappen van langzaam invriezen kunnen diverse vormen van beschadiging optreden. Zo is de optimale koelsnelheid van groot belang. Bij te snelle afkoeling worden er schadelijke intracellulaire ijskristallen gevormd, bij te trage afkoeling komt uitdroging voor. Deze uitdroging ontstaat door de beweging van water uit de cellen om de concentraties aan opgeloste stoffen, die overblijven na extracellulaire ijsvorming, binnen en buiten de cel in evenwicht te brengen (Stout, 2012). Ook opwarming kan leiden tot beschadiging. Men streeft naar langzame hydratatie door embryo’s in oplossingen met dalende concentraties cryoprotectantia te plaatsen, opdat de influx van water niet leidt tot osmotische zwelling tijdens de opwarming (Carnevale, 2008).

3.1.2. Soorten cryoprotectantia Orief et al. (2005) beschrijft cryoprotectantia als “componenten die gebruikt worden om de gewenste intracellulaire dehydratatie te bereiken”. Bij het conventionele invriezen worden er veel lagere concentraties van deze cryoprotectantia gebruikt dan bij de vitrificatie (Carnevale, 2008).

Cryoprotectantia worden ingedeeld in twee groepen: enerzijds de permeabele cryoprotectantia die cellen penetreren en water naar extracellulair verplaatsen, anderzijds de niet permeabele cryoprotectantia die voornamelijk buiten de cellen blijven en watermoleculen via osmose uit de cellen onttrekken (Orief et al., 2005). De permeabele of intracellulaire cryoprotectantia, zoals glycerol, ethyleenglycol, propyleenglycol, dimethylsulfoxide (DMSO), … kunnen cellen binnendringen door hun lage moleculaire gewicht (Carnevale, 2008). Glycerol werd gebruikt bij cryonische patiënten en bij de vitrificatie van humaan sperma. Ethyleenglycol in water is bekend als antivries voor auto’s en propyleenglycol gebruikte men in ijs-crème om de vorming van ijskristallen te verminderen (Orief et al., 2005). Het effect van deze permeabele cryoprotectantia is de bescherming van de intracellulaire organellen tegen de vorming van ijskristallen. De verscheidene producten vertonen qua toxiciteit en permeabiliteit veel verschillen, afhankelijk van de diersoort en van het stadium waarin de eicel of het embryo zich bevindt. Zo zouden bij het rund ethyleenglycol en glycerol minder toxisch zijn dan propyleenglycol en zou ethyleenglycol de beste permeabiliteit vertonen in morulae en blastocysten. Er wordt steeds gestreefd naar een hoge permeabiliteit en een lage toxiciteit (Kasai et al., 1997; Lieberman, 2012).

De

niet

permeabele

of

extracellulaire

cryoprotectantia,

onder

andere

sucrose,

glucose,

polyethyleenglycol, serum albumine, … vertonen een aanzienlijk hoger moleculair gewicht waardoor deze de cellen niet binnendringen (Carnevale, 2008). Een eerste groep niet permeabele agentia zijn de sacchariden, bijvoorbeeld sucrose, glucose, trehalose… Deze additieven zorgen voor dehydratie door water uit de cellen te onttrekken. Door de lagere concentratie cryoprotectantia binnenin de cellen, vermindert de toxiciteit en is er minder zwelling van de cellen tijdens de opwarming (Kasai et al.,1997; Orief et al., 2005). De tweede groep niet permeabele of extracellulaire cryoprotectantia zijn de macromoleculen, zoals polyethyleenglycol (PEG), polyvinylpyrrolidone (PVP), serum albumine (SA), Ficoll… Aangezien cellen van nature uit een ruime hoeveelheid proteïnen bezitten, zijn er extracellulair meer cryoprotectantia nodig bij invriezen. Men voegt polymeren met een hoog moleculair gewicht toe, 7

die de cellen niet kunnen binnendringen, waardoor er extracellulair en intracellulair een gelijke concentratie cryoprotectantia nodig is. Deze polymeren hebben dus verschillende werkingen. Door de vermindering van de vereiste concentratie cryoprotectantia is er een lager toxisch effect. Bovendien hebben de polymeren een invloed op de viscositeit van de oplossingen (Orief et al., 2005).

Cryoprotectantia worden vaak in combinatie gebruikt om schade door hoge hoeveelheden te beperken vermits de concentraties van de afzonderlijke cryoprotectantia worden gereduceerd. Ze worden ook vaak geleidelijk aan toegevoegd en verwijderd zodat abrupte osmotische verschuivingen worden verhinderd, dit voornamelijk bij het verwijderen van de cryoprotectantia (Carnevale, 2008).

3.2. Vitrificatie 3.2.1. Het verloop Voor de vitrificatie of verglazing (figuur 3) worden eicellen of embryo’s eerst in een basisoplossing geplaatst. Nadien wordt de eicel of het embryo blootgesteld aan de vitrificatieoplossing in één of meerdere stappen, om vervolgens onmiddellijk in vloeibare stikstof te worden overgebracht (EldridgePanuska et al., 2005).

INVRIEZEN Eicel of embryo: in basisoplossing (bv. fosfaatgebufferde zoutoplossing met foetaal bovine serum)  Blootstelling aan vitrificatieoplossing OF Blootstelling aan verschillende vitrificatieoplossingen (voor een bepaalde duur en met een stijgende hoeveelheid cryoprotectantia)  In vloeibare stikstof (-196°C)

OPWARMEN (na bewaringsperiode) Rietje snel ontdooien in waterbad van 37°C  Cryoprotectantia verwijderen (in meerdere stappen), met een sucroseoplossing  Eicel of embryo: in basisoplossing

Figuur 3: Het verloop van de vitrificatie (Naar: Eldridge-Panuska et al., 2005; De Leon et al., 2012)

Verglazing of vitrificatie wordt bijgevolg bereikt door de bijsturing van twee belangrijke onderdelen in het invriezingsproces. Enerzijds worden er hogere concentraties (6 tot 7 molair) cryoprotectantia 8

toegevoegd om de viscositeit van de vloeistof te verhogen zodat een vaste toestand wordt bekomen (Carnevale, 2008). Door een hogere concentratie cryoprotectantia, is de temperatuur bij de overgang naar de glasfase hoger en is er dus minder kans op de vorming van ijskristallen (Saragusty en Arav, 2011). Het exacte tijdstip van toevoeging van de cryoprotectantia en de stapsgewijze blootstelling is belangrijk

voor

de

beperking

van

schade

(Carnevale,

2008).

De

blootstelling

aan

de

vitrificatieoplossing met cryoprotectantia kan in één stap of in verschillende stappen gebeuren. De blootstelling in één stap, waarbij embryo’s van de fysiologische oplossing direct in de vitrificatieoplossing en daarna in de vloeibare stikstof worden gebracht, is de eenvoudigste manier. Echter niet alle stadia van embryo’s zullen dit overleven. Zo zullen bijvoorbeeld blastocysten vanuit de fysiologische oplossing eerst in een oplossing met een lagere concentratie cryoprotectantia gebracht worden en nadien in één of meerdere vitrificatieoplossingen met

stijgende concentratie

cryoprotectantia waardoor de toxische effecten verminderen. Deze laatste manier is de stapsgewijze blootstelling. (Kasai, 1997).

Anderzijds is de toename van de afkoelingssnelheden van belang bij vitrificatie (figuur 4). Water is weinig viskeus en de viscositeit neemt weinig toe bij afkoeling; echter bij vriestemperatuur vindt een abrupte faseovergang plaats naar een ijskristal. Bij een zeer snelle afkoeling van water hebben de watermoleculen niet voldoende tijd om zich te rangschikken tot een kristallijne structuur en zal het water verglazen. Er zijn twee voordelen gekoppeld aan deze snelle bevriezing. Ten eerste, de concentratie aan cryoprotectantia kan gereduceerd worden waardoor de toxische en osmotische schade afneemt. Ten tweede, de schade door afkoeling daalt vanwege de snelle passage doorheen de temperatuurzone +15 en - 5°C (Orief et al., 2005).

Figuur 4: De afkoelingssnelheden tijdens het conventioneel invriezen en de vitrificatie. Let op de blootstellingtijd aan temperaturen in de kritische zone van beide technieken (Uit: Scholz E.C. en Navas C.G. (2014) Chapter 6: The maining of cryopreservation for in-vitro fertilization patients. In: Dr. Hideaki Yamashiro (Editor), Recent Advances in Cryopreservation, InTech, 83-122)

9

De

nauwgezette

strategie

van

vitrificatie,

met

de

verhoging

van

de

snelheid

van

temperatuursverandering en de verhoging van de concentratie cryoprotectantia, zorgt voor de volledige uitschakeling van ijskristalvorming. Dit resulteert in zowel intracellulaire als extracellulaire verglazing (Orief et al., 2005). De opwarming na de bewaring in vloeibare stikstof verloopt gelijkaardig als bij het conventioneel invriezen. Het rietje wordt ontdooid in een warmwaterbad, de cryoprotectantia worden stapsgewijs verwijderd en tenslotte bevindt de eicel of het embryo zich in de basisoplossing (Eldridge-Panuska et al., 2005).

Ook in de natuur komt vitrificatie voor. Zo kunnen wollige beerrupsen 10 maanden per jaar temperaturen tot onder -50°C verdragen en overleven sommige kikkers dagen tot weken met 65% van hun volledige lichaamsgewicht als ijs. De mate van invriezing die wordt getolereerd kent een brede diversiteit bij de verschillende amfibieën en insecten. De reden van deze tolerantie is de productie van natuurlijke cryoprotectantia door deze dieren, zoals glycerol dat wordt geproduceerd in de lever van sommige amfibieën en werkt als antivries door de verlaging van het vriespunt en de reductie van ijsvorming. Sommige kikkers produceren een specifieke soort insuline dat bij het bereiken van het vriespunt de afgifte en absorptie van glucose, een cryoprotectant, verhoogt. Deze natuurlijke cryoprotectantia zorgen ervoor dat het water in het lichaam van deze dieren verhardt door verglazing en niet door ijskristalvorming (Storey K.B. en Storey J.M., 1990).

3.2.2. Vitrificatieoplossingen 1. Samenstelling Orief et al. (2005) beschrijft vitrificatieoplossingen als “waterige cryoprotectant oplossingen die niet bevriezen wanneer gekoeld bij hoge koelsnelheden tot zeer lage temperatuur”. Deze cryoprotectant oplossingen bestaan uit een basisoplossing met toegevoegde additieven. De basisoplossing is een zoutoplossing, met buffering door middel van fosfaat of HEPES (N-2- hydroxyethyl- piperazine-N-2ethane sulfonic acid), die de pH van de vitrificatieoplossing in stand houdt (Orief et al., 2005). Aan deze gebufferde basisoplossing worden additieven toegevoegd: de permeabele en de niet permeabele cryoprotectantia, die eerder zijn besproken bij de soorten cryoprotectantia (3.1.2.).

2. Categorieën Volgens Kasai (1997) bestaan er 4 categorieën vitrificatieoplossingen: - de gebufferde zoutoplossing met uitsluitend permeabele cryoprotectantia - de gebufferde zoutoplossing met permeabele cryoprotectantia en macromoleculen - de gebufferde zoutoplossing met permeabele cryoprotectantia en sacchariden - de gebufferde zoutoplossing met permeabele cryoprotectantia, macromoleculen en sacchariden.

Hoewel de samenstelling van de oplossingen nog aan verbetering toe is, lijkt de laatste categorie het meest beloftevol vermits daar alle componenten, met elk hun specifieke functie, aanwezig zijn. Door het gebruik van meerdere cryoprotectantia en de toevoeging van macromoleculen en sacchariden 10

kunnen de concentraties van de cryoprotectantia worden gereduceerd waardoor de toxiciteit wordt geminimaliseerd (Kasai, 1997; Orief et al., 2005).

3. Vitrificatieoplossing bij het paard: een voorbeeld In 1994 slaagde Hochi et al. erin de eerste dracht uit een gevitrificeerd embryo te bekomen met de oplossing ‘EFS40’. Deze oplossing bestaat uit 40% ethyleenglycol, 18% Ficoll 70 en 0.3M sucrose in een fosfaatgebufferde zoutoplossing (Hochi et al., 1994a). De vitrificatieoplossing bij deze experimenten werd voordien bestudeerd bij de vitrificatie van muizenembryo’s (Kasai et al., 1990).

3.2.3. Soorten carriersystemen Zoals eerder vermeld zijn hoge afkoelingssnelheden van groot belang voor een degelijke vitrificatie. Het is essentieel dat het volume van de vitrificatieoplossing zo klein mogelijk is en dat het monster snel wordt ondergedompeld in de vloeibare stikstof zonder op het oppervlak van deze stikstof te drijven. Om deze redenen worden er verschillende carriers gebruikt bij vitrificatie (Arav et al., 2002; Orief et al., 2005; Vajta en Kuwayama, 2006).

De laatste jaren zijn er verschillende methodes ontworpen om kleinere volumes te bekomen, die betere warmteoverdracht toelaten en dus leiden tot hogere afkoelingssnelheden. Enerzijds de ‘oppervlak technieken’, dit zijn open systemen met directe blootstelling aan de oplossing, waardoor snelle afkoeling en opwarming wordt bereikt. Anderzijds de ‘buis technieken’ die veilig en gemakkelijk gemanipuleerd kunnen worden doordat ze gesloten zijn (Saragusty en Arav, 2011). Een belangrijk voordeel van deze gesloten systemen is de bescherming tegen ziekteoverdracht vanuit eventueel besmette vloeibare stikstof (Bielanski et al., 2000).

Enkele voorbeelden van de oppervlak technieken zijn: elektronen microscopische koperen roosters, MDS of minimale druppel grootte, cryotop, cryoloop, …

Figuur 5: Oppervlakte carriersystemen: A) Elektronen microscopisch rooster (Uit Martino et al., 1996); B) Cryotop (Uit Saragusty en Arav, 2011); C) Cryoloop (Uit Mukaida et al., 2002)

Door de extreme afkoelingssnelheden bij het gebruik van de elektronen microscopische koperen roosters (figuur 5A) verkrijgt men hogere overlevingswaarden dan bij het gebruik van rietjes (Martino et al., 1996). Arav et al. (1997) ontwikkelde de methode ‘MDS’ of minimale druppel-grootte, waarbij 0.1 11

– 0.5 µl druppels op een dekglaasje worden klaargemaakt en ondergedompeld worden in stikstof. Met deze methode wordt er 50% minder cryoprotectantia gebruikt in vergelijking met de klassieke richtlijnen, zonder ijsvorming of breukschade. (Arav et al., 2002). De cryotop (figuur 5B) is een smalle film strip op een kunststoffen houder, met een plastieken dopje ter bescherming. Na blootstelling aan de vitrificatieoplossing wordt een druppel van kleiner dan 0.1 ml op de film strip geladen, waardoor enkel een dun laagje de eicellen of embryo’s bedekt om dan rechtstreeks in vloeibare stikstof te worden gedompeld. Deze methode is eenvoudig, betrouwbaar en levert stabiele resultaten op (Kuwayama, 2007). Een cryoloop (figuur 5C) bestaat uit een stalen buis, met een nylon lus, die bevestigd is in het deksel van een flacon. De cryoloop wordt gecoat met een dun laagje vitrificatieoplossing door onderdompeling in deze vloeistof en wordt, na overdracht van de blastocyst op de dunne filmlaag, in de flacon met vloeibare stikstof geplaatst (Lane et al., 1999). Enkele voorbeelden van de ‘buis technieken’ zijn: het plastieken rietje, OPS of open rietje, CPS of gesloten rietje, cryotip… Plastieken rietjes zijn de oudste carriers van allemaal. Open getrokken rietjes of open pulled straws (OPS) worden geconstrueerd door Franse mini-rietjes te verwarmen en te verzachten op een hete plaat. Nadien worden deze rietjes manueel uitgerokken totdat de binnenste diameter afneemt van 1,7 tot 0,8 mm en de wanddikte afneemt van 0,15 tot 0,07 mm ter hoogte van de het centrale deel. Daarna worden de rietjes afgekoeld in de lucht en doorgesneden op het smalste punt. Met het gebruik van OPS kunnen koudeletsels en toxische of osmotische schade vermeden worden, door zeer hoge afkoelings- en opwarmingssnelheden en beperkt contact met de geconcentreerde cryoprotectantia (Vajta et al., 1998).

Figuur 6: Buisvormige carriersystemen. A) De Cryotip met een breder deel (w), een metalen huls (m) en een dun deel (n) (Uit Kuwayama et al., 2005); B) De Rapid–i (Uit Lardman en Gardner, 2010)

De Cryotip (figuur 6A) bestaat uit een rietje met een smal deel verbonden met een breder deel en is voorzien van een beweegbare beschermende metalen huls. Embryo’s worden in het dunne deel geladen in een druppel van 1µl zonder luchtbellen. Aansluitend is er een verzegeling van het rietje aan beide uiteinden via warmte en trekt men de beschermende huls over het smalle deel. Nadien kan de Cryotip ondergedompeld worden in vloeibare stikstof (Kuwayama et al., 2005). De Rapid-i (figuur 6B) is een carrier voor vitrificatie die wordt opgeslagen in een afgesloten rietje. De carrier bestaat uit een kunststof staaf en een rietje, met aan het uiteinde een flens of platte rand. De flens heeft een 50nL opening waar de embryo’s in gepipetteerd worden (Larman en Gardner, 2010). 12

Men tracht de afkoelings- en opwarmingssnelheden mede te verhogen door de dampvorming rondom het monster te voorkomen bij afkoeling. Door vloeibare stikstof te koelen tot -210°C, net onder zijn kookpunt van -196°C, vermindert het kookpunt van het ondergedompelde staal waardoor de koelsnelheid opmerkelijk toeneemt. Een groot deel van de vloeibare stikstof verdampt en de resterende oplossing vormt ‘stikstof slush’ door afkoeling en stolling. VitMaster is een instrument dat de temperatuur van vloeibare stikstof doet dalen door onderdruk en wordt bijgevolg gebruikt voor de vorming van stikstof slush (Arav et al., 2002; Vajta en Kuwayama, 2006). Een andere methode voor de vermindering van dampvorming rondom het monster is de solide-oppervlak-verglazing, die gebruik maakt van een voorgekoeld metalen oppervlak (Dinnyés et al., 2000). De oplossing die het biologische monster bevat wordt op dit oppervlak geplaatst (Vajta en Kuwayama, 2006).

4. Enkele belangrijke oorzaken van schade bij het invriezen 4.1. Toxiciteit van cryoprotectantia De vorming van schadelijke ijskristallen tijdens vitrificatie wordt beperkt door de toevoeging van hoge hoeveelheden cryoprotectantia. Deze hoge concentraties kunnen osmotische of chemische toxiciteit tot gevolg hebben. De reductie van de toxische cryoprotectantia kan op verschillende manieren gebeuren. Onder andere door toevoeging van polymeren die niet in de cellen kunnen binnendringen en dus extracellulair blijven (Orief et al., 2005). Men maakt ook gebruik van combinaties van twee of drie cryoprotectantia om de specifieke toxiciteit van elk product afzonderlijk te verminderen (Vajta en Kuwayama, 2006). Door de verhoging van afkoelings- en opwarmingssnelheden, waardoor het water niet voldoende tijd heeft om ijskristallen te vormen, kan de concentratie cryoprotectantia verminderen en verlaagt bijgevolg de toxiciteit. En ook door stapsgewijze blootstelling van cellen aan cryoprotectantia zal de toxiciteit verminderen (Orief et al., 2005).

4.2. Koudeletsels Ook koudeletsels zijn een belangrijke oorzaak van de beknotting van cryopreservatie. Arav et al. (1996) definieert directe koudeletsels als “de expressie van irreversibele schade kort na de blootstelling aan temperaturen tot juist boven het vriespunt”. De plasmamembraan is een van de voornaamste doelwitten van deze koudeletsels (Arav et al., 1996). Tijdens de studie in 1996 bepaalt men aan de hand van FITR (Fourier-transform-infraroodspectroscopie) de faseovergangstemperatuur, dit is de temperatuur bij de overgang van de vloeibare naar de gelfase, van de membraanlipiden van zowel onrijpe als rijpe eicellen. Er wordt een verband vastgesteld tussen de temperaturen waarbij de faseovergang plaatsvindt en de temperaturen waarbij koudeletsels van de membranen optreden. Bovendien

toont

de

studie

aan

dat

de

blootstelling

van

immature

eicellen

aan

de

faseovergangstemperatuur schadelijker is dan de blootstelling aan lagere temperaturen. De faseovergang van de membraanlipiden van onrijpe eicellen doet zich voor tussen 13 en 20°C; rijpe of mature eicellen hebben een breed profiel van de faseovergang dat schommelt rond de 10°C en de membranen van deze eicellen tolereren afkoeling tot 4°C. Immature eicellen zijn bijgevolg gevoeliger aan koude dan mature eicellen. Bij onrijpe eicellen beschadigt de koude voornamelijk de 13

plasmamembraan terwijl bij rijpe eicellen voornamelijk schade aan de microtubuli en microfilamenten voorkomt, met frequent meer polyspermie als gevolg (Arav et al., 1996).

Hoewel nog meer bevestiging nodig is door studie, stelt men dat het wijzigen van de samenstelling van de membranen van immature eicellen – door fusie met gekernde of ongekernde mature eicellen – een invloed kan hebben op de gevoeligheid aan lage temperaturen (Arav et al., 1996). Anderzijds zullen, zoals eerder besproken, hoge afkoelings- en opwarmingssnelheden tot minder koudeletsels leiden door de snelle passage doorheen de kritische temperatuurzone waardoor er onvoldoende tijd is om schade te ontwikkelen. Koudeletsels komen dus algemeen minder voor bij vitrificatie dan bij conventioneel invriezen (Kasai, 1997; Vajta en Kuwayama, 2006).

4.3. Intracellulaire vorming van ijskristallen Cryopreservatie kan de organisatie in cellen enorm verstoren (Dobrinsky et al., 2000). Er is veel kans tot vorming van ijskristallen, die schadelijk tot zelfs dodelijk kunnen zijn voor de cel (Kasai, 1997). De plasmamembraan kan uiteenvallen door ijskristalvorming, intracellulaire organellen en functies kunnen verstoord worden door opslag in vloeibare stikstof en de centrale opbouw van de cellen van een embryo kan worden afgebroken (Dobrinsky, 1996). Bij vitrificatie worden embryo’s niet blootgesteld aan de cellulaire schade veroorzaakt door ijskristallen (Dobrinsky et al., 2000). Door de toevoeging van hoge concentraties cryoprotectantia bij verglazing, wordt de vorming van deze schadelijke ijskristallen gelimiteerd.

4.4. Osmotische zwelling Cellen die cryopreservatie hebben ondergaan bevatten permeabele cryoprotectantia. Indien deze cellen juist na het opwarmen in een isotone oplossing worden gebracht, kan schade door osmotische zwelling optreden omdat water veel sneller in de cel binnendringt dan dat de cryoprotectantia uit de cellen verplaatsen (Leibo en Mazur, 1978). Osmotische zwelling kan bijgevolg gedeeltelijk worden voorkomen door het gebruik van snel penetrerende cryoprotectantia, die snel uit de cel zullen diffunderen. Verder kan influx van water in de cellen vermeden worden door stapsgewijze afnemende concentraties sucrose in het medium tijdens de opwarming. De molaliteit van de sucroseoplossing moet hierbij initieel voldoende hoog zijn. Eerst verdunnen in een oplossing met cryoprotectantia en sucrose alvorens de cellen over te plaatsen in een oplossing met enkel sucrose blijkt zeer effectief. Hierdoor zullen de cellen krimpen en is er minder kans op schade door osmotische zwelling (Kasai, 1997; Kasai et al., 1980).

4.5. Breukschade Na cryopreservatie en opwarming treft men sporadisch een gebroken zona pellucida (figuur 7) aan (Kasai, 1997). De schade aan de zona pellucida treedt op tijdens de snelle faseovergang (Rall en Meyer, 1989). Volgens de studie van Rall en Meyer (1989) zou het optreden van breukschade

14

voornamelijk afhangen van de omstandigheden tijdens het opwarmen, waarbij de snelheid van de opwarming en het medium tijdens het opwarmen van belang blijken te zijn.

Figuur 7: A. een normale eicel na de verwijdering van de cumulus met een intacte zona pellucida; B. een abnormale eicel met een gebroken zona pellucida (Uit: Savitha et al., 2012)

Het verminderen van deze fysische schade kan enerzijds door het gebruik van een flexibele, dunwandige carrier die tijdens afkoeling en opwarming volumeveranderingen van het monster toelaat. Anderzijds kan de blootstelling aan lucht gedurende tien seconden vóór de blootstelling aan hogere temperaturen de letsels beperken, vermits snelle opwarming leidt tot meer schade (Rall en Meyer, 1989). Bij vitrificatie komt breukschade minder voor dan bij conventioneel invriezen, vermoedelijk door de afwezigheid van ijs en de snelle passage doorheen de kritische temperatuurzone (Kasai, 1997).

II. EICELLEN 1. Het verzamelen en het gebruik van eicellen Paarden hebben oligolecite eicellen met centraal de kern en een kleine dooier die evenwichtig verdeeld is over de eicel. Tijdens de ovogenese zullen de ovogoniën, na hun vorming in het embryo, mitosen en differentiatie ondergaan tot een primaire oöcyt. Er wordt een primordiale follikel gevormd en de primaire oöcyt start met meiose I. Deze meiotische deling wordt geremd en er volgt een lange rustperiode. Vanaf de puberteit zullen de primordiale follikels bij iedere cyclus rijpen tot primaire en secundaire follikels. Tussen de eicel en de follikelcellen ontwikkelt de zona pellucida. Ondertussen wordt er follikelvocht geproduceerd waardoor de tertiaire follikel ontstaat met een cumulus oöphorus. Juist voor de ovulatie hervat de meiose I met de vorming van de secundaire oöcyt en een poollichaampje, beiden omgeven door de zona pellucida en de corona radiata. Dit wordt direct gevolgd door meiose II die opnieuw wordt onderbroken bij het begin van de metafase. Deze tweede meiotische deling wordt pas afgewerkt bij de bevruchting met de vorming van de zygote (Cornillie, 2009).

15

Eicellen worden, met behulp van specifiek gereedschap en kennis, gecollecteerd op een semiinvasieve manier (Brinsko et al., 2011a). Bij de levende merries zijn er twee manieren waarop eicellen kunnen worden verzameld. Een eerste methode is de verzameling van immature eicellen uit de antrale follikels door de transvaginale aspiratie (TVA) onder echografische begeleiding. Alle follikels op de eierstok worden geaspireerd, zowel juveniele follikels, groeiende follikels als follikels die atresie ondergaan (Brinsko et al., 2011a). Het aspireren van deze immature eicellen is niet zo eenvoudig aangezien deze behoorlijk vastgehecht zitten aan de follikelwand (Leemans et al., 2012; Smits, 2012). Deze onrijpe eicellen moeten verder in vitro gematureerd worden alvorens ze bevrucht kunnen worden. De tweede methode voor het verzamelen van eicellen bij levende merries is het aspireren van de preovulatoire dominante follikels, eventueel na stimulatie met gonadotropines. Doorgaans verzamelt men op deze manier één rijpe eicel (soms twee), die door maturatie in vivo zich in de metafase II van de meiose bevindt en optimale ontwikkelingscapaciteiten bezit (Hinrichs, 2010; Brinsko et al., 2011a). Het aspireren van deze rijpe eicellen is eenvoudiger dan bij de onrijpe eicellen, vermits deze eicellen relatief los in de follikel zitten als gevolg van de voorbereiding voor de ovulatie (Coutinho da Silva, 2008). De dominante follikel (> 35 mm diameter) kan zowel transvaginaal (TVA) als transabdominaal (flankpunctie) geaspireerd worden (Leemans, 2012). Eicellen kunnen ook post mortem verzameld worden, bij merries die plots sterven of moeten geëuthanaseerd worden. Het is aanbevolen de ovaria vóór de euthanasie te collecteren onder anesthesie, of indien niet uitvoerbaar zo snel mogelijk na de dood (Brinsko et al., 2011a; Leemans et al., 2012). Na het transport van de ovaria naar het laboratorium, worden de follikels geopend met een scalpel en wordt de binnenwand afgeschraapt (Brinsko et al., 2011a).

Zoals reeds vermeld kunnen zowel mature eicellen, die reeds in vivo gerijpt zijn, als immature eicellen, die nadien in vitro rijpen, gecollecteerd worden. Na de maturatie van deze eicellen kunnen ze bevrucht worden. De incubatie van rijpe eicellen met gecapaciteerd sperma of de ‘in vitro fertilisatie’ blijkt niet herhaalbaar bij het paard, aangezien spermatozoa van hengsten moeite hebben met de penetratie van de zona pellucida van de eicel in vitro (Leemans et al., 2012). Bij intracytoplasmatische sperma-injectie (figuur 8) wordt één spermacel in het cytoplasma van een rijpe eicel geïnjecteerd door middel van micromanipulatie, met een fijne glazen naald. Op deze manier is bevruchting in vitro wel mogelijk ondanks de moeilijkheden met IVF bij paarden (Choi et al., 2002; Hinrichs et al., 2002; Smits et al., 2010; Leemans et al., 2012). Vervolgens zullen de in vitro bevruchte eicellen ofwel direct in de eileider van een receptormerrie worden gebracht ofwel in vitro verder ontwikkelen tot blastocysten (Leemans et al., 2012).

Figuur 8: Intracytoplasmatische spermainjectie (Uit Smits et al, 2010)

Anderzijds kan de bevruchting in vivo gebeuren door eiceltransfer. Dit is de chirurgische overdracht van een rijpe eicel van een donormerrie naar de eileider van een geïnsemineerde receptormerrie. Rijpe eicellen uit preovulatoire follikels kunnen rechtstreeks worden overgebracht naar de 16

receptormerrie terwijl onrijpe eicellen eerst in vitro moeten rijpen (Scott et al., 2001; Hinrichs et al., 2002; Leemans et al., 2012). Eicellen kunnen na het verzamelen ook worden ingevroren om later gebruikt te worden voor eiceltransfer, bijvoorbeeld bij waardevolle merries die plots sterven.

2. Invloed van het maturatiestadium en het cumuluscomplex van de eicel Het invriezen van eicellen kent geringe toepassing in de praktijk door weinig succesvolle embryoontwikkelingen of drachten na cryopreservatie. Een eicel bestaat uit één cel en is bijgevolg meer kwetsbaar dan de multicellulaire embryo’s die het verlies van enkele cellen beter kunnen rechtzetten (Mukaida en Oka, 2012). Tharasanit et al. (2006a en 2006b) ging aan de hand van verschillende experimenten na wat het effect is van de rijpingsfase van een eicel, de methode van invriezen en de cumulusmorfologie op het vermogen van eicellen om cryopreservatie te weerstaan. Dit werd getoetst door de beoordeling van de mate van rijping, de kwaliteit van de spoelfiguur bij de MII fase en de mate van deling en blastocystontwikkeling na intracytoplasmatische sperma-injectie (Tharasanit et al., 2006a en 2006b).

2.1. Invloed van het maturatiestadium Bij de rijpingsfase van de eicel maakt men het onderscheid tussen het GV stadium en het MII stadium. GV of ‘germinal vesicle’ of ‘kiemblaas’ stadium is de fase vóór de rijping van de eicel, met een geremde meiose I. Het MII of ‘metafase II’ stadium is de fase na de rijping van de eicel, die zowel in vivo als in vitro kan gebeuren, met een geremde meiose II. Met andere woorden, eicellen die zich in het GV stadium bevinden zijn onrijpe eicellen en eicellen die zich in het MII stadium bevinden zijn rijpe eicellen (Tharasanit et al., 2006b).

Volgens de studie van Tharasanit et al. (2006a) hebben onrijpe eicellen meer vermogen om de metafase II te bereiken na in vitro maturatie wanneer deze ingevroren worden door vitrificatie (28%), in vergelijking met de conventionele invriezingstechniek (1,2%). Bij de conventionele methode stoppen immers vele eicellen (20%) met rijpen bij metafase I. Het percentage van onrijpe eicellen dat de metafase II bereikt na conventioneel invriezen en na in vitro maturatie, vertoont in deze studie lagere waarden dan de studie van Hochi et al. (1994b). Dit komt vermoedelijk door de tragere temperatuursdaling in de experimenten van Tharasanit et al. (2006a), die meer schade veroorzaakt. Ondanks het feit dat er meer onrijpe eicellen de metafase II bereiken na vitrificatie, vertoont 42% van de eicellen in deze studie na vitrificatie en maturatie een abnormale spoelfiguur (figuur 9) (Tharasanit et al., 2006a). De schade aan de spoelfiguur wordt veroorzaakt door zwelling van de mitochondriën, die een belangrijke rol spelen in de vorming van de spoelfiguur en de polymerisatie van de microtubuli (Hochi et al., 1994b).

17

Figuur 9: Confocale laser scanning microfoto om het cytoskelet en chromatine in ingevroren eicellen te illustreren (A. normale kwaliteit van de spoelfiguur, B. abnormale kwaliteit van de spoelfiguur: verspreiding van de spoelfiguur en klontering van de chromatine; C. abnormale kwaliteit van de spoelfiguur: abnormale vorming van de polen van de spoelfiguur; PB= polair lichaam; kleuring actine cytoskelet door Alexa Fluor ® 488 phalloidin (groen); kleuring microtubuli door monoklonale anti-α-tubuline-TRIT C (rood); kleuring chromatine door ToPro3 (blauw)) (Uit: Tharasanit et al., 2006a).

Rijpe eicellen hebben bij meer dan 50% van de eicellen na conventioneel invriezen of vitrificatie schade aan de spoelfiguur, vermits deze structuur zeer gevoelig is aan koude (Tharasanit et al., 2006a). Behalve een abnormale spoelfiguur kunnen andere vormen van schade, zoals gezwollen mitochondriën, beschadigde cytoplasmatische factoren, het niet hervatten van de meiose,… zorgen voor verminderde bevruchting- en delingspercentages. Deze schade wordt niet veroorzaakt door de aanwezige cryoprotectantia maar door het invriezen van de eicellen (Tharasanit et al., 2006b).

Conventionele invriezing

Vitrificatie

Onrijpe eicellen (GV stadium)

1%

15%

Rijpe eicellen (MII stadium)

35%

20%

Tabel 2: Het percentage eicellen, onrijp of rijp, dat de metafase II bereikt met een normale spoelfiguur na conventionele invriezing of vitrificatie. (Naar: Tharasanit et al., 2006a)

Aangezien een normale spoelfiguur essentieel is voor de bevruchting en embryo-ontwikkeling (Winston et al., 1995), is de conventionele invriezing van rijpe eicellen (tabel 2) de meest geschikte methode voor de opslag van eicellen bij het paard volgens de studie van Tharasanit et al. (2006a). Hoewel deze combinatie van maturatiestadium en invriezingstechniek 35% normaal uitziende eicellen in de metafase II oplevert, wordt het vermogen van deze eicellen om de bevruchting te ondersteunen zwaar ondermijnd. De delingspercentages van rijpe eicellen na conventioneel invriezen en bevruchting door ICSI bedragen immers slechts 8% (Tharasanit et al., 2006a).

2.2. Invloed van het cumuluscomplex Een normale eicel is omgeven door een corona radiata en enkele lagen cumuluscellen, waarbij de communicatie tussen de eicel en de cumuluscellen zeer belangrijk is voor de eicelrijping. Deze ‘cumulus oöcyt complexen’ (COC’s) vertonen twee vormen van cumulus morfologie (figuur 10): de 18

compacte (Cp) of geëxpandeerde (Ex) cumulus, afhankelijk van de mate van cumulus expansie (Hinrichs et al., 1993). Uit studie blijkt dat Ex eicellen een hoger percentage rijping tot de metafase II hebben dan de Cp eicellen (Choi et al., 2004; Hinrichs, 2010)

Figuur 10: Licht microfoto van cumulus eicel complexen met typische Cp (A) en Ex (B) cumulus massa . (Uit Tharasanit 2006b)

Het verloop van de maturatie in vitro hangt af van de rijpingsfase van de eicel bij het verzamelen en de wijze van verzameling. Rijpe eicellen uit preovulatoire follikels zijn reeds bezig met de meiose. Ze bevinden zich in de metafase I en worden 12 tot 18 uur in cultuur gebracht (Hinrichs, 2013). Onrijpe eicellen gecollecteerd door schraping van de weggesneden eierstokken, hebben een intacte cumulus. Geëxpandeerde eicellen hebben een optimale rijpingsduur van 24 tot 30 uur en bij compacte eicellen bedraagt deze 30 tot 36 uur (Hinrichs et al., 2005). Onrijpe eicellen die worden verzameld door aspiratie, behouden enkel de corona radiata waardoor geen onderscheid kan worden gemaakt tussen compacte en geëxpandeerde eicellen. Deze geaspireerde oöcyten laat men 30 uur rijpen vermits dit voor een goede ontwikkeling zorgt bij zowel Cp als Ex eicellen (Hinrichs et al., 2005).

Cumuluscellen zijn bij voorkeur aanwezig tijdens het invriezen omdat ze de eicel beschermen tegen celschade tijdens cryopreservatie en ze belangrijk zijn voor de rijping van de eicellen (Pellicer et al., 1988). Tharasanit et al. (2006b) gaan op zoek naar de meest geschikte cumulusmorfologie voor cryopreservatie. Er is geen effect van een compacte of een geëxpandeerde cumulus op het vermogen van eicellen om tot de metafase II te komen tijdens de in vitro maturatie, ongeacht de eicellen werden ingevroren of niet (Tharasanit et al., 2006b). Uit andere studies blijkt echter dat eicellen met een geëxpandeerde cumulus betere waarden voor maturatie vertonen dan eicellen met een compacte cumulus (Hinrichs, 2010; Choi et al., 2004). Het contrast tussen de studies zou te wijten zijn aan de verschillende methode van eicelverzameling, de verschillende follikelgroottes, een verschillende behandeling van de ovaria voor de eicelverzameling,… (Choi et al., 2004; Hinrichs, 2010; Tharasanit et al., 2006b). Bovendien heeft de cumulusmorfologie geen invloed op de delingspercentages na ICSI, maar wel een duidelijk effect op de kwaliteit van de spoelfiguur na invriezing. Voornamelijk eicellen met een geëxpandeerde cumulus vertonen een slechte kwaliteit van de spoelfiguur: 67% Ex eicellen en 37% Cp eicellen bezitten een beschadigde spoelfiguur (Tharasanit et al., 2006b). Wellicht zorgt de dichte en compacte cumulus tijdens de verglazing en opwarming voor een betere buffering tegen osmotische schade dan de geëxpandeerde cumulus met minder beschermende cellagen (Pellicer et al., 1988). 19

De beste perspectieven voor het verkrijgen van eicellen in de metafase II met een normale spoelfiguur en het vermogen tot bevruchting, worden verkregen door de vitrificatie van onrijpe eicellen met een compacte cumulus (tabel 3). Verder onderzoek is echter nodig aangezien vitrificatie zorgt voor een drastische daling in de ontwikkeling (Tharasanit et al., 2006b).

Compacte cumulus

Geëxpandeerde cumulus

Onrijpe eicellen (GV stadium)

26%

15%

Rijpe eicellen (MII stadium)

19%

19%

Tabel 3: Het percentage eicellen dat de metafase II bereikt met een normale spoelfiguur na vitrificatie. (Naar: Tharasanit et al., 2006b)

3. Het invriezen van eicellen bij het paard Een overzicht van de studies omtrent de cryopreservatie van eicellen bij het paard wordt weergegeven in tabel 4. In deze studies gaat men op zoek naar de meest geschikte methode voor het invriezen van eicellen bij de merrie. Enkele van de studies onderzoeken het effect van de soorten cryoprotectantia, het effect van synthetische ijs-blokkers en de beste methode voor de blootstelling aan deze oplossingen. Hochi et al. (1994b) tonen aan dat immature paardeneicellen in vitro kunnen rijpen tot het MII stadium na het conventioneel invriezen en opwarmen in ethyleenglycol en 1,2-propanediol, maar niet in glycerol. In de loop der jaren wordt voornamelijk ethyleenglycol als cryoprotectant aangewend, in combinatie met DMSO of onder de vorm van EFS (tabel 4). In de studie van Nowak et al. (2014) hebben eicellen een hogere vitaliteit na verglazing met het EquiPro Vit-Kit medium in vergelijking met het EFS medium. Bijkomend kan het toevoegen van een synthetische ijs-blokker een positieve invloed hebben op de maturatiewaarden. In 2012 evalueert De Leon et al. de carriersystemen OPS en SSV en het gebruik van een synthetische ijs-blokker bij de vitrificatie van immature eicellen. Er is geen significant voordeel geassocieerd met OPS of SSV in verband met de maturatie, maar de toevoeging van 0,1% synthetische ijs-blokkers doet de maturatiewaarden stijgen (De Leon et al., 2012). Ook de methode van blootstelling aan de cryoprotectantia is van belang. Zo tonen Hochi et al. (1996a) aan dat het percentage eicellen dat de metafase II bereikt na in vitro maturatie groter is na stapsgewijze blootstelling aan de vitrificatieoplossing. Bovendien blijft de ultrastructuur van eicellen beter bewaard na een vermindering van de duur van blootstelling aan de vitrificatieoplossing (Curcio et al., 2014).

Slechts één studie geeft aanleiding tot de productie van veulens. In de studie van MacLellan et al. (2002b) worden in vivo gematureerde eicellen verzameld, verglaasd en overgebracht naar een receptormerrie voor bevruchting in vivo. Twee gezonde veulens worden geproduceerd, ondanks dat de leefbaarheid van de gevitrificeerde eicellen een stuk lager ligt dan de controle eicellen (MacLellan et al., 2002). Enkele jaren later tonen MacLellan et al. aan dat rijpe eicellen ingevroren kunnen worden met de cryotop methode. Ondanks de hoge delingspercentages (83%) is de embryo-ontwikkeling na bevruchting telleurstellend (slechts 40% bereikt het blastocyst stadium) (MacLellan et al., 2010). 20

A. CONVENTIONEEL INVRIEZEN Referentie

Cryoprotectant

Carrier

Maturatie

Cumulus

Resultaat

Hochi et al., 1994b

1. Ethyleenglycol (2 stappen)

0,25 ml rietje

Immatuur

Compact

1. 15,8% MII 2. 5,8% MII

2. 1,2- propanediol (2 stappen)

3. 0% MII Controle 63,3% MII

3. Glycerol (2 stappen) Tharasanit et al., 2006a

Ethyleenglycol (2 stappen)

0,25 ml rietje

Immatuur

Compact

1,2% MII Controle 65,7% MII

Matuur

Compact

35% MII, 8% deling

B. VITRIFICATIE Referentie

Vitrificatie oplossing

Carrier

Maturatie

Cumulus

Resultaat

Hochi et al., 1996a

EFS (1 stap)

0,25 ml rietje

Immatuur

Aanwezig

2% MII

EFS (2 stappen)

16% MII Controle 60%

Hurt et al., 1999

EFS (2 stappen)

OPS

Immatuur

Compact

30% MII

Matuur

Compact

40% MII Controle 46% MII

MacLellan et al., 2002b

Ethyleenglycol en DMSO

Nylon cryoloop

Matuur (in vivo mat.)

Compact of geëxpandeerd

12% embryoblaasje, 2 veulens Controle 83% embryoblaasje

Tharasanit et al., 2006b

Ethyleenglycol en DMSO (2 stappen)

OPS

Immatuur

Compact

41% MII, 34% deling, 4% BL

OPS

Matuur

Geëxpandeerd

46% MII, 27% deling, 0% BL

Compact

47% MII, 16% deling, 0% BL

Geëxpandeerd

54% MII, 4% deling, 0% BL Controle Cp 58% MII, 48% deling; Controle Ex 68% MII, 66% deling

MacLellan et al., 2010

Ethyleenglycol

Cryotop

Matuur (20-24 uur mat. in vivo, 18 uur mat. in vitro)

(niet bepaald)

83% deling, 40% BL, 26% dracht

De Leon et al., 2012

DMSO en ethyleenglycol (2 stappen)

OPS (0% / 0,1% / 1,0% ijs-blokker)

Immatuur

(niet bepaald)

13,3% / 30,5% / 20,2% MII

SSV (0% / 0,1% / 1,0% ijs-blokker)

Immatuur

9,4% / 20,9% / 13,2% MII Controle 50,9% MII

Nowak et al., 2014

1. EquiPro Vit-Kit medium 2. EFS

Rapid-i

Matuur

Compact, geëxpandeerd of afwezig

1. 63% levende eicellen 2. 55% levende eicellen

Tabel 4: Een overzicht van de studies omtrent het invriezen van eicellen bij het paard (MII= metafase II, BL= blastocyst, mat.= maturatie)

21

Zoals reeds eerder aangegeven, wordt het hoogst aantal normaal uitziende eicellen in de metafase II volgens Tharasanit et al. (2006a) bereikt door de conventionele invriezing van rijpe eicellen met een compacte cumulus. Desondanks vertonen deze eicellen 48 uur na intracytoplasmatische spermainjectie slechts delingspercentages van 8%, in vergelijking met delingspercentages van 41% in de controlegroep (Tharasanit et al., 2006a). De vitrificatie van onrijpe eicellen met een compacte cumulus resulteert in lagere maturatiewaarden (26%, in vergelijking met 35% na conventioneel invriezen van rijpe eicellen), maar deze eicellen vertonen na bevruchting delingspercentages van 34%. Afgezien van betere verwachtingen na deze bevinding, zorgt vitrificatie nog steeds voor een opvallende daling in de mogelijkheid van eicellen tot verdere ontwikkeling. Geen van de bestudeerde methoden blijkt effectief, er is bijgevolg meer onderzoek nodig om het invriezen van eicellen in de praktijk te kunnen toepassen (Tharasanit, 2006b).

III. EMBRYO’S 1. Het verzamelen en het gebruik van embryo’s Twaalf tot vierentwintig uur na de bevruchting beginnen de eerste delingen. Er worden blastomeren gevormd en tijdens de afdaling zorgt de zona pellucida voor verhindering van vroegtijdige inplanting. Na het achtcellig stadium ontstaat een cluster van 64 blastomeren: de morula (Cornillie, 2009). Deze ondergaat compactie waarna er verschillende holtes ontstaan die samenvloeien tot de blastocoel. De afgeplatte cellaag van blastomeren errond is de trofoblast en de inwendige blastomeren die samen aan één zijde van de blastocoel zitten vormen de kiemknop of embryoblast (Cornillie, 2009). De blastocoel, trofoblast en embryoblast vormen samen de blastocyst, die 130 tot 142 uur na de ovulatie in de uterus komt (Freeman et al., 1991). Tijdens de blastulatie produceren de trofoblastcellen een mantel van glycoproteïnen tussen de zona pellucida en het embryo, het kapsel. Deze verdwijnt pas na implantatie van de vrucht (Cornillie, 2009).

Alvorens embryo’s te collecteren via de niet-chirurgische transcervicale baarmoederspoeling, is er informatie nodig in verband met de ovulatie (Coutinho da Silva, 2008). De transporttijd van paardenembryo’s in de oviducten, vanaf de ovulatieplaats tot aan de ingang van de uterus, bedraagt 5,5 tot 6 dagen. Ze vertonen bij binnenkomst in de uterus ontwikkelingsstadia van compacte morulae tot vroege blastocysten (Freeman et al., 1991). Embryo’s voor cryopreservatie worden het best verzameld tussen 6 en 6,5 dagen na ovulatie of 8 dagen na de toediening van hCG (Carnevale, 2006; Carnevale, 2008). Het collecteren van embryo’s voor embryotransfer wordt uitgevoerd op dag 7 of 8 na de ovulatie. Bij spoeling op dag 6 riskeert men dat het embryo de baarmoeder nog niet heeft bereikt, bij spoeling op dag 9 is het embryo te groot voor manipulatie en zal het snel beschadigd worden (Hinrichs, 2013). Het verzamelen van embryo’s gebeurt door een baarmoederspoeling, aan de hand van een grote katheter die steriel doorheen de cervix van de merrie wordt gebracht. Vervolgens wordt de baarmoeder gespoeld en wordt dit spoelingmedium terug afgelaten. Nadien gaat men via een stereomicroscoop op zoek naar het embryo en wordt de grootte en het ontwikkelingsstadium bepaald (Squires et al., 2003).

22

Een embryo wordt rechtstreeks na embryospoeling, na koeling of na invriezing en opwarming overgebracht naar een receptormerrie via embryotransplantatie (ET). De voorbije decennia is het gebruik van ET enorm toegenomen. Deze techniek werd toegankelijker door de ontwikkeling van nietchirurgische overdracht van embryo’s, door aanpassingen in de regelgeving omtrent de registratie van het aantal veulens per moeder per jaar en door de ontwikkeling van gekoeld transport van embryo’s (Stout, 2012). Een belangrijke factor bij embryo transplantatie is de synchronisatie van de donor- en de receptormerrie. Men spreekt over een tijdsvenster tussen ovulatie bij donor en receptor. Bij paarden bedraagt deze vier dagen, +1 tot -3 dagen, wat wil zeggen dat de receptormerrie één dag voor tot drie dagen na de donormerrie mag ovuleren (Squires en Seidel, 1995). De transplantatie van het embryo kan via een chirurgische of een niet chirurgische methode. De chirurgische methode, een staande laparotomie, is duurder, trager en ethisch minder verantwoord (Stout, 2006). De niet chirurgische benadering kan worden verricht met een kunstmatige inseminatiepipet, een wegwerpbare plastieken inseminatie pistool of een herbruikbare roestvrijstalen inseminatie pistool (figuur 11). Het embryo wordt in het baarmoederlichaam of in één van de baarmoederhoornen achtergelaten (Vanderwall, 2000).

Figuur 11: Uitrusting van een nietchirurgische embryo-transfer: A) herbruikbare roestvrijstalen inseminatie pistool, B) wegwerpbare plastieken inseminatie pistool, C) standaard inseminatiepipet, D) bescherming (Uit: Vanderwall, 2000)

2. Invloed van het glycoproteïnenkapsel en de grootte van het embryo Zoals eerder aangegeven, worden embryo’s voor cryopreservatie het best verzameld tussen 6 en 6,5 dagen na ovulatie of 8 dagen na de toediening van humaan choriongonadotrofine (hCG) (Freeman et al., 1991; Carnevale, 2006; Carnevale, 2008). Op dit tijdstip zijn de embryo’s nog klein genoeg, vermits acceptabele drachten enkel worden bereikt door de cryopreservatie van embryo’s kleiner dan 300 µm (Slade et al., 1985). De verzameling van embryo’s blijkt echter efficiënter op dag 7, aangezien collecte op dag 6 minder embryo’s oplevert. Een mogelijke verklaring is de variatie in de snelheid van de groei van het embryo en het tijdstip van aankomst in de uterus. Niet alle embryo’s bereiken de baarmoeder immers na 6 dagen. Bij te vroege spoeling dreigt men het embryo bijgevolg te missen, bij het te laat spoelen riskeert men een embryo dat te groot is voor cryopreservatie. (Stout, 2012).

De contradictie tussen de optimale leeftijd van het embryo voor invriezing met de huidige methoden (dag 6) en de optimale leeftijd van het embryo voor verzameling (dag 7 of dag 8) is een struikelblok bij de cryopreservatie van embryo’s (Scherzer et al., 2011). Enerzijds kan men zich focussen op het verzamelen van kleine embryo’s, onder andere door het precieze tijdstip van ovulatie te bepalen na

23

ovulatie-inductie. Volgens de studie van Eldridge-Panuska et al. (2005) kan de verzameling van kleine embryo’s succesvol zijn bij goede timing na hCG injectie. Door toediening van hCG aan de merrie wordt de ovulatie 36 uur later geïnduceerd en komt het embryo 8 dagen na de injectie aan in de baarmoeder. Deze methode is niet effectief indien de merrie vroeger ovuleert, indien er geen reactie is op hCG of indien er een vertraagde embryo-ontwikkeling optreedt, zoals bij oudere merries of na inseminatie met diepvries sperma (Carnevale, 2006). Meer hoop wordt gevestigd op een protocol voor het invriezen van oudere en dus grotere blastocysten. Redenen voor het mislukken van de cryopreservatie bij deze grote embryo’s zijn enerzijds het kapsel rondom het embryo en anderzijds de snel groeiende blastocyst met een grote bastocoel.

2.1. Invloed van het glycoproteïnenkapsel Tijdens de vorming van de blastocyst vormen de trofoblastcellen mucine-achtige glycoproteïnen tussen de zona pellucida en het embryo. Deze mantel van glycoproteïnen is het kapsel. Door dit kapsel zal er nog geen implantatie van het embryo plaatsvinden maar de groei wordt niet verhinderd. Bovendien is de migratie van het embryo belangrijk voor de herkenning van de dracht door de merrie. Het kapsel verdwijnt pas na implantatie van de vrucht (Cornillie, 2009). De vitrificatie van embryo’s wordt geremd door de moeizame penetratie van cryoprotectantia doorheen dit kapsel. De grote blastocysten zijn minder permeabel voor ethyleenglycol en glycerol, terwijl kleine blastocysten deze cryoprotectantia wel behoorlijk kunnen opnemen. Hoewel er voldoende cryoprotectantia in het embryo aanwezig zijn, blijft er water over in de cel wat ongunstig is voor vitrificatie (Hochi et al., 1995).

Verschillende studies zijn uitgevoerd voor de verbetering van de permeabiliteit van het kapsel voor cryoprotectantia (Choi et al., 2011). Legrand et al. (2000) behalen drachtigheidsresultaten van 75% door het gebruik van trypsine, wat het kapsel deels doet oplossen. Andere studies met trypsine zijn beduidend minder succesvol (MacLellan et al., 2002a; Choi et al., 2011). Ook het gebruik van cytochalasine B, die beschadiging van de celmembraan voorkomt, heeft weinig effect (MacLellan et al., 2002a; Choi et al., 2011). Het simpelweg verwijderen van het kapsel biedt ook geen oplossing vermits het embryo zonder kapsel niet verder kan ontwikkelen (Stout et al., 2005). In 2008 testen Scherzer et al. een methode van aspiratie van de blastocoel vloeistof gevolgd door de injectie van cryoprotectantia, gebaseerd op een studie bij vissenembryo’s. Het protocol resulteert in verminderde vorming van schadelijke ijskristallen. Één van de embryo’s in deze studie vormt een kiemblaas maar resorbeert vroeg in de dracht, vermoedelijk door hittestress. Dit resultaat moedigt aan tot bijkomend onderzoek (Scherzer et al., 2008). Vervolgens wordt dit protocol aangepast: de blastocoel vloeistof wordt vervangen door een cryoprotectantoplossing via een laser systeem dat een kleine opening maakt in het kapsel. Verder onderzoek is echter noodzakelijk aangezien de meeste embryo’s in dit experiment verloren gaan tussen dag 13 en dag 23 van de dracht (Scherzer et al., 2011).

24

2.2. Invloed van de grootte van het embryo Vijf en een halve dag na de ovulatie bereikt het embryo de baarmoeder (Freeman et al., 1991). Nadien verdubbelt de grootte van dit embryo bijna iedere dag. Volgens Vanderwall (2000) en Brinsko et al. (2011b) nemen embryo’s de volgende groottes en stadia (figuur 12) aan in de dagen na het bereiken van de uterus; dag 6 na ovulatie: morula tot vroege blastocyst (+- 200 µm: tussen 130 – 750 µm); dag 7 na ovulatie: morula tot geëxpandeerde blastocyst (+- 400 µm: tussen 135 – 1460 µm); dag 8 na ovulatie: blastocyst tot geëxpandeerde blastocyst (1000 µm: tussen 120 – 4000 µm); dag 9 na ovulatie: geëxpandeerde blastocyst (2000 µm: tussen 750 – 4500 µm). Kleine embryo’s, van het morula tot blastocyst stadium, worden gedefinieerd als kleiner dan 300 µm. Embryo’s worden beschouwd als groot wanneer ze groter zijn dan 300 µm. Dit zijn doorgaans blastocysten (Carnevale, 2008).

De grote hoeveelheid vocht in de blastocoel van de blastocyst veroorzaakt moeilijkheden bij de cryopreservatie van grote blastocysten. Dehydratatie van de blastocyst is een mogelijke oplossing voor deze problemen. Barfield et al. (2009) bestudeert het effect van galactose. Door toevoeging van deze niet-penetrerende suiker vloeit er vocht uit de blastocoel naar buiten door osmose. Deze methode is succesvol bij boviene embryo’s (een grote volume daling door dehydratatie wordt gezien bij blootstelling van 0,6M galactose gedurende 2 minuten), maar vertoont slechte resultaten bij paardenembryo’s. Vanwege de grotere oppervlaktevolume verhouding voor uitwisseling bij equine embryo’s in vergelijking met boviene embryo’s, zou langere blootstelling aan galactose eventueel betere resultaten opleveren (Barfield et al., 2009).

Figuur 12: Ontwikkelingstadia van het equine embryo; A) Onbevruchte eicel; B) Compacte morula; C) Vroege blastocyst; D) Geëxpandeerde blastocyst (Uit: Brinsko et al., 2011b)

25

Tijdens een studie naar pre-implantatie genetische diagnostiek via embryo biopsie wordt het kapsel van een embryo via micromanipulatie gepuncteerd en worden de trofoblastcellen geaspireerd. Deze trofoblastcellen worden vervolgens geanalyseerd. Ten gevolge van deze manipulatie treedt er collaps op van de blastocoel waardoor de diameter van het embryo verkleint (Choi et al., 2010). In 2011 verrichten Choi et al. bijkomend onderzoek. Met behulp van micromanipulatie met een Piezoelektrisch boorsysteem wordt het embryonale kapsel doorboord, gevolgd door de aspiratie van de trofoblastcellen met een micro-pipette. Bij de centrale aspiratietechniek wordt er meer dan 70% van het vocht en cellen uit het centrum van de blastocoel opgezogen. Na de vitrificatie en de opwarming wordt een deel van deze embryo’s onmiddellijk getransfereerd en wordt het andere deel 6 uur in cultuur

gebracht

vóór

de

transfer.

Deze

centrale

aspiratietechniek

geeft

aanleiding

tot

drachtigheidsresultaten van 57% bij directe transfer en 13% bij transfer na 6 uur in cultuur. Bij de perifere aspiratietechniek wordt er meer dan 70% van de blastocoel vloeistof weggezogen aan de periferie van het embryo. Deze techniek geeft aanleiding tot hogere drachtigheidsresultaten (71%), vermoedelijk doordat de centrale aspiratietechniek het ontwikkelende endoderm die de blastocoel aflijnt verstoort (Choi et al., 2011). Zowel de afname van volume van de blastocoel als de penetratie van het kapsel, waardoor cryoprotectantia kunnen binnendringen, zorgen voor het slagen van deze blastocoel collaps techniek. Verder onderzoek is nodig voor de vereenvoudiging van deze techniek.

3. Het invriezen van embryo’s bij het paard Een overzicht van de studies omtrent het invriezen van embryo’s bij het paard is weergegeven in tabel 5. In enkele van deze studies wordt het effect van de verschillende soorten cryoprotectantia bestudeerd. In 1984 vergelijken Yamamoto en Hachinohe het gebruik van DMSO en glycerol, waaruit blijkt dat paardenembryo’s gevoeliger zijn aan zuiver DMSO. Hochi et al. (1994a) tonen aan dat stapsgewijze blootstelling aan de vitrificatieoplossing essentieel is voor het overleven van de embryo’s na het opwarmen (Hochi et al., 1994a). In een ander onderzoek wordt het effect van drie cryoprotectantia (ethyleenglycol, glycerol en ethyleenglycol met sucrose) geëvalueerd door embryotransfer na stapsgewijze verdunning (ethyleenglycol en glycerol) of na directe transfer (ethyleenglycol met sucrose). Het conventioneel invriezen met ethyleenglycol en sucrose gevolgd door de directe transfer van de blastocysten, zonder verwijdering van de cryoprotectantia, geeft aanleiding tot acceptabele drachtigheidspercentages (63,3%) op dag 15 (Hochi et al., 1996b). Embryo’s kleiner dan 300 µm vertonen acceptabele drachtresultaten na zowel conventionele invriezing als verglazing. In een studie uitgevoerd door Slade et al. (1985) geeft embryotransfer, na conventionele invriezing van kleine embryo’s met glycerol, aanleiding tot een drachtigheidspercentage van 53%. Vroege blastocysten behalen hierbij hogere resultaten (80%) dan geëxpandeerde blastocysten (14%) (Slade et al., 1985). De studie van Czlonkowska et al. (1985) bevestigt dat vroege blastocysten cryopreservatie beter verdragen dan grote blastocysten. Hochi et al. (1994a) tonen aan dat late morulae en vroege blastocysten gevitrificeerd kunnen worden met EFS-40, met een drachtigheidspercentage van 40% (Hochi et al., 1994a). Kleine embryo’s kunnen volgens EldridgePanuska et al. (2005) succesvol verzameld worden 6,5 dagen na ovulatie of 8 dagen na de toediening 26

van hCG. De transfer van deze kleine embryo’s na vitrificatie levert goede drachtigheidsresultaten op (67%) (Eldridge-Panuska et al., 2005). Campos-Chillón et al. (2009) onderzoekt de optimale methode en het optimale stadium van ontwikkeling voor de vitrificatie van boviene embryo’s en past deze toe bij equine embryo’s. De vitrificatie van 2- tot 8-cellige equine embryo’s (na ICSI), met ethyleenglycol en galactose, geeft aanleiding tot drachtigheidsresultaten van 62% op dag 20 (Campos-Chillón et al., 2009).

A. CONVENTIONEEL INVRIEZEN Referentie Yamamoto en Hachinohe, 1984

Cryoprotectant

Carrier

Embryo stadium

Pyrex test tube

vroege tot Ex BL

1. DMSO (3 stappen)

2. Glycerol (2 of 3 stappen)

Resultaat

D6, D7

0% dracht

D8

0% dracht

D6, D7

19,3% dracht, 4 veulens

D8

0% dracht

Slade et al., 1985 (experiment 2)

Glycerol (2 stappen)

0,5 ml rietje

D6: vroege BL en BL (gem. 255 µm)

53% dracht (80% uit vroege BL en 14% uit Ex BL)

Czlonkowska et al., 1985

Glycerol (4 stappen)

0,25 ml rietje

D6-D8: 1/14 M, 2/14 Cp BL, 11/14 Ex BL

10/14 geen dracht 2/14 vruchtblaasje 2/14 dracht (1 veulen)

Hochi et al., 1996b

1. Ethyleenglycol (2 stappen)

0,25 ml rietje

D6: BL

1. 25% dracht 2. 37,5% dracht

2. Glycerol (2 stappen)

3. 63,6% dracht na directe transfer

3. Ethyleenglycol en sucrose (2stappen)

Controle 70% dracht

B. VITRIFICATIE Referentie

Vitrificatieoplossing

Carrier

Embryo stadium

Resultaat

Hochi et al., 1994a (experiment 2)

EFS-40 (2 stappen)

0,25ml rietje

D5-7: late M tot vroege BL (gem. 169,3 µm)

40% dracht (2/5)

Hochi et al., 1995

EFS (2 stappen)

0,25ml rietje

1. < 200 µm

1. 88% levensvatbaarheid

2. 200-300 µm

2. 75% levensvatbaarheid

3. > 300 µm

3. 25% levensvatbaarheid

D6,5-D7,5: M, BL < 300 µm, BL > 300 µm

> 300 µm: geen dracht

1. BL: 350-550 µm of 550750 µm

1. 0% dracht

2. BL: 300 – 750 µm

2. 35% dracht (alle groottes), 55% dracht (300-400 µm)

2-tot 8-cellige embryo’s (na ICSI)

62% dracht (5/8)

Eldridge-Panuska et al., 2005

Glycerol en ethyleenglycol (3 stappen)

0,25ml rietje

Campos-Chillon et al., 2005

1. Glycerol en ethyleenglycol (3 stappen)

0,25ml rietje

2. Ethyleenglycol met galactose en Ficoll (4 stappen) Campos-Chillon et al., 2009

Ethyleenglycol met galactose (2 stappen)

OPS

< 300 µm: 67% vruchtblaasje (4/6)

Tabel 5: Een overzicht van de studies omtrent het invriezen van embryo’s bij het paard (M= morula, BL= blastocyst, Cp= compact, Ex= geëxpandeerd)

27

De protocollen die goede resultaten opleveren bij de cyropreservatie van kleine embryo’s geven aanleiding tot geringe overlevingskansen bij embryo’s groter dan 300 µm. Geen van de acht dagen oude embryo’s in de studie van Yamamoto en Hachinohe (1984) ontwikkelt verder na vitrificatie in DMSO of glycerol. Na vitrificatie van zes of zeven dagen oude embryo’s met glycerol worden vier gezonde veulens geboren, waaronder het eerste veulen in de wereld dat ontwikkelde uit een diepgevroren embryo (Yamamoto en Hachinohe, 1984). Alsook de studies van Hochi et al. (1995) en Eldridge-Panuska et al. (2005) tonen aan dat grote blastocysten gevoeliger zijn aan schade door vitrificatie dan kleinere blastocysten. In de studie van Campos-Chillon et al. (2005) leidt de vitrificatie van blastocysten met een grootte van 300 tot 750 µm tot iets betere drachtigheidspercentages: 35% dracht voor alle embryo’s gebruikt in het experiment, 55% dracht voor de embryo’s met een grootte tussen 300 en 400 µm en geen dracht voor embryo’s groter dan 400 µm. De resultaten van het invriezen van embryo’s groter dan 300 µm blijken teleurstellend, tot de doorbraak van de blastocoel collaps techniek (Choi et al., 2011). Voor het eerst zijn er goede drachtigheidspercentages (71%) na het invriezen van grote blastocysten (zie ‘III.2. Invloed van het glycoproteïnenkapsel en de grootte van het embryo’). Deze techniek zou mogelijks een oplossing kunnen bieden voor de invriezing van grote embryo’s, echter meer onderzoek is nodig opdat deze techniek kan worden toegepast in de praktijk.

28

BESPREKING De laatste decennia was er een enorme evolutie in de reproductietechnologie. Uit vele onderzoeken is gebleken dat het invriezen van eicellen en embryo’s niet eenvoudig is bij paarden. Bij andere diersoorten zoals het rund, de muis en de mens staat men reeds veel verder in deze tak van de wetenschap. Men is continu bezig met het verbeteren en vernieuwen van de bestaande technieken om uiteindelijk standaard protocollen te kunnen opstellen.

Vitrificatie neemt steeds meer de conventionele techniek van invriezen over. Gedurende reeds vele jaren worden de vele vormen van schade door invriezen bestudeerd en zoekt men naar oplossingen om deze schade te beperken. Door de hoge afkoelings- en opwarmingssnelheden en de minimalisatie van het volume van de vitrificatieoplossing door specifieke carriers, verminderen de toxische effecten van de cryoprotectantia. Dit geeft aanleiding tot betere drachtresultaten.

Omwille van de lage aantallen aan eicellen die ter beschikking zijn voor onderzoek en de strubbelingen met superovulatie bij het paard, is er weinig vooruitgang geboekt in het onderzoek naar de cryopreservatie van eicellen bij het paard. Desondanks 35% van de merries twee eisprongen hebben in een cyclus (Davies Morel en Newcombe, 2008), worden paarden aanzien als een diersoort met één eisprong per cyclus. Bovendien zijn er geen geregistreerde producten bij paarden voor het betrouwbaar stimuleren van superovulatie. De conventionele invriezing van rijpe eicellen geeft aanleiding tot het hoogst aantal normaal uitziende eicellen in metafase II. Desondanks wordt het vermogen tot bevruchting zwaar aangetast (Tharasanit, 2006a). De cumulusmorfologie heeft geen effect op het vermogen van eicellen om tot de metafase II te komen of op de delingspercentages na ICSI, maar wel op de kwaliteit van de spoelfiguur. Vitrificatie van onrijpe eicellen met een compacte cumulus geeft de beste vooruitzichten voor het verkrijgen van eicellen in de metafase II met een normale spoelfiguur en de capaciteit tot bevruchting (Tharasanit, 2006b). De schade aan ingevroren eicellen enerzijds en de vitaliteit en het ontwikkelingsvermogen van ingevroren eicellen anderzijds worden sterk beïnvloed door de rijpingsfase, de cumulusmorfologie en de diersoort. De vitrificatie van equine eicellen werd slechts enkele keren geëxperimenteerd en geen van de gebruikte methodes blijkt effectief. Meer experimenten zijn nodig om specifieke protocollen op te stellen zodat er reproduceerbare resultaten ter beschikking zijn, want enkel dan zullen de paardenfokkers deze methodes lanceren in de praktijk (Nowak et al., 2014). Ook het invriezen van embryo’s staat nog niet op punt. De meerderheid van de embryo’s wordt vandaag de dag vers of na afkoeling overgebracht naar de receptormerrie. Ondanks de vele voordelen van cryopreservatie - het eenvoudiger beheer van de receptormerries, opslag voor later gebruik, lagere transportkosten, het voortbrengen van nakomelingen tijdens de sportcarrière van de merrie… - is er weinig progressie in het onderzoek betreffende de cryopreservatie van embryo’s bij paarden. Deze trage vooruitgang is te wijten aan meerdere factoren: wegens hoge kosten en problemen met ovulatie en IVF bij het paard is er slechts een kleine hoeveelheid embryo’s 29

beschikbaar voor onderzoek (Stout, 2012); bepaalde stamboeken registreren geen veulens uit een gecryopreserveerd embryo (Squires et al., 2003); embryo’s die groter zijn dan 300 µm vertonen meer cellulaire schade en lagere drachtigheidspercentages na invriezen dan embryo’s kleiner dan 300 µm (Stout, 2012); het kapsel dat wordt gevormd bij een 6,5 dagen oud embryo veroorzaakt een tragere influx van de cryoprotectantia (Hochi et al., 1995),… Embryo’s kleiner dan 300 µm vertonen reeds acceptabele drachtresultaten na zowel conventionele invriezing als verglazing. Maar door de moeilijkheden bij het verzamelen van deze kleine embryo’s is men genoodzaakt op zoek te gaan naar methoden om ook embryo’s groter dan 300 µm in te vriezen met goede resultaten. Voor de cryopreservatie van grote embryo’s zijn de ontwikkelingen in verband met de blastocoel collaps na micromanipulatie of na het gebruik van laser, veelbelovend en een stap in de goede richting. Men moet op zoek naar een eenvoudige methode voor blastocoel collaps en vitrificatie van blastocysten zonder dat het embryo daarvoor naar een laboratorium moet verzonden worden (Choi et al., 2011).

30

REFERENTIELIJST

ALLEN W.R. (2005) The development and application of the modern reproductive technologies to horse breeding. Reproduction in domestic animals, 40, 310-329 ARAV A., YAVIN S., ZERON Y., NATAN D., DEKEL I., GACITUA H. (2002) New trends in gamete’s cryopreservation. Molecular and Cellular Endocrinology,187, 77-81 ARAV A., ZERON Y. (1997) Vitrification of bovine oocytes using modified minimum drop size technique (MDS) is effected by the composition and the concentration of the vitrification solution and by the cooling conditions. Theriogenology,47,341. Bron: ORIEF Y., SCHULTZE-MOSGAU A., DAFOPOULOS K., AL-HASANI S. (2005) Vitrification: will it replace the conventional gamete cryopreservation techniques? Middle East Fertility Society Journal, 10 (3), 171-184 ARAV A., ZERON Y., LESLIE S.B., BEHBOODI E., ANDERSON G.B., CROWE J.H. (1996) Phase transition temperature and chilling sensitivity of bovine oocytes. Cryobiology, 33, 589-599 BIELANSKI A., NADIN-DAVIS S., SAPP T., LUTZE-WALLACE C. (2000) Viral contamination of embryos cryopreserved in liquid nitrogen. Cryobiology, 40, 110-116 BRINSKO S.P. (2011a) Chapter 19: Assisted Reproductive Technology. In: BRINSKO S.P., BLANCHARD T.L., VARNER D.D., SCHUMACHER J., LOVE C.C., HINRICHS K., HARTMAN D. (Editors) Manual of equine reproduction. 3th edition. 302-312 BRINSKO S.P. (2011b) Chapter 17: Embryo transfer. In: BRINSKO S.P., BLANCHARD T.L., VARNER D.D., SCHUMACHER J., LOVE C.C., HINRICHS K., HARTMAN D. (Editors) Manual of equine reproduction. 3th edition. 276-287 CAMPOS-CHILLON L.F., SUH T.K., BARCELO-FIMBRES M., SEIDEL JR., G.E. CARNEVALE E.M. (2009) Vitrification of early-stage bovine and equine embryos. Theriogenology, 71, 349-354 CAMPOS-CHILLON L.F., COX T.J., SEIDEL JR G.E., CARNEVALE E.M. (2005) Vitrification in vivo of large equine embryos after vitrification or culture. Reproduction, fertility and development, 18 (2),151 (abstract) CARNEVALE E.M. (2006) Vitrification of Equine Embryos. Veterinary clinics equine practice, 22, 831841 CARNEVALE E.M. (2008) Chapter 17: Cooling and cryopreservation of equine embryos. In: SAMPER J.C (Ed) Equine breeding management and artificial insemination. 2nd edition.., 201-207 CHOI Y.H., GUSTAFSON-SEABURY A., VELEZ I.C., HARTMAN D.L., BLISS S., RIERA F.L., ROLDAN J.E., CHOWDHARY B., HINRICHS K. (2010) Viability of equine embryos after puncture of the capsule and biopsy for preimplantation genetic diagnosis. Reproduction, 140, 893-902 CHOI Y.H., LOVE C.C., LOVE L.B., VARNER D.D., BRINSKO S., HINRICHS K. (2002) Developmental competence in vivo and in vitro of in vitro matured equine oocytes fertilized by intracytoplasmic sperm injection with fresh or frozen–thawed spermatozoa. Reproduction, 123, 455465 CHOI Y.H., LOVE L.B., VARNER D.D., HINRICHS K. (2004) Factors affecting developmental competence of equine oocytes after intracytoplasmic sperm injection. Reproduction, 127, 187-194 CHOI Y.H., VELEZ I.C., RIERA F.L., ROLDÁN J.E., HARTMAN D.L., BLISS S.B., BLANCHARD T.L., HAYDEN S.S., HINRICHS K. (2011) Successful cryopreservation of expanded equine blastocysts. Theriogenology,76, 143-152 CORNILLIE P. (2009) Hoofdstuk 1: De gametogenese en Hoofdstuk 3: Klieving en vorming van de blastocyst. Embryologie van de huisdieren. Vakgroep morfologie, Universiteit Gent, 42-47 en 57-63 31

COUTINHO DA SILVA M.A. (2008) When should a mare go for assisted reproduction? Theriogenology, 70, 441-444 CURCIO B.R., GASTAL M.O., PEREIRA G.R., CORCINI C.D., LANDIM-ALVARENGA F.C., BARROS S.S., NOGUEIRA C.E.W., DESCHAMPS J.C., GASTAL E.L. (2014) Ultrastructural morphology and nuclear maturation rates of immature equine oocytes vitrified with different solutions and exposure times. Journal of Equine Veterinary Science, 34, 632-640 DAVIES MOREL M.C.G., NEWCOMBE J.R. (2008) The efficacy of different hCG dose rates and the effect of hCG treatment on ovarian activity: Ovulation, multiple ovulation, pregnancy, multiple pregnancy, synchrony of multiple ovulation; in the mare. Animal Reproduction Science, 109, 189-199 DE LEON P.M.M., CAMPOS V.F., CORCINI C.D., SANTOS E.C.S., RAMBO G., LUCIA T., DESCHAMPS J.C., COLLARES T. (2012) Cryopreservation of immature equine oocytes, comparing a solidsurface vitrification process with open pulled straws and the use of a synthetic ice blocker. Theriogenology, 77, 21-27 DINNYÉS A., DAI Y., JIANG S., YANG X. (2000) High developmental rates of vitrified bovine oocytes following parthenogenetic activation, in vitro fertilization, and somatic cell nuclear transfer. Biology of reproduction, 63, 513-518 DOBRINSKY J.R. (1996) Cellular approach to cryopreservation of embryos. Theriogenology, 45,17-26 DOBRINSKY J.R., PURSEL V.G., LONG C.R., JOHNSON L.A. (2000) Birth of piglets after transfer of embryos cryopreserved by cytoskeletal stabilization and vitrification. Biology of reproduction, 62, 564570 ELDRIDGE- PANUSKA W.D., CARACCIOLODI BRIENZA V., SEIDEL G.E., SQUIRES E.L., CARNEVALE E.M. (2005) Establishment of pregnancies after serial dilution or direct transfer by vitrified equine embryos. Theriogenology, 63, 1308-1319 FAHY G.M., McFARLANE D.R., ANGELL C.A., MERYMAN H.T. (1984) Vitrification as an approach to cryopreservation. CRYOBIOLOGY, 21, 407-426 FREEMAN D.A., WEBER J.A., GEARY R.T., WOODS G.L. (1991) Time of embryo transport trough the mare oviduct. Theriogenology, 36, 823-830 HINRICHS K. (2010) In vitro production of equine embryos: state of the art. Reproduction in domestic animals, 45 (2), 3-8 HINRICHS K. (2013) Assisted reproduction techniques in the horse. Reproduction, Fertility and Development, 25, 80-93 HINRICHS K., CHOI Y.H., LOVE L.B., VARNER D.D., LOVE C.C., WALCKENAER B.E. (2005) Chromatin configuration within the germinal vesicle of horse oocytes: changes post mortem and relationship to meiotic and developmental competence. Biology of reproduction, 72,1142-1150 HINRICHS K., CHOI Y.H., WALCKENAER B.E., VARNER D.D., HARTMAN D.L. (2007) In vitroproduced equine embryos: production of foals after transfer, assessment by differential staining and effect of medium calcium concentrations during culture. Theriogenology, 68, 521-529 HINRICHS K., LOVE C.C., BRINSKO S.P. CHOI Y.H, VARNER D.D. (2002) In vitro fertilization of in vitro-matured equine oocytes: effect of maturation medium, duration of maturation, and sperm calcium ionophore treatment, and comparison with rates of fertilization in vivo after oviductal transfer. Biology of reproduction, 67, 256-262 HINRICHS K., SCHMIDT A.L., FRIEDMAN P.P., SELGRATH J.P., MARTIN M.G. (1993) In vitro maturation of horse oocytes: characterization of chromatin configuration using fluorescence microscopy. Biology of reproduction, 48, 363-370

32

HOCHI S., FUJIMOTO T., BRAUN J., OGURI N. (1994a) Pregnancies following transfer of equine embryos cryopreserved by vitrification. Theriogenology, 42, 483-488 HOCHI S., FUJIMOTO T., CHOI Y.H., BRAUN J., OGURI N. (1994b) Cryopreservation of equine oocytes by 2-step freezing. Theriogenology, 42, 1085-1094 HOCHI S., FUJIMOTO T., OGURI N. (1995) Large equine blastocysts are damaged by vitrification procedures. Reproduction, fertility and development, 7, 113-17 HOCHI S., KOZAWA M., FUJIMOTO T., HONDO E., YAMADA J., OGURI A. (1996a) In vitro maturation and transmission electron microscopic observation of horse oocytes after vitrification. Cryobiology, 33, 300-310 HOCHI S., MARUYAMA K., OGURI N. (1996b) Direct transfer of equine blastocysts frozen-thawed in the presence of ethylene glycol and sucrose. Theriogenology, 46, 1217-1224 HURTT A.E., LANDIM-ALVARENGA F., SEIDEL G.E. JR., SQUIRES E.L. (1999) Vitrification of immature and mature equine and bovine oocytes in an ethylene glycol, ficoll and sucrose solution using open-pulled straws. Theriogenology, 54, 119-128 KASAI M. (1997) Vitrification: refined strategy for the cryopreservation of mammalian embryos. J.Mamm. Ova. Res., 14, 17-28 KASAI M., KOMI J.H., TAKAKAMO A., TSUDERA H., SAKURAI T., MACHIDA T. (1990) A simple method for mouse embryo cryopreservation in a low toxicity vitrification solution, without appreciable loss of viability. Journals of reproduction and fertility Ltd., 89, 91-97 KASAI M., NIWA K., IRITANI A. (1980) Survival of mouse embryos frozen and thawed rapidly. J. Reprod. Fert., 59, 51-65 KUWAYAMA M. (2007) Highly efficient vitrification for cryopreservation of human oocytes and embryos: The Cryotop method. Theriogenology, 67, 73-80 KUWAYAMA M., VAJTA G., IEDA S., KATO O. (2005) Comparison of open and closed methods for vitrification of human embryos and the elimination of potential contamination. Reproductive BioMedicine Online, 11 (5), 608-614 LANE M. , SCHOOLCRAFT W.B., GARDNER D.K. (1999) Vitrification of mouse and human blastocysts using a novel cryoloop container-less technique. Fertility and sterility, 72 (6), 1073-1078 LARMAN M.G., GARDNER D.K. (2011) Vitrification of mouse embryos with super-cooled air. Fertility and Sterility, 95 (4), 1462-1466 LEEMANS B., SMITS K., VAN SOOM A., NELIS H. (2012) Fertiliteitsbehandelingen bij het paard: toepassingsmogelijkheden en beperkingen. Vlaams Diergeneeskundig Tijdschrift, 81, 329-339 LEGRAND E., KRAWIECKI J.M., TAINTURIER D., CORNIÈRE P., DELAJARRAUD H., BRUYAS J.F. (2000) Does the embryonic capsule impede the freezing of equine embryos? Havemeyer Foundation Monograph Series, 3, 62-65 LEIBO S.P., MAZUR P. (1978) Methods for the preservation of mammalian embryos by freezing. Methods in Mammalian Reproduction, 179 – 201, Academic Press, New York. Bron: KASAI M. (1997) Vitrification: refined strategy for the cryopreservation of mammalian embryos. J.Mamm. Ova. Res., 14, 17-28 LIEBERMAN J. (2012) Vitrification of oocytes and embryos. Current Frontiers in Cryobiology, Prof. Igor Katkov (Ed.), InTech, Beschikbaar op: http://www.intechopen.com/books/currentfrontiers-incryobiology/vitrification-of-human-oocytes-and-embryos MACLELLAN L.J., CARNEVALE E.M., COUTINHO DA SILVA M.A., MCCUE P.M., SEIDEL G.E. JR, SQUIRES E.L. (2002a) Cryopreservation of small and large equine embryos pre-treated with cytochalasin-B and/or trypsin. Theriogenology, 58, 717–20 (abstract) 33

MACLELLAN L.J., CARNEVALE E.M., COUTINHO DA SILVA M.A., SCOGGIN C.F., BRUEMMER J.E., SQUIRES E.L. (2002b) Pregnancies from vitrified equine oocytes collected from super-stimulated and non-stimulated mares. Theriogenology, 58, 911-919 MACLELLAN L.J., STOKES J.E., PREIS K.A., MCCUE P.M., CARNEVALE E.M. (2010) Vitrification, warming, ICSI and transfer of equine oocytes matured in vivo. Animal Reproduction Science, 121, S260-S261 (abstract) MARTINO A., SONGSASEN N., LEIBO S.P. (1996) Development into blastocysts of bovine oocytes cryopreserved by ultra-rapid cooling. Biology of reproduction, 54, 1059-1069 MEYERS-BROWN G., BIDSTRUP L.A., FAMULA T.R., COLGIN M., ROSER J.F. (2011) Treatment with recombinant equine follicle stimulating hormone (reFSH) followed by recombinant equine luteinizing hormone (reLH) increases embryo recovery in superovulated mares. Animal Reproduction Science, 128, 52-59 MUKAIDA T., OKA C. (2012) Vitrification of oocytes, embryos and blastocysts. Best Practice & Research Clinical Obstetrics and Gynaecology,26, 789-803 MUKAIDA T., TAKAHASHI K., KASAI M. (2002) Blastocyst cryopreservation: ultrarapid vitrification using cryoloop technique. Reproductive BioMedicine Online, 6 (2), 221-225 NOWAK A., KOCHAN J., PAPIS K., OKÓLSKI A. (2014) Studies on survival of horse oocytes after rapid-i method vitrification. Journal of Equine Veterinary Science, 34, 675-679 ORIEF Y., SCHULTZE-MOSGAU A., DAFOPOULOS K., AL-HASANI S. (2005) Vitrification: will it replace the conventional gamete cryopreservation techniques? Middle East Fertility Society Journal, 10 (3), 171-184 PELLICER A., LIGHTMAN A., PARMER T.G., BEHRMAN H.R., DE CHERNEY A.H. (1988) Morphologic and functional studies of immature rat oocyte–cumulus complexes after cryopreservation. Fertility and Sterility, 50, 805–810. Bron: THARASANIT T. , COLLEONI S, LAZZARI G., COLENBRANDER B., GALLI C., STOUT T.A.E. (2006b) Effect of cumulus morphology and maturation stage on the cryopreservability of equine oocytes. Reproduction, 132, 759-769. PEREIRA R.M., MARQUES C.C. (2008) Animal oocyte and embryo cryopreservation. Cell Tissue Banking, 9, 267-277 RALL W.F., MEYER T.K. (1989) Zona fracture damage and its avoidance during the cryopreservation of mammalian embryos. Theriogenology, 31 (3), 683-692 SARAGUSTY J., ARAV A. (2011) Current progress in oocyte and embryo cryopreservation by slow freezing and vitrification. Reproduction ,141, 1-19 SAVITHA P., RAMESH RAJA D., RADHA PANDIYAN (2012) Normal and abnormal oocytes observed during assisted reproductive technique (ART) procedures. Chettinad Health City Medical Journal, 1 (1), 4-11 SCHERZER J., DAVIS C., HURLEY D.J. (2011) Laser-assisted vitrification of large equine embryos. Reproduction in domestic animals, 46, 1104-1106 SCHERZER J., FAYRER-HOSKEN R.A., RAY L., HURLEY D.J., HEUSNER G.L. (2008) Advancements in Large Animal Embryo Transfer and Related Biotechnologies. Reprod Dom Anim, 43, 371–376 SCOTT T.J., CARNEVALE E.M., MACLELLAN L.J., SCOGGIN C.F., SQUIRES E.L. (2001) Embryo development rates after transfer of oocytes matured in vivo, in vitro, or within oviducts of mares. Theriogenology, 55, 705-715 SEIDEL G.E. (1996) Cryopreservation of equine embryos. Vet Clin North Am Equine Pract,12, 85 - 99 Bron: CARNEVALE E.M. (2008) Chapter 17: Cooling and cryopreservation of equine embryos. In: Equine breeding management and artificial insemination. 2nd edition. Samper J.C., 201-207 34

SLADE N.P., TAKEDA T., SQUIRES E.L., ELSDEN R.P., SEIDEL G.E. (1985) A new procedure for the cryopreservation of equine embryo’s. Theriogenology, 24 (1), 45-58 SMITS K., GOVAERE J., HOOGEWIJS M., DE SCHAUWER C., VAN HAESEBROUCK E., VAN POUCKE M., PEELMAN L.J., VAN DEN BERG M., VULLERS T., VAN SOOM A. (2010) Birth of the first ICSI foal in the Benelux. Vlaams Diergeneeskundig Tijdschrift, 79, 134-138 SMITS K., HOOGEWIJS M., WOELDERS H., DAELS P., VAN SOOM A. (2012) Breeding or Assisted Reproduction? Relevance of the Horse Model Applied to the Conservation of Endangered Equids. Reproduction in domestic animals, 47 (suppl. 4), 239-248 SQUIRES E.L. (2009) Changes in equine reproduction: have they been good or bad for the horse industry? Journal of Equine Veterinary Science, 29 (5), 268-273 SQUIRES E.L., CARNEVALE E.M., Mc CUE P.M., BRUEMMER J.E. (2003) Embryo technologies in the horse. Theriogenology, 59, 151-170 SQUIRES E.L., SEIDEL G.E. (1995) Collection and transfer of equine embryos. Animal Reproduction and Biotechnology Laboratory, bulletin No. 8. Bron: VANDERWALL D.K. (2000) Current equine embryo transfer techniques. Recent advances in equine reproduction. Publisher: International Veterinary Information Service (www.ivis.org). Document No. A0204.0400 STOREY K.B., STOREY J.M. (1990) Frozen and Alive. Scientific American, December 1990, 92 - 97 STOUT T.A.E. (2006) Equine embryo transfer: review of developing potential. Equine veterinary journal, 38 (5), 467-478 STOUT T.A.E. (2012) Cryopreservation of Equine Embryos: Current State-of-the-Art. Reproduction in Domestic Animals, 47, 84-89 STOUT T.A.E., MEADOWS S., ALLEN W.R. (2005) Stage-specific formation of the equine blastocyst capsule is instrumental to hatching and to embryonic survival in vivo. Animal Reproduction Science, 87, 269-281 THARASANIT T., COLENBRANDER B. , STOUT T.A.E. (2006a) Effect of maturation stage at cryopreservation on post-thaw cytoskeleton quality and fertilizability of equine oocytes. Molecular reproduction and development, 73, 627-637 THARASANIT T. , COLLEONI S, LAZZARI G., COLENBRANDER B., GALLI C., STOUT T.A.E. (2006b) Effect of cumulus morphology and maturation stage on the cryopreservability of equine oocytes. Reproduction, 132, 759-769. VAJTA G., HOLM P., KUWAYAMA M., BOOTH P.J., JACOBSEN H., GREVE T., CALLESEN H. (1998) Open Pulled Straw (OPS) Vitrification: A new way to reduce cryoinjuries of bovine ova and embryos. Molecular reproduction and development, 51, 53-58 VAJTA G., KUWAYAMA M. (2006) Improving cryopreservation systems. Theriogenology, 65, 236-244 VANDENBERGHE L.T.M., GOVAERE J., NELIS H., HOOGEWIJS M., DAELS P., VAN SOOM A. (2012) Embryotransplantatie bij het paard: onmisbaar in de moderne fokkerij. Vlaams Diergeneeskundig Tijdschrift, 81, 274-282 VANDERWALL D.K. (2000) Current equine embryo transfer techniques. Recent advances in equine reproduction. Publisher: International Veterinary Information Service (www.ivis.org) Document No. A0204.0400 WINSTON N.J., MCGUINNESS O., JOHNSON M.H., MARO B. (1995) The exit of mouse oocytes from meiotic M-phase requires an intact spindle during intracellular calcium release. Journal of Cell Science, 108, 143-151 YAMAMOTO Y., HACHINOHE Y. (1984) Frozen storage of equine embryos . Journal of the Faculty of Agriculture, Hokkaido University,62 (2), 182-210 35