VALIDATIERAPPORT RAPPORT DE VALIDATION

FAVV – BESTUUR LABORATORIA / AFSCA – ADMINISTRATION DES LABORATOIRE LABO: FLVVT

SECTIE - SECTION: Microscopie/Mycotoxines

VALIDATIERAPPORT – RAPPORT DE VALIDATION Analysemethode

MET-FLVVT-096

Méthode d’analyse

voedingsmiddelen en bier

Techniek

HPLC

Bepaling

van

deoxynivalenol

(DON)

in

dierenvoeders,

Technique Matrix / matrixgroep

granen

Matrice / Groupe de matrices Datum laatste aanpassing / Initieel dossier: 2004, aanpassing layout/vorm : juni 2013; laatste aanpassing Date du dernière adaption

inhoud: juni 2013





Overzicht van de prestatiekenmerken: - lineariteit: werkgebied range 100 – 1000 ng/ml (0,4 – 4 mg/kg) - Bepaalbaarheidsgrens (LOQ): 150 µg/kg - Aantoonbaarheidsgrens (LOD): 80 µg/kg - Herhaalbaarheid, intralaboratoriumreproduceerbaarheid en terugvinding: niveau herhaalbaarheid (%) reproduceerbaarheid (%) 400 µg/kg 5,7 13,1 750 µg/kg 4,5 2,6 1200 µg/kg 2,6 3,8 Meetonzekerheid %U Concentratie Laag niveau 40% Midden 30% Hoog 25% -

-

Robuustheid: vergelijking uitdamping extract op 70°C en 60°C



De validatie voldoet aan de procedure LAB 00 P180



De laboratoria die deze methode willen overnemen, moeten aantonen dat de criteria hieronder aangegeven voldaan zijn: Prestatiecriteria uit EU-verordening 401/2006

• •

Inhoud: Initieel dossier: 2003, aanpassing layout/vorm : juni 2013; laatste aanpassing inhoud: juni 2013



VALIDATIERAPPORT – RAPPORT DE VALIDATION Analysemethode

MET-FLVVT-096

Méthode d’analyse

voedingsmiddelen en bier

Techniek

HPLC-UV

Bepaling

van

deoxynivalenol

(DON)

in

dierenvoeders,

Technique Matrix / matrixgroep

Granen

Matrice / Groupe de matrices Type validatie

Totaal

Type de validation Verantwoordelijke (Naam

Jeroen Vancutsem

en functie)

sectiehoofd microscopie/mycotoxines

Responsable (Nom et fonction) Opgesteld door

Naam – Nom: Jeroen Vancutsem

Rédaction par

Functie

-

Fonction:

Handtekeningen - Signatures:

sectiehoofd (Get.)

microscopie/mycotoxines Datum - Date: juni 2013 Medewerkers

Ruth Vanhoof, analist

(Naam en functie)

Rudy Van Meerbeek, analist

Collaborateurs

Roel Tits, analist

(Nom et fonction) Periode van validatie

Start - Début: 2003

Période de validation

Einde - Fin: 2013

Methode goedgekeurd en Naam – Nom: Mandy Lekens geschikt bevonden door

Handtekeningen - Signatures:

Functie - Fonction: laboratoriummanager Datum - Date: 24 juni 2013

(Get.)

Méthode approuvée et jugé convenable pour la routine par

Hierna volgt een beschrijving van de resultaten van het validatieonderzoek zoals aangegeven in stap 8 van de procedure LAB 00 P 180. Ce qui suit est une description des résultats de l'étude de validation comme indiqué dans l'étape 8 de la procédure LAB P 00 180.



Validatiedossier 1

Lineariteit: range 100 - 1000 ng/ml (400 - 4 mg/kg)

De lineariteitscurve werd opgesteld in het gebied van 100 – 1000 ng/ml (400 – 4000 µg/kg). De concentraties die geïnjecteerd werden, zijn: 100 ng/ml ; 250 ng/ml ; 500 ng/ml ; 1000 ng/ml Resultaat: concentratie 100 ng/ml (400 µg/kg) 250 ng/ml (1000 µg/kg) 500 ng/ml (2000 µg/kg) 1000 ng/ml (4000 µg/kg)

Piekoppervlak 11524 29540 60437 120150

Resultaten: parameter 2 R intercept standaardstoringen

waarde 0,9999 -451,12 (p = 0,32) tussen -0,62 en 1,42

limiet > 0,99 p > 0,05 tussen -2 en 2

resultaat OK OK OK

Besluit: De rechte is lineair en loopt door het nulpunt.

2

Bepaling in blanco granen (selectiviteit/specificiteit)

Een reeks van 20 monsters werd opgenomen en beoordeeld op het voorkomen van storende pieken.

3

De aantoonbaarheidsgrens (LOD)

De aantoonbaarheidsgrens werd bepaald door spiking op tarwe van 80 µg/kg. Reeks (01/06/04) nummer concentratie (µg/kg) 1 113 2 110 3 110 4 114 5 112 6 104 Op basis van deze monsters werd een gemiddelde S/N-verhouding van 3,7 berekend (> 3) gemiddelde gemiddelde recovery

111 138%

Besluit: De LOD kan vastgelegd worden op 80 µg/kg.

LAB 00 P 180 F 002 Template validatierapport – Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 4/14


4


De bepalingsgrens: De bepalingsgrens werd bepaald door spiking van 150 µg/kg op tarwe. Reeks (01/06/04)

nummer concentratie (µg/kg) recovery (%) 1 124 83 2 155 103 3 161 107 4 159 106 5 149 99 6 161 107 Op basis van deze monsters werd een gemiddelde S/N-verhouding van 11,5 berekend (> 6) gemiddelde 152 gemiddelde recovery 101 herhaalbaarheid RSD (%), 9,39 2,8 x STDEV 39,83 outliers (Grubbs’ test) Ghoogste waarde OK Gkritisch: 1,89 Glaagste waarde* NOK *De laagste waarde is een outlier volgens de Grubbs test maar voldoet aan de voorwaarden van Verordening 401/2006 en werd meegenomen in de berekeningen. Op basis van Verordening 401/2006 is een maximale RSDr van 20% toegestaan en een terugvindingspercentage van 60-110%. Besluit: De LOQ kan vastgelegd worden op 150 µg/kg.

5

De herhaalbaarheid, intralaboratoriumreproduceerbaarheid, terugvinding en juistheid:

De herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid werden bepaald conform template LAB 00 P 180 F 004 (201203-15_LAB-00-P-180-F-004-validatie-berekeningen-formules_v01_NL-FR). De herhaalbaarheid, intralaboratoriumreproduceerbaarheid, terugvinding en juistheid werden bepaald -

door spiking op tarwe van 150 µg/kg (zie 4. Bepalingsgrens, herhaalbaarheid en terugvinding) Op basis van Verordening 401/2006 is een maximale RSDr van 20% en een terugvindingspercentage van 60-110% toegestaan voor gehalten 100 - ≤ 500 µg/kg Besluit: De herhaalbaarheid en terugvinding voldoen aan de voorwaarden gesteld in Verordening 401/2006



-


door standaardadditie op tarwe van 400 µg/kg (1/2 norm). De monsters werden gespiket met 100 µl van de standaardoplossing van 100 µg/ml.

Reeks Reeks 1 11/06/13 R. Tits

Reeks 2 12/06/13 R. Vanhoof

Reeks 3 13/06/13 R. Van Meerbeek

nummer 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6

concentratie (µg/kg) recovery (%) 396 99 423 106 433 108 423 106 418 105 335 84 373 93 343 86 355 89 339 85 338 85 367 92 287 72 359 90 336 84 319 80 343 86

gemiddelde gemiddelde recovery herhaalbaarheid RSD (%), 2,8 x STDEV reproduceerbaarheid RSD (%) 2,8 x STDEV outliers (Grubbs’ test) Ghoogste waarde Gkritisch: 2,62 Glaagste waarde

363,94 91,0 5,70 58,10 13,06 133,11 OK OK

Op basis van Verordening 401/2006 is een maximale RSDr van 20%, een maximale RSDR van 40% en een terugvindingspercentage van 70-120% toegestaan voor gehalten > 500 µg/kg. Besluit: De herhaalbaarheid, intralaboratoriumreproduceerbaarheid en terugvinding voldoen aan de voorwaarden gesteld in Verordening 401/2006



-


door standaardadditie op tarwe van 750 µg/kg (norm). De monsters werden gespiket met 187,5 µl van de standaardoplossing van 100 µg/ml.


Reeks 2 12/06/13 R. Vanhoof

Reeks 3 13/06/13 R. Van Meerbeek

nummer 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6

concentratie (µg/kg) 632 677 654 679 676 591 587 581 604 585 606 635 729 673 599 658 658


recovery (%) 84 90 87 91 90 79 78 77 81 78 81 85 97 90 80 88 88

636,71 84,9 4,50 80,14 7,52 134,03 OK OK




-


door spiking op tarwe van 1200 µg/kg (1,5 X norm). De monsters werden gespiket met 300 µl van de standaardoplossing van 100 µg/ml


nummer

1 2 3 4 5 Reeks 2 1 12/06/13 2 R. 3 Vanhoof 4 5 6 Reeks 3 1 13/06/13 2 R. Van 3 Meerbeek 4 5 6

concentratie (µg/kg) 997 1008 1003 1003 996 995 917 942 1020 946 925 997 1020 1021 1013 1021 1012


recovery (%) 83 84 84 84 83 83 76 79 85 79 77 83 85 85 84 85 84 990,35 82,5 2,55 70,62 3,84 106,44 OK OK




-


De juistheid werd bepaald door analyse van CRM’s 1. CRM 378 Maïs 0,43 mg/kg (Nr 153)

De gecertificeerde waarde is 0,43 ± 0,04 mg/kg Nummer (16/01/03) 1 2 3 4 5 6

oppervlakte

concentratie (mg/kg)

1409 1673 1578 1578 1627 1253

0,35 0,41 0,39 0,39 0,40 0,31

gemiddelde STDEV RSD (%) herhaalbaarheid = 2,8 x STDEV

Concentratie na correctie voor recovery (mg/kg) 0,39 0,45 0,43 0,43 0,44 0,34

0,41 0,042 10,1 0,11

Wegens de beperkte hoeveelheid CRM werd 20g afgewogen ipv 25g. Volgens de instructies van het gebruik van de CRM moet minstens 20g afgewogen worden. Om de waarden van de herhaalbaarheidstest te vergelijken met het gehalte DON in de CRM, passen we de volgende methode toe volgens de instructies van de leverancier: Eerst wordt nagegaan of de standaardfout (s/√ni) op het gemiddelde van de test kleiner is dan de standaarddeviatie (SD) in de validatiestudie waarbij SD voortkomt uit de gemiddelde waarden gevonden door de labo’s. Standaardfout (s/√ni) 0,017 SD 0,036 resultaat OK Als aan deze voorwaarde voldaan is, wordt gekeken of het gemiddelde binnen de toegestane grenzen ligt: (gecertificeerde waarde – 2SD) < y < (gecertificeerde waarde + 2SD) Dit interval bevat 95% van de populatie van de gemiddelden van de labo’s die deelnamen aan de certificatietest. (gecertificeerde waarde – 2SD) < y < (gecertificeerde waarde + 2SD) y resultaat

0,35-0,50 0,41 OK

Besluit: De bepaling van de juistheid voldoet aan de criteria.




2. CRM 379 TARWE 0,67 mg/kg (nr 305) De gecertificeerde waarde is 0,67 ± 0,02 mg/kg Nummer (21/01/03) 1 2 3 4 5 6

oppervlakte

concentratie (mg/kg)

2597 2923 2693 2579 2649 2681

0,62 0,70 0,64 0,61 0,63 0,64

gemiddelde STDEV RSD (%) herhaalbaarheid = 2,8 x STDEV

Concentratie na correctie voor recovery (mg/kg) 0,76 0,86 0,79 0,75 0,77 0,79

0,64 0,032 4,9 0,090

Wegens de beperkte hoeveelheid CRM werd 20g afgewogen ipv 25g. Volgens de instructies van het gebruik van de CRM moet minstens 20g afgewogen worden. Om de waarden van de herhaalbaarheidstest te vergelijken met het gehalte DON in de CRM, passen we de volgende methode toe volgens de instructies van de leverancier: Eerst wordt nagegaan of de standaardfout (s/√ni) op het gemiddelde van de test kleiner is dan de standaarddeviatie (SD) in de validatiestudie waarbij SD voortkomt uit de gemiddelde waarden gevonden door de labo’s. Standaardfout (s/√ni) 0,013 SD 0,019 resultaat OK Als aan deze voorwaarde voldaan is, wordt gekeken of het gemiddelde binnen de toegestane grenzen ligt: (gecertificeerde waarde – 2SD) < y < (gecertificeerde waarde + 2SD) Dit interval bevat 95% van de populatie van de gemiddelden van de labo’s die deelnamen aan de certificatietest. (gecertificeerde waarde – 2SD) < y < (gecertificeerde waarde + 2SD) y resultaat

0,64-0,71 0,79 OK, rekening houdend met meetonzekerheid

Besluit: De bepaling van de juistheid voldoet aan de criteria.



6


Meetonzekerheid:

Voor het bepalen van de meetonzekerheid werd de volgende strategie gevolgd: Eerst wordt nagegaan of de bias significant is (in dat geval is de bias > 2sRW). concentratie 400 ppb 750 ppb 1200 ppb

bias 36,06 113,29 209,65

2sRW 95,08 95,74 76,03

bias > 2sRW ? NEE JA JA

Dit is het geval bij een concentratie van 750 en 1200 µg/kg. De uitgebreide meetonzekerheid is daar gelijk aan: U  b  2 * sRW

Dit geeft volgende waarden: b 113,29 209,65

750 µg/kg 1200 µg/kg

2*sRW 95,74 76,03

Bij 400 µg/kg < 2sRW en kiezen we volgende formule:

U (µg/kg) 209,03 285,68

U (rel, %) 27,9% 23,8%

2 uc  ubias  u (Rw) 2 met

2

u bias  RMSbias  u( spiking ) 2  u(Cref, spike)2 (meetonzekerheid op basis van recovery) en u(RW ) = sR

2

Met RMSbias (%) 400 µg/kg

Met u(spiking)

182,81

2

Voor 400 µg/kg werd 100 µl van de standaard van 100 µg/ gepiket met een micropipet van 10-100 µl. Volgende onzekerheidsparameters werden in rekening gebracht: a. onzekerheid op precisie van de pipet om te spiken (driehoeksverdeling) pipet 10-100 µl: accuracy: 0,8% (voor 100µl)-> onzekerheid: 0,33% b. reproduceerbaarheid in pipetteren: 1% (geschat, zie cursus “meetonzekerheid) 2

2

2

u(spiking)400µg/kg = 0,33 +1 = 1,11 Met u(Cref spike)

2

Concentratie (µg/ml) onzekerheid Onzekerheid relatief 2 u(Cref spike)

99,1 2,24 2,26 5,11




Samengevat 2

RMSbias (%) 2 u(spiking) 2 u(Cref spike) som 2

400 µg/kg 182,81 1,11 5,11 189,03

2

uRw = sR (rel) 400 µg/kg

170,56

uc 400 µg/kg

√(189,03+170,56)= 18,96

U = 2uc 400 µg/kg

37,9 %

Samengevat meetonzekerheid: 400 µg/kg 750 µg/kg 1200 µg/kg

37,9% 27,9% 23,8%

Besluit meetonzekerheid: meetonzekerheid gebied LOQ-1/2 norm gebied ½ norm – 3/2 norm gebied > 3/2 norm

40% 30% 25%



7


Robuustheid

De invloed van de temperatuur op het uitdampen van het extract na opzuivering werd nagegaan. De monsters werden op 70°C uitgedampt in plaats van 60°C. Volgende resultaten werden bekomen (datum uitvoering 11/06/13): 60°C 632 677 654 679 676 663,6

1 2 3 4 5 gemiddelde

70°C 652 612 637 598 671 634

Om na te gaan of er een significant verschil is, werd gebruik gemaakt van volgende formule (referentie: Statistiek, validatie en meetonzekerheid voor het laboratorium, Klaessens):

met

Uitwerking van het eerste lid geeft als resultaat: 1,64. Besluit: Er is geen significant effect van de temperatuur bij het uitdampen op 70°C in plaats van 60°C.

REFERENTIEMETHODE: Methode gebaseerd op: NBN EN 15891 : 2010 Voedingsmiddelen - Bepaling van deoxynivalenol in granen, graanproducten en op granen gebaseerde voeding voor peuters en jonge kinderen - HPLC methode met immunoaffiniteitszuivering en UV detectie



8


Foto's a) Extractie met Ultraturrax

c) Chromatografie

b) Opzuivering met immunoaffiniteitskolom

d) Chromatogram


VALIDATIERAPPORT RAPPORT DE VALIDATION

Recommend Documents