ÚSTAV FYZIKÁLNÍ BIOLOGIE JIHOČESKÁ UNIVERZITA V ČESKÝCH BUDĚJOVICÍCH PŘIHLÁŠKA STUDENTSKÉHO PROJEKTU Projekt Název projektu: Fylogeografie západoafrických hor na příkladu endemického motýla jako modelového taxonu Uchazeč Hlavní řešitel Příjmení, jméno, tituly: RNDr. Robert Tropek E-mail:
[email protected] Tel.: 777755785 Studium v doktorském studijním programu zahájeno dne: 9.7.2008 Pracoviště/místo studia Fakulta (VŠ ústav): Přírodovědecká fakulta Katedra (ústav, pracoviště): katedra zoologie Školitel: doc. Mgr. Martin Konvička, PhD. Vedoucí projektu Příjmení, jméno, tituly: doc. Mgr. Martin Konvička, PhD. E-mail:
[email protected] Tel.: 387775312 Pracoviště Fakulta (VŠ ústav): Přírodovědecká fakulta Katedra (ústav, pracoviště): katedra zoologie Celkové náklady na řešení projektu Náklady nebo výdaje na pořízení hmotného a nehmotného majetku: 14003Kč Další provozní náklady nebo výdaje: 35133Kč Doplňkové náklady nebo výdaje: 0Kč Celkem Kč: 49136Kč V Českých Budějovicích dne 24.5.2011 Podpis uchazeče:…………………………......
Zdůvodnění návrhu projektu Stav řešení problematiky projektu (max. 2 stránky): Stanovení vnitrodruhové genetické variability jednotlivých organismů se stalo jedním z nezbytných nástrojů odhalování historie celých oblastí a stanovení jejich ochranářského významu. Získané informace o populační struktuře jsou obvykle konfrontovány se známými údaji o klimatické i geografické historií studované oblasti (např. Carnaval et al., 2009, Gratton et al., 2008), ale i s mírou jejího ovlivnění člověkem (např. Kahindo et al., 2007, Smith et al., 2000). Tyto přístupy jsou velmi důleţité zejména u oblastí se silným vlivem člověka, kde dosud nebyly jednoznačně stanoveny ochranářské priority kvůli nedostatečným znalostem oblasti – paradoxně jde často o tzv. „hot-spoty diverzity“, které jsou z hlediska ochrany světové přírody klíčovými (Myers et al., 2000, Moritz, 2002). Pohoří Guinejského zálivu (bez ustáleného českého názvu, v angličtině obvykle označováno jako Cameroon Volcanic Line nebo the Gulf of Guinea Highlands) je tvořené vnitrozemským vulkanickým pásem na hranicích Kamerunu a Nigériea dále pak pokračuje v Guinejském zálivu ostrovy Bioko, Sv. Tomáš a Princovým ostrovem. Toto pohoří představuje jedinou rozsáhlejší horskou oblast ve střední a západní Africe. Unikátnost bioty těchto hor s velkým významem pro globální biodiverzitu je způsobena zejména vysokou mírou izolace od ostatních horských oblastí. Ta je způsobena ca 1500 km širokým pásem níţinného lesa dělícím je od nejbliţších východoafrických hor a ca 1500 km širokým pásem níţinné savany mezi nimi a Guinejskou vysočinou na západě (Graham et al., 2004; Fattorini, 2007). Ochranářská hodnota hor Guinejského zálivu je proto obrovská, oblast je součástí jednoho z „hospotů diverzity“ nazvaného Guinejské lesy západní Afriky (Myers et al., 2000, ww.biodiversityhotspots.org). Význam ochrany celého pohoří je o to urgentnější, ţe patří k nejhustěji zalidněným oblastem tropické Afriky s velmi silným vlivem člověka (Stuart, 1984, Tropek & Konvička, 2010). Fylogeografie tropických oblastí se ve většině studií soustředí na rozsáhlé oblasti níţinných lesů (např. Craft et al., 2010, Huhndorf et al., 2007), zatímco studií tropických horských systémů je zatím poskrovnu (např. Bowie et al., 2008, Flanagan et al., 2004). To je ještě patrnější při pohledu do západní Afriky: zatímco biogeografie níţinných oblastí je jiţ relativně lépe prozkoumaná (např. Agnese et al., 2006; Eaton et al., 2009; Marks, 2010; Nicolas et al., 2008), fylogeografické studie západoarických hor jsou stále ještě spíše výjimkou (Smith et al., 2000, Zimkus, 2009). Tropická horská fauna je však neméně zajímavá a důleţitá k pochopení historie globální biodiverzity. Nedávná historie fauny i flóry hor Guinejského zálivu, byla vedle vysoké izolovanosti pohoří i jeho jednotlivých součástí silně ovlivněna klimatickými cykly čtvrtohor. Ze studované oblasti existuje řada paleoenvironmentálních dat, které ukazují zejména na existenci delších suchých období spojených s ústupem horského lesa a rozvojem otevřených biotopů (Stager & Anfang-Sutter, 1999; Zogning et al., 1997, Maley 2001). Tyto události byly pro šíření a evoluční vývoj populací horských druhů nepochybně klíčové, díky velmi omezené znalosti genetické diverzity celé oblasti však ještě nebyl jejich vliv stanoven v dostatečné míře (srov. Smith et al., 2000; Zimkus, 2009). Konkrétních fylogeografických studií západoafrických hor je zatím velmi málo, z toho plyne i omezená interpretovatelnost zjištěných výsledků. Jediná fylogeografická analýza endemických ptáků (Smith et al., 2000) odhalila tři izolované genetické linie: ostrov Bioko, Mt. Cameroon a Bamenda/Bamboutos Mts. Nedostatečný počet studovaných lokalit ve zmíněné práci však neumoţňuje hlubší analýzu moţných příčin izolace, diverzitu uvnitř
jednotlivých linií a významně omezená je také rekonstrukce vztahů mezi těmito liniemi. Trochu odlišné výsledky přinesla fylogeografická studie (Zimkus, 2009) ţab Phrynobatrachus, která odhalila izolovanost populací v okolí Mt. Oku (Bamenda Mts.) od populací v ostatních částech hor (Mt. Manengouda, Bamboutos Mts., Obudu Plateau). Menší areál rozšíření studovaných ţab v rámci celého pohoří však opět omezuje moţnosti rekonstrukce historie diverzity celého hor. Fylogeografické analýzy scinků (Jesus et al., 2007) a ţab Ptychadena newtoni (Measey et al., 2007) sice ukázaly relativní izolaci populací obývajících vulkanické ostrovy patřící k celému horskému pásu, v obou těchto případech však nešlo o horské specialisty, ale o druhy niţších nadmořských výšek. Navrhovaná studie populační struktury motýlů tak bude první vnitrodruhovou analýzou populační struktury bezobratlých v celé oblasti. Vzhledem k počtu studovaných lokalit pokrývajících téměř celé pohoří a srovnání s jiţ studovanými obratlovci umoţní odhalit obecnější vztahy mezi biotami jednotlivých oblastí a rekonstrukcí příčin těchto jevů. Motýli patří k obecně nejprozkoumanějším skupinám organismů vůbec. I proto slouţí jako oblíbený modelový organismus při fylogeografických a ochranářsky genetických studiích v různých oblastech. Jejich detailnější studium umoţňují i dobře propracované, terénní a molekulární metody (Sparrow et al. 1994; Wahlberg & Wheat 2008). Přesto, ţe motýli patří k taxonomicky a faunisticky nejprozkoumanějším skupinám bezobratlých ţivočichů západní Afriky (Larsen 2005), konkrétní údaje o jejich bionomii jsou zatím ojedinělé (např. Tropek & Konvička 2010; Amiet & Libert, 1995) a údaje o genetické struktuře populací dokonce zatím chybí úplně. Přesto je význam studovaných hor pro motýly nesporný, vyskytuje se tu 36 endemických taxonů a dalších 14 horských specialistů (orobiontů) s širším areálem rozšířením (tj. s výskytem ve východoafrických horách a/nebo v Guinejské vysočině; Larsen 2005). Většina těchto specializovaných druhů se vyskytuje v nadmořských výškách nad 1400 m n.m., ţádný z nich pak nebyl zjištěn ve výšce pod 1200 m n.m. Literatura: Agnèse, J.-F., Zentz, F., Legros, O., Sellos, D. (2006) Molecular Phylogenetics and Evolution 40: 332–346. Bowie, R.C.K., Fjeldsa, J., Hackett, S.J. et al. (2006) Mol. Phylogenet. Evol. 38: 171-188. Carnaval, A.C., Hickerson, M.J., Haddad, C.F.B. et al. (2009) Science, 323: 785-789. Craft K. J., Pauls S. U., Darrow K. et al. (2010) PNAS 107: 5041–5046. Eaton, M.J., Martin, A., Thorbjarnarson, J., Amato, G. (2009) Molecular Phylogenetics and Evolution 50: 496–506. Fattorini, S. (2007) African Entomology 15, 340-355. Flanagan N.S., Tobler A., Davison A. et al. (2004) PNAS 101: 9704-9709. Graham, C.H., Smith, T.B. & Languy, M. (2004) Journal of Biogeography 32, 1371-1384. Gratton, P., Konopinski, M.K. & Sbordoni, V. (2008) Molecular Ecology 17: 4248-4262. Huhndorf, M.H., Peterhans, J.C.K. & Loew, S.S. (2007) Molecular Ecology 16, 663-674. Kahindo, C., Bowie, R.C.K. & Bates, J.M. (2007) Biological Conservation 134: 262-270. Marks, B.D. (2010) Molecular Phylogenetics and Evolution 55: 178–184. Moritz, C. (2002) Systematic Biology 51: 238-254. Myers, N., Mittermeier, R.A., Mittermeier, C.G. et al. (2000) Nature 403: 853–858. Nicolas, V., Mboumba, J.-F., Verheyen, E. et al. (2008) J. Biogeogr. 35: 2074–2089. Smith, T.B., Holdeer, K., Girman, D. et al. (2000) Mol. Ecol. 9: 1505-1516 Sparrow, H.R., Sisk, T.D., Ehrlich, P.D. & Murphy, D.D. (1994) Conservation Biology 8: 800-809. Stager, J.C. & Anfang-Sutter, R. (1999) Journal of Paleolimnology 22, 319-330. Stuart, S.N. (Ed.) (1986) Conservation of Cameroon montane forests. International Council for Bird Preservation, Cambridge. Wahlberg N., Wheat C.W. (2008) Systematic Biology 57: 231-242. Zimkus, B.M. (2009) Zoological Journal of the Linnean Society 157: 795–813. Zogning, A., Giresse, P., Maley, J. & Gadel, F. (1997) J Afr Earth Sci 24, 285-300.
Stanovení badatelských cílů, metody a způsob řešení (max. 2 stránky): Cíle projektu Cílem práce je na základě molekulárních dat zrekonstruovat strukturu a historii populací okáče Bicyclus anisops endemického pro západoafrické hory. Získané poznatky budou interpretovány pouţitím dvou přístupů: biogeografického a ochranářsky biologického. Biogeografický přístup bude uplatněn zejména při rekonstrukci šíření a evoluce studovaného motýla v jednotlivých horských oblastech. Molekulární metody umoţní odhalit míru genového toku mezi jednotlivými populacemi, či jejich vzájemnou izolaci a nalezený pattern bude následně konfrontován se známými daty o vývoji pohoří (kromě jejich geologické historie zejména posun habitatů během klimatických cyklů čtvrtohor; Maley 2001) a s geografickými faktory ovlivňujícími šíření (zejména rozloha a nadmořská výška níţin mezi oblastmi výskytu). Z výsledků bude dále moţné stanovit význam těchto faktorů pro šíření a existenci populací jednotlivých horských motýlů. Ochranářsky biologický přístup spočívá v konfrontaci unikátnosti izolovaných populací a jejich významu pro genetickou diverzitu druhu s potenciální ohroţeností habitatů studovaného motýla (Tropek & Konvička 2010) v jednotlivých oblastech. Studium a poznání potenciálního ovlivnění historie jednotlivých populací vývojem prostředí v minulosti, (zejména čtvrtohorní klimatické výkyvy) umoţní následně lepší interpretaci výsledků s ohledem na současné antropogenní změny krajiny (odlesnění, intenzivní zemědělství). Studovaný motýl Studován bude okáč Bicyclus anisops. Jde o druh striktně vázaný na horské biotopy ve vyšších nadmořských výškách od 1400 m n.m. s nejbliţšími příbuznými ve východní Africe (Larsen 2005; Monteiro & Pierce 2001). Jde o hojného motýla vázaného na křovinatou submontánní krajinu a řidší horské lesy (Tropek & Konvička 2010). Studované lokality a sběr materiálu Pro sběr materiálu byly vybrány lokality napříč Kamerunem, coţ odpovídá pohoří Guinejského zálivu. Volba oblastí proběhla na základě předchozích zkušeností řešitele z dané oblasti (viz ţivotopis řešitele). Jednotlivé lokality byly vybírány tak, aby rovnoměrně pokrývaly celé pohoří a aby dostatečně zahrnovaly různě izolované lokality (jednotlivé vrcholy – Mt. Cameroon; soustavy menších hor vzájemně izolovaných níţinami – Mt. Kupe, Mt. Manengouba a Bakossi Mts.; a relativně kompaktnější horské hřebeny – Bamenda Mts., Bamboutos Mts.). Při výběru cílových lokalit byla zohledněna i míra jejich narušení činností člověka (od silně poznamenaných lokalit – např. okolí Mt. Lefo, Mt. Manengouba; přes částečně narušená území – okolí Big Babanki, Bakossi Mts., aţ po relativně zachovalá území – Mt. Kupe, Mt. Oku). Cílové lokality byly jiţ řešitelem navštíveny a materiál byl nasbírán. Pokrytí studovaného pohoří tak bude víceméně odpovídat známým areálům výskytu studovaných motýlů, s vyjímkou oblastí Obudu a Mambila Plateau leţících v Nigérii. Veškerý materiál pro tuto studii byl sebrán ještě před započetím projektu a terénní sběr nebude financován z rozpočtu tohoto projektu. Další potenciální cílové lokality se nacházejí na ostrově Bioko. Tento ostrov je však lepidopterologicky velmi špatně prozkoumán a o výskytu cílového druhu a dalších horských motýlů není prakticky nic známo. Kvůli horší dostupnosti a značné nejistotě získání dat proto nebude zatím do projektu zahrnut. Řešitel v současné době rovněţ řeší moţnost získání doplňujícího materiálu z okrajové části hor leţící ve špatně dostupné Nigérii (Obudu Plateau, Mambila Plateau; spolupráce s Dr. Saastamoinenem, Holandsko). Vzhledem k dobrému pokrytí většiny horského pásma však není získání materiálu k rekonstrukci hlavních patternů bezpodmínečně nutné. Z kaţdé lokality bude zahrnuto 5-10 jedinců studovaného druhu. Vzorky tkání jsou odděleně skladovány v mikrozkumavkách v čistém ethanolu. Jedinci jsou odchytáváni tak, aby byl poměr pohlaví co nejvyrovnanější.
Laboratorní analýzy K rekontrukci historie a struktury populací cílových taxonů budou vyuţity sekvence třech genů: dva mitochondriální geny s různou variabilitou (COI a pravděpodobně ITS2) a jeden jaderný gen (pravděpodobně EF1alpha). Pouţitelnost vybraných genů a jejich variabilita byla opakovaně ověřena u různých motýlích taxonů (např. Vila & Bjorklund 2004; Norgate et al. 2009). Ze vzorků tkání bude DNA bude izolována komerčním izolačním kitem (Qiagen) podle protokolu výrobce. Geny budou amplifikovány během PCR reakce za pouţití PPP Master mixu a primerů navrţených dle informací z předchozích studií (Wahlberg & Wheat 2008). Purifikace DNA a následná sekvenační reakce budou provedeny komerční firmou Macrogen, Inc. (Soul, Jiţní Korea). Řešitel zvládá všechny uvedené postupy. Provedl jiţ izolaci DNA z části nasbíraných vzorků, optimalizoval PCR pro amplifikaci genu COI a ověřil jeho variabilitu vzhledem k cílům studie. Optimalizace amplifikace zbylých genů bude provedena hned v počátcích projektu, aby bylo moţno včas potvrdit jejich vhodnost. Výsledky budou analyzovány standarními fylogeografickými a fylogenetickými metodami, zjm. rekontrukce fylogenetických stromů pomocí Bayesovské analýzy (v programu MrBayes) a přístupů Maximum Likelihood a Maximum Parsimony (v programech PAUP a PhyML). Alternativně budou rekonstruovány haplotypové sítě (programy TCS, Network). Následně budou provedeny biogeografické analýzy rekonstruující scénář vývoje taxonu v minulosti, konkrétně hledání areálu výskytu předků a jevy jako disperse, vikariance či extinkce (programy DiVA, DEC, R8S, Multidivtime aj.). Pro dotvoření celkového obrazu kolonizace studovaných hor a historie jejich společenstev budou výsledky zasazeny do kontextu současných poznatků, a to jak fylogeografických tak i paleoenvironmentálních a ochranářsky biologických. Literatura Larsen, T.B. (2005) Butterflies of West Africa. Apollo Books, Stenstrup. Maley, J. (2001) In: African rain forest ecology and conservation. An interdisciplinary perspective (Eds. W. Weber, L. White, A. Vedder & L. Naughton-Treves). New Haven, Conn., Yale University Press. Monteiro, A.F. & Pierce, N.E. (2001) Molecular Phylogenetics and Evololution 18, 264-281. Norgate M., Chamings J., Pavlova A., Bull J.K., Murray N.D., Sunnucks P. (2009) PLoS ONE 4, e7950. Vila M., Bjorklund M. (2004) Journal of Molecular Evolution 58, 280-290. Wahlberg N., Wheat C.W. (2008) Systematic Biology 57: 231-242.
Harmonogram prací: Materiál bude v době započetí projektu jiţ k dipozici, část materiálu byla v Kamerunu nasbírána řešitelem v lednu 2010, zbytek bude získán řešitelem při další cestě v říjnu aţ prosinci 2010. Sběr materiálu tedy není do předkládaného projektu vůbec zahrnut. Řešitel rovněţ jiţ izoloval DNA z menší části získaného materiálu a optimalizoval metodiku získání sekvencí COI. červen – červenec 2011: optimalizace získání sekvencí genů ITS2 a EF1alpha (testování primerů a protokolů pro PCR) srpen – září 2011: izolace DNA, amplifikace genů pomocí PCR, sekvenace říjen – prosinec 2011: analýza a interpretace výsledků, příprava publikace Předpokládaný typ vědeckých výsledků projektu Primárním cílem je zveřejnění výsledků v odborném vědeckém časopise s IF s biogeografickou (např. Molecular Phylogeny and Evolution) a/nebo ochranářskou tématikou (např. Conservation genetics). Výsledky budou dále prezentovány v popularizačních časopisech určených pro českou odbornou veřejnost (např. Ţiva) a na konferencích.
Hlavní řešitel (maximálně 30 řádek) Robert Tropek je absolventem magisterského a rigorózního studia PřF JU (obě 2008), zaměstnanec Entomologického ústavu AV ČR. Věnuje se také ekologii antropogenních stanovišť, polinační biologii v afromontánních společenstvech (Kamerun – 2007/2008, 2009/2010, 2010/2011 celkem 8 měsíců) a ekologii pavouků a denních motýlů. (Spolu)autor 6 IF článků (plus 4 IF článků „in press“), 7 článků v recenzovaných časopisech bez IF, 3 kapitol v české monografii a 4 populárně-naučných článků s biologickou tématikou. Řešitel 2 projektů SGA (PřF JU) a 1 projektu GAJU. Autor pilotní studie o ekologii cílových endemických motýlů západní Afriky. Vybrané publikace: Tropek R., Konvicka M. (in press) Should restoration damage rare habitats? Biological Conservation. Tropek R., Kadlec T., Karešová P., Spitzer L., Kočárek P., Malenovský P., Baňař P., Tuf I.H., Hejda M., Konvička M. (2010) Spontaneous succession in limestone quarries as an effective restoration tool for endangered arthropods and plants. Journal of Applied Ecology 47, 139-147. Janeček Š., Patáčová E., Bartoš M., Padyšáková E., Spitzer L., Tropek R. (2011) Hovering sunbirds in the Old World: occasional behaviour or evolutionary trend? Oikos 120, 178183. Tropek R., Konvička M. (2010) Forest Eternal? Endemic butterflies of the Bamenda Highlands, Cameroon, avoid close-canopy forest. African Journal of Ecology 48, 428437. Tropek R., Konvicka M. (2008) Can quarries supplement rare xeric habitats in a piedmont region? Spiders of the Blansky les Mts., Czech Republic. Land Degradation and Development 19, 104-114. Tropek R., Spitzer L., Konvicka M. (2008) Two groups of epigeic arthropods differ in colonising of piedmont quarries: the necessity of multi-taxa and life-history traits approaches in the monitoring studies. Community Ecology 9, 177-184. Spitzer L., Konvička M., Beneš J., Tropek R., Tuf I.H., Tufová J. (2008) Does closure of traditionally managed open woodlands threaten epigeic invertebrates? Effects of coppicing and high deer densities. Biological Conservation 141, 827-837. Vedoucí projektu (maximálně 30 řádek) Doc. Konvička se zabývá biologií ochrany přírody, zejména z hlediska bezobratlých ţivočichů, a ekologií a ochranou denních motýlů a dalších bezobratlých. Je (spolu)autorem 55 IF publikací (plus 6 IF publikací „in press“), 12 článků v zahraničních časopisech bez IF, 1 zahraniční a 3 českých knih, 3 kapitol v zahraničních monografiích a několika desítek odborných i popularizačních článků v českých periodikách. Výběr z recentních publikací: Neve G., Pavlíčko A., Konvička M. (2009) Loss of genetic diversity through spontaneous colonization in the bog fritillary butterfly, Proclossiana eunomia (Lepidoptera: Nymphalidae) in the Czech Republic. European Journal of Entomology 106: 11-19. Konvička M., Fric Z., Beneš J. (2006) Butterfly extinctions in European states: do socioeconomic conditions matter more than physical geography? Global Ecology and Biogeography 15: 82-92. Foltan P., Sheppard S., Konvička M., Symondson W.O.C. (2005) The significance of facultative scavenging in generalist predator nutrition: detecting decayed prey in the guts of predators using PCR. Molecular Ecology 14: 4147-4158.
Schmitt T., Číţek O., Konvička M. (2005) Genetics of a butterfly relocation: large, small and introduced populations of the mountain endemic Erebia epiphron silesiana. Biological Conservation 123: 11-18. Pech P., Fric Z., Konvička M., Zrzavý J. (2004) Phylogeny of Maculinea blues (Lepidoptera: Lycaenidae) based on morphological and ecological characters: evolution of parasitic myrmecophily. Cladistics 20: 362-375. Konvička M., Maradová M., Beneš J., Fric Z., Kepka P. (2003) Uphill shifts in distribution of butterflies in the Czech Republic: effects of changing climate detected on a regional scale. Global Ecology and Biogeography 12: 403-410. Výběr z grantové činnosti GAAV – 1x hlavní řešitel (2003-2005) GAČR – 3 x hlavní řešitel (2004-2006, 2010-2012, 2010-2013), 1x spoluřešitel (2006-2008) MŢP ČR – 1x hlavní řešitel (2008-2011), 1x spoluřešitel (2008-2010)
Požadované finanční prostředky Výdaje a náklady na pořízení hmotného a nehmotného majetku (max. 50000Kč) Drobný hmotný a nehmotný majetek
14 003 Kč
Spotřební materiál
35 133 Kč
Náklady na publikace (max. 2000Kč) Požadované finanční prostředky celkem:
2 000 Kč 51 136 Kč
Slovní zdůvodnění a rozpis finančních prostředků Projekt zahrnuje laboratorní zpracování většího mnoţství jiţ nasbíraného materiálu. Při navrhování rozpočtu bylo počítáno se získáním sekvencí 3 genů u cca 100 vzorků motýlů. Rozpočet počítá i s prostředky pro optimalizaci získání sekvencí genů ITS2 a EF1alpha, optimalizace získání sekvencí genu COI jiţ byla řešitelem provedena. Pravidla projektu neumoţňují financovat sekvenaci a purifikaci vzorků, ta bude hrazena z jiných projektů. Rovněţ část spotřebního a laboratorního materiálu byla jiţ zakoupena z jiných zdrojů. Drobný hmotný a nehmotný majetek Multikanálová pipeta (Finnpipette) ......
14 003 Kč
Spotřební materiál Izolační kit (Qiagen) PCR Mastermix (Top-Bio) Laboratorní špičky
21 800 Kč 12 200 Kč 1 133 Kč
...... ...... ......
Knihy (ceny jsou odhadnuté dle zahraničních ceníků) Conservation Biogeography ...... 1 000 Kč Environmental Biogeography ...... 1 000 Kč
