ÚSTAV FYZIKÁLNÍ BIOLOGIE JIHOČESKÁ UNIVERZITA V ČESKÝCH BUDĚJOVICÍCH PŘIHLÁŠKA STUDENTSKÉHO PROJEKTU Projekt Název projektu: Kontrola produkce adipokinetických hormonů nadřazenými systémy Uchazeč Hlavní řešitel Příjmení, jméno, tituly: Zemanová Milada, Mgr. E-mail:
[email protected] Tel.: +420-387775272, +420-724736124 Studium v doktorském studijním programu zahájeno dne: 1. 3. 2010 Pracoviště/místo studia Fakulta (VŠ ústav): Přírodovědecká Katedra (ústav, pracoviště): Fyziologie ţivočichů, Entomologický ústav, Biologické centrum AVČR, v.v.i. Školitel: Prof. RNDr. Dalibor Kodrík CSc. Vedoucí projektu Příjmení, jméno, tituly: Prof. RNDr. Dalibor Kodrík CSc. E-mail:
[email protected] Tel.: +420-387775271 Pracoviště Fakulta (VŠ ústav): Přírodovědecká Katedra (ústav, pracoviště): Fyziologie ţivočichů, Entomologický ústav, Biologické centrum AVČR, v.v.i. Celkové náklady na řešení projektu Náklady nebo výdaje na pořízení hmotného a nehmotného majetku: 49910,39 Kč Další provozní náklady nebo výdaje: 0 Kč Doplňkové náklady nebo výdaje: 0 Kč Celkem Kč: 49910,39 Kč V Českých Budějovicích dne 3. 6. 2011 Podpis uchazeče:…………………………......
Zdůvodnění návrhu projektu Stav řešení problematiky projektu Endokrinní soustava hmyzu je tvořena dvěma hlavními systémy: (1) neurosekretorickým komplexem spojeným s centrální nervovou soustavou (CNS) - neurosekretorické buňky mozku, corpora cardiaca (CC) a corpora allata (CA) a (2) prothorakálními ţlázami. Tato centra jsou doplněna několika dalšími skupinami endokrinních buněk ostatních tkáních. Neurosekretorické buňky mozku hmyzu produkují neurohormony peptidického charakteru (Gäde a Marco 2006). Tyto neurohormony mají v hmyzím organismu širokou škálu funkcí - ovládají další ţlázy (adenotropní účinek), řídí metabolismus a homeostázu, metamorfózu, vývoj a růst, pohlavní funkce, modifikují svalovou kontrakci nebo řídí barvoměnu. Velmi důleţitou skupinou hmyzích neurohormonů jsou adipokinetické hormony (AKH) produkované v CC. AKH se někdy řadí do skupiny neurohormonů řídících hmyzí homeostázu a metabolismus a označují se jako RPCH/AKH hormonální rodina (red pigment concentrating hormone/adipokinetic hormone family). Jsou to typické stresové hormony s pleiotropním účinekem - stimulují katabolické a inhibují syntetické reakce. Energeticky zajišťují především lokomoci: primárním signálem pro uvolnění AKH do hemolymfy je let či pohyb obecně. Konkrétně AKH zajišťují mobilizaci lipidů a stimulaci vylučování trehalózy z tukového tělesa do hemolymfy aktivací lipázy a glykogen fosforylázy, dále pak stimulaci srdeční činnosti, zvýšení svalového napětí, stimulaci pohybové aktivity a imunitní a antioxidační odpovědi. Na druhé straně AKH inhibují syntézu lipidů, bílkovin i RNA (Gäde a Marco 2006, Kodrík 2008). Ţlázy CA produkují juvenilní hormony (JH). Jsou to látky terpenoidní povahy, které řídí larvální vývoj a metamorfózu a u dospělců se významně podílí na řízení rozmnoţování: ovlivňují vývoj ovárií u samic a produkci vajíček tím, ţe regulují tvorbu vitellogeninů v tukovém tělese, jejich transport a vstup do vyvíjejících se oocytů. Jako pleiotropní hormony se podílí také na kontrole embryogeneze, diapauzy, barvoměny nebo polymorfismu. Syntéza JH je hormonálně kontrolována neuropeptidy z neurosekrečních buněk mozku - allatostatiny a allatotropinem (Gäde a Marco 2006). V prothorálních ţlázách jsou produkovány ekdysteroidy, které řídí řadu biologických funkcí, které mají vztah k hmyzímu svlékání a reprodukci. Ekdysteroidy patří spolu s juvenilními hormony k hlavním metamorfózním hormonům (Gäde a Marco 2006). Pro výzkum AKH, jejich funkcí a jejich vztahů k ostatním hmyzím hormonům se výborně hodí ruměnice pospolná (Pyrrhocoris apterus) (Socha 1993, Kodrík a kol. 2000). Je to nelétavá ploštice (Heteroptera: Pyrrhocoridae), která se vyskytuje ve dvou morfách makropterní, která je disperzní s dlouhými křídly a brachypterní s krátkými křídly. Obě morfy se liší svými biochemickými, fyziologickými a endokrinními charakteristikami (Kodrík a Socha 1999, Socha a Kodrík 1999, Maxová a kol. 2001). U této ploštice byly popsány 2 zástupci AKH rodiny, oktapeptidy Pyrap-AKH (Kodrík a kol. 2000) a Peram-CAH-II (Kodrík a kol. 2002). Výhodou ruměnice je také snadný chov a rychlá reprodukcí (Socha 1993). Výzkum funkcí AKH P. apterus naznačil, ţe produkce tohoto hormonu je sníţena působením juvenilního hormonu JH (Socha a kol. 2005, Kodrík 2008). Vyplývá to z faktu, ţe samice makropterní morfy, které mají na začátku svého imaginálního vývoje zablokovanou reprodukci, coţ je pravděpodobně spojeno s nízkou hladinou nebo absencí JH, vykazují vyšší hladinu AKH neţ samice brachypterní reprodukční morfy (Socha a kol. 2005). Tato skutečnost jiţ byla podpořena experimentálně aplikací analogu JH - methoprenu, který v podmínkách in vivo i in vitro sniţoval výdej adipokinetických hormonů (Kodrík a kol.
2010a). Vyvstává otázka, jestli je tento účinek nespecifický nebo je kontrolován přes produkci JH pomocí hormonu allatostatinu (příp. allatotropinu). JH ani allatostatin u ploštice Pyrrhocoris apterus nebyl dosud identifikován. Zdá se však, ţe pro studium výše zmíněného problému není tento stav rozhodující. Pyrrhocoris apterus dobře reaguje na řadu analogů JH (zmíněný methopren) a předběţné pokusy s ovlivněním produkce vitellogeninů, která je kontrolována přes JH, ukázaly, ţe reaguje i na allatistatin AST-1 (Ala-Pro-Ser-Gly-Ala-Gln-Arg-Leu-Tyr-Gly-Phe-Gly-Leu-NH2) z Locusta migratoria (nepublikovaná data), který je jako několik dalších allatostatinů komerčně dostupný (např. Sigma). Pokusy, které by měly přispět k objasnění tohoto problému se budou provádět in vivo i in vitro. Stanovení badatelských cílů, metody a způsob řešení Cílem práce je objasnit kontrolu uvolňování nebo syntézy adipokinetických hormonů z corpora cardiaca prostřednictvím JH, jejichţ výdej je dále kontrolován neurohormony allatostatinem a allatotropinem. Pokusy by měly ukázat, zda je tato kontrola primárně řízena na úrovni JH nebo zda se na ní podílí uţ výdej zmíněných neurohormonů především allatostatinu. a. Vytipování nejúčinnějšího z dostupných allatostatinů. Jednorázově i opakovaně aplikovat komerčně dostupné allatostatiny na reprodukční samice na začátku jejich vitelogenního stádia (Socha 1993). Aplikaci provádět injikčně přes metathorakálně abdominální intersegmentální membránu pod integument Hamiltonovou injekční stříkačkou vţdy v objemu 2 μl Ringerova fyziologického roztoku (0.13 M NaCl, 1.3 mM KCl, 6.8 mM CaCl2 · 2H2O, 2mM MgCl2 · 6H2O, 2 mM NaHCO3) s rozpuštěným hormonem o dávce 2 pmol, 5 pmol, 10 pmol, 15 pmol, 20 pmol. Kontrolám injikovat pouze Ringerův roztok. První a druhý den po ošetření odebrat hemolymfu a sledovat mnoţství vitelogeninu v hemolymfě: pomocí polyakrylamidové elektroforézy (Laemmli 1970) a nebo imunoreakcí na nitrocelulózové membráně (Western blotting, Towbin a kol. 1979) s králičí protilátkou proti vitelogeninu (Socha a kol. 1991). Kvantifikaci provádět na zařízení GS-800 Calibrated Densitometer (Bio-Rad, Taiwan). Allatostanin a jeho vhodné dávky, které budou nejúčinnější v inhibici syntézy vitellogeninů vybrat pro další pokusy. b. Sledování zněm v obsahu ţivin v ováriích po aplikaci allatostatinu. V předchozích pokusech vytipovaný allatostatin vyuţít k následujícím charakteristikám: - stanovení celkového obsahu proteinů ve vypitvaných ovariích ploštic po ošetření allatostatiny: obsah bílkovin bude stanovován pomocí reakce s bicinchoninovou kyselinou (BSA) (Stoscheck 1990). Vzorek tkáně se homogenizuje pomocí sonikátoru, následně centrifuguje a obsah proteinů se stanovuje rekcí s BSA v odebraném supernatantu. Princip metody: proteiny redukují alkalický Cu(II) na Cu(I) úměrně své koncentraci. Bicinchoninová kyselina je specifické chromogenní reagens s Cu(I) tvořící nachový komplex s absorbančním maximem 562nm. Optická absorbance je přímo uměrná koncentraci proteinů, naměřené hodnoty se přepočítávají podle hodnot standartu BSA (bovine serum albumin). - stanovení celkového obsahu lipidů ve vypitvaných ovariích: obsah lipidů bude stanoven pomocí fosfovanilínového testu (Zöllner a Kirsch 1962, modifikace pro P. apterus – Kodrík a kol. 2000). Princip metody: lipidické sloučeniny v prostředí silných kyselin odštěpují mastné kyseliny, jejichţ dvojné vazby pak reagují s vanilinem za vzniku barevných sloučenin. Vzorek se smíchá s 96 % H2SO4, je vařen ve vodní lázni, po zchlazení se přidá vanilínové činidlo (vanilin, kys. fosrorečná, destilovaná voda) a naměřené hodnoty optické denzity (546 nm) se přepočítají podle hodnot standartu kyseliny olejové.
- stanovení celkového obsahu glykogenu (glycidů) ve vypitvaných ovariích: obsah glykogenu bude stanoven podle Ohtsu a kol. (1992), coţ zahrnuje modifikace metody Dubios a kol. (1956) - princip metody: zahříváním glukózy v prostředí silných kyselin vzniká hydroxymetylfuran, který vytváří s fenolem ţlutohnědý produkt, který je pak vhodný pro fotometrické stanovení. Ze vzorku se přidáním kyseliny trichloroctové vysráţí bílkoviny. Glycidové sloţky ze supernatantu pak reagují s fenolem v přítomnosti koncentrované kyseliny sírové. Optická denzita barevného produktu se následně měří při 490 nm. c. Sledování anatomických změn ovárií po aplikaci allatostatinu Po aplikaci allatostatinů ve výše popsaných experimentech sledovat také vnější anatomické změny na ováriích včetně jejich hmotnosti a usuzovat na délku pre-ovipoziční periody d. Sledování fyziologických a anatomických změn na ováriích pomocí analogu JH methoprenu Výše uvedené pokusy zopakovat s aplikací analogu JH methoprenu (Kodrík a kol. 2010a, sledovat změny v obsahu ţivin a anatomické změny na ováríích a srovnat je v výsledky po aplikaci allatostatinů. Methopren (Výzkumný ústav organických syntéz a.s., Rybitví, Česká republika) je po rozpuštění v acetonu (1 μl/1 μl) (kontrola pouze aceton) topikálně aplikován na integument pod křídla. Efekt stanovit po 6, 24, 48 a 72 hodinách. e. Sledování interakcí allatostatinů s AKH - aplikací nejúčinnějšího allatostatinu (nebo i methoprenu) na modelu reprodukčních ploštic ověřit vliv na produkci AKH v corpora cardiaca a hemolymfě pomocí ELISA za pouţití protilátky proti Pyrap-AKH - králíčí protilátka (IgG) proti Cys1-Pya-AKH (Sigma Genosys Biotechnologie Ltd., Cambridge, UK) (Kodrík a kol. 2000, Goldsworthy a kol. 2002 ). Výsledky potvrdit pomocí in vitro pokusů (Kodrík a kol. 2010a): po 6-72 hodinách od aplikace allatostatinu nebo methoprenu, vypitvat CNS ploštic a inkubovat je 6 hodin v 200 μl Graceho media: obsah AKH stanovit pomocí ELISA v inkubované tkáni a sledovat i produkci AKH do media. - Sledovat následující AKH charakteristiky u ploštic ošetřených aplikaci allatostatinů (nebo methoprenu): 1. mobilizace lipidů - obsah lipidů v hemolymfě stanovovat pomocí fosfovanilinového testu (Zöllner a Kirsch 1962). Srovnat hladiny lipidů před aplikací a po aplikaci 10 pmol Pyrap-AKH a sledovat rozdíly mezi plošticemi ošetřenými allatostatinem a kontrolami 2. intenzita lokomoce - pomocí lokomoční jednotky (Socha a kol. 1999) sledovat vliv na pohybovou aktivitu pokusných plotic. Sledovat lokomoční aktivitu, která se několikanásobně zvyšuje po aplikaci 80 pmol Pyrap-AKH (Kodrík a kol. 2000) u allatostatinem ošetřených ploštic a kontrol 3. intenzita metabolismu - měření produkce CO2 – pomocí zařízení LI-7000 (LI-COR Biosciences) sledovat vliv studovaných hormonů na intenzitu metabolismu. Aplikace PyrapAKH na ploštice zvyšuje signifikantně celkovou hladinu metabolismu v jejich těle, coţ se projeví zvýšeným výdejem oxidu uhličitého (Kodrík a kol. 2010b). Sledovat jak je produkce CO2 po aplikaci AKH ovlivněna předchozím ošetřením allatostatiny 4. schopnost reagovat na oxidační stress – nedávno bylo zjištěno, ţe AKH se významně zapojují do obrany organismu před oxidačním stresem aktivací anti-stresových mechanismů (Kodrík a kol. 2007, Večeřa a kol. 2007). Sledovat jak je tato schopnost AKH ovlivněna předchozím ošetřením allatostatiny. Jako markery oxidačního stresu poţít stanovení hladiny glutathionu a proteinových karbonylů. Glutathion a jeho oxidovaný produkt stanovit v hemolyfě pomocí metody Griffitha (1980) a modifikované Krishnanem a kol. (2007) za pouţití glutathion reduktázy a následného produktu měřeného fotometricky při 412 nm.
Karbonylace proteinů bude měřena jejich reakcí s 2,4-dinitrophenylhydrazinem (DNPH) podle Levineho a kol. (1990). Reakce je kvantifikována měřením produktů na spektrofotometru při 370 nm. Harmonogram prací leden - prosinec 2011 Studium vlivu allatostatinu případně analogu JH na fyziologické charakteristiky: změny hladin vitellogeninu v hemolymfě a ováriích, změny obsahu bílkovin, lipidů a glykogenu v ováriích Sledování změn adipokinetických charakteristik po aplikaci allatostatinu nebo methoprenu: mobilizace lipidů, intenzita lokomoce, intenzita metabolismu (produkce CO2) a schopnost reagovat na oxidační stress. Vypracování podmínek in vitro inkubací Měření hladin AKH v CNS a hemolymfě (příp. v mediu u in vitro pokusů) po aplikaci allatostatinu nebo methoprenu Předpokládaný typ vědeckých výsledků projektu Uvedený projekt je součástí plánu doktorské disertace, proto se předpokládá, ţe výsledky budou presentovány na 26th Conference of European Comparative Endocrinologists, konané ve švýcarské Ţenevě v roce 2012 a případně na 88. Fyziologických dnech ve stejném roce v Praze. Dále se předpokládá publikace výsledků v mezinárodním vědeckém časopise. Hlavní řešitel Milada Zemanová, Mgr. 2010 doktorské studium, obor Fyziologie ţivočichů a vývojová biologie, Přírodovědecká fakulta JU, téma disertační práce: Hormonální řízení metabolismu u hmyzu 2007 - 2011 magisterské studium, obor Zoologie, specializace Zoologie obratlovců, Přírodovědecká fakulta JU, uznána předchozí diplomová práce 2007 - 2010 magisterské studium, obor Experimentální biologie, specializace Fyziologie ţivočichů, Přírodovědecká fakulta Jihočeské univerzity, diplomová práce: Termoregulační schopnosti rypoše Fukomys darlingi a jejich vývoj u mláďat 2004 - 2007 bakalářské studium, obor Biologie, Biologická fakulta JU, bakalářská práce: Bioenergetika reprodukce a postnatálního vývoje dvou sociálních druhů rypoše rodu Fukomys Udělen grant: SGA2009/015 Zemanová a Jerkovičová - Reprodukční biologie a bioenergetika postnatálního vývoje mláďat sociálního druhu rypoše Fukomys darlingi.
Vedoucí projektu (maximálně 30 řádek) Prof. RNDr. Dalibor Kodrík CSc. Entomologický ústav, Biologické centrum AVČR, v.v.i. Školitel se zabývá výzkumem hmyzích hormonů a specializuje se na skupinu hmyzích stresových hormonů z rodiny adipokinetických hormonů (AKH). Za posledních 20 let publikoval asi 80 vědeckých prací, prezentoval téměř 70 příspěvků na mezinárodních
konferencích, byl řešitelem 12 českých grantů (GAAV, GAČR, MŠMT), 2 zahraničních grantů (NATO, Royal Society), spoluřešitelem 2 grantů (GAČR, Ministerstvo zemědělství) a členem týmů dalších 12 grantů. Pod jeho vedením obhájilo své diplomové práce 17 studentů všech stupňů a v jeho laboratoři prodělalo středně- aţ dlouhodobé stáţe 8 zahraničních studentů (Polsko, Taiwan, Chorvatsko, Mexiko). V současné době je garantem 3 kurzů na PřF JU. Pět významných publikací za posledních 5 let: 1. Kodrík D., Krishnan N. and Habuštová O. (2007) Is the titer of adipokinetic peptides in Leptinotarsa decemlineata fed on genetically modified potatoes increased by oxidative stress? Peptides 28: 974-980 2. Kodrík D. (2008) Review article: Adipokinetic hormone functions that are not associated with insect flight. Physiol. Entomol. 33: 171-180 3. Alquicer G., Kodrík D., Krishnan N., Večeřa J. and Socha R. (2009) Activation of insect anti- oxidative mechanisms by mammalian glucagon. Comp. Biochem. Phys. B. 152: 226227 4. Kodrík D., Bártů I. and Socha R. (2010) Adipokinetic hormone (Pyrap-AKH) enhances the effect of a pyrethroid insecticide against the firebug Pyrrhocoris apterus. Pest Manag. Sci. 66: 425-431. 5. Zralá J., Kodrík D., Zahradníčková H., Zemek R. and Socha R. (2010) A novel function of red pigment-concentrating hormone in crustaceans: Porcellio scaber (Isopoda) as a model species. Gen. Comp. Endocrinol. 166: 330-336.
Požadované finanční prostředky Výdaje a náklady na pořízení hmotného a nehmotného majetku (max. 50000Kč) Drobný hmotný a nehmotný majetek: 0 Kč Spotřební materiál: 49910,39 Kč
Náklady na publikace (max. 2000Kč) 0 Kč Požadované finanční prostředky celkem: 49910,39 Kč
Slovní zdůvodnění a rozpis finančních prostředků
Drobný hmotný a nehmotný majetek (0 Kč) Spotřební materiál (49910,39 Kč) lab. sklo (zkumavky, reagenční láhve, odměrné válce, vialky), lab. plasty (zkumavky), pitvací nůţky, mikrostříkačky, mikrolţičky, parafilm, chemikálie (kys. sírová, metanol, kys. ortofosforečná, chlorid sodný), protilátka, membránové filtry Náklady na publikace (0 Kč)
