ÚSTAV FYZIKÁLNÍ BIOLOGIE JIHOČESKÁ UNIVERZITA V ČESKÝCH BUDĚJOVICÍCH ZPRÁVA O UKONČENÍ PROJEKTU Projekt Název projektu: Změna optických vlastností listů révy vinné v závisloti na obsahu fenolických látek v místech infekce houbou Plasmopara viticola. Případová studie v terénu. Průběh řešení projektu : Průběh projektu byl mírně ovlivňen dodáním měřícího notebooku.
Dosažené výsledky: V průběhu roku 2010 byla dokončena terénní měření na experimentální vinici Ústavu vinohradnictví a vinařství Mendelovy Univerzity v Brně, zahradnické fakultě v Lednici, která vedla k ověření výsledků laboratorních experimentů (Cséfalvay et al. 2009), tj. že FV/FM a/nebo ΦII jsou citlivými parametry vhodnými pro včasnou detekci infekce způsobené houbou Plasmopara viticola. Celkem bylo testováno 5 odrůd, z toho 3 citlivé a 2 odolné celkem 120 listů (tab.1) Odolné odrůdy
Laurot Malverina
Citlivé odrůdy
Cabernet Sauvignon Rulandské Bílé Rulandské Šedé
Tab.1 Kategorie zkoumaných odrůd (Odolné a citlivé)
Od každé odrůdy jsme měřili celkem 10 listů zdravých a 10 listů infikovaných. Pomocí zobrazovacího fluorometru FluorCam jsme měřili distribuci parametru FV/FM (Obr.1). U všech listů signifikantní změny FV/FM v ploše listu korelovaly s místy napadení. V místech se sníženou aktivitou fotosystému II
(snížená hodnota FV/FM) jsme odebrali vzorky pro
stanovení obsahu fenolických látek a fotosyntetických pigmentů. V případě citlivých odrůd v rané fázi infekce, kdy ještě nebyly znatelné žádné viditelné příznaky, heterogenní distribuce FV/FM ukázala malá místa na listech s lokálně sníženou fotosyntetickou aktivitou v důsledku
infekce. Jak infekce postupovala, míst se sníženou fotosyntetickou aktivitou přibývalo a jejich plocha se zvětšovala (Obr.1 ukazuje pouze pletivo v pozdní fázi infekce). V případě rezistentních (odolných) odrůd místa se sníženou ΦII v rané fázi infekce byla daleko rozsáhlejší. Zde nedocházelo k rozšiřování zasažených oblastí, ale rostlina infekci lokalizovala do velkého spotu na listu, který následně nekrotizoval. Nekróza infikovaného pletiva je jasně na viditelná na obr. 1 u odrůdy Laurot. Obr. 1 ukazuje typické příklady distribuce FV/FM u zdravých (horní řádek) a infikovaných (spodní řádek) listů citlivých a odolných listů révy vinné. Laurot
Malverina
CabSauv
PinotBlanc
PinotGris 0.8
0.3 Obr.1 Distribuce parametru FV/FM. Horní řádek pletivo zdravých listů, spodní řádek napadené pletivo.
Na obr. 2 jsou průměrné hodnoty FV/FM u zdravých listů a v ohnisku napadení houbou Plasmopara viticola naměřené během terénních experimentů v roce 2010. Je zřejmé, že snížení fotosyntetické aktivity v místě napadení je podobné jak u citlivých tak u odolných odrůd. 0.8
Fv/Fm
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3 Laurot
Malverina
CabSauv
PinotBlanc
PinotGris
Obr. 2 FV/FM (efektivní kvantový výtěžek fotosystému II) u zdravých listů (bílé) a ohnisek napadení (černé) sloupce.
Snížená fotosyntetická aktivita v míste napadení byla způsobena poklesem koncentrace fotosyntetických pigmentů (Chl a, Tab.2). Pigmenty byly stanovovány spektrofotometricky podle Lichtenthalera (1987). Chlorophyll a (µg·g-1) Fresh weight Control
SEM
Infected
SEM
Difference%
Laurot
1232.2
± 62,6
907.3
± 45,2
-26.36747281
Malverina
1109.3
± 35,9
720.3
± 46,1
-35.06715947
CabSauv
798
± 47,2
546.8
± 50,8
-31.47869674
PinotBlanc
592
± 12,3
524.8
± 55,2
-11.35135135
763.7
± 27,9
460.8
± 26,0
-39.66217101
PinotGris
Tab.2 Obsah chlorofylu a (µg·g-1) čerstvé váhy
U listů vybraných odrůd (Cabernet Sauvignon, Rulandské bílé, Rulandské šedé, Laurot, Malverina) jsme měřili kinetiku fluorescence chlorofylu v aktinickém světle (200 µmol(fotonů).m-2.s-1, zhášecí analýza) a absorbční a reflektanční spektrum v UV a VIS světle (280 - 800 nm). Měřili jsme na temnotně adaptovaných listech (20 min temnotní adaptace) v laboratorních podmínkách. Pletivo napadené houbou Plasmopara viticola (černé symboly, Obr.3) vykazovalo nižší fluorescenční signál, který souvisí s nižším obsahem chlorofylu v místech napadení a pomalejší pokles fluorescence z lokálního maxima (FP) v aktinickém světle. Ten naznačuje pomalejší transport elektronů z plastochinonového poolu. 6.0
3.0 2.0 1.0
Pinot Blanc
45
4.0 3.0
40
2.0 1.0
0.0
0.0 0
50
100
150
200
0
time, s
50
100
150
200
time, s 6.0
6.0
Malverina
5.0
5.0
Cab.Sauvignon
F/F0, rel.u.
3.0
3.0
2.0
2.0
1.0
1.0
0.0 50
100
150
200
30
20 15
0.0
0
35
25
4.0
4.0
T im e Fd/2
F/F0, rel.u .
F/F0, rel.u.
5.0
Laurot
4.0
F/F0 , re l.u.
50
6.0
5.0
0
time, s
50
100
150
200
Laurot
Malverina
time, s
Control
Infected
Obr.3 Kinetiky Chl-F v místě napadení (černě) a u zdravého pletiva (bíle)
Obr.4 Fd/2 parametr
Cabsauv
PinotBlanc
S rychlostí transportu elektronů z plastochinonového poolu souvisí také parametr fd/2, počítaný jako rozdíl (FP-FS)/2 (FS-ustálená úroveň Chl-F; tzv. steady state). Polovina času transportu elektronů z lokálního maxima FP v aktinickém světle do úrovně ústálené Chl-F byla vyšší u všech sledovaných odrůd (Obr.4). 100
Differences in ref. spektra
D iffe re n c e , %
50
0
-50 Laurot Pinot Blanc
-100
-150 400
450
500
550
600
650
700
750
800
wavelenght, nm
Obr.5 Rozdíl v reflektanci u napadených a zdravých pletiv. Vybraný zástupce citlivé odrůdy (Pinot Blanc) a rezistentní odrůdy (Laurot).
Největší rozdíl v reflektanci napadeného a zdravého pletiva citlivé a rezistentní odrůdy (Obr. 5) je v oblasti 670-690nm, ve které je maximální absorbce chlorofylu. Pokles koncentrace v chlorofylu v napadeném pletivu způsobuje největší změnu v reflektanci. Pokles koncentrace chlorofylu v napadených oblastech koreluje se vybranými indexy pro jeho neinvazivní odhad ( Gitelson and Merzlyak 1994, Chapelle et al. 1992, Vogelman et al. 1993), vyjímkou rezistentní odrůdy Laurot (Obr.6 A,B,C). Laurot vykazoval zvýšený obsah chlorofylu a jak v místě napadení, tak ve zdravém pletivu. 18
0.5
16
0.4 R675/R700
14 R750/R550
y = 0.0115x + 0.015 R2 = 0.8076
0.45
y = 0.3554x + 0.6833 R2 = 0.631
12 10 8
A
0.35 0.3 0.25
B
0.2
6
0.15 0.1
4 10
15
20
25
30
35
40
45
10
15
20
Control
Infected
Laurot Control
25
30
35
40
Ca+b (ug/cm 2)
Ca+b (ug/cm 2) Laurot Infected
Control
Linear all
Infected
Laurot Control
Laurot Inf ected
Linear all
1.89
Obr.6 Korelace vybraných reflektančních indexů s chemickou analýzou
1.79 y = 0.0223x + 0.9474 R2 = 0.7984
R740/R720
1.69 1.59 1.49 1.39 1.29
C
1.19 1.09 10
15
20
25
30
35
40
Ca+b (ug/cm 2) Control
Infected
Laurot Control
Laurot Inf ected
Linear all
45
3
16
Control Resistant
Control Resistant Control Susceptible
Control Susceptible
2.5
Infected Resistant
Infected Resistant
12
Infected Susceptible
Infected Susceptible
2
10
Red/Green
ARI [R800*(1/R550-1/R700)]
14
8 6
1.5
1
4
A
2
B
0.5
0
0
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
0
Anth. content (nmol*m-2) calculated per Fresh weight
0.5
1
1.5
2
2.5
3
Anth. content (nmol*m -2) calculated per Fresh weight
Obr. 7 Korelace vybraných reflektančních indexů s chemickou analýzou
Vybrané reflektanční indexy pro neinvazivní odhad obsahu antokyanů (ARI index a Red/Green index, Obr. 7 A,B) ukazují viditelný trend. U napadeného pletiva rezistentních odrůd je výrazně vyšší hodnota ARI
a Red/Green indexu, zatímco zdravé pletivo
rezistentních a citlivých odrůd stejně tak jako infikované pletivo citlivých odrůd vykazují podobný trend.
Stav čerpání finančních prostředků: Měřící notebook Acer
22 000 Kč
Dewarovy nádoby
13 690 Kč
Mikropipeta Hirschmann
4 020 Kč
Laboratorní materiál, chemikálie apod.
9 000 Kč
Celkem čerpáno
48 710 Kč
Využitelnost dosažených výsledků a navazující práce Výsledky této práce budou použiti při dalších studiích interakce patogenu Plasmopara viticola a hostujícího organismu Vitis vinifera, zejména se zaměřením na fluorescenční emise (FLD) napadených listů.
