ÚSTAV FYZIKÁLNÍ BIOLOGIE JIHOČESKÁ UNIVERZITA V ČESKÝCH BUDĚJOVICÍCH

ÚSTAV FYZIKÁLNÍ BIOLOGIE JIHOČESKÁ UNIVERZITA V ČESKÝCH BUDĚJOVICÍCH PŘIHLÁŠKA STUDENTSKÉHO PROJEKTU Projekt Název projektu: Rekonstrukce fylogeneze Oocystaceae molekulárních dat kódovaných v jádře a v chloroplastu

(Chlorophyta)

na

základě

Uchazeč Hlavní řešitel Příjmení, jméno, tituly: Pažoutová, Marie, Mgr. E-mail: [email protected] Tel.: 389 032 302 Studium v doktorském studijním programu zahájeno dne: 1.10. 2008 Pracoviště/místo studia Fakulta (VŠ ústav): Fakulta přírodovědecká Katedra (ústav, pracoviště): Katedra botaniky Školitel: Doc. RNDr. Jan Kaštovský, Ph.D. Vedoucí projektu Příjmení, jméno, tituly: E-mail: Tel.:

Kaštovský, Jan, Doc. RNDr. Ph.D. [email protected] 389 032 252

Pracoviště Fakulta (VŠ ústav): Fakulta přírodovědecká Katedra (ústav, pracoviště): Katedra botaniky Celkové náklady na řešení projektu Náklady nebo výdaje na pořízení hmotného a nehmotného majetku: 0 Další provozní náklady nebo výdaje: 52 000 Doplňkové náklady nebo výdaje: 0 Celkem Kč: 52 000 V Českých Budějovicích dne 11.7. 2011 Podpis uchazeče:…………………………......

Zdůvodnění návrhu projektu Stav řešení problematiky projektu (max. 2 stránky): Rod Oocystis, charakteristický zvláštním citrónkovitým tvarem buňky se ztluštěninami na pólech, zahrnuje hojné a dlouho známé zelené řasy (popsán byl v 19. stol.). Jeho druhy se vyskytují v planktonu po celém světě, některé kmeny se používají i jako modelové organismy v biochemických a toxikologických studiích (např. Soldo et al. 2005). Původní užší pojetí čeledi Oocystaceae zohledňovalo především specifický tvar buněk Oocystis a jí podobných řas a udrželo se v podstatě až dodnes, přestože někteří autoři (Smith 1950) řadili k Oocystis i mnoho dalších zelených řas s kokální stélkou a jednoduchým životním cyklem (Chlorella, Ankistrodesmus…). Poslední definice čeledi vychází z ultrastrukturních znaků, ty však nejsou ověřeny u všech zástupců (Komárek1979). Recentní monografie sladkovodních zelených řas z řádu Chlorococcales (Komárek & Fott 1983) dělí čeleď Oocystaceae na čtyři podčeledi a uvádí celkem 33 rodů – toto členění lze dnes považovat za zastaralé. Ve vnitřní systematice čeledi se uplatňovaly (a dodnes uplatňují) morfogické znaky jako přítomnost či nepřítomnost ostnů a trnů, tvar a počet chloroplastů, charakter a počet a pyrenoidů aj. Zásadní změny do taxonomie a studia řas vůbec vnesl nástup molekulárních metod. Na základě fylogenetických analýz sekvencí 18S rDNA se mnoho rodů ale i některé čeledi ukázaly jako polyfyletické a jejich zástupci se umístili dokonce do různých tříd (např. rod Chlorella: Huss et al. 1999, čeleď Radiococcaceae: Wolf et al. 2003, Pažoutová 2009). V těchto souvislostech se právě čeleď Oocystaceae jeví velice zajímavá: jako jedna z mála původně morfologicky definovaných skupin tvoří robustní celek, tj. dobře podpořený monofyletický clade, ve všech dosud publikovaných molekulárních studiích. Ještě zajímavější je zvýšená evoluční rychlost v této skupině: u Oocystaceae najdeme relativně velké množství mutací i v dosti konzervativním úseku 18S rDNA, také se často vyskytují introny (příklad: ačkoli se u zelených řas délka genu 18S rDNA pohybuje nejčastěji okolo 2000 párů bazí, tentýž úsek u druhu Echinocoleum elegans dosahoval délky přes 4000 párů bazí a obsahoval šest intronů; Pažoutová et al. 2010). I v případě čeledi Oocystaceae došlo dle molekulární fylogenetiky k několika taxonomickým přesunům – nicméně se zdá, že tyto změny neodporují ani tradičnímu morfologickému konceptu (Hepperle et al. 2000, Krienitz et al. 2003, Pažoutová et al. 2010). U mnoha rodů však jejich taxonomická pozice dosud jistá není, např. z celé podčeledi Lagerheimioideae je publikována pouze jediná sekvence, její umístění uvnitř čeledi postrádá relevantní statistickou podporu. Do současné doby se čeledi Oocystaceae věnovaly pouze tři již citované molekulárně fylogenetické studie a v databázi Genbank je k dispozici méně než 20 použitelných sekvencí genu 18S rDNA. Na jiném molekulárním markeru se zatím soustavněji nepracovalo.

Obr. 1. Fylogeneze a morfologie zástupců Oocystaceae. Výřez z fylogenetického stromu třídy Trebouxiophyceae, sestrojeného metodou maximum likelihood. Statistická podpora větví zobrazena níže v Obr. 2. Pažoutová et al. 2010.

Literatura: Hepperle, D., Hegewald, E. & Krienitz, L. (2000): Phylogenetic position of the Oocystaceae (Chlorophyta). Journal of Phycology 36 (3): 590-595. Huss, V. A. R., Frank, C., Hartmann, E. C., Hirmer, M., Kloboucek, A., Seidel, B. M., Wenzeler, P. & Kessler, E. (1999): Biochemical taxonomy and molecular phylogeny of the genus Chlorella sensu lato (Chlorophyta). Journal of Phycology 35 (3): 587-598. Krienitz, L., Hegerwald, E., Hepperle, D. & Wolf, M. (2003): The systematics of coccoid green algae: 18S rRNA gene sequence data versus morphology. Biologia. 58 (4): 437–446. Krienitz, L., Hegewald, E. H., Hepperle, D., Huss, V. A. R., Rohrs, T. & Wolf, M. (2004): Phylogenetic relationship of Chlorella and Parachlorella gen. nov (Chlorophyta, Trebouxiophyceae). Phycologia 43 (5): 529-542. Komárek, J. (1979): Änderungen in der Taxonomie der Chlorokokkalgen. Algological Studies 24: 239-263. Komárek, J. & Fott, B. (1983): Chlorococcales. In Huber-Pestalozzi, G. (ed.) Das Phytoplankton des Süßwassers, Band 7. 1044 pp., Schweizerbart’sche Verlagsbuchhandlung, Stuttgart. Pažoutová, M. (2009): Changing taxonomical concept in Radiococcaceae. Meeting Abstract. Phycologia, Suppl. 48 (4): 104-104. Pažoutová, M., Škaloud, P. & Nemjová, K. (2010): Phylogenetic position of Ooplanctella planoconvexa, gen. et comb. nova and Echinocoleum elegans (Oocystaceae, Trebouxiophyceae, Chlorophyta). Fottea 10 (1): 75-82. Smith, G. M. (1950): The fresh-water algae of the United States. Ed 2. 716 pp., McGraw-Hill Book Co., New York. Soldo, D., Hari, R., Sigg, L. & Behra R (2005): Tolerance of Oocystis nephrocytioides to copper: intracellular distribution and extracellular complexation of copper. Aquatic Toxicology 71 (4): 307-317. Wolf, M., Hepperle, D. & Krienitz, L. (2003): On the phylogeny of Radiococcus, Planktosphaeria and Schizochlamydella (Radiococcaceae, chlorophyta). Biologia 58 (4): 759-765.

Stanovení badatelských cílů, metody a způsob řešení (max. 2 stránky): Z dostupných molekulárních analýz Oocystaceae, tj. fylogenetických rekonstrukcí podle sekvencí 18S rDNA (Obr. 2), je patrné, že u celé skupiny Oocystaceae (a zvláště pak v jedné její vnitřní větvi) došlo k výraznému zrychlení evoluce tohoto genu. A to jak v podobě vyšší variability kódujících úseků, tak i co se týká frekvence intronů. Což je u takto konzervativního úseku poměrně pozoruhodné. Cílem navrhovaného projektu je studium širšího spektra kmenů řas patřící do Oocystaceae: sekvenace jaderného genu pro 18S rRNA (případně též oblasti ITS) a chloroplastového markeru rbcL a porovnání fylogenetických signálů z těchto dat.

Obr. 2. Pozice Oocystaceae v rámci třídy Trebouxiophyceae. Fylogenetický strom sestrojen metodou maximum likelihood. Statistická podpora větví v pořadí maximum likelihood, maximum parsimony a bayesian posterior probability (BP). Hvězdička označuje plnou podporu (100/100/1.00), tloušťka čáry BP  0.99. Pažoutová et al. 2010.

 otázky pro navrhovaný projekt: - je u zástupců Oocystaceae zmíněná vyšší mutační rychlost (rychlejší evoluce) pouze specifickou „úchylkou“ genu pro 18S rRNA – nebo najdeme podobný pattern také v případě jiných vybraných genů (rbcL) což by naznačovalo, že mají Oocystaceae v rámci své třídy specifický celý genom? - liší se od sebe fylogeneze jednotlivých genů (jaderný 18S vs. chloroplastový rbcL)? - porovnat signál jednogenových a multigenových analýz („single-gene trees“ vs. „concatenated trees“) - nevyvrátí molekulární data dalších, dosud nesekvenovaných zástupců monofylii a taxonomickou „robustnost“ této skupiny? (Předpokládáme, že nikoli a že se podaří potvrdit korelaci molekulárních markerů i s jiným typem dat, zejména s morfologií.) - vyskytuje se v čeledi Oocystaceae ještě specifická „rychlejší“ linie coenobiálních zástupců (Makinoella/Crucigeniella) nebo se jedná pouze o metodický artefakt (Long Branch Attraction)? metody a způsob řešení: ▪ materiál: kmeny ze světových sbírek doplněné o vlastní izoláty ▪ kultivace kmenů v algologické laboratoři, světelná mikroskopie ▪ standardní metody v molekulární laboratoři katedry botaniky (izolace DNA, PCR, sekvenační reakce) a jejich optimalizace (zejména parametry PCR reakce) ▪ vytipování vhodných primerů a primerových kombinací, design specifických primerů ▪ analýzy molekulárních dat: sestavení sekvencí jednotlivých genů, alignment, analýzy metodami maximum likelihood, maximum parsimony a Bayesian inference of phylogeny Harmonogram prací: ▪ první polovina roku 2011 – výběr kmenů ke studiu, izolace DNA, testování primerů ▪ červenec až září 2011 – práce v molekulární laboratoři, sekvenace ▪ zaří až listopad 2011 – kompletace sekvencí, analýza dat Předpokládaný typ vědeckých výsledků projektu ▪ „hrubá data“: sekvence dostud nestudovaných organismů (posléze přístupné v databázi NCBI), morfologická dokumentace zkoumaných kmenů ▪ publikace v relevantním impaktovaném časopise (pravděpodobně v oboru fykologie) ▪ prezentace na výroční konferenci České algologické společnosti, případně na půdě Britské fykologické společnosti apod.

Hlavní řešitel (maximálně 30 řádek) Mgr. Marie Pažoutová (* 1983) e-mail: [email protected], tel.:387772302 pracoviště: Katedra botaniky, Přf JU, Na Zlaté stoce 1, 370 05 České Budějovice ▪ Studium: 2002 - 2008 Přf UK v Praze (Magisterská práce: Phylogenetic diversity and generic concept in the family Radiococcaceae, Chlorophyta); 2005 - semestr na Univesity of Plymouth, Velká Británie a Ecology Fieldcourse, Yucatan, Mexiko; od 2008 Přf JU, doktorské studium.

▪ Granty: 2007 - 2008 GA UK „Fylogeneze a taxonomie aerofytických zelených řas z morfologicky definované čeledi Radiococcaceae“; 2010 FRVŠ „Morfologická variabilita zelených řas v podmínkách kultivace a přírodním prostředí a její implikace v taxonomii“. ▪ Konference: 2008 - Algal Culture Collections 2008, Oban, Velká Británie (poster); 2009 9th International Phycological Congress, Tokyo, Japonsko (poster); 2010 – 59th Annual Meeting of the British Phycological Society, Cardiff, Velká Británie (prezentace “What’s new in phylogeny of Oocystaceae (Trebouxiophyta): Insights and Questions”). ▪ Publikace: Bock, C., Pažoutová, M. & Krienitz, L. (2011): Phylogenetic relationship of Coronastrum ellipsoideum and allied species. Biologia 66 (4): 585-594. Pažoutová, M., Škaloud, P. & Nemjová, K. (2010): Phylogenetic position of Ooplanctella planoconvexa, gen. et comb. nova and Echinocoleum elegans (Oocystaceae, Trebouxiophyceae, Chlorophyta). Fottea 10 (1): 75-82. Pažoutová, M. (2009): Changing taxonomical concept in Radiococcaceae. Meeting Abstract. Phycologia, Suppl. 48 (4): 104-104. Vedoucí projektu (maximálně 30 řádek) Kaštovský, Jan, RNDr., Ph.D. e-mail: [email protected], tel.:387772252 pracoviště: Katedra botaniky, Přf JU, Na Zlaté stoce 1, 370 05 České Budějovice ▪ Odborná specializace: taxonomie sinic, zejména kombinace klasické taxonomie a molekulárně-biologických metod; ekologie sinic a řas z extrémních biotopů ▪ Vybrané granty: 2009-2012 spolupracovník na grantu GA ČR 521/09/1912 „Telomery řas“; 2008-2010 spolupracovník na grantu GA ČR 206/08/0318 „Fylogenetické vztahy, diverzita a ekologie heterocytózních sinic s polarizovanou stélkou“; 2004-2006 juniorský badatelský grant GA AV B6141404 “Polyfázický přístup k fylogenezi sinic (Cyanobacteria)”. ▪ Vybrané publikace: Kaštovský, J., Fučíková, K.,Hauer, T., Bohunická, M. (2011): Microvegetation on the top of Mt. Roraima, Venezuela. Fottea 11 (1): 171-186; Zammit G., Billi D., Shubert E., Kaštovský J., Albertano P. (2011): The biodiversity of subaerophytic biofilms from Maltese hypogea. Fottea 11(1): 187-201; de los Ríos A., Valea S., Ascaso C., Davila A., Kaštovský J., McKay Ch.P., Gómez-Silva B., Wierzchos J. (2010): Comparative analysis of the microbial communities inhabiting halite evaporites of the Atacama Desert. International Microbiology 13 (2): 79-89; Korelusová J., Kaštovský J. & Komárek J. (2009): Heterogeneity of the cyanobacterial genus Synechocystis and description of a new genus Geminocystis. Journal of Phycology 45(4): 928-937; Fučíková K. & Kaštovský J.(2009): Vincularia roraimae (Zygnematophyceae, Desmidiales), gen. et sp. nov. from the top of Mt. Roraima, Venezuela. Nova Hedwigia 88(1-2): 49-56; Margheri M.C., Ventura S., Kaštovský J. & Komárek J. (2008): The taxonomic validation of the cyanobacterial genus Halothece. Phycologia 47: 4777-486; Kaštovský J. & Johansen J.R. (2008): Mastigocladus laminosus (Stigonematales, Cyanobacteria): phylogenetic relationship of strains from thermal springs to soil-inhabiting genera of the order and taxonomic implications for the genus. Phycologia 47: 307–320; Kaštovský J., Řeháková K., Bastl M., Vymazal J., King R.S. (2008): Experimental Assessment of Phosphorus Effects on Algal Assemblages in Dosing Mesocosms. In: Richardson C. (ed.): The Everglades Experiments, 465-479 p, Springer; Fiore MF, Sant’Anna CL, Azevedo MTP, Komárek J, Kaštovský J, Sulek J., Lorenzini AS (2007): The Cyanobacterial genus Brasilonema gen.nov., a molecular and phenotypic. Journal of Phycology 43: 789-798.

Požadované finanční prostředky Výdaje a náklady na pořízení hmotného a nehmotného majetku (max. 50000Kč) Drobný hmotný a nehmotný majetek: 0 kč Spotřební materiál: 50 000 kč Náklady na publikace (max. 2000Kč): 2 000 kč Požadované finanční prostředky celkem: 52000Kč

Slovní zdůvodnění a rozpis finančních prostředků Finanční prostředky budou využity na pokrytí nákladů na práci v molekulární laboratoři katedry botaniky, zejména budou pořízeny reagencie pro PCR reakci (PCR Master mix) a přečištění PCR produktu. Z prostředků na literaturu bude zakoupena literatura s algologickou tematikou (kniha Algae: Anatomy, Biochemistry, and Biotechnology, Laura Barsanti).