Určování toxicity látek Odhady na základě předchozích znalostí (experimentů) QSAR Experimenty – testy toxicity
1
1. QSAR • Quantitative Structure Activity Relationship • přístup založený na odhadu biologických účinků látek na základě jejich struktury – výstavba QSAR modelů • účinek (aktivita) x soubor vhodných parametrů (deskriptorů) • porovnávání souboru podobných látek • studium na základě různých strukturních domén (Ashbyho metoda strukturního varování) • databázové systémy CASE, ADAPT, TOPKAT • metoda umožňující předběžně odhadovat chování dané látky (počítačové simulace) • odhad možných genotoxických účinků studované látky
2
QSAR • Analýza QSAR využívá korelace a vztahy, které existují mezi vlastnostmi, které jsou spojené s konstitucí molekuly a vlastnostmi, které jsou spojené s biologickým systémem. • Tyto vztahy lze pro soubor chemických látek vyjádřit matematickou formulí nebo parametry matematické statistiky:
• BAi = f(Xi)
3
QSAR • Na začátku šedesátých let Hansch popsal účinky látek na organismy funkcí tří hlavních vlastností látek:
• Hydrofobností – Vedle rozdělovacího koeficientu Kow bývá používána i Hanschova konstanta πi • Reaktivitou – Bývá vystižena Hammettovými konstantami σi • Sterickými faktory – Taftovou substituentovou konstantou Es nebo konstantami, které souvisejí s geometrií a rozměry molekuly – případně i relativní molekulovou hmotností
4
Hanschova rovnice • Příklad Hanschovy rovnice pro určité alkoholy a chlorované uhlovodíky na Daphnia magna
1 log a(log Kow) 2 b(log Kow) c dEs e EC50
1 log ( M ) 0,91* log Kow 4,72 EC50
5
2. Testy toxicity - biotesty • Experimenty s organismy hledající odpověď na otázku – jak bude testovaná látka ovlivňovat život organismů – Jak bude ovlivňovat biologické funkce ekosystémů • Látky mohou na organismy působit různým způsobem: – negativně či pozitivně. – Látka v určité koncentraci může způsobovat smrt organismu, zpomalovat jeho vývoj či ovlivňovat metabolické funkce. – Na druhé straně zase může způsobovat jeho nadměrný nárůst či rozmnožování, což je rovněž nežádoucí. • Míra působení látek na organismus je závislá na jejich koncentraci v ekosystému, biodostupnosti a perzistenci.
6
Endpoint - odpověď • Při testech toxicity se nesleduje pouze závislost úhynu organismů na koncentraci testované látky.
• Podle druhu testovacího organismu se sleduje také imobilizace, reprodukční schopnost, růst apod. • Sledovanou reakci organismu na testovanou látku nazvěme ekotoxikologickou odpovědí organismu (testovacího systému). • Při různých koncentracích testované látky lze sledovat jiné ekotoxikologické odpovědi. – Při nižších koncentracích to mohou být etologická pozorování či změny v porodnosti – Při vyšších např. imobilizace či smrt. 7
Ekotoxikologické indexy • „Veličiny“ charakterizující kvantitativně účinky látek na organismy. • Slouží k – odhadu rizik – k hodnocení přijatelnosti látek pro ekosystémy – ke srovnávání toxických účinků různých látek vzájemně – k jejich třídění do tříd nebezpečnosti. • Jsou výstupem testů toxicity, obecně biotestů.
8
Vypočtené indexy • EC 50 – Efektivní koncentrace testované látky,která způsobuje pozitivní odezvu u 50% testovacích organismů • effective concentration, mg/L, ml/L • Lethal concentration, LC50 • Inhibition concentration, IC50
• EC05, EC20, EC90, …
9
Určené indexy • NOEC – No Observed Effect Concentration – Nejvyšší testovaná koncentrace, ve které nebyl pozorován statisticky významný účinek ve srovnání s kontrolou. • LOEC – Bezprostředně vyšší testovaná koncentrace než NOEC • NOEL – No Observed Effect Level. • NOAEL – No Observed Adverse Effect Level. – Účinek látky je pozorován, není však považován za nežádoucí.
10
Uspořádání testu toxicity
Kontrola
6 mg/L
12 mg/L
25 mg/L
50 mg/L
100 mg/L
Nasazeno po 20 ks Odpověď po 24 hodinách, počet uhynulých ryb
0
0
1
6
13
17
Odpověď po 96 hodinách, počet uhynulých ryb
0
0
4
9
15
20 11
Záznam testu
Koncentrace
Kontrola
6 mg/L
12 mg/L
25 mg/L
50 mg/L
100 mg/L
Účinek 24 hod
0%
0%
5%
Účinek 96 hod
0%
0%
20% 35% 75% 100%
30% 65% 85%
12
Dávka-Odpověď
Mortalita
100
24 hod. 96 hod.
75 50 25 0 0
25
50
75
100
Koncentrace 13
Ideální dose – response křivka
100
efekt, %
80 60
Lineární měřítko je často nepřehledné
40 20 0 0
500
1000
koncentrace 14
Ideální dose – response křivka
100 90 NOEC 80 70 60 50 40 30 20 10 Netoxické 0účinky 0,1 1
Letální účinky
LOEC LC
Odhad EC50 10
100
1000
10000
Logritmické měřítko koncentrací 15
Prezentace výsledků testu toxicity • • • •
EC50 + intervaly spolehlivosti na hladině významnosti obvykle 95% NOEC, EC05 LOEC, EC20 LC, EC95
16
Faktory ovlivňující výsledky testů toxicity
Jak zajistit, aby výsledky experimentálních testů byly relevantní? Vladimír Kočí Ústav chemie ochrany prostředí, VŠCHT Praha
Faktory ovlivňující výsledky testů toxicity; podmínky Z důvodů reprodukovatelnosti je třeba standardizovat především následující faktory:
• • • • • • • •
Vzorkování Doba expozice Teplota Světelné podmínky Objem Kyslíkové poměry Složení ředící vody Stáří organizmu
18
Volba metody a testovacího organismu • Existují různé zájmové skupiny, které si po svém volí metodiku testování a výsledky svých prací vědomě i nevědomě extrapolují do sféry vlivu skupin druhých. • Cíl studie je určující pro volbu metodiky testu. – Nikoliv obráceně. – – Výsledek by neměl určovat volbu metodiky ;-)
19
Odběr vzorku
Základní schéma práce
Úprava vzorku (Předúprava, výluh, extrakt) pozitivní
Limitní Test pozitivní, odpověď > 50%
negativní
Ověřovací test
negativní
Orientační Test pozitivní, odpověď < 50%
Základní Test Hodnocení 20
Vzorkování • Vzorkování ≠ Odběr vzorků • Vzorek, který je v laboratoři podroben zkoumání toxických účinků na vodní organizmy, je podroben ekotoxikologickým testům, může být skupenství - kapalného nebo tuhého (plyny se zatím netestují). • Důraz na reprodukovatelnost, objektivitu…
21
Předúprava • Jedná se o upravení vzorku k vlastnímu testu. • Již předúprava zásadní měrou ovlivňuje výsledek. • Způsob předúpravy je třeba volit s ohledem na testované látky. • Významný krok manipulace se vzorkem v období mezi jeho odběrem a vlastním biotestem. – Např. vysušení, úprava ph, filtrace atd. • Další cíle předúpravy: – Odlišení typů toxikantů – Eliminaci rušivých vlivů
22
Předúprava • Tepelná úprava – Sterilizace autoklávem, zejména pro environmentální vzorky – Denaturace bílkovin, pesticidů – Rozklad termolabilních látek – Zdůraznění termostabilních – Lépe neprovádět • Předúprava, osmotický tlak – Aby se v případě malé rozpustnosti pevného vzorku vyloučilo negativní působení nízkého osmotického tlaku na ryby, bezobratlé a semena rostlin, nebo nedostatku živin v testech na zelených řasách se do výluhů přidávají předepsaná množství živných solí. – Změna celkové mineralizace mění množství rozpustných látek. 23
Předúprava • Prokysličování – Nutné pro organismy – Způsobuje odstranění těkavých látek – Dochází ke změnám pH – Stripování – odstranění nežádoucích rušivých látek • Úprava pH – Ovlivní formy výskytu kovů a tudíž i jejich toxicitu, podobně amoniak. – pH jako součást nepříznivých vlastností vzorku – Je-li vzorek silně toxický – lépe neprovádět
24
Kapalné vzorky, úprava pH Existují dva přístupy: 1. pH se neupravuje; je to součást nepříznivých vlastností testované látky 2. pH se upravuje; v přírodě dojde v vyrovnání v důsledku pufrační kapacity toku • K úpravě pH se používá roztok HCl o koncentraci 0,1 mol.l-1, popř. NaOH.
25
Předúprava • Kapalné vzorky – Používají se pro testování přímo – v odpovídajícím naředění – Důležitou vlastností látek je jejich chování ve vodě, ne všechny kapalné vzorky musí být ve vodě dobře rozpustné. – Látky, které tvoří s vodou pěnu, emulzi či gel je velmi komplikované testovat. – Zejména u organických látek je důležitá jejich rozpustnost ve vodě. – Případně vpravení do zeminy – na půdní expozici • Pevné vzorky – převedení do roztoku (výluh, extrakt) => pro aquatické testy – terestrické, kontaktní testy toxicity (dosud se u nás nepoužívají, jednání s EU to urychlí, EPA testy) 26
Předúprava pevných vzorků pro akvatické testy • Z pevných vzorků je nejprve třeba připravit roztok o známé koncentraci. • Z látek nerozpustných nebo z látek nespecifického složení, např. zeminy ze skládek, se připravují výluhy či extrakty, jež jsou dále testovány. • Výluh – vhodné pro látky ve vodě dobře rozpustné. • Kyselý výluh – vhodné pro látky ve vodě dobře rozpustné při nižším pH; kovy. – V přírodních podmínkách však nedochází k vyluhování destilovanou vodou, ale vodou o nižším pH, jež může mít vliv na větší uvolňování kovových iontů. – Z tohoto důvodu se doporučuje používat pro získání výluhu destilovanou vodu nasycenou CO2. • Extrakt – pro organické, hydrofóbní látky. (rozpouštědla: metanol, aceton, DMSO). 27
Výluh pevných vzorků
H O H
• Ve zhomogenizovaném vzorku se stanoví obsah sušiny při 105°C. • V dobře uzavřené skleněné lahvi se 100 g vzorku nechá 24 hodin třepat v 1 l destilované vody v překlopné třepačce. • Pak se ze směsi oddělí pevná fáze filtrací na filtračním papíru s velikostí pórů 5 m (0,45 m). • Takto získaný vodní výluh se skladuje při teplotě 4°C po dobu maximálně jednoho měsíce.
• Volba pH výluhu ovlivní druh vyluhovaných látek i jejich výslednou toxicitu • Existují systémy extrakčních pufrů, které stejný vzorek vyluhují při plynule se měnícím pH gradientu od pH 2 do 12.
28
Předúprava pevných vzorků pro aquatické testy • Vysoušení vzorku – Toxikologická data jsou vztažena na hmotnost zeminy. – Je třeba precisně dodržovat vlhkost vzorku. – Obvykle se vysušuje v proudu vzduchu při laboratorní (pokojové) teplotě • Homogenizace vzorku • Míchání • Mletí a drcení na požadovanou jemnost (pozor na teplotní změny)
29
Předúprava - shrnutí • Předúprava vzorku zásadním způsobem ovlivňuje výsledná data z biotestů. • Metodika použité předúpravy vzorku musí být volena s ohledem na: – výslednou interpretaci zjištěných dat – účel provedené analýzy (chemická analýza) • Podrobná specifikace provedené předúpravy by měla být součástí zprávy o biotestu.
30
Limitní test • V předběžném testu se vzorek (původní – neředěný) o neznámé toxicitě podrobí první zkoušce s testovacími organizmy. • Jde o to, zjistit, zda látka vykazuje toxické účinky či nikoliv. • Obvykle se používají dvě paralelní nasazení se dvěma kontrolami. • Nedojde-li k úhynu žádného organismu nebo není-li pozorována inhibice růstu, je předběžný test hodnocen jako negativní a přistoupí se k ověřovacímu testu. • V opačném případě se provádí orientační test.
31
Ověřovací test • Negativní výsledek předběžného testu se ověřuje v šesti paralelních nasazeních, kdy se opět testuje původní, neředěný vzorek. • Nedojde-li v testovaných roztocích k úhynu o 10% převyšující úhyn v kontrole (lépe t-resty), je i zde výsledek hodnocen jako negativní. Další testování se neprovádí. (stará metodika hodnocení odpadů) • Je-li výsledek pozitivní, úhyn v testovaném vzorku převýší o více než 10% úhyn v kontrole, záleží další postup na míře účinku. • V případě mortality nižší 50% se další testy neprovádějí a zjištěné skutečnosti se zaznamenají do protokolu.
• Překročí-li mortalita 50%, přistupuje se k orientačnímu testu. 32
Orientační test • Účelem testu je určení rozmezí, ve kterém lze očekávat hodnotu EC50 (LC50,IC50) testované látky.
• Používá se zde zpravidla 10 koncentrací vodného výluhu, volených v širokém rozpětí. • Do tohoto testu se nasazuje menší počet pokusných organismů. • Cílem je zjistit nejvyšší koncentraci látky, při které ještě nedochází k úhynu či imobilizaci organizmů a nejnižší koncentraci, která již působí letálně.
33
Volba testovaných koncentrací
100 90
Předpokládaný úhyn, %
80 70
Působí letálně
Nepůsobí toxicky
60 50 40 30
Odhad EC50
20 10 0
OC0
OC100 vzrůstající log koncentrace
34
Základní test • Základní test slouží k určení hodnoty EC50 (LC50, IC50) případně dalších toxikologických indexů. • Test sestává zpravidla ze sedmi různých koncentrací geometrické posloupnosti v rozmezí stanoveném orientačním testem. • Ředění se provádí tak, aby kolem předpokládané hodnoty EC50, IC50 došlo k úhynu nebo imobilizaci 5 - 95 % organizmů ve třech či více ředěních. • Pro každou koncentraci se nasazují 2 - 3 paralelní nasazení. • Na začátku i konci pokusu se zaznamenává teplota, koncentrace rozpuštěného kyslíku a pH v každé testované koncentraci.
35
Použití standardních toxikantů • Průběžné testování kvality a citlivosti testovacích organismů
Příklad hodnot pro ryby P. reticulata Standard Průměrná hodnota EC50 (mg.l-1) Rozpětí EC50 (mg.l-1)
ZnSO4 . 7 H2O 174
K2Cr2O7 180
p-nitrofenol 28
130 – 240
130 - 240
20 - 30
36
Ředicí řady • Pro kvalitní výsledek experimentu záleží na správné volbě testovaných koncentrací. • Testované koncentrace by měly zahrnovat koncentraci letální i takovou, jež nevykazuje toxické účinky. • Optimální koncentrační řada má jednu koncentraci blízkou EC50 a koncentrace s nižší a vyšší odezvou má rozmístěné okolo této hodnoty symetricky. • Ředicí řada by měla být geometrická s koeficientem ředění obvykle od 10 do 2. Pro určité typy vzorků je vhodné volit koeficient ředění z intervalu (1; 2).
• Koncentrace by měly být odstupňovány v řadách například: – 1:10, 1:100, 1:1000, 1:10000, 1:100000 pro látky s plochou závislostí odezvy na koncentraci (některé druhy pesticidů). Koeficient ředění 10. – 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32 pro látky se strmou závislostí odezvy na koncentraci (výluhy zemin, detergenty). Koeficient ředění 2. 37
Pracovní roztoky • Při snaze docílit co nejlepší shody mezi různými pracovišti, je nezbytné dodržovat stejné zásady přípravy pracovních roztoků. • Prostředí, ve kterém se testovací organizmy vyskytují velkou měrou ovlivňují jejich kondici a tedy i citlivost ke zkoumané látce. • Pracovním roztokem (mediem, zřeďovací vodou) rozumíme laboratorně připravenou vodu jež má optimální vlastnosti pro chov testovacího organizmu. • Připravuje se nadávkováním předepsaných koncentrací anorganických solí, případně dalších látek do redestilované vody – zajištění vhodných podmínek pro život testovacích organismů – Kromě vody redestilované lze použít vodu destilovanou ze skleněné aparatury či vodu deionizovanou. • Zřeďovací voda pro testy na rybách, perloočkách a semenech dle normy ISO 7346. 38
Příklady složení laboratorních živných roztoků • Ryby, perloočky, semena hořčice:
• Chlorokokální sladkovodní řasy
• • • •
• • • • • •
CaCl2 . 2H2O MgSO4.7H2O NaHCO3 KCl
NaNO3 Ca(NO3)2 . 4H2O K2HPO4 MgSO4 . 7H2O Na2CO3 Fe-EDTA a Gaffronův roztok
39
Experimentální určování toxicity Testy toxicity a jejich členění
Vladimír Kočí Ústav chemie ochrany prostředí, VŠCHT Praha
Cíl vývoje v oblasti testů toxicity •
Vyvíjet takové metody, které umožňují sledovat nepříznivý vliv látek na živé organizmy za standardních reprodukovatelných podmínek.
Metody musí umožnit srovnání účinků různých látek různých organizmů mezi sebou a především srovnání odpovídajících výsledků z různých laboratoří.
41
Základní principy a předpoklady testů toxicity
• Reprodukovatelnost • Standardní uspořádání • Možnost přenášet získané informace na přírodní společenstva • Ekonomická dostupost • Časová přijatelnost
42
Biotest • Biotest lze definovat jako experiment, při němž je testovací systém (tkáně, organizmus, populace apod.) exponován v přesně definovaných podmínkách různými koncentracemi zkoumané chemické látky nebo směsného či přírodního vzorku. • Ekotoxikologické biotesty jsou pak takové biotesty, které pro stanovení sledovaného jevu využívají detekční systémy (organizmy, tkáně apod.), které jsou relevantní (umožňují interpretaci, mají dostatečnou výpovědní hodnotu apod.) pro sledované ekosystémy či složky životního prostředí (vodní, půdní ekosystémy, chemické látky, odpady apod.)
43
Členění testů toxicity • Dle doby expozice – Akutní – Semiakutní (semichronické) – Chronické • Dle pokročilosti designu testovacího systému (také 3 generace biotestů) – 1. generace - klasické (standardní) – 2. generace - mikrobiotesty – 3. generace - biosenzory, biosondy a biomárkry
44
Mikrobiotesty - miniaturizované testy • • • • • •
Důvody jako vždy ekonomické. Úspora Času Místa Práce 1. Dávkování Chemikálií testovaných látek 2. Inkubace organizmů 3. Expozice
45
Členění testů toxicity • Dle trofické úrovně testovacích organizmů – Producenti – Konzumenti – Destruenti • Dle testované matrice – Voda – Půda – Vzduch – Sediment – Odpad – Chemická látka
46
Členění testů toxicity • Dle počtu druhů testovacích organismů – jednodruhové (Single Species) – vícedruhové (Multi Species) s přírodními populacemi i laboratorními směsmi kultur • Dle typu testovaného vzorku – čisté chemické látky (hydrofilní, hydrofobní, těkavé) – směs látek (známých i neznámých) – přírodní vzorky (většinou neznámé, směsné, s neznámými interakcemi - nejsložitější interpretace)
47
Členění testů toxicity • Dle způsobu přípravy vzorku – definované koncentrace chemických látek – testování výluhů přírodních vzorků (extrakce org. rozpouštědly, DMSO, vodou, různé pH, teplota atd.) – přímé testy (Direct Tests, Solid Phase Tests, Whole Effluent etc.) – srovnávací testy sorbčních matric (triolein z SPMD membrán),
• Dle stupně komplexnosti detekčního systému – enzymy (biomárkry, biosondy) – buněčné a tkáňové kultury in vitro – intaktní živý organismus – Populace – Společenstvo (mikro/mezo kosmos) – terénní (polní) experimenty
48
Schematické znázornění biotestů na různé organizační úrovni Ekosystémy Změny společenstva Populační změny Intaktní organismus Fyziologické změny Biochemické změny Toxikant
Nárůst doby projevu (nepříznivé odpovědi) Nárůst obtížnosti korelace projevů s původním chemickým toxikantem Stoupající závažnost
49
Členění testů toxicity • Dle způsobu vyhodnocování – letální efekty (mortalita, imobilizace) – subletální efekty (chování organizmů – např. rychlost a směr pohybu) – hodnocení fyziologické aktivity (fotosyntetické asimilace, enzymatická aktivita, efekty na membránách, přírůstky – délka kořene, počet buněk v populaci, nebo hmotnost organizmu, náchylnost k napadení chorobami, škůdci či parazity apod.) – reprodukční aktivita, malformace a teratogenita atd. • Speciální testy pro konkrétní účinky – trofie – mutagenita/genotoxicita – teratogenita – embryotoxicita – reprodukční testy 50
Baterie testů • Praxe si žádá rychlé testy. – Je však nutno mít stále na zřeteli, že u expozičních testů je spolehlivý pouze pozitivní výsledek, tj. nález toxicity. – Negativní nález pouze znamená, že se toxicita může projevit až po delším čase, tj. až růstovým testem. • Z podobných důvodů je spolehlivější bateriový test který užívá souboru různých organismů (bakterie, řasa, dafnie, rybky, kořeny hořčice, atd.) nežli test na jediném organismu.
51
Členění testů toxicity • Expoziční testy – testovaný organismus se ve zkoušené látce či vzorku nemnoží – výsledek testu není tedy přírůstek počtu organismů ve srovnání s kontrolou. – Expoziční testy jsou rychlé. Využívají ovlivnění fotosyntézy, syntézy ATP, zastavení pohybu bičíků či drkání sinic atd. – Např.: Testy mortality na rybách, imobilizace perlooček, bioluminiscence fotobaktérií.
• Růstové testy – Růstový biotest je nejspolehlivějším kriteriem pro stanovení toxicity či úživnosti – Reprodukční proces je nejcitlivějším, kritickým momentem v životním cyklu všech organismů – Pokud je testovací organismus schopen se v testovaném vzorku úspěšně rozmnožovat alespoň tři generace, pak je velmi pravděpodobné, že tuto látku bude snášet trvale. – Např.: Řasové testy, test reprodukce perlooček, klíčivost semen rostlin. 52
Historické biotesty
53
Oscillatoria test podle Práta: Pohyb sinice Oscillatoria může být inhibován přítomností toxické látky. PRÁT et POSPÍŠIL navrhli tento princip pro biotest. Oscillatoria je naočkována, jako obří kolonie do středu agarové či sádrové plotny s živným roztokem a testovanou látkou. Rozšiřování sinice je možno i měřit jako průměr kolonie. Test je poměrně rychlý, již v řádu hodin jsou změny viditelné.
54
Cladophora test podle Cyruse • Velmi jednoduchý test toxicity navrhl Z.CYRUS (1954). • Do koncentrační řady vzorků ve zkumavkách umístil na dno malé chomáčky řasy Cladophora a exponoval na světle. Ve zkumavkách, kde koncentrace toxické látky byla neškodná chomáčky vyplavaly na hladinu díky bublinkám kyslíku, které byly výsledkem fungující fotosyntézy. • Nevýhodou tohoto je, že řasa Cladophora sbíraná v přírodě nezaručuje standardnost a je k dispozici jen v létě. Obě nevýhody by bylo možno vyřešit použitím kultury, problémem však zůstává kvantifikace výsledků. 55
Test s bromthymolovou modří • LUSSE a SOEDER navrhli využít změn pH, které provází fotosyntézu.
• Vzorky jsou inokulovány testovacím fotosyntetizujícím organismem v koncentraci min. 2,5 milionu buněk/ml a je přidána bromthymolová modř v koncentraci max. 20 mg/l. • Po expozici na světle u neškodných vzorků stoupá pH a tím se mění barva bromthymolové modři: Žlutá > zelená > modrá.
56
Standardní testy toxicity
Sada biotestů v legislativní současnosti: řasy, rostliny, zooplankton, ryby, (bakterie)
57
