Obecná toxikologie - zjišťování toxicity, informační zdroje a testy toxicity, legislativa
Základy toxikologie a ekologie Marek Šír
[email protected]
Základní zdroje dat Pozorování jedinců vystavených účinku toxické látky Epidemiologické studie – vystavení toxické látce v pracovním prostředí, životním prostředí, v důsledku stravovacích návyků/životního stylu, v důsledku průmyslových havárií Klinické studie - záměrná kontrolovaná expozice dobrovolníků Testy toxicity – záměrné vystavení účinku toxické látky: • In vitro – v moderní toxikologii nejvýznamnější zdroj poznatků, na biomolekulách, buněčných preparátech (leukocity, jaterní buňky), s využitím jednoduchých organismů (bakterie, prvoci, červi) • In vivo – pokusy v živém organismu, na zvířatech (myši, potkani, králíci) (Zákon č. 246/1992, Zákon na ochranu zvířat proti týrání, část třetí – Ochrana pokusných zvířat) • Ex vivo – mimo živý organismus, např. na tkáních z poraženého dobytka • (In silico) – SAR, QSAR
Vztah dávky a odpovědi Systémový účinek závisí přímo na absorbované dávce Typy dávek: • Dávka podaná • Dávka absorbovaná – je dána biologickou dostupností, může nabývat 0 – 100% hodnoty dávky podané. Absorpce kriticky závisí na cestě do organismu Dávka se obvykle udává v mg / kg (hmotnost toxické látky / hmotnost organismu). Základní cesty vstupu látky do organismu: • Vdechnutím • Požitím • Přes kůži • Intravenosně Typy odpovědí: • kvantální (binární) (jev se vyskytne / nevyskytne, např. smrt, spánek) • stupňovitá (např. inhibice určitého enzymu, úbytek svalové hmoty, změna krevního tlaku)
Závislost účinku na dávce – jednorázová expozice
podíl odpovědí %
100
• Kumulativní závislost, procentuální podíl jedinců, u kterých se projevil účinek
log D
podíl odpovědí %
• Diferenciální závislost, frekvence účinku, na vrcholu křivky se účinek projeví u 50% jedinců
log D
Závislost účinku na dávce – jednorázová expozice Tvar křivky vychází z receptorové teorie:
Pojmy:
S+R
• •
ED50 – střední efektivní dávka (efekt obecně) ID50 – střední inhibiční dávka (inhibice enzymu) TD50 - střední toxická dávka LD50 – střední letální dávka
• •
TI – terapeutický index TI = LD50 / ED50
•
Důležitý parametr ve vztahu k lékům, čím je větší hodnota TI, tím je větší rozpětí bezpečnosti dané látky.
k2
E – účinek, podíl odpovědí (bezrozměrný) [S] – konc. substrátu [R] - konc. molekul receptoru [SR] – konc. komplexu k – rychlostní konstanta
SR
E = k1[S] / (k2 + k1[S])
ED
Podíl odpovědí %
•
k1
ED10
ED50
Log D
Testy in vitro Požívá testování na zjednodušených modelech (biomolekuly, subcelulární preparáty, buněčné preparáty, izolované orgány), testování na nižších organismech. Potřeba testů in vitro vychází ze základní strategie 3R: • • •
Replacement (nahrazení): metody in vitro mimo živý organismus, tzn. alternativa bez použití pokusných zvířat Reduction (redukce): snížení počtu pokusných zvířat Refinement (zmírnění): upravené metody experimentování
Přináší informace zejména o: • • •
Interakci toxická látka – receptor Biochemickém mechanismu účinku Genotoxicitě na buněčné úrovni
Naopak nelze získat informace o: •
Toxokinetice, systémových účincích, orgánové toxicitě
Příklady • Test na nitěnkách (Tubifex tubifex) – rychlý orientační test toxicity látek rozpustných ve vodě • Amesův test na bakteriích Salmonella typhimurium – test mutagenity
Testy akutní toxicity in vivo Stále nezbytná součást metod experimentální toxikologie Použití: • Klasifikace látek podle toxicity, např. testování silně toxických léčiv Princip: • Zjišťuje se závislost akutního účinku na jednorázové dávce testované látky • Nejčastěji zjišťován letální účinek – mortalita • Medián letální dávky – LD50, medián letální koncentrace LC50 • • •
Minimálně 3 dávky – pod, blízko a nad očekávanou LD50 Poté 2 týdny sledování – období latence, sledovány další zjevné toxické projevy Testování nejčastěji na hlodavcích, skupiny mezi 5 – 10 jedinci
•
Problém – mnohdy obtížně přenositelné na jiné druhy (člověka)
5 zvířat 5 mg/kg
A
T+
B
T+
C
5 zvířat 50 mg/kg
A
T+
B
T
C
5 zvířat 300 mg/kg
A
T
B
Xn
Metoda fixní dávky A – alespoň 2 zvířata uhynou B – uhyne 1, nebo 1 zjevné známky toxicity C – žádné neuhyne ani známky toxicity
T + - vysoce toxické T – toxické Xn – zdraví škodlivé N – neklasifikované podle toxicity
Použití: • Klasifikace látek podle toxicity
C
5 zvířat 2000 mg/kg
A
Xn
B
N
C
N
Princip: Stupňovité dávkování toxické látky a sledování odpovědi (smrt, zjevné známky toxicity) • • •
Menší počet zvířat Neumožňuje stanovit LD50 Neměří kvantitativně míru toxicity
podíl odpovědí %
Subchronické testy in vivo
NOAEL
Práh účinku
log D
•
Posuzování bezpečnosti léčiv, potravinových aditiv, pesticidů
• •
Subakutní 2 - 4 týdny Subchronické 14 - 90 dní
•
Min. 3 dávkové hladiny, 1 neexponovaná skupina, někdy pozitivní kontrola, skupin 10 – 20 zvířat
•
Nejvyšší hladina max. 10% úhyn
•
Měření odpovědí – ztráta (přírůstku) hmotnosti, biochemické parametry, aktivity enzymů
LOAEL
NOAEL (no observed adverse effect level) – nebyl pozorován účinek LOAEL (the lowes observed adverse effect level) – nejnižší dávka, kdy byl účinek pozorován
podíl odpovědí %
Chronické testy in vivo •
Stanovení dlouhodobého působení látek na organismus, posuzování kumulativních účinků
•
Opakované dávky po dobu dospělého života (u myši 6 měsíců, u potkana 2 roky)
•
Podávána maximální tolerovaná dávka (MTD) ze subchronického testu (slabý pokles hmotnosti), 1/2 MTD, 1/4 MTD, neexponovaná skupina
•
Kontrolní populace – nutná pro srovnání, i v kontrole určité % odpovědí bez expozice látce
% odpovědí v kontrolní populaci
log D NOAEL
Práh účinku
LOAEL
LOAEL – nejnižší dávková hladina, při které je podíl odpovědí statisticky odlišný od kontrolní populace
Prahový model Předpokládá se, že pro danou látku existuje práh účinku, tzn. existuje bezpečná prahová dávka, pod níž je účinek nulový. Základní převedení dat z pokusných zvířat na člověka podle: • Tělesné hmotnosti m • Velikost povrchu těla S (S = k m2/3) • Energetických nároků EN (EN = k m3/4) (k – konstanta úměrnosti) Přípustná denní dávka (ADI – acceptable daily intake): • Při opakované expozici po celou dobu života představuje zanedbatelné nebo žádné riziko, odvozuje se z NOAEL
ADI = NOAEL / (UF.MF) UF (faktor nejistoty, uncertainty factor) – hodnoty 1-10, popisuje nejistoty při převodu hodnot ze zvířete na člověka, variabilitu mezi lidmi, nejistotu při převodu LOAEL na NOAEL MF (modifikační faktor, modifying factor) – hodnoty 0<MF<10, zahrnuje nejistoty při statistickém vyhodnocení dat z různých typů studií
Inhalační expozice Nejvýznamnější nezamýšlená expozice toxickým látkám Stanovení absorbované dávky: Di = R Vinh cinh t R = (cinh – cexh) / ci D – absorbovaná dávka, cinh (cexh) – koncentrace látky ve vdechovaném (vydechovaném) vzduchu, t – doba inhalace, R – retence látky v plicích Retence pro páry organických látek v plicích se běžně pohybuje mezi 50 – 90%. Nařízení č. 361/2007 Sb. stanovuje podmínky ochrany zdraví při práci: • NPK – nejvyšší přípustná koncentrace – koncentrace látky, která nesmí být v žádném časovém okamžiku překročena • PEL – přípustný expoziční limit – průměrná koncentrace látky za určité časové období nesmí překročit PEL
Minutové objemy vzduchu (l/min) prošlého plícemi: spánek: 6, •lehká práce: 20, •střední práce: 20-40, těžká práce: 40-60
Příklad Látka
NPK - P (mg/m3)
PEL (mg/m3)
Imisní limit (mg/m3)
benzen
10
3
0,005
ethanol
3000
1000
-
Expozice kontaktem s kůží a požitím Přes kůži: V pracovním prostředí nezanedbatelná možnost expozice Stanovení přenosu přes kůži: J = Kp.c J – tok látky jednotkovou plochou kůže, Kp – permeabilita kůže (rozhodující je permeabilita zrohovatělé vrstvy stratum corneum, c – koncentrace látky Příklad: J (methanol) = 11,5 mg/cm2/h – možnost oslepnutí/úmrtí v důsledku kontaktu s kůží Požití: V pracovním prostředí – nehody. V běžném životě mohou toxické látky vstupovat do těla s kontaminovanou potravou a vodou + nutno brát v úvahu pojídání půdy/prachu/strkání předmětů do úst u dětí. US EPA definuje průměrné a maximální hodnoty příjmu potravy, pitné vody a další veličiny pro stanovení míry expozice.
Příklad Látka
Odhad průměrné hodnoty
Pitná voda
1,4 l za den (dospělí), 1 l za den (děti)
Zelenina
200 g za den
Půda / prach (vstup ústy)
100 mg za den (dospělí), 200 mg za den (děti)
Biologické monitorování Nepřímé určení absorbované dávky nebo její odezvy v organismu pomocí vnitřního ukazatele. • Indikátorem expozice je – samotná látka, metabolit, produkt reakce s biomolekulami, biochemický parametr
• Biologický expoziční limit (BEL) – limitní hodnota, vychází z epidemiologických studií nebo z PEL • Požadavky na biologický indikátor expozice – dostatečná citlivost k podchycení reálných expozic, neinvazivnost odběru vzorku, specifičnost pro určitou látku, znalost kvantitativní závislosti
Škodlivá látka
Biologický indikátor
BEL
Vzorek
toluen
hippuronová kyselina
1600 mg/g kreatininu
moč, konec směny
Testy karcinogenity in vivo Použití: • identifikace látek, které vyvolávají novotvary (benigní a maligní nádory) a získat tak podklady pro stanovení přijatelných denních dávek (ADI) těchto látek a stanovení bezpečných limitů expozice Princip: • Zjišťuje se frekvence výskytu novotvarů v závislosti na dávce
•
Nutné velké množství zvířat, myš, potkan, skupiny nejméně 100 zvířat (50 samců, 50 samic), často speciální kmeny – transgenické myši – např. s nedostatečně aktivními nebo nefunkčními opravnými mechanismy DNA
•
3 – 4 dávkové hladiny, MTD, 1/2MTD, 1/3MTD, 1/4MTD
•
Testovaná látka se podává dlouhodobě, obvykle po celou dobu života zvířete
Amesův test Slouží ke stanovení mutagenního a karcinogenního potenciálu chemických sloučenin. Vhodný pro přímé karcinogeny, nedokáže rozpoznat karcinogenitu látek, které jsou aktivovány až metabolizmem (prokarcinogeny). Několik kmenů bakterie Salmonella typhimurium – mutace v genech účastnících se syntézy aminokyseliny histidinu - vyžadují tedy externí zdroj histidinu. Sleduje se schopnost testované látky způsobit reverzní mutaci a obnovit růst bakterie v mediu bez přídavku histidinu.
Potenciální mutagen Jaterní enzymy
Vysoký počet změněných bakterií (his- na his+) udává, že látka způsobuje mutace inkubace
Média s minimálním množstvím histidinu inkubace kmeny Salmonella (vyžadující zdroj histidinu)
Kontrola
Bezprahový model Předpokládá, že pro danou látku neexistuje práh účinku – neexistuje tedy koncentrace látky, která by nezpůsobovala biologickou odezvu. Bezprahový účinek se předpokládá u např. genotoxických karcinogenů, tzn. že teoreticky jediná molekula látky může vyvolat rakovinu.
Při hodnocení rizika se vychází z tzv. VSD – virtualy safe dose (zdánlivě bezpečná dávka). Ta je dána konceptem Risk De-minimis (minimální možné riziko): Riziko, které je pod hranicí společenského zájmu • Případně riziko pod detekční schopností metod, které by bylo možné používat k jeho kontrole • Jako přípustná míra rizika se obvykle volí hodnota 1 . 10-6 (akceptovaná agenturami pro ochranu zdraví a životního prostředí (EPA, FDA apod.). V populaci 1 000 000 osob se vyskytne během lidského života (70 let) 1 případ rakoviny navíc v důsledku expozice látce. Extrapolace experimentálních dat (z pokusů na zvířatech, epidemiologických studií) k velmi nízkým hladinám – řada farmakokinetických / toxokinetických modelů, Nejjednoduší je lineární extrapolace k nulové hodnotě, nicméně obvykle se jedná o značně nelineární závislost.
Klasifikace karcinogenů • Legislativa EU – Direktiva 67/5448/EHS • Mezinárodní agentura pro výzkum rakoviny (IARC – International Agency for the Research on Cancer) • Americký vládní Národní toxikologický program (NTP, National Toxicology Program) • Americká agentura pro ochranu životního prostředí (US EPA, United States Environmental Protection Agency) • Organizace spojených národů – Globálně harmonizovaný systém klasifikace a označování chemikálií (GHS, Globally Harmonized Systém of Classification and Labeling of Chemicals)
Klasifikace karcinogenů • EU – 3 kategorie
• IARC – 5 skupin
1 – Prokázané lidské karcinogeny 2 – Podezřelé lidské karcinogeny 3 – Látky, které nejsou zařaditelné mezi karcinogeny
1 – Karcinogenní pro člověka 2A – Pravděpodobně karcinogenní pro člověka 2B – S potenciálním karcinogenním účinkem pro člověka (možné lidské karcinogeny) 3 – Nejsou klasifikovatelné jako lidské karcinogeny 4 – Pravděpodobně nekarcinogenní pro člověka
• US EPA - 5 skupin A – E, (B1 a B2), + také podrobnější slovní hodnocení
• NTP- 2 kategorie
• GHS - 2 skupiny (1. má 2 podskupiny)
Látka
EU
IARC
NTP
US EPA
vinylchlorid
1
1
A
A
azbest
1
1
A
B2
chloroform
3
2B
B
B2
Ethanol
neklasifikován
1
neklasifikován
neklasifikován
Predikční metody • • • •
SAR, QSAR – (quantitative structure-activity relationship) Kvantitativní vztah mezi strukturou a biologickou aktivitou – nejčastěji využíván v počátečním stádiu navrhování nových léčiv Farmakofor – ve farmacii označení pro strukturní fragment v molekule spojený s určitou biologickou aktivitou Toxikofor – odpovědný za toxické účinky (nitroareny, halogenalkeny, aromatické aminy…)
2-fenylethylamin: seskupení v endogenních neurotrasmiterech, budivých aminech a opiátech, např:
adrenalin
dopamin
methamfetamin
Nejběžnější epidemiologické studie •
•
•
Kohortní – sledování změn ve vybrané skupině exponované určité látce oproti kontrolní skupině, dlouhé časové období, Cíl: srovnání výskytu určitých nemocí, počtu úmrtí v závislosti na úrovni expozice Případové – skupina jedinců s určitou nemocí se srovnává s kontrolní skupinou zdravých jedinců (co nejvíce podobní – věk, pohlaví), Cíl: identifikace rizikových faktorů Průřezové – náhodný výběr, jednorázový sběr dat o zdravotním stavu a úrovni expozice, pak následuje odpovídající vyšetření, Cíl: popsat vztah mezi nemocí a faktory, které ji mohou vyvolat nebo ovlivnit
Tabulka s počty osob z kohortní nebo průřezové studie
Onemocnění
Expozice
Celkem
ANO
NE
ANO
a
b
a+b
NE
c
d
c+d
Celkem
a+c
b+d
n
Riziko onemocnění u exponovaných osob R1 = a/(a+b)
Riziko onemocnění u neexponovaných osob R1 = c/(c+d) Relativní riziko R = [a/(a+b)] / [c/(c+d)]
Klinické studie • Záměrná kontrolovaná expozice dobrovolníků • Státní ústav pro kontrolu léčiv •
V několika fázích, jejichž cílem je získat pro navržený účel použití léku dostatek informací, aby se mohl vyhodnotit poměr mezi jeho prospěchem a riziky:
• I. Fáze představuje studie/klinická hodnocení nejčastěji prováděná na zdravých dobrovolnících. Výzkum na zdravých dobrovolnících se neprovádí, je-li podání látky zdravému člověku vysoce nevhodné (např. u cytostatik). Zjištění – působení v organismu, dávkování pro minimalizaci nežádoucích účinků, od nízkých dávek, NE hodnocení účinnosti léčivého přípravku. • II. Fáze Látka podávána v dané indikaci malému počtu vybraných nemocných (desítky až stovky). Ověřují se léčebné účinky. • III. Fáze Studie s velkým souborem testovaných osob (stovky až tisíce pacientů) – pak žádost o registraci a používání. • IV. Fáze Shromažďování informací.
Informační zdroje - TOXNET • http://toxnet.nlm.nih.gov/ Volně přístupné Informace o toxicitě látek, životním prostředí, lékařství
•
Využívá řadu databází:
TOXLINE – Toxicology Literature On Line DART - Developmental and Reproductive Toxicology Database
HSDB - Hazardous Substances Data Bank CCRIS - Chemical Carcinogenesis Research Information System GENETOX - Genetic Toxicology Data Bank IRIS - Integrated Risk Information System ITER - International Toxicity Estimates for Risk LactMed - Drugs and Lactation Database Household product Database
Zdroje toxikologických dat • Web of Science (WoS) http://apps.webofknowledge.com/ přístupné z VŠCHT Praha, přírodní a technické vědy • Scopus http://www.scopus.com/ přístupné z VŠCHT Praha, široké zaměření – přírodní, technické, lékařské a humanitní vědy • PubMed http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed volně přístupné, medicína, farmakologie • MedScape http://emedicine.medscape.com/ volně přístupné, medicína, toxikologie z pohledu medicíny
Informace o toxicitě • Státní zdravotní ústav – Centrum toxikologie a zdravotní bezpečnosti (CTZB) - toxikologické metody, biomedicína, chemická bezpečnost výrobků, toxikogenomika, + Národní referenční laboratoře a centra (NRL, NRC) • Toxikologické informační středisko (TIS) – Co dělat při akutní otravě – volejte 224 91 92 93 nebo 224 91 54 02 • Klinika pracovního lékařství 1. LF UK a VFN – např. Centrum pracovního lékařství, Laboratoř průmyslové toxikologie – možnost vyšetření biologického materiálu
Zákon 350/2011 Sb o chemických látkách a chemických směsích a o změně některých zákonů (chemický zákon) • Upravuje práva a povinnosti právnických osob a podnikajících fyzických osob při výrobě, klasifikaci, zkoušení nebezpečných vlastností, •
balení, označování, uvádění na trh, používání, vývozu a dovozu chemických látek (a směsí) Definuje vlastnosti látek a směsí a skupiny nebezpečnosti:
•Výbušné •Oxidující •Extrémně hořlavé •Vysoce hořlavé •Hořlavé
•Vysoce toxické •Toxické
•Karcinogenní – 3 kategorie dle EU
•Zdraví škodlivé
•Mutagenní
•Žíravé
•Toxické pro reprodukci
•Dráždivé
•Nebezpečné pro životní prostředí
•Senzibilizující Výrobce, dovozce nebo následný uživatel, který uvádí na trh látku nebo směs, ji v závislosti na intenzitě jejích nebezpečných vlastností při klasifikaci zařazuje do jedné nebo více skupin nebezpečnosti.
Nařízení (ES) č. 1272/2008 o klasifikaci a označování látek a směsí = nařízení CLP (classification, labelling and packaging) Nařízení CLP je právně závazné ve všech členských státech EU. Je přímo použitelné, většinou implementované do vnitrostátních právních předpisů GHS (Globálně harmonizovaný systém) - mezinárodní harmonizaci kritérií klasifikace látek a směsí Pokud je látka klasifikována jako nebezpečná informují výrobci, dovozci a následní uživatelé o nebezpečnosti prostřednictvím označení (např. štítek) • • • • • • • •
Povinné údaje: a) jméno, adresa, tel. číslo dodavatele b) jmenovité množství látky c) identifikace výrobku d) výstražné symboly e) signální slova f) standardní věty o nebezpečnosti g) pokyny pro bezpečné zacházení
Nařízení (ES) č. 1272/2008 • •
H – věty (standardní věty o nebezpečnosti) P – věty (pokyny pro bezpečné zacházení
Do 1. 6. 2015 - Vyhláška č. 402/2011, R – věty: standardní věty označující specifickou rizikovost a S – věty: standardní pokyny pro bezpečné zacházení.
Výstražné symboly nebezpečnosti podle (ES) č. 1272/2008 Fyzikální nebezpečnost
Nebezpečnost pro zdraví
Nebezpečnost pro ŽP
Bezpečnostní listy Material Safety Data Sheets (MSDS) Pokud je daná látka klasifikována jako nebezpečná podle nařízení (ES) č. 1272/2008, je povinností osoby (výrobce i dovozce), která uvádí látku na trh, vypracovat Bezpečnostní list (u nás např. Penta, Sigma-Aldrich)
Skládá se z několika oddílů – Identifikace látky/směsi a společnosti, Identifikace nebezpečnosti, Složení/Informace o složkách, Pokyny pro první pomoc, Opatření pro hašení požáru, Opatření v případě náhodného úniku, Zacházení a skladování, Osobní ochranné prostředky, Fyzikální a chemické vlastnosti, Stálost a reaktivita, Toxikologické informace, Ekologické informace, Pokyny pro odstraňování, Informace o přepravě, Informace o předpisech
Další informační zdroje • US EPA (U.S. Environmental Protection Agency) - Protects Our Health, Environment & Economy http://www.epa.gov Rozsáhlé studie: např. EPA-823-R-01-001 - Water Quality Criterion for the Protection of Human Health: Methylmercury – 303 stran • US FDA (U.S. Food and Drug Administration) - Protecting and Promoting Your Health http://www.fda.gov/
• WHO- World Health Organization IPCS - International Programme on Chemical Safety http://www.who.int/ipcs/en/ Vliv chemických látek na lidské zdraví, hodnocení rizika, posílení chemické bezpečnosti, management • Evropská Agentura pro bezpečnost a ochranu zdraví při práci https://osha.europa.eu/cs
Knihy o toxikologii
Články – WoS, Scopus, PubMed
Bezpečnostní listy (MSDS) H – věty P - věty
Databáze - TOXNET
Hg
IARC, NTP, US EPA, GHS
SZÚ, TIS, Klinika pracovního lékařství
Aktuální Studie (WHO, IPEN, NGOs, BRI)
PEL, NPK, NPK-P Zákon 350/2011 Sb Nařízení (ES) č. 1272/2008 Nařízení vlády 361/2007 Sb.
RfD, ADI, TDI, ARfD
Testy toxicity
