Zjišťování toxicity
Základy toxikologie a ekologie Marek Šír
[email protected]
Souhrn • Závislost účinku na dávce • Od akutní přes chronickou toxicitu po testy karcinogenity – experimentální toxikologie • Zdroje dat, legislativa, expoziční limity, analýza rizika • Expozice toxickým látkám v běžném životě
Závislost účinku na dávce podíl odpovědí %
• Kumulativní závislost • Diferenciální závislost
log D
• Hormeze a homeostáze
podíl odpovědí %
• Práh účinku • Opakovaná expozice log D
Testování toxicity • In vitro – v moderní toxikologii nejvýznamnější zdroj poznatků, na biomolekulách, buněčných preparátech, s využitím jednoduchých organismů (bakterie, prvoci) • In vivo – pokusy v živém organismu, na zvířatech • Ex vivo – mimo živý organismus, např. na tkáních z poraženého dobytka • (In silico) – SAR, QSAR
Testy akutní toxicity • • • •
Cíl – zjistit závislost akutního účinku na dávce testované látky Nejčastěji letální účinek – mortalita Medián letální dávky – LD50, medián letální koncentrace LC50 Tvar křivky – v závislosti na obsazenosti receptoru
S+R
k1 k2
SR
Stanovení LD50, LC50 • • •
Minimálně 3 dávky – pod, blízko a nad očekávanou LD50 Poté 2 týdny sledování – latence, další projevy Testování nejčastěji na hlodavcích, skupiny mezi 5 – 10
• •
Účel - klasifikace látek podle toxicity, např. pro silně toxické léčiva Problém - přenesení na jiné druhy (člověka)
5 zvířat 5 mg/kg
A
T+
B
T+
C
5 zvířat 50 mg/kg
A
T+
B
T
C
5 zvířat 300 mg/kg
A
T
B
Xn
Metoda fixní dávky A – alespoň 2 zvířata uhynou B – uhyne 1, nebo 1 zjevné známky toxicity C – žádné neuhyne ani známky toxicity
T + - vysoce toxické T – toxické Xn – zdraví škodlivé N – neklasifikované podle toxicity
C
5 zvířat 2000 mg/kg
A
Xn
B
N
C
N
• • • •
Pro klasifikaci látek podle toxicity Šetrnější na počet zvířat Neumožňuje stanovit LD50 Neměří kvantitativně míru toxicity
podíl odpovědí %
Subchronické testy
NOAEL
Práh účinku
log D
• •
Subakutní 2 - 4 týdny Subchronické 14 - 90 dní
•
Min. 3 dávkové hladiny, 1 neexponovaná skupina, někdy pozitivní kontrola, skupin 10 – 20 zvířat
•
Nejvyšší hladina max. 10% úhyn
•
Měření odpovědí – ztráta (přírůstku) hmotnosti, biochemické parametry, aktivity enzymů
•
Posuzování bezpečnosti léčiv, potravinových aditiv, pesticidů
LOAEL
NOAEL (no observed adverse effect level) – nebyl pozorován účinek LOAEL (the lowes observed adverse effect level) – nejnižší dávka, kdy byl pozorován
podíl odpovědí %
Chronické testy •
Cíl – stanovení dlouhodobého působení látek, kumulativních účinků
•
Opakované dávky po dobu dospělého života myši (6 měsíců), potkana (2 roky)
•
Maximální tolerovaná dávka (MTD) ze subchronického testu (slabý pokles hmotnosti), 1/2 MTD, 1/4 MTD, neexponovaná skupina
•
Kontrolní populace má zásadní význam
% odpovědí v kontrolní populaci
log D NOAEL
Práh účinku
LOAEL
LOAEL – nejnižší dávková hladina, při které je podíl odpovědí statisticky odlišný od kontrolní populace
Testy karcinogenity • Cíl – identifikovat látky, které vyvolávají novotvary (benigní a maligní nádory) a získat tak podklady pro stanovení přijatelných denních dávek a pro analýzu rizika • Nutné velké množství zvířat, myš, potkan, skupiny nejméně 100 zvířat (50 samců, 50 samic), často speciální kmeny – transgenické myši – např. s nedostatečně aktivními nebo nefunkčními opravnými mechanismy DNA • 3 – 4 dávkové hladiny, MTD, 1/2MTD, 1/3MTD, 1/4MTD
• Problém – poškození buněk v důsledku toxicity vysokých dávek látky
Zákon č. 246/1992 • Zákon na ochranu zvířat proti týrání • ČÁST TŘETÍ – Ochrana pokusných zvířat Zejména: Cíle pokusů eticky opodstatněné a jsou nezbytné. Pokusy mohou být povoleny pouze po ověření, že při současném stavu nelze zajistit poznatky nebo jejich využití jinými metodami nebo postupem. Pokusy se smějí provádět jen v uživatelských zařízeních, kterým bylo Ústřední komisí pro ochranu zvířat uděleno oprávnění, mají potřebné odborně způsobilé pracovníky a zařízení vyhovující pro příslušný druh a množství pokusných zvířat.
Amesův test Slouží ke stanovení mutagenního a karcinogenního potenciálu chemických sloučenin. Několik kmenů bakterie Salmonella typhimurium – mutace v genech účastnících se syntézy aminokyseliny histidinu - vyžadují tedy externí zdroj histidinu. Sleduje se schopnost testované látky způsobit reverzní mutaci a obnovit růst bakterie v mediu bez přídavku histidinu.
Potenciální mutagen Jaterní enzymy
Vysoký počet změněných bakterií (hisna his+) udává, že látka způsobuje mutace inkubace
Média s minimálním množstvím histidinu inkubace kmeny Salmonella (vyžadující histidin)
Kontrola
Klasifikace karcinogenů • Legislativa EU – Direktiva 67/5448/EHS • Mezinárodní agentura pro výzkum rakoviny (IARC – International Agency for the Research on Cancer) • Americký vládní Národní toxikologický program (NTP, National Toxicology Program) • Americká agentura pro ochranu životního prostředí (US EPA, United States Environmental Protection Agency) • Organizace spojených národů – Globálně harmonizovaný systém klasifikace a označování chemikálií (GHS, Globally Harmonized Systém of Classification and Labeling of Chemicals)
Klasifikace karcinogenů • EU – 3 kategorie
• IARC – 5 skupin
1 – Prokázané lidské karcinogeny 2 – Podezřelé lidské karcinogeny 3 – Látky, které nejsou zařaditelné mezi karcinogeny
1 – Karcinogenní pro člověka 2A – Pravděpodobně karcinogenní pro člověka 2B – S potenciálním karcinogenním účinkem pro člověka (možné lidské karcinogeny) 3 – Nejsou klasifikovatelné jako lidské karcinogeny 4 – Pravděpodobně nekarcinogenní pro člověka
• US EPA - 5 skupin A – E, (B1 a B2), + také podrobnější slovní hodnocení
• NTP- 2 kategorie
• GHS - 2 skupiny (1. má 2 podskupiny)
Látka
EU
IARC
NTP
US EPA
vinylchlorid
1
1
A
A
azbest
1
1
A
B2
chloroform
3
2B
B
B2
Ethanol
neklasifikován
1
neklasifikován
neklasifikován
Převod dat, prahový a bezprahový účinek • Převedení dat z pokusných zvířat na člověka: vztažené na tělesnou hmotnost (m), na velikost povrchu těla (S = k m2/3) nebo na energetické nároky (EN = k m3/4). Prahový účinek: lze určit přípustnou denní dávku ADI – acceptable daily intake, zanedbatelné nebo žádné riziko při celoživotní expozici ADI = NOAEL / (UF.MF) UF (uncertainty factor) – faktor neurčitosti, hodnoty 1-10, MF (modifying factor) – modifikující faktor, 0<MF<10 RfD = BMD10 / (UF.MF)
Bezprahový účinek: např. genotoxické karcinogeny Vyjadřuje se statisticky významný nárůst výskytu nádorů, obvykle se volí přípustná míra rizika 1 . 10-6. Extrapolace experimentálních dat k velmi nízkým hladinám – řada matematických modelů
Predikční metody • • • •
SAR, QSAR – (quantitative structure-activity relationship) Kvantitativní vztah mezi strukturou a biologickou aktivitou Toxikofor – nitroareny, halogenalkeny, aromatické aminy… Plánování nových léčiv… 2-fenylethylamin
adrenalin
dopamin
methamfetamin
Epidemiologické studie •
•
•
Kohortní – sledování změn ve vybrané skupině exponované určité látce oproti kontrolní skupině, dlouhé časové období, srovnává se: výskyt určitých nemocí, úroveň expozice, počet úmrtí… Případové – skupina jedinců s určitou nemocí se srovnává s kontrolní skupinou zdravých jedinců (co nejvíce podobní – věk, pohlaví), cíl: identifikace rizikových faktorů Průřezové – náhodný výběr, jednorázový sběr dat o zdravotním stavu a úrovni expozice, pak následuje odpovídající vyšetření, cíl: popsat vztah mezi nemocí a faktory, které ji mohou vyvolat nebo ovlivnit
Onemocnění
Expozice
Celkem
ANO
NE
ANO
a
b
a+b
NE
c
d
c+d
Celkem
a+c
b+d
n
Relativní riziko: R = [a/(a+b)] / [c/(c+d)]
Klinické studie • Záměrná kontrolovaná expozice dobrovolníků • Státní ústav pro kontrolu léčiv •
V několika fázích, jejichž cílem je získat pro navržený účel použití léku dostatek informací, aby se mohl vyhodnotit poměr mezi jeho prospěchem a riziky:
• I. Fáze představuje studie/klinická hodnocení nejčastěji prováděná na zdravých dobrovolnících. Výzkum na zdravých dobrovolnících se neprovádí, je-li podání látky zdravému člověku vysoce nevhodné (např. u cytostatik). Zjištění – působení v organismu, dávkování pro minimalizaci nežádoucích účinků, od nízkých dávek, NE hodnocení účinnosti léčivého přípravku. • II. Fáze Látka podávána v dané indikaci malému počtu vybraných nemocných (desítky až stovky). Ověřují se léčebné účinky. • III. Fáze Studie s velkým souborem testovaných osob (stovky až tisíce pacientů) – pak žádost o registraci a používání. • IV. Fáze Shromažďování informací.
TOXNET • http://toxnet.nlm.nih.gov/ Volně přístupné Informace o toxicitě látek, životním prostředí, lékařství •
Využívá řadu databází:
TOXLINE – Toxicology Literature On Line DART - Developmental and Reproductive Toxicology Database HSDB - Hazardous Substances Data Bank CCRIS - Chemical Carcinogenesis Research Information Systém GENETOX - Genetic Toxicology Data Bank IRIS - Integrated Risk Information Systém ITER - International Toxicity Estimates for Risk LactMed - Drugs and Lactation Database Household product Database
Zdroje toxikologických dat • Web of Science (WoS) http://apps.webofknowledge.com/ přístupné z VŠCHT Praha, přírodní a technické vědy • Scopus http://www.scopus.com/ přístupné z VŠCHT Praha, široké zaměření – přírodní, technické, lékařské a humanitní vědy • PubMed http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed volně přístupné, medicína, farmakologie • MedScape http://emedicine.medscape.com/ volně přístupné, medicína, toxikologie z pohledu medicíny
Informace o toxicitě • Státní zdravotní ústav – Centrum toxikologie a zdravotní bezpečnosti (CTZB) - toxikologické metody, biomedicína, chemická bezpečnost výrobků, toxikogenomika, + Národní referenční laboratoře a centra (NRL, NRC)
• Toxikologické informační středisko (TIS) – Co dělat při akutní otravě – volejte 224 91 92 93 nebo 224 91 54 02
• Klinika pracovního lékařství 1. LF UK a VFN – např. Centrum pracovního lékařství, Laboratoř průmyslové toxikologie – možnost vyšetření biologického materiálu
Zákon 350/2011 Sb o chemických látkách a chemických směsích a o změně některých zákonů (chemický zákon) • Upravuje práva a povinnosti právnických osob a podnikajících fyzických osob při výrobě, klasifikaci, zkoušení nebezpečných vlastností, •
balení, označování, uvádění na trh, používání, vývozu a dovozu chemických látek (a směsí) Definuje vlastnosti látek a směsí a skupiny nebezpečnosti:
•Výbušné •Oxidující •Extrémně hořlavé
•Vysoce hořlavé •Hořlavé
•Vysoce toxické •Toxické
•Karcinogenní – 3 kategorie dle EU
•Zdraví škodlivé
•Mutagenní
•Žíravé
•Toxické pro reprodukci
•Dráždivé
•Nebezpečné pro životní prostředí
•Senzibilizující Výrobce, dovozce nebo následný uživatel, který uvádí na trh látku nebo směs, ji v závislosti na intenzitě jejích nebezpečných vlastností při klasifikaci zařazuje do jedné nebo více skupin nebezpečnosti.
Vyhláška č. 402/2011 o hodnocení nebezpečných vlastností chemických látek a chemických směsí a balení a označování nebezpečných chemických směsí Prováděcí předpis k zákonu 350/2011 Sb Obsahuje obecné postupy pro hodnocení nebezpečných vlastností látky a směsí, popis výstražných symbolů, standardní věty označující specifickou rizikovost a standardní pokyny pro bezpečné zacházení. • R – věty (R 41 – Nebezpečí vážného poškození očí) • S – věty (S 25 – Zamezte styku s očima, S 26 – Při zasažení očí důkladně vypláchněte vodou a vyhledejte lékařskou pomoc) • Zrušena od 1.6. 2015
Nařízení (ES) č. 1272/2008 o klasifikaci a označování látek a směsí = nařízení CLP (classification, labelling and packaging) • Obsáhlý předpis, včetně příloh již přes 2000 stran, mnohokrát novelizován • Nadřazen národním legislativním předpisům • Obsahuje Standardní věty o nebezpečnosti podle nařízení GHS a Pokyny pro bezpečné zacházení
Nařízení (ES) č. 1272/2008 • H318 – Způsobuje vážné poškození očí • P262 – Zabraňte styku s očima, kůží nebo oděvem • P305+P351+P313 – PŘI ZASAŽENÍ OČÍ: Několik minut opatrně oplachujte vodou. Vyhledejte lékařskou pomoc/ošetření
• Výstražné symboly nebezpečnosti Fyzikální nebezpečnost
Nebezpečnost pro zdraví
Nebezpečnost pro ŽP
Bezpečnostní listy • Material Safety Data Sheets (MSDS) Pokud je daná látka klasifikována jako nebezpečná podle nařízení (ES) č. 1272/2008, je povinností osoby (výrobce i dovozce), která uvádí látku na trh, vypracovat Bezpečnostní list (u nás např. Penta, Sigma-Aldrich)
• Skládá se z několika oddílů –
Identifikace látky/směsi a společnosti, Identifikace nebezpečnosti, Složení/Informace o složkách, Pokyny pro první pomoc, Opatření pro hašení požáru, Opatření v případě náhodného úniku, Zacházení a skladování, Osobní ochranné prostředky, Fyzikální a chemické vlastnosti, Stálost a reaktivita, Toxikologické informace, Ekologické informace, Pokyny pro odstraňování, Informace o přepravě, Informace o předpisech
Inhalační expozice • Ventilace plic Di = R Vi ci t R = (ci – ce) / ci
V závislosti na stupni fyzické zátěže. • NPK – nejvyšší přípustná koncentrace • PEL – přípustný expoziční limit • Imisní limity • Nařízení č. 361/2007 Sb. – kterým se stanoví podmínky ochrany zdraví při práci Látka
NPK - P (mg/m3)
PEL (mg/m3)
Imisní limit (mg/m3)
benzen
10
3
0,005
olovo
0,2
0,05
0,00005
ethanol
3000
1000
-
Expozice požitím a expozice kontaktem s kůží Pracovní prostředí X Běžný život US EPA definuje průměrné a maximální hodnoty příjmu potravy, pitné vody a další veličiny pro stanovení míry expozice, ADI, RfD [mg/kg.den] a stanovení míry rizika (např. HQ – hazard quotient a HI – hazard index) HQ = E/RfD
E – průměrná denní absorbovaná dávka (ADD) nebo průměrná celoživotní denní absorbovaná dávka (LADD), resp. chronický denní příjem CDI [mg/kg.den]
Látka
Odhad průměrné hodnoty
Pitná voda
1,4 l za den (dospělí), 1 l za den (děti)
Zelenina
200 g za den
Půda (vstup ústy)
100 mg za den (dospělí), 200 mg za den (děti)
Kombinovaná expozice – např. při užívání vody kontaminované těkavou látkou – ústy, inhalačně (sprchování - teplá voda), přes kůži
Biologické indikátory • Indikátorem expozice je – samotná látka, metabolit, produkt reakce s biomolekulami, biochemický parametr… • Biologický expoziční limit (BEL) – limitní hodnota, z epidemiologické studie, z PEL • Využití - hodnocení expozice z pracovního prostředí • Biologický indikátor – dostatečná citlivost, neinvazivnost odběru, specifičnost, znalost kvantitativní závislosti Škodlivá látka
Biologický indikátor
BEL
Vzorek
toluen
Hippuronová kyselina
1600 mg/g kreatininu
moč, konec směny
Vztaženo na koncentraci kreatininu - standardizace
Další informační zdroje • US EPA (U.S. Environmental Protection Agency) - Protects Our Health, Environment & Economy http://www.epa.gov Rozsáhlé studie: např. EPA-823-R-01-001 - Water Quality Criterion for the Protection of Human Health: Methylmercury – 303 stran • US FDA (U.S. Food and Drug Administration) - Protecting and Promoting Your Health http://www.fda.gov/ • WHO- World Health Organization IPCS - International Programme on Chemical Safety http://www.who.int/ipcs/en/ Vliv chemických látek na lidské zdraví, hodnocení rizika, posílení chemické bezpečnosti, management • Evropská Agentura pro bezpečnost a ochranu zdraví při práci https://osha.europa.eu/cs
RISC • Software RISC (Risk-Integrated Software for Cleanups) Odhad nepříznivých vlivů toxických látek na lidské zdraví, karcinogenních i nekarcinogenních, možnost volit z čtrnácti expozičních cest. Potřebné údaje pochází z databází US EPA.
Knihy o toxikologii
Články – WoS, Scopus, PubMed
Bezpečnostní listy (MSDS) H – věty P - věty
Databáze - TOXNET
Hg
SZÚ, TIS, Klinika pracovního lékařství
RfD, ADI, TDI, ARfD Aktuální Studie (WHO, IPEN, NGOs, BRI)
PEL, NPK, NPK-P Zákon 350/2011 Sb Nařízení (ES) č. 1272/2008 Nařízení vlády 361/2007 Sb.
IARC, NTP, US EPA, GHS
Testy toxicity
RISC - software
