Testy toxicity s rostlinami
Mgr. Klára A. Mocová, Ph.D.
[email protected]; místnost A 153. Ústav chemie ochrany prostředí, VŠCHT Praha 1
Fytotoxicita • Fytotoxin – toxická látka produkovaná rostlinou k potírání svých konkurentů (allelopatie) • Fytotoxická látka – látka působící nepříznivě na rostlinu (fytotoxikant) - redukuje růst rostlin nebo způsobuje změny normálního vývoje rostlin - tisíce organických látek klasifikováno jako látky fytotoxické
2
Testy fytotoxicity • Byly popsány stovky metodik hodnocení toxických účinků látek na rostliny • Jednotlivé metodiky se liší druhem testovacího organismu, podmínkami testu a prakticky především testovanou substancí, resp. účelem zkoušky – zadavatelem a dostupností pro laboratoř.
3
Volba organismu • Dle účelu zkoušky by měl být volen testovací organismus. • Je-li cílem zkoušky hodnotit možný dopad látek na vodní ekosystém, měla by jako testovací organismus být použita vodní rostlina. Důvodem je minimálně způsob příjmu látek do rostlinného těla.
4
Sledované odezvy Hodnocení v různých stádiích vývoje rostliny: • počet rostlin • úhyn • změny velikosti • klíčivost semen • změny v hmotnosti čerstvě sklizených rostlin • změny v hmotnosti sušiny • opad listů • výnosy plodů • deformace orgánů • respirace • obsah chlorofylu v listech 5
Praktická kritéria • cena • bezpečnost používání nebezpečných látek • reprodukovatelnost kontrolních testů, spolehlivost a výpovědní hodnota • extrapolovatelnost na podmínky in situ
Která z těchto kritérií budou upřednostňována, závisí na záměru a finančních zdrojích různých testujících institucí. 6
Kdo má zájem o testy na rostlinách? • • • •
výrobci herbicidů rostlinní ekologové inspekce ŽP sanační a dekontaminační firmy
7
Výrobci herbicidů • nejbohatší subjekty • záměrem je určit chemikálie, které jsou neškodné pro hlavní zemědělské plodiny, ale zároveň hubí nežádoucí traviny rostoucí na polích. • posuzuje se 5 nejdůležitějších plodin: rýže, kukuřice, drobné obiloviny, bavlna a sója versus cca 100 druhů plevelů (drobné obiloviny: pšenice, ječmen, žito, oves) 8
Výrobci herbicidů • Testování probíhá cca 4-5 let: předběžné levné testy, nákladné sekundární experimenty, finální polní testy s vybranými látkami (při jednotlivých fázích testování se redukuje počet testovaných chemikálií) • Přesné postupy testování, které příslušná firma provádí, nejsou veřejně dostupné. • Hodnocení vizuálních kritérií kvality a velikosti rostlin, barvy listů a kvality jednotlivých rostlinných orgánů. 9
Agentury ochrany životního prostředí • Např. ČIŽP, OECD, EPA • Zájem o účinky dané látky na všechny rostlinné druhy přítomné v regionu. (např. pro EPA – 40 druhů plodin + 16 000 přirozených druhů rostlin v USA) • Jsou zodpovědné za proces schvalování, zda budou nové látky dostupné na komerčním trhu. • Hodnocení je založeno na určení nejvyšší koncentrace, která ještě prokazatelně nezpůsobí nepříznivý účinek.
10
Agentury ochrany životního prostředí • Založeno na určení dose-response křivky na klíčivost semen či vzrůst semenáčků vybraných indikačních druhů (3-30). • Nedošlo-li ke standardizaci testů fytotoxicity, vyžadují agentury zodpovědné za různé regiony (severoamerická EPA, evropská OECD) různé testy fytotoxicity – problémy při registraci.
11
Výzkumné organizace • Ekologové • Studium allelopathie (negativní ovlivňování rostliny jiným rostlinným druhem) • Problém allelopathie často spojen s fenoménem zavlékání nových druhů; původní druhy pak ohroženy • Nejčastěji se používají testy inhibice klíčivosti semen • V oblasti studia allelopathie nutnost standardizace testů a nezbytnost prokázat, že lze výsledky laboratorních testů extrapolovat na přírodní podmínky
12
Sanační firmy • Cílem sanačních firem je zjistit, jaká rostlina je odolná vůči polutantům přítomným v kontaminované zemině a hodí se tudíž pro rekultivaci či eventuelně fytoremediaci • Účinky zamořených zemin před a po procesu remediace na rostliny mohou být dobrým měřítkem účinnosti použitých prostředků a využití vynaložených finančních prostředků • Remediace území by měla zajistit takové podmínky v zemině, které jsou příznivé pro růst rostlin charakteristických pro danou oblast
• Potřeba navržení, standardizace a validace testů toxicity potřebných pro oblast hodnocení ekologických rizik kontaminovaných zemin
13
Řasové testy • často založeny na ovlivnění fotosyntézy • velmi rychlé testy využívají změn fluorescence chlorofylu působením např. herbicidů, - reagují ve zlomcích sekundy, - vyžadují však velmi drahý fluorimetr - reagují také pouze na látky, které blokují transport elektronů. • středně rychlé testy využívají ovlivnění temnostní fáze fotosyntézy, tj. příjmu CO2 nebo výdeje kyslíku, - reagují řádově v minutách až hodinách
14
Řasový test v baňkách - ukončení
Řasový test - mikrodestička
Test semichronické toxicity s okřehkem • Aquatický test s vodní rostlinou - okřehek (Lemna minor L.) • Hodnocení růstu biomasy ( celkový počet stélek = lístků v koloniích ve vzorku), listová plocha, hmotnost sušiny • Hodnocení obsahu chlorofylu (spektrofotometricky) • Vizuální posuzování vzhledu rostlin - chloróza (ztráta zeleného pigmentu, žloutnutí) - nekróza (rozpad tkáně, bílé až průsvitné stélky) - fragmentace (rozpad kolonií na jednotlivé lístky) - abnormality ve vzhledu kolonií (miniaturní lístky, tvar...)
lístek, listen = frond (Angl.), stélka (CZ – překlad normy) 17
Podmínky testu toxicity na organismu Lemna minor Testovací organismus: okřehek menší, Lemna minor Barva :
zelená
Velikost:
2 - 4 mm
Počet iniciačních stélek v jedné kádince: 10 - 16 Sledovaná odezva: Inhibice růstu (počet stélek, hmotnost sušiny, celková listová plocha) a obsahu chlorofylu, symptomy Opakování: 2-3 Objem testované koncentrace: nejméně 100 ml v 1 kádince Teplota: 24±2 °C Doba expozice: 7 dní Osvětlení: kontinuální osvětlení Chemikálie: výchozí roztok testované látky, zřeďovací voda dle ISO 20079, methanol Pomůcky a zařízení: kádinky, hodinová skla, odměrné baňky, pipety, termoluminostat, spektrofotometr, sušárna, analytické váhy, digitální fotoaparát, software pro obrazovou analýzu 18
Test na okřehku • Probíhá v kádinkách za stálého osvětlení • Nasazení stejného počtu „lístků“ do všech kádinek • Vyhodnocování 2-3× během testu a na konci – – – –
počet lístků (ručně, pomocí fotografie) plocha listů (digitální analýza) hmotnost sušiny (sušárna, dobré váhy) chlorofyl (extrakce, spektrofotometrie)
Lemna minor L.
Uspořádání testu - okřehek
Uspořádání testu - okřehek
Okřehek – jak to dělají jinde
Sledování počtu stélek („lístků“)
Velikost listové plochy – obrazová analýza A A
C C
B B
A = původní foto B = označení a změření plochy listů C = binární obraz
Velikost listové plochy – binární obraz Každému bodu obrazu je přiřazena jedna ze 2 variant • hodnota 1 (= objekt; bílá) • hodnota 0 (okolí objektu; černá)
Množství chlorofylu Chlorofyly jsou důležité pro fotosyntézu – zdroj energie Chloróza - ztráta chlorofylu (zeleného barviva) – objeví se světlejší karotenoidy (žlutá barviva) Nekróza – odumírání - rozpad listového pletiva (tkáně) – rostliny bílé, poloprůsvitné
Množství chlorofylu Chloróza a nekróza – pozorování pouhým okem Množství chlorofylu – stanovení analyticky • extrakce rostlin v organickém rozpouštědle • spektrofotometrie
Rozpad chlorofylu, nekróza
Okřehek menší (Lemna minor L.)
30
Test I
Test III 100
75 inhibice (%)
inhibice (%)
100
50 25 0 0,10
1,00
10,00
chlorofyl a
50 25 0 0,10 -25
1,00
10,00
3,5-dichlorfenol (mg/l)
3,5-dichlorfenol (mg/l) celkový chlorofyl
75
počet lístků
celkový chlorofyl
chlorofyl a
počet lístků
Lemna VII
inhibice (%)
100 75 50 25 0 1,00
10,00
100,00
CdCl2
Celkový chlorofyl
Chlorofyl a
počet lístků
31
okřehek menší L. minor × okřehek hrbatý L. gibba
okřehek menší lístky „vodorovné“
okřehek hrbatý stélky vypouklé směrem dolů autor fotografie: Christian Fischer
Pozn: Dle OECD lze použít oba druhy Dle ISO pouze L. minor Okřehek má na 1 stélce (lístku) pouze 1 kořen! podobný druh: závitka mnohokořenná (Spirodela polyrhiza) má více kořenů na stélce – určující znak k rozlišení při odběru divokých kultur rostlin 32
Test semichronické toxicity se semeny hořčice • Původně k testování neškodnosti odpadních vod, jež by mohly být použity pro závlahy. • Testuje se vliv vody na klíčení semen a růst kořenů hořčice bílé (Sinapis alba L.) v počátečních stádiích vývoje. • Kultivace semen na podložkách nasycených roztoky zkoumané látky ve srovnání se semeny, které rostou na podložce nasycené ředící vodou.
33
Podmínky testu toxicity na organismu Sinapis alba. Testovací organismus: hořčice bílá, Sinapis alba Barva semene :
okrově žlutá
Velikost, střední: 1,5 – 2 mm Klíčivost minimálně: 90% Počet semen v jedné Petriho misce: 15 Sledovaná odezva: Inhibice růstu kořene ve srovnání s kontrolou Opakování: 3 Objem testované koncentrace: 5 ml v 1 Petriho misce Teplota: 20 °C Doba expozice: 72 hodin Osvětlení: bez přístupu světla Chemikálie: výchozí roztok testované látky, zřeďovací voda dle ISO 7346 Pomůcky a zařízení: Petriho misky, filtrační papír, odměrné baňky, pipety, termostat, milimetrové měřítko 34
Test semichronické toxicity se semeny hořčice
Měří se délka kořene
35
Klíčivost semen hořčice (Sinapis alba L.)
Test klíčivosti jetele – aquatický (konec)
Test klíčivosti – měření délky kořene (jetel)
Klíčivost semen hořčice (Sinapis alba L.) Nepřirozené prostředí a poloha klíčních rostlin Sorpce testovaných látek na filtrační papír Délka kořene: nízké koncentrace škodlivých látek - často stimulace růstu, to ovšem nemusí vylučovat toxickou reakci Rostlina „nemá za úkol růst do délky“ Inhibice prodlužování kořene způsobují některé látky, tzv. rhizotoxické (= škodlivé pro kořen), např. hlinité ionty Al3+
Test klíčivosti na salátu • Půdní test • Délka testu: 5 dnů • Kultivační nádoba: uzavíratelná miska • Testovací organismus: - semena salátu (Lactuca sativa L.) - semena se předkličují v Petriho miskách s vodou • Hodnocení: průměrná délka kořene rostlin
Test klíčivosti – jetel (Trifolium pratense L.)
• předkličování semen ve vodě
Test klíčivosti – jílek (Lolium perenne L.)
Vyhodnocení výsledků - obecně Pro každé ředění, vč. kontrol se vypočítá aritmetický průměr hodnoceného znaku ze všech paralelních stanovení. Na základě průměrných hodnot znaku v jednotlivých koncentracích se spočítá inhibice růstu podle následujícího vzorce:
D(k ) D(t ) I D( k ) • I je inhibice hodnoceného znaku (%) • D(k) je průměrná hodnota znaku v kontrole (mm, mg, počet ks…) • D(t) je průměrná hodnota znaku v testované koncentraci (mm, mg, počet ks…) 43
Přednosti metody klíčivosti semen
Krátké trvání testu - relativně rychlé získání výsledků. Nenáročnost na speciální zařízení. Celoroční dostupnost semen testovacího organismu.
44
Testy klíčivosti • Důvody popularity těchto testů jsou zřejmé: jednoduchost, rychlost, nízká cena, prostorová nenáročnost či spotřeba malých objemů činidel a vzorků. • Hlavními nedostatky – Špatná korelace s experimenty in situ – Nízká citlivost – Délka jako endpoint (hmotnost sušiny?)
• Existují dvě stránky růstu rostlin – regenerace orgánů a celkový růst • Obě umožňují rostlinám překonat nepříznivé období, které po překonání nemusí mít dopad na produkci plodů či druhové složení v lokalitě. Toto test klíčivosti nepodchycuje. 45
Vyšší rostliny – kontaktní terestrické testy (EPA, OECD, FDA, ISO) • Dvouděložné – – – – – – – –
hořčice, Sinapis alba, Brassica alba další druhy z čeledi brukvovitých (Brassicaceae) salát, Lactuca sativa; čeleď hvězdnicovité (Asteraceae) fazol, Phaseolus aureus další druhy z čeledi bobovitých (Fabaceae) rajče, Lycopersicon esculentum; čeleď lilkovité (Solanaceae) okurka, Cucumis sativus; čeleď tykvovité (Cucurbitaceae) mrkev, Daucus carota; čeleď miříkovité (Apiaceae)
• Jednoděložné – – – – –
kukuřice, Zea mays rýže, Oryza sativa ječmen, Hordeum vulgare další kulturní trávy (obilniny) z čeledi lipnicovitých (Poaceae) cibule, Allium cepa; čeleď liliovité (Liliaceae)
46
Kontaktní test fytotoxicity (ISO) • 1. část – Krátkodobý test - naklíčená semena rostlin (6 ks na květináč) - expozice cca 5 dní - hodnocení inhibice elongace kořene • 2. část – Dlouhodobý test - nenaklíčená semena (10 ks na květináč) - expozice 14 – 21 dnů od vzejití 50 % kontroly - hodnocení klíčivosti (%) - po vzejití výběr 5 reprezentativních jedinců - stanovení inhibice růstu (hmotnost čerstvé / suché biomasy nadzemních částí rostlin) 47
Kontaktní testy fytotoxicity
48
toxikant: Cd (NO3)2
toxikant: CdCl2
Stavba kořene rostlin A – zóna postranních kořenů B – zóna kořenového vlášení C – prodlužovací zóna D – vrchol kořene
Stavba kořene rostlin a její hodnocení
Obrazová analýza – měření růstu kořene – původní fotografie kořenu (jetel)
Obrazová analýza – měření růstu kořene – vymezování měřeného objektu a pozadí (jetel)
Obrazová analýza – měření růstu kořene – binární obraz – bíle vymezený objekt (jetel) z původního binárního obrazu vytvořena 1bodová mediální linie, která není příliš vidět
Obrazová analýza – měření růstu kořene – binární obraz – bíle vymezený objekt (jetel)
zvětšení části předchozího obrázku
Digitální analýza obrazu – NIS Elements
Rostlinné biomarkery
Mgr. Klára A. Mocová, Ph.D. Ústav chemie ochrany prostředí VŠCHT Praha
58
Fytochelatiny, metallothioneiny • molekuly vyvazující těžké (toxické) kovy FYTOCHELATINY
METALLOTHIONEINY
ryze rostlinný původ
obecněji rozšířeny (objeveny u koně)
syntetizovány enzymaticky fytochelatinsyntasou
každý individuální metallothionein kódován v DNA
za normálních podmínek se v buňce nevyskytují; syntéza je vyvolána přítomností toxického kovu v buňce
za obvyklých podmínek bazální hladina proteinů v buňce – zajištění homeostáze - reversibilní vazba esenciálních i neesenciálních kovů; v přítomnosti toxických kovů se syntéza zvyšuje
nízkomolekulární peptidy bohaté na cystein
vysoký obsah cysteinu (cca 25 %) 59
Fytochelatiny, metallothioneiny 1. Syntéza proteinu 2. Navázání toxického kovu 3. Transport toxického kovu do vakuoly
• Fytochelatiny – potencionální biomarkery toxicity kovů • Metallothioneiny – účastní se příjmu, transportu, kompartmentizace a exkrece kovů (nejen toxických); je-li v buňce daného esenciálního kovu nedostatek, uvolňuje se z metallothioneinu opět do cytoplasmy • Jestliže je systém skladování a detoxikace kovů v podobě fytochelatinů a metallothioneinů přetížen – dochází k oxidačnímu stresu 60
Další ochranné a signální molekuly • Chelataci kovů signalizuje také zvýšení volných aminokyselin, např. prolinu • Některé volné aminokyseliny a organické kyseliny vyvazují molekuly herbicidů a odvádějí je do vakuoly • Rostliny chrání před oxidačním poškozením také polyaminy (putrescin, spermin, spermidin) • Při stresu se zvyšuje obsah kyseliny abscisové (ABA) – nejdůležitějšího stresového fytohormonu 61
Oxidační stres rostlin • způsoben: volnými kyslíkovými radikály (H2O2 , O2·, ·OH), alkoxyradikály (RO·) a peroxyradikály (ROO·); • uvedené radikály jsou produkovány některými xenobiotiky po vstupu do organismu • kyslíkové radikály vznikají v organismu přirozeně díky aerobnímu metabolismu – v chloroplastech, mitochondriích aj. mikrosomech; tvoří se při redukci některých aromatických nitrosloučenin a kovů • peroxidace biomembrán – vznik malondialdehydu • kyslíkové radikály napadají –SH skupiny proteinů; přítomnost v blízkosti DNA - mutageneze
62
Rostlinné antioxidanty 1. • • • •
Neenzymatické složky: α-tokoferol askorbát glutathion karotenoidy (ochranné pigmenty v chloroplastech)
2. • • • • •
Specializované (antioxidační) enzymy: superoxiddismutasa askorbátperoxidasa katalasa glutathionperoxidasa glutathionreduktasa 63
Karotenoidy • Organické látky – izoprenoidy, 40 atomů uhlíku • Karoteny (červené - uhlovodíky), xantofyly (žluté – kyslíkaté deriváty) • Antioxidační účinky (chrání fotosyntetický aparát před nevratnou fotooxidací)
β-karoten
64
Xantofylový cyklus zeaxantin (2 volná vazebná místa)
antheraxantin (1 volné a 1 obsazené vazebné místo)
violaxantin (obě vazebná místa obsazená)
65
Antioxidační enzymy • Odbourávání superoxidu superoxiddismutasou: 2 O2· + 2H+ → H2O2 + O2 • Odbourávání peroxidu katalasou: 2 H2O2 → H2O + O2 • Odbourávání peroxidu glutathionperoxidasou: 2GSH + H2O2 → GS-SG + H2O 66
Antioxidační enzymy
APX askorbátperoxidasa; DHAR dehydroaskorbátreduktasa; GR glutathionreduktasa; AA askorbát; DHA dehydroaskorbát; GSSG oxidovaný glutathion; GSH redukovaný glutathion; NADPH redukovaný nikotinamidadenindinukleotidfosfát; NADP+ oxidovaný nikotinamidadenindinukleotidfosfát
67
Antioxidační enzymy • Nepříznivé podmínky stimulují syntézu stresového hormonu - kyseliny abscisové (ABA): • Ta aktivuje antioxidační enzymy: – indukcí genové exprese genů kódujících antioxidační enzymy (proteosyntéza) – zvyšování aktivity antioxidačních enzymů
• Někdy nalézány při stresu nové isoformy enzymů – isozymy • Přesáhne-li oxidativní stres únosnou mez (velká intenzita, dlouhodobé působení), rostlina odumírá
68
