Testy toxicity s konzumenty
Vladimír Kočí Ústav chemie ochrany prostředí VŠCHT Praha
Konzumenti vodních ekosystémů
2
Testy toxicity na rybách • Základní okruhy použití testů na rybách: • Testy toxicity látek a přípravků používaných v chovu ryb (nátěry sádek, krmiva, hnojiva…) – Testy na chovných rybách (např. pstruh) • Testy látek potenciálně škodlivých pro vodní ekosystémy (pesticidy, antibiotika, detergenty…) – Organismy doporučené v normách (pstruh, akvarijní ryby)
• Testy toxicity odpadů – Akvarijní ryby (potřebné velké množství jedinců – akvarijní méně náročné na chov)
3
„Velké“ ryby • Pstruh duhový - test subchronické toxicity látek na růstovou rychlost • „ČSN ISO 10229 Jakost vod – Stanovení subchronické toxicity látek pro sladkovodní ryby – Metoda vyhodnocení účinků látek na růstovou rychlost pstruha duhového Oncorhynchus mykiss Walbaum (Teleostei, Salmonidae).“
4
Pstruh duhový Oncorhynchus mykiss • Pstruh duhový (syn. Americký) • • • • •
říše Animalia - živočichové kmen Chordata - strunatci třída Actinopterygii – paprskoploutví řád Salmoniformes - lososotvární čeleď Salmonidae - lososovití
• Dorůstá délky až 120 cm, běžná velikost 50 cm • Sladkovodní ryba - žije ve stojatých i tekoucích vodách, není tak náročný na kyslík, jako pstruh obecný. • Vyznačuje se červeným nebo purpurovým pruhem, táhnoucím se středem těla, posetého černými skvrnami. Hřbet má modrý až olivově zelený, boky stříbřité a břicho bílé. •
U nás dorůstá výjimečně hmotnosti až 7 kg. Kapitální úlovek z českých revírů je z roku 1985, měřil 89 cm a vážil 7,05 kg. V USA však největší úlovek vážil 25,4 kg! Nejstarší dokumentovaná ryba tohoto druhu byla stará 11 let.
5
Rozšíření pstruha duhového • Pstruh duhový dříve označovaný jako Salmo gairdneri Richardson.
6
Princip testu • • •
•
Test spočívá ve sledování inhibice růstové rychlosti testovacích ryb při expozici toxickou látkou po dobu 14 a 28 dní. Test patří mezi testy náročné na prostor a vlastní přípravu. Zejména zajištění chovných podmínek pro získávání dostatečného množství testovacích organizmů vyžaduje zkušenosti a dostatečné zázemí. Metoda může být přizpůsobena k použití pro ostatní sladkovodní, mořské a brakické ryby patřičnými úpravami zkušebních podmínek, zejména vzhledem k teplotě, objemu a jakosti (složení) ředicí vody, potravě a technice označování jednotlivých ryb.
7
Akutní test toxicity na hepatocytech pstruha duhového • Test spočívá v expozici jaterních buněk pstruha duhového (rainbow trout hepatocytes - RTH) – tkáňový test • Není třeba obětovat tak velké množství jedinců jako u testu mortality • Snížení ceny testu
• Test je vhodný zejména pro: komunální a průmyslové odpadní vody – – – – –
Povrchové vody Podzemní vody a výluhy ze zemin Pórové vody sedimentů Ve vodě rozpustné látky Organické látky rozpustné v DMSO
8
Princip testu • Test se provádí na čerstvých jaterních buňkách pohlavně nedospělých pstruhů
• Kultura hepatocytů se izoluje alespoň ze tří jedinců (odstranění rozdílů v citlivosti mezi jedinci) • Hepatocyty se umístí do mikrodestiček ve speciálním médiu L-15 • Expozice koncentrační řadě toxikantů probíhá v temnu za teploty 15°C . • Po 24 a 48 hodinách se testuje životaschopnost jaterních buněk
9
Test životaschopnosti hepatocytů RTH • Živé buňky jsou schopné absorbovat barvivo a ukládat jej v lysozomech
• Ke kultuře buněk se po expozici přidá barvivo (neutrální červeň nebo fluorescein) • Po krátké době se přebytečné barvivo vymyje • K buňkám se přidá směs methanolu a kys. octové a získá se zabarvený roztok jehož barevná intenzita odpovídá množství absorbovaného barviva v buněčné kultuře • Množství absorbovaného barviva se stanovuje spektrofotometricky
10
Výhody testu na RTH •
•
•
•
• •
Snadno kontrolovatelné standardní podmínky – pH, teplota, množství živin – Snížení variability testů Menší objemy – RTH vyžaduje jen 1 ml vzorku, zatímco test na rybách až 60 nebo 200 litrů. Menší utrpení ryb – Pro RTH test je nutné obětovat 3 ryby, zatímco pro konvenční test cca 120 kusů. Více toxikologických informací – Z hepatocytů lze stanovit další biomarkry jaterních systémů genotoxicita, endocrinnní poruchy (estrogeny), biotransformace a měření oxidativního stresu aniž by bylo nutné obětovat další ryby Kratší expozice – RTH test trvá 24 až 48 h, místo 96 h u testu růstovou rychlost pstruha Test je citlivý na hepatotoxiny, na jedy ovlivňující základní procesy všech buněk jako je DNA syntéza a integrita, buněčné dělení, respirace, oxidativní stres, dýchání apod.)
11
Omezení testu na RTH • Relevance testu – Každý alternativní test in vitro musí být validován, zda jsou výsledky srovnatelné s původním testem in vivo. • Neposkytuje systémové účinky – Test je citlivý pouze na látky působící na hepatocyty. I když jsou jaterní pochody základem metabolismu organismů, nejsou tímto testem zaznamenány účinky jiných jedů (nervové jedy, immunosupresory, atd.) • Nižší citlivost na kovy – Kultivační médium RTH obsahuje relativně vysoké koncentrace solí 7-9 g/L za účelem udržení pro RTH příznivých osmotických podmínek – Přítomnost solí může snižovat citlivost na kovy přítomné ve vzorcích. 12
Akvarijní ryby Podle normy (ISO 7346-1-3: 1997) se používají následující akvarijní ryby:
• • • • •
Danio pruhované, Brachydanio rerio, Živorodka duhová, Poecilia reticulata, Slunečnice, Lepomis macrochirus, Halančík japonský, Oryzias latipes, Pimephales promelas.
13
Poecilia reticulata říše Animalia – živočichové kmen Chordata – strunatci třída Actinopterygii – paprskoploutví řád Cyprinodontiformes – halančíkovci čeleď Poeciliidae - živorodkovití
14
Brachydanio rerio Danio pruhované (Zebřička pruhovaná) říše Animalia – živočichové kmen Chordata – strunatci třída Actinopterygii – paprskoploutví řád Cypriniformes – máloostní čeleď Cyprinidae - kaprovití
18h. 35h.
15
Akutní test toxicity na rybách • EN ISO 7346-1-3: 1997 Jakost vod- Stanovení akutní letální toxicity látek pro sladkovodní ryby. ČNI 1999 Praha, s.15.
• Test spočívá ve sledování chování a přežívání (většinou akvarijních) ryb v odstupňovaných koncentracích testované látky po dobu 96 hodin. • Jako testovací organizmy se používají sladkovodní ryby, které lze snadno chovat v laboratorních podmínkách.
16
Podmínky testu toxicity na akvarijních rybách • • • • • • • •
Stáří ryb 3-4 měsíce Sledovaná odezva je úhyn Opakování 2-3; Počet organizmů v jedné paralelce 10 Objem testované koncentrace: minimálně 1 gram ryb na 1 litr vody Teplota dle druhu ryb; většinou 23 °C 1 °C Osvětlení: světelný hodinový cyklus 16:8 (jako v chovu) Bez aerace a bez krmení (před pokusem se ryby 24 hodin nekrmí) Doba expozice 96 hodin; mortalita se odečítá ve 24 hodinových intervalech
17
OECD normy Kromě ISO metod existují i OECD normy • Test No. 204: Fish, Prolonged Toxicity Test: 14-Day Study OECD Guidelines for the Testing of Chemicals • Test No. 210: Fish, Early-Life Stage Toxicity Test OECD Guidelines for the Testing of Chemicals • Test No. 212: Fish, Short-term Toxicity Test on Embryo and Sac-Fry Stages OECD Guidelines for the Testing of Chemicals • Test No. 215: Fish, Juvenile Growth Test OECD Guidelines for the Testing of Chemicals 18
Testy toxicity na perloočkách • ČSN EN ISO 6341 Jakost vod. Zkouška inhibice pohyblivosti Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea) – Zkouška akutní toxicity. ČNI Praha, 1997, s.16. • Test No. 202: Daphnia sp. Acute Immobilisation Test OECD Guidelines for the Testing of Chemicals
• Hrotnatky Daphnia magna, jakožto základní potrava ryb, jsou významnou složkou vodní biocenosy.
19
Testovací organismus • Hrotnatky druhu Daphnia magna a Daphnia pulex • Dále existuje dlouhodobější test na perloočce Ceriodaphnia dubia kmen členovci Arthropoda třída korýši Crustacea podtřída lupenonožci Phyllopoda řád perloočky Cladocera • Velmi četný organismus sladkovodních ekosystémů: od drobných tůní po velká jezera a údolní nádrže či mírně tekoucí vody. • Zooplanktonní organismus • Nesmáčivý chitinový krunýř – svléká jej při růstu 20
Princip akutního testu • Jako sledovaná odezva organizmu je testu použita imobilizace. • Test spočívá ve sledování imobilizace perlooček v odstupňovaných koncentracích toxické látky s expozicí 24 nebo 48 hodin. • Zkouška je založena na určení koncentrace, která imobilizuje 50 % jedinců. • Test se obvykle provádí za statických podmínek, lze jej však provádět i semistaticky či průtokově. • Varianta testu: CCD kamerové snímání pohybu – rychlejší a citlivější odezva
21
Imobilizace perlooček • Je definována jako makroskopicky pozorovatelná neschopnost samostatného prostorového pohybu hrotnatek do 15 s po krouživém zamíchání lázně. • Jako imobilizované organizmy hodnotíme např. i jedince, kteří pohybují tykadly 2. páru, ale výše uvedeného samostatného pohybu nejsou schopni.
22
Podmínky akutního testu toxicity hrotnatkách • Stáří 24 hodin; velikost 0,4-1 mm • Sledovaná odezva imobilizace • Podmínky testu: Bez aerace a bez krmení • Opakování 2-3; počet organizmů v jedné paralelce 10 • Objem testované koncentrace je minimálně 5 ml na 1 perloočku • Teplota 25°C • Světelný hodinový cyklus 16:8 hodin jako v chovu • Doba expozice 48 hodin (24 hod)
23
Vajíčka vs. efipium
Snímek © Adam Petrusek
24
Princip chronického testu •
Exponuje se vždy 1 hrotnatka v kádince zpravidla v 10 replikacích na koncentraci (objem vzorku v 1 kádince 60-80 ml)
• •
Sleduje se počet snůšek a počet narozených jedinců v intervalu 21 dní Narození jedinci se vždy z testu odstraňují
•
V 1-3 denních intervalech je nutné vyměňovat médium, pravidelný přísun potravy
25
Korýš Thamnocephalus platyurus • TNV 75 7754 Test akutní toxicity na korýši Thamnocephalus platyurus • Organizmus je dostupný ve stadiu trvalých vajíček, cyst. • Líhnutí na světle. • Expozice 24 hodin v destičkách 4 6 jamek po 1 ml • Teplota testu 25 °C • Expozice v temnu
Vývojová stádia: Nauplius, Instar II, III
26
Žábronožky Artemia salina říše Animalia – živočichové kmen Arthropoda – členovci třída Branchiopoda – lupenonožci řád Anostraca – žábronožky čeleď Artemiidae • • •
Organismus žijící v mineralizované vodě. Není však mořský. Akutní test toxicity – může být prolongován přídavkem glukosy
27
Klidová stádia žábronožek •
•
Cysty jsou opouzdřená embrya, jež jsou v klidovém stavu. – Cysty jsou velice odolné – vydrží krátkodobě zamražení i teplotu varu vody Líhnutí: – laboratorní mořská voda o salinitě 1,2-3,0% NaCl – Mírný pohyb vody vzduchováním - tím se zajistí i adekvátní aerace. – Je třeba nastavit proudění vzduchu tak, aby cysty vířily ve vodním sloupci a neležely na dně nebo na hladině. – Líhnivost kvalitních cyst se obvykle blíží 100%. – Optimální teplota pro líhnutí je 27-29°C, kdy k vylíhnutí dochází přibližně do 18 hodin. – Snížením teploty na 25°C nedochází ke změně v citlivosti nauplií, ale k prodloužení doby líhnutí; při této teplotě se líhnou za 24 hodin a to je pro provozní podmínky v laboratořích často příznivější. 28
Testy toxicity s vířníky • Test slouží k testování toxicity kapalných vzorků jak pro sladkovodní tak pro mořské ekosystémy – lze použít v testu jak sladkovodní tak mořský druh • Vířníci jsou citlivé organismy na široké spektrum látek – kovy, organické polutanty, pesticidy, endokrinní disruptory apod.
29
Akutní test toxicity na vířnících • Zooplankton, obrněnky • Vířníci mají významné místo v potravní pyramidě • Velikost 50 – 1500 m – Vzhledem k tomu, že na jeden organizmus stačí 300 l roztoku, jsou velmi úsporným organismem pro testy toxicity z hlediska prostoru i chemikálií. – Je možné použití testovacích destiček
30
Obrněnky Brachionus říše Animalia – živočichové kmen Rotifera – vířníci třída Monogononta – točivky čeleď Brachionidae – obrněnky
• Tělo vířníků sestává pouze z několika set buněk. Ačkoli je to již poměrně složitý organismus, velikostí odpovídá protozoálním organismům (jednobuněčným). • Brachionus calyciflorus – Sladkovodní druh • Brachionus plicatilis – Test slouží k určení toxického vlivu látek na mořské organizmy a organizmy žijící ve vodách s vyšším obsahem rozpuštěných i nerozpuštěných látek 31
Schéma nepohlavního a pohlavního rozmnožování vířníků Brachionus plicatilis • Vířníci se rozmnožují především parthenogeneticky – z mateřského organismu se rodí dceřiné organismy stejné genetické výbavy (průměrně 6 za den). • Samčí organismy se vyskytují jen u některých druhů a obvykle ani nemají ústní otvor ani zažívací trakt a hynou v řádu hodin eventuelně dnů. 32
Podmínky testu na vířnících • • • • • • •
Objem testované koncentrace 3 ml (destičky) Zdroj vajíček: vlastní chov nebo cysty Stáří organismů 24 hodin Opakování 3-6; 10 ks v jedné paralelce Bez aerace a bez krmení, stálé světlo, 25°C Doba expozice 24 hodin Sledovaná odezva: Imobilizace (živý vířník se vždy pohybuje)
33
Test inhibice příjmu potravy vířníků • Princip: – Za normálních podmínek vířníci přijímají potravu kontinuálně stálou rychlostí. – Příjem potravy je ovlivněn přítomností toxických látek. – Čím je vyšší toxický účinek, tím méně vířníci přijímají potravu. – Pokles rychlosti příjmu potravy je úměrný toxickému účinku • Tato metoda slouží jako rychlý screeningový test toxicity.
34
Postup testu • 24 jamková destička umožňuje nasadit vedle kontroly 5 koncentrací ve 4 replikacích
• Do každé jamky se umístí 10 vířníků • Expozice 45 min • Následuje přídavek 5 µm červeně obarvených částic (tzv. red microspheres) nebo suspenze karmínové barvy ve vodě
• Aktivní vířníci přijímají suspendované obarvené částice jako potravu • Po 15 minutách se vyhodnotí kolik vířníků přijalo obarvenou potravu – v jejich střevech je patrná jasná červeň 35
Identifikace zabarvení • Červeně zabarvený zažívací trakt vířníků je dobře patrný v mikroskopu již při 25 násobném zvětšení • Vířníci se zabarvenými střevy jsou hodnoceni jako nezasažení toxickými účinky • A) vířník s červenými střevy; B) bez zabarvení
36
Test toxicity na nezmaru • Účelem testu je určení nejvyšší koncentrace látek nebo odpadní vody, která nepůsobí toxicky během 7 denní expozice na nezmary Hydra • Nezmar je citlivým organismem na expozici zejména kovy – jak v čisté podobě, tak ve směsích v odpadních vodách. • Nezmar vykazuje nízkou citlivost na organické látky.
37
Testovací organismus • Nezmaři Hydrae (Cnidaria:Hydrozoa) jsou všudypřítomné mnohobuněčné organismy sladkovodních ekosystémů. • Jedná se o mikro-bezobratlé organismy široké přibližně 2-3 mm a dlouhé cca 5-20 mm. • Mají jednoduchou tělesnou stavbu: – dvě tkáňové vrstvy ektoderm a endoderm s bezbuněčnou výplní mezi (mesoglea) – Tudíž v podstatě všechny buňky nezmarů jsou v přímém kontaktu se všemi toxikanty ve vodním prostředí • Rozmnožování nezmarů – Nepohlavně: Při příznivých podmínkách pučí dceřiní jedinci na mateřském organismu – Pohlavně: při nepříznivých podmínkách jako jsou výkyvy teploty 38 – v přírodě často předznamenávající vysychání či zmrznutí
Testovací organismus • • • • • •
•
•
říše Animalia – živočichové kmen Cnidaria – žahavci třída Hydrozoa – polypovci řád Hydroida – nezmaři čeleď Hydridae - nezmarovití Pro testování toxicity se používají dva druhy nezmarů: – Nezmar zelený (H. viridissima) se stálými řasovými symbionty – Nezmar obecný (H. vulgaris) bez symbiontů Oba druhy jsou velmi citlivé na kovy a obývají rozdílné přírodní habity – Zelený nezmar čisté stojaté vody – Růžový nezmar zakalené tekoucí vody Oba druhy se v laboratorních podmínkách dobře chovají – množí se pučením
39
Chov nezmarů • Nezmaři se chovají v 1 litrových skleněných dobře provzdušňovaných lahvích • Pohyb vody provzdušňováním zajišťuje přichycení nezmarů na stěny nádob, což usnadňuje výměnu kultivačního roztoku. • Nezmaři se krmí dvakrát týdně suspenzí čerstvě vylíhnutých žábronožek Artemia salina • Týden před nasazením do testu se krmí jednou denně s cílem co nejvíce stimulovat pučení.
40
Princip testu • Pučící nezmaři se umístí do testované koncentrační řady v 90 mm Petriho miskách – Do každé Petriho misky se umístí 5 pučících nezmarů – Expozice probíhá při teplotě 25°C a fotoperiodě 12:12 – Krmí se denně přebytkem (0,5 ml) suspenzí žábronožek – Po 30 min krmení se vymění roztok v Petriho miskách odpovídající koncentrací toxikantu • Test se ukončuje po 7 dnech
• Pozorují se změny v počtu celých nezmarů (jeden nezmar odpovídá jednomu organismu včetně všech na něm pučících dceřiných organismů).
41
Konzumenti sedimentů Testování toxicity sedimentů
42
Vlastnosti sedimentů • Sedimenty představují významný zdroj znečištění pro aquatické organismy. • Lipofilní látky a některé kovy jsou v sedimentech zadržovány a mají dlouhý poločas uvolnění či rozkladu • Určování toxicity látek obsažených v sedimentech je náročné, neboť není zřejmé, jaké množství v sedimentech obsažených polutantů je v kontaktu s organismy – jak jsou biodostupné. • Pevně vázané látky vyskytující se v nízkých koncentracích (i vysoce toxické) nemusí být organismem vstřebány jak při pohybu organismu sedimentem, tak při průchodu sedimentu zažívacím traktem organismu či přes dýchací orgány. • Vývoj nových a optimalizace stávajících testů toxicity sedimentů je aktuálním tématem. 43
Vzorkování sedimentů • Podstatně komplikovanější úkol ve srovnání s vodním prostředím. • Vzorky sedimentů se odebírají z hloubky 2-5 cm pod rozhraním voda-sediment. • Po homogenizaci následuje sítování přes síto o porozitě 0,5 mm (odstranění velkých částic a organismů). • Umístění podílů sedimentu do 1 l lahvích s vodou (sladkovodní či mořskou) – hladina vody je 2 cm nad povrchem sedimentu • V případě potřeby lze sediment ředit podíly nekontaminovaného sedimentu s cílem získat koncentrační řadu. • Kontroly se provádějí v čistém sedimentu (problémy se „standardním sedimentem“) • Při testování látek či jiných vzorků lze čistý sediment uměle kontaminovat známou koncentrací testované látky. 44
Test toxicity sedimentů na různonožci Amphipod Hyalella azteca • Různonožci - Amphipoda • Jeden z nejcitlivějších organismů sedimentů
• Chronický test toxicity – 4 týdny s mladými organismy na počátku • Vysoký poměr voda / sediment • Během testu několikrát výměna vodní fáze
• Test bioakumulace – 1 týden s dospělými organismy 45
Testovací organismus říše Animalia – živočichové kmen Arthropoda – členovci třída Malacostraca – rakovci řád Amphipoda – různonožci čeleď Hyalellidae
• Hyalella azteca velmi rozšířený organismus od severní po jižní Ameriku. • Je všežravý, živí se detritem a není kanibalistický. • Žije zahrabán ve svrchní oxické zóně sedimentů • Po většinu času je skryt v sedimentu, opouští jej pouze v případě nedostatku potravy. • Stálý kontakt se sedimentem činí tento organismus vhodným pro testování toxicity. • Na rozdíl od ostatních bentických organismů může být chován i bez sedimentu – náhrada vhodným pevným substrátem. 46
Taxonomické nejasnosti • Hyalella azteca je ve skutečnosti skupina několika velmi blízkých druhů – je nutná bližší taxonomická revize
• Tato skutečnost je příčinou publikovaných rozdílných citlivostí na stejné látky zjištěných v různých laboratořích (s různými druhy). • Druhová rozdílnost je pravděpodobnou příčinou rozdílů v chování i citlivosti.
47
Význam testu • Hyalella je velmi citlivý organismus. • Ačkoli je to sladkovodní druh, byl úspěšně použit i pro testování vod s mineralizací až do 15 g/L. • Existuje již několik standardizovaných metod pro rutinní testování toxicity sedimentů. • Ačkoli se jedná o původně americký druh, používá se často i v evropských a asijských laboratořích a výzkumných projektech. • Snadno se v laboratoři chová při laboratorní teplotě i mimo specializované kultivátory.
48
Popis testu • Test se provádí v Imhoffových kuželích se zavedenou aerací doprostřed vodního sloupce. • V úzkém hrdle je zátka (čtyřčetná), na které je umístěno 15 ml sedimentu o hloubce 2,3 cm a s průměrem 3,1 cm na povrchu. • Sediment je přelit 1 l vody. • Množství sedimentu v kuželu umožňuje umístění až 15 kusů • Organismy lze exponovat pouze ve vodním sloupci – v malých klíckách umístěných v kuželu. – To umožňuje rozlišení toxicity/bioakumulace pouze z vodního prostředí od sedimentů. 49
Podmínky testu • • • •
Teplota 23-25°C Fotoperioda 16:8 Potrava: Tetra-Min® Expozice: 4 týdny (1 týden bioakumulace)
• Ukončení testu – Opatrná dekantace vodního sloupce – Přenesení sedimentu na jemné síto – vylití z kužele za pomoci jemného proudu vody – Přenesení organismů do skleněné misky, kde jsou spočítány a zváženy • Kultivace bývá realizována v min. 2 l skleněných nebo polypropylénových nádobách 50
Test toxicity sedimentů na larvách pakomára • Test slouží ke zjištění toxických účinků sedimentů či látek a vzorků uměle do sedimentů přidaných na růst a přežívání larev pakomára Chironomus riparius. • Z pohledu bentických organismů je test poměrně krátký (7 dní), pokrývá ovšem významný úsek životního cyklu pakomára. • Test je dobře zdokumentovaný a dostatečně citlivý. • Laboratorně dobře proveditelný.
51
Testovací organismus • Testovacím organismem je larva nebodavého pakomára.
• Pakomár Chironomus riparius je velmi rozšířený na severní polokouli. • Má významné místo v aquatických ekosystémech jakožto potrava pro ryby a ptáky. • Chironomidae patří mezi nejčetnější bentické organismy téměř všech sladkovodních ekosystémů. 52
Podmínky testu a kultivace • Test • Objem testovacích nádob 0,5 až 1 l • Počet organismů: 50 až 70 v jedné testované koncentraci • Fotoperioda 16:8 h • Teplota 21 ± 1°C • Chov se realizuje v cca 20 l akváriích s uzavíratelným prostorem pro pohyb dospělých jedinců umožňující jejich rozmnožování. – Potrava TetraMin
53
Průběh testu • Do kádinek (cca 0,5 – 1 l) s povrchem dna cca 14 cm2 se umístí testovaný sediment ve vrstvě 1,5-3 cm. • Sediment se přelije 4 násobným množstvím vody • 2 dny staré larvy se po 10 kusech umístí do každé kádinky • Potrava: během testu se larvy krmí TetraMinem • Expozice 7 dní • Sledovaná odezva: počet živých larev, jejich délka – Pro určení délky larev jsou larvy zahubeny roztokem formaldehydu (20%), odstraněny ze sedimentu a s použitím binokulárního mikroskopu se stanovuje jejich délka.
54
Standardizace testů na pakomárech • Test No. 218: Sediment-Water Chironomid Toxicity Using Spiked Sediment OECD Guidelines for the Testing of Chemicals • Test No. 219: Sediment-Water Chironomid Toxicity Using Spiked Water OECD Guidelines for the Testing of Chemicals
55
Nítěnka • • • •
Nítěnka Tubifex tubifex Organismus žijící i v relativně kontaminovaných sedimentech Používá se pro testy fototoxických látek Špatně se laboratorně chová – zdroj z přírodních lokalit (nestejné podmínky; možná přírodní kontaminace)
56
Půdní konzumenti Testování toxicity půd a pevných vzorků
57
Funkce půdy • Půda má široký rozsah funkcí - je multifunkční. • Z hlediska člověka byla dlouhodobě uvažována pouze její produkční funkce v zemědělství a lesnictví, nebo jako zdroj stavebních materiálů či plocha k zástavbě či jinému užití. • V ekosystému je však půda filtračním, akumulačním a transportním prostředím pro vodu a roztoky, je pufračním, stabilizačním, transformačním a asanačním médiem. • Je prostředím pro výměnu energie mezi atmosférou, hydrosférou a geosférou. • Problémy vznikají, jestliže nějaký způsob antropického užití nebo nějaké přírodní vlivy naruší nebo zničí některou nebo více funkcí půdy. • Ochrana půdy tudíž zahrnuje ochranu heterogenního systému s dynamickou povahou.
58
Vlastnosti půdních ekosystémů • Půda je nezbytnou podmínkou rovnováhy různých ekosystémů – živá půda je podmínkou života • Úbytek kvalitní živé půdy ovlivňuje přírodu i člověka (nedostatek pitné vody, potravin atd.) • Půda je komplexní médium obsahující – neživé i živé složky - je „živá“ – hydrofóbní i hydrofilní látky – ve vodě rozpustné i nerozpustné • Půda je heterogenní na různých škálách • Je to trojfázový systém: pevná, kapalná a plynná složka • Souhrnně – velmi komplikované médium pro testování 59
Nepříznivé účinky toxických látek na půdní ekosystémy 1. Ovlivnění půdních funkcí – zejména schopnosti působit jako substrát pro rostliny a živočichy živící se půdou a přebývající v ní.
2. Snížení rostlinné produkce a transport jedů do rostlin (potravní řetězec) 3. Ovlivnění kvality prostředí jak pro půdní organismy, pro organismy žijící na povrchu půdy, tak i pro organismy žijící v listí (padance) Úhyn organismú narušuje rovnováhu ekosystému. 4. Akumulace toxických látek do v půdě žijících organismů a dále do potravního řetězce.
60
Standardní (artificiální) půda • Pro testování je třeba zajistit přísun standardní půdy • Obvykle se laboratorně připravuje z • 10 % (hm) rašelina – vysušená na vzduchu, jemně rozemletá, bez viditelných rostlinných zbytků • 20 % (hm) kaolínový jíl – na vzduchu vysušený, obsahující aspoň 30 % kaolínu • 70 % (hm) průmyslový křemenný písek – na vzduchu vysušený, převážně jemný s více než 50 % částic velikosti 0,05 – 0,2 mm • Mezilaboratorní testy ukazují na určité odchylky ve vlastnostech
61
Stárnutí půdy • V reálných podmínkách „živé“ půdy dochází k přirozeným pochodům ovlivňujícím toxicitu a biodostupnost látek. • Biodostupnost organických látek s časem klesá. Příčiny: – sorpce: toxických látek na částice půdy – Zachycení toxikantů v mikropórech půdy • S časem obvykle toxicita látek klesá (po možném počátečním nárůstu toxicity způsobeném vznikem ve vodě lépe rozpustných metabolitů). • Látky obvykle vykazují vyšší toxicitu v artificiální půdě než jejich stejná množství v reálných podmínkách in situ. • Stárnutí půdy (snižování toxicity kontaminantů) je posilováno opakovaným vysycháním a vlhčením půdních vzorků • Vhodné je při umělé kontaminaci artificiální půdy toxikantem podrobit připravenou půdu procesu stárnutí – to ovšem v praktických podmínkách obvykle trvá příliš dlouho. 62
Biodostupnost v půdě • Biodostupnost organických a anorganických látek v půdě je rozdílná.
– Kovy vykazují při stárnutí půdy zvýšenou i sníženou biodostupnost v závislosti na vlastnostech původně deponované látky. – Organické látky téměř výhradně se stárnutím půdy snižují svoji biodostupnost a to jednak sorpcí na organickou složku půdy a v důsledku mikrobiální degradace.
63
Nematoda - hlístice • Hlístice Nematoda jsou organismy žijící v půdní vodě – jedná se vlastně o aquatické organismy – Používají se 2 druhy: • Háďátko Panagrellus redivivus • Hlístice Caenorhabditis elegans
• Mají krátký životní cyklus – výhodné pro testování
• Problematická je extrapolace na reálné prostředí – test se provádí v roztoku nebo na agaru • Metody jsou dosti vzdálené reálným podmínkám – Používají se kultury organismů laboratorně chovaných po mnoho let – Oba organismy se obtížně identifikují v reálných podmínkách in situ. 64
Nematoda – testovací organismy • Malé organismy mající po celý život pouze několik set somatických buněk říše Animalia – živočichové kmen Nematoda – hlístice třída Secernentea řád Rhabditida – háďata • Háďátko Panagrellus redivivus – čeleď Panagrolaimidae – 530 somatických buněk • Hlístice Caenorhabditis elegans – čeleď Rhabditidae – 959 somatických buněk 65
Test toxicity s háďátkem Panagrellus redivivus • Akutní test: 24 hodin • Chronický a genotoxický test 96 hodin – Přechod na dospělce je charakterizován vysokou genovou aktivitou – citlivé na genotoxické a mutagenní látky • Chovné podmínky – nádoba se směsí mouky a vody – Potrava – kvasnice – před testováním se chovají na Petriho miskách odkud se vyberou gravidní samičky (jsou větší – mechanicky nebo filtrací na 12 µm filtru) – Během 12 hodin dojde k produkci juvenilů – selekce opět filtrací • Test – 2,5 ml nádobky; 10 jedinců – Určení počtu organismů na konci testu (v kontrole min 10% reprodukce) 66
Test toxicity na hlísticích Caenorhabditis elegans • Půdní test je variantou původní ho aquatického uspořádání – ASTM: E2172 E2172-01 Standard Guide for Conducting Laboratory Soil Toxicity Tests with with the Nematode Caenorhabditis elegans.
• Do testu 3-4 dni staří jedinci – Část původní kultury se ošetří roztokem chlornanu a NaOH – vajíčka přežijí, dospělci nikoliv – po vylíhnutí jsou všichni jedinci stejně staří • Do malých nádobek (Petriho misky, destičky) se připraví koncentrační řada půdního vzorku • 10 hlístic do jamky • Expozice 24 hodin ve tmě (event. déle – pak je nutné přidávat potravu E.coli) • Na konci testu extrakce a centrifugace – hlístice na hladině • Přenesení jedinců pod lupu a určení počtu živých a mrtvých (mechanickým podrážděním) – Výpočet LC50 67
Testy na žížalách • Typický zástupce půdní fauny – vyskytuje se téměř ve všech půdách • Významný půdotvorný činitel – podílí se na tvorbě půdy, dekompozičních procesech, zajišťuje úrodnost půdy • Expozice potravou i dermálním kontaktem • Klíčové místo v přenosu polutantů potravním řetězcem • Tendence k bioakumulaci – testy bioakumulace • Snadná identifikace v reálných vzorcích (díky velikosti) • Zavedené v mnoha laboratořích – relativně nenáročný chov
68
Testovací organismus •
říše Animalia - živočichové / kmen Annelida - kroužkovci / třída Oligochaeta - máloštětinatci / řád Opisthopora - žížaly / čeleď Lumbricidae – žížalovití
• Žížala hnojní Eisenia fetida – Má poměrně rychlý vývoj – dobře se chová pro testy – V přírodě méně běžný druh – žije v hnoji či vysoce humózní půdě, ne v půdě (nejedná se o čistě půdní organismus) – Ekologicky méně relevantní organismus • Žížala obecná Lumbricus terrestris – Ekologicky relevantní pro většinu půd – Množí se poměrně pomalu a vyžaduje velké objemy půd – Nevhodné pro rutinní monitoring 69
Standardizace • ISO 11268-1:1993 Soil quality - Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida) -Part 1: Determination of acute toxicity using artificial soil substráte • ISO 11268-2:1998 Soil quality - Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida) -Part 2: Determination of effects on reproduction
• Test No. 207: Earthworm, Acute Toxicity Tests OECD Guidelines for the Testing of Chemicals • Test No. 222: Earthworm Reproduction Test (Eisenia fetida/Eisenia andrei) OECD Guidelines for the Testing of Chemicals
70
Chov a varianty testu • Žížaly E.f. jsou chovány v bednách s hnojem – náročné na prostor, ale jinak docela dobře schůdné
• Ostatní druhy žížal jsou náročnější na prostor i na podmínky chovu • Varianty testu: – Akutní s filtračním papírem: žížala je exponována na nasyceném filtračním papíře – Akutní test v půdním vzorku – Reprodukční: sleduje se porodnost žížal v půdním vzorku
71
Akutní test na filtračním papíře • •
Testuje se výluh, eventuelně připravený s pomocí rozpouštědla Ve zkumavce nebo na Petriho misce vždy filtrační papír nasycený vzorkem (udává se v mg/cm2) a 1 žížala
•
48 - 72 hodin expozice
•
Expozice pouze pokožkou – pouze ve vodě rozpustné látky
•
Odezva organizmu – reakce na podráždění předního konce těla
• Velmi umělý test – téměř nemožná extrapolace výsledků na reálné podmínky
72
Akutní test v artificiální půdě • • • • • • • • • •
Kontaktní test s pevným vzorkem Artificiální zemina + voda (35% hmotnosti) Do nádob se zeminou se umístí 10 dospělých jedinců 4 replikace 14 denní expozice Kontinuální osvětlení – žížaly pak nevylézají na povrch Expozice jak pokožkou tak potravou Na konci testu se vyhodnotí počet živých jedinců a jejich hmotnost Vypočte se LC50 Ve většině studiích je v akutních testech L.terrestris citlivější než E.fetida
73
Reprodukční test • Chronický test sledující vliv látek na rozmnožování žížal • Nádoba cca 1 l s povrchem 200 cm2; dávkuje se cca 500-600 g, což odpovídá vrstvě zhruba 5-6 cm, 1 organismus v nádobě • Expozice 4 týdenní • 20°C • Potrava: 5 g sušeného hnoje týdně • Na konci testu se vyhodnocuje počet kokonů • A následně počet nerozených jedinců z kokonů • V kontrole musí být reproduce min. 30 juvenilů na 1 dospělce • Test je citlivější, ekologicky relevantní • Náročný na práci i na prostor a množství vzorku • V chronických testech se ukazuje obvykle citlivější E.fetida. Juvenilní žížala rodící se z kokonu o průměru 2 mm.
74
Testy na roupicích •
•
• • •
Roupice jsou významnou skupinou půdních bezobratlých organismů, patří do podtřídy máloštětinatců (stejně jako žížaly). – Zastupují velké procento půdní mikrofauny – významná úloha při rozkladu organického materiálu a tvorbě půdy. Enchytraeus crypticus a Enchytraeus albidus
Na rozdíl od žížaly hnojní E.fetida jsou roupice půdním organismem – ekologicky relevantní test Toxické látky přijímají dermálně a potravou. Jsou díky své velikosti méně náročné na prostor jak v kultivaci tak v testu
•
Test No. 220: Enchytraeid Reproduction Test OECD Guidelines for the Testing of Chemicals
•
ISO 16387:2004 Soil duality – Effects of pollutants on Enchytraeidae (Enchytraeus sp.) – Determination of effects on reproduction and survival 75
Testovací organismus • Obývají nejsvrchnější vrstvy půdy a tím jsou vystaveny působení toxických látek mezi prvními živočichy. • Roupice jsou převážně světle zbarvené, bělavé, s délkou těla 10 – 20 mm a průměrem 0,1 – 1 mm. • Významnou částí těla je opasek, který kryje segmenty obsahující vývody samčích a samičích pohlavních žláz. Je to oboupohlavní živočich (hermafrodit). • Kokon může obsahovat jedno nebo více (až 15) vajíček, z oplodněného vajíčka se vyvine jedinec délky 1 mm, který prorazí kokon. Inkubační doba činí 12 – 24 dní. • Podmínky: 5 – 25 °C; pH 4,5 – 7,5. Roupice se mohou dožít maximálně 1 roku života. • Zatímco žížaly žijí hlavně v neutrálních či zásaditých půdách, roupice upřednostňují půdy kyselé. 76
Roupice říše Animalia – živočichové kmen Annelida – kroužkovci třída Oligochaeta – máloštětinatci řád Tubificida čeleď Enchytraeidae - roupicovití
77
Přehled testu • Jedná se o reprodukční test – chronický. • Pro test se používají dospělí jedinci (s vajíčky) s podobnou velikostí asi 10 mm. • Do skleněných testovacích nádob o objemu 0,2 – 0,25 litrů se vloží 20 g suché půdy. • Před přidáním organismů je nutné přidat deionizovanou nebo destilovanou vodu, aby bylo dosaženo vlhkosti 40 – 60 %. • Přidává se potrava pro roupice, což jsou sterilizované ovesné vločky v množství 50 mg. • Do každé testovací nádoby se vloží 10 roupic. • Celková doba expozice je 6 týdnů.
78
Zjišťování počtu roupic • • • •
Sledovaná odezva – počet narozených juvenilů Po ukončení testu usmrcení ethanolem. Zalití nádoby vodou a obarvení bengálskou červení. Počítání červených roupic na Petriho misce.
79
Test s chvostoskoky • Chvostoskok – Folsomia candida – malý bezkřídlý členovec
• Mnoho druhů chvostoskoků - v půdách jsou velmi četní • • • •
Patří mezi nejcitlivější organismy Dobře se chovají v laboratoři Test je ekologicky relevantní Rychlý životní cyklus – snadná a rychlá reprodukce • Dobře standardizovaný test ISO 11 267: 1999 Soil quality – Inhibition of reproduction of Collombola (Folsomia candida) by soil pollutants 81
Testovací organismus •
•
• • • •
•
Jejich tělo je členěno na hlavu, tříčlánkovou hruď, která nese tři páry končetin a zadeček tvořený šesti články.
Vyskytují se téměř ve všech typech půd na povrchu, v hlubších vrstvách, ale i na vegetaci. Živí se řasami, baktériemi, prvoky, detritem – všežravci Je slepý, nepigmentovaný a má dobře vyvinutou furku (skákací ústrojí). Velikost až 2 mm.
říše Animalia – živočichové kmen Arthropoda – členovci třída Entognatha – skrytočelistní řád Collembola – chvostoskoci čeleď Isotomidae - poskokovití
Folsomia candida se vyskytuje v půdách s dostatečným množstvím organické hmoty. – Parthenogenese. Folsomia fimetaria – pohlavní rozmnožování 82
83
Průběh testu • • • • • • • • • • •
Testuje se koncentrační řada půdy/pevného vzorku a kontrola o objemu 30 g. Upravuje se WHC na hodnotu 40-60 % deionizovanou vodou. Potrava - cca 2 mg suchých granulovaných kvasnic. Do každé nádoby se vloží 10 jedinců ve věku 10 – 12 dnů. Testovací nádoby jsou přikryty krytem, provzdušnění se zajišťuje krátkým otevřením nádoby 2x týdně. Podmínky testu: 20 ± 2°C, osvětlení pod zářivkou 400 – 800 lx, cyklus 12:12 nebo 16:8 (den:noc), pH 6,0 ± 0,5. Počet replikací: 3-5 Potrava: po 2 týdnech; cca 2 mg suchých granulovaných kvasnic Chvostoskoci jsou v podmínkách testu inkubováni po dobu nutnou k nakladení vajíček a následnému vylíhnutí juvenilů. Stanovovaným parametrem je mortalita dospělých jedinců a reprodukce – počet juvenilů. Validita testu: mortalita dospělých v kontrole <20%; reprodukce minimálně 100 juvenilů 84
Odezva testu • Pro snadné počítání dospělých jedinců a juvenilů se obsah testovací nádoby převede do větší nádoby a zalije se vodou. • Vzniklou suspenzí jemně mícháme, abychom dostali chvostoskoky na povrch vodní hladiny a vodu obarvíme inkoustem. • Poté spočítáme (obvykle po vyfotografování) – Dospělce – mortalita – Juvenily – reprodukce
85
Testy toxicity na měkkýších • Měkkýši jsou významným indikátorem bioakumulace – do svého těla zakoncenrovávají značná množství toxických látek
• Test na měkkýších – další významná skupina organismů • V ekotoxikologii se zatím uplatňují především stopkoocí plicnatí plži – hlemýždi • Hlemýždi se dostávají do kontaktu s jedy: – Dotekem – půda, výluhy, opadanka – Potravou (půda, rostliny) – Dýcháním • Jsou citliví na kontaminaci • Dobře se chovají v laboratorních podmínkách 86
Test toxicity na hlemýždi kropenatém • Test se aplikuje pro: – odpady a vodné výluhy z odpadů – Půdy – Odpady – čisté látky (chemikálie), které se mohou přidávat do půd. • • •
•
Určují se účinky na přežití a růst juvenilů hlemýžďů po čtyř týdenní expozici v substrátu obsahujícím testované látky. Půdy se pro testovaní upravují sítováním na velikost max 4 mm. ISO 15952:2006 Soil quality – Effects of pollutants on juvenile land snails (Helicidae) – Determination of the effects on growth by siol contamination. Francouzská norma: AFNOR NF X 31-255-2
87
Testovací organismus • Hlemýžď kropenatý (jihoevropský) Helix aspersa říše Animalia – živočichové kmen Mollusca – měkkýši třída Gastropoda – plži řád Pulmonata – plicnatí čeleď Helicidae – hlemýžďovití
• •
•
Obývá lesy a pole, vyskytuje se v parcích, zahradách a vinicích. Velkou část života tráví v zemi – kladení a líhnutí vajíček, ale i během ostatních fází života je v úzkém kontaktu s půdou Ulita – – –
žluto-hnědě kropenatá s 5ti tmavými, místy přerušovanými pásky. Má 4,5 – 5 rychle rostoucích závitů. Ústí je oválné. Obústí je ztlustlé se zřetelným bílým pyskem.
88
Postup testu • • • • • • • • • • • •
Celková doba expozice je 4 týdny. Test probíhá v koncentrační řadě vzorku a v půdě kontrolní 150 g suché půdy ve skleněných nádobách Úprava vlhkosti na WHC 50 – 60 % deionizovanou vodou Stáří organismů je 3 – 5 týdnů, 5 ks na koncentraci Krmivo na bázi mouky (spec. potrava Helixal) Varianta testu s kontaminovanou potravou. Testovací nádoby jsou přikryty krytem s otvory, které umožňují výměnu plynů mezi substrátem a atmosférou Optimální podmínky pro test jsou 20 ± 2°C, osvětlení zářivkou, fotoperioda18:6 (den:noc) a pH 6,0 ± 0,5. Doporučená replikace: 3 Odezva testu: inhibice růstu; mortalita Validace testu: mortalita v kontrole ≤10% a čtyřnásobný přírůstek hmotnosti.
89
Test na zlatohlávku tmavém • Princip: stanovení akutní toxicity testované látky na larvy hmyzu. • Ekologicky relevantní test - vajíčka i larva žijí v půdě • Podílí se na tvorbě půdní struktury a provzdušňování • Pro testování kontaminovaných půd, pevných vzorků, odpadů apod. • ISO 20963:2005 Soil quality – Effects of pollutants on insect larvae (Oxythyrea funesta) – Determination of acute toxicity
90
Zlatohlávek tmavý • Zlatohlávek tmavý Oxythyrea funesta • Je to leskle černý brouk s drobnými bílými skvrnami na štítu a na krovkách, tělo je bíle ochlupené.
říše Animalia - živočichové kmen Arthropoda – členovci třída Insecta – hmyz řád Coleoptera – brouci čeleď Cetoniidae (Scarabidae) zlatohlávkovití
• Je veliký 8 – 14 mm. Larvy se vyvíjí v zemi, kde požírají kořínky rostlin. • Hojně se vyskytuje na loukách a okrajích lesů, v období května až července.
91
Postup testu • Celková doba expozice je 10 dní. • Test probíhá v koncentrační řadě vzorku a v půdě kontrolní • Do skleněných testovacích nádob se vloží 300 g suchého vzorku. 3 opakování. • Úprava WHC na 50% deionizovanou vodou. • Testovací organismus: – třetí růstový stupeň stadia larvy. – Stáří je zhruba 15 dní – hmotnosti 100 – 200 mg. Dávkuje se 10 larev. • Krmivo: přidává suchý, jemně mletý kravský hnůj. • Podmínky testu: 26 ± 1°C, bez osvětlení a pH 6,0 ± 0,5. • Odezva testu: mortalita • Validace: mortalita v kontrole <10%; nárůst biomasy v kontrole >80% 92
Další metody testování ekotoxicity • Metody pro testování chemických individuí i chemických přípravků • Např. pesticidy a obecně biocidní látky a přípravky • Tyto skupiny látek se testují i dříve popsanými metodami – zde pro úplnost vyjmenujeme i další testy používané v ekotoxikologii.
93
Testy toxicity s hmyzem • Testy toxicity látek na hmyz slouží především k testování insekticidů, a to jak s ohledem na jejich toxické účinky na nežádoucí hmyz, tak na nežádoucí toxické účinky zástupce hmyzu, jež hodláme chránit (motýli, dvoukřídlí, brouci apod.). • Tyto testy se často používají při schvalování nových pesticidů pro používání v přírodě. • Testy obvykle slouží k určování letálních odezev a také k testování resistence k jedům. • Podobné testy se provádějí s hospodářským hmyzem (včely, predátoři nežádoucího hmyzu apod.).
94
Testy na hmyzu • Testování se obvykle provádí aplikací roztoku testované látky mikrostříkačkou - přímo na vnější krunýř organismu. – Látka bývá rozpuštěna ve zvoleném organickém rozpouštědle (např. aceton). – V tomto případě se dávka vztahuje na organismus a určuje se topická (místní) LD. • Slouží k testování citlivosti organismů • Expozice je ovšem nerealistická. – Hmyz je obvykle v polních podmínkách exponován sprejem, granulemi nebo prachovými částicemi. – V realističtějších testech se tudíž používají expozice skrze kontaminovanou potravu nebo kontaminovaný prach umístěný do pokusných nádob. 95
Test toxicity na včelách • Standardní metoda určení toxicity pesticidů a chemických látek • Test No. 213: Honeybees, Acute Oral Toxicity Test OECD Guidelines for the Testing of Chemicals • Test No. 214: Honeybees, Acute Contact Toxicity Test OECD Guidelines for the Testing of Chemicals • V ČR provádí Výzkumný ústav včelařský: http://www.beedol.cz/
96
Testovací organismus • Včela medonosná- Apis mellifica říše Animalia – živočichové kmen Arthropoda – členovci třída Insecta – hmyz řád Hymenoptera – blanokřídlí čeleď Apidae – včelovití
97
Postup testu toxicity na včelách • • • •
Oddělení dělnic od roje Anaestezie pomocí CO2 Umístění dělnic do válců uzavřených drátěným sítem V každém válci je v krmítku roztok cukru s definovanou koncentrací testované látky. • Do válce se umísťuje 10 dělnic. 3 replikace. • Konstantní teplota: 25°C • Expozice: počet uhynulých dělnic se odečítá po 1, 2, 4, 24, a 48 hodinách.
• Některé látky se dávkují přímo na hruď (thorax) včel.
98
In situ test toxicity na včelách • Metoda výrazně náročnější na prostor • Včelí roj se umístí do uzavíratelného tunelu z PE nebo ze síťoviny s přehledným dnem pod rojem • Pole, kam létají včely sbírat pyl, se nasprejuje testovanou látkou. • Včely se vrací do roje – ale během noci umírají. – Mrtvé včely jsou dělnicemi odstraňovány z roje a na desce pod rojem je určován jejich počet.
99
Testy toxicity s obojživelníky • Obojživelníci – velmi citlivé organismy na znečištění prostředí – Negativní dopady farmak (antikoncepce, antibiotika) • Obojživelníci mají řadu unikátních biologických i ekologických charakteristik s významem pro (eko)toxikologické procesy: • Jsou významnou součástí ekosystémů a reprezentují většinou konzumenty druhého řádu (většina druhů je insektivorních).
• Většina zástupců prodělává unikátní proces metamorfózy, kdy ve vodním prostředí žijící vajíčka a časná vývojová stadia (embrya a larvy) jsou přeměněna v převážně terestricky žijící dospělce. Tato životní strategie reprezentuje řadu rozličných expozičních cest a míst pro působení polutantů (vodní prostředí vs. terestrické prostředí). • Značné riziko zvýšeného příjmu toxikantů u dospělců představuje velký význam povrchu kůže obojživelníků pro výměnu vody a plynů. 100
Testy na obojživelnících • Testy s obojživelníky se provádějí většinou v embryonálním stádiu organismů • Rutinní test FETAX – teratogenita a toxicita na drápatce Xenopus laevis • Publikovány testy na skokanech Rana sp. a ropuchách Bufo sp.
101
Testy toxicity na ptácích • Testování látek v ptačí potravě • Pesticidy, přípravky na ošetřování zrní apod. (jed na hraboše polní je testován v neškodnosti pro bažanta obecného • Testy na křepelkách – následují veterinární vyšetření – Křepelka virginská Colinus virginianus – Křepelka japonská Coturnis japonica • Testy na bažantech – Bažant obecný Phasianus colchicus
102
Význam testů na ptácích • V současné době vzrůstá potřeba hodnotit účinnost pesticidů nejen z hlediska výsledného efektu, tzn. pozitivní inhibice cílového organismu, ale také z hlediska možného ohrožení necílových organismů. • Vzhledem k použití pesticidů patří ptáci do skupiny necílových organismů. • Údaje o toxicitě látek pro ptáky jsou nenahraditelné a nemohou být zastoupeny testy na laboratorních hlodavcích, poněvadž některé látky jsou více toxické pro ptáky než pro savce a naopak. • Riziko pro ptáky představují zejména rodenticidní přípravky, které jsou vyráběny ve formě granulované nástrahy. • Přestože výrobci těchto přípravků deklarují relativní bezpečnost pro necílové organismy, mohou tyto např. svým zbarvením představovat pro některé ptačí druhy atraktivní potravní nabídku a tím ohrožovat jejich populace. 103
Akutní perorální test toxicity u ptáků (OECD 205) • Test No. 205: Avian Dietary Toxicity Test OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. • 10 ptáků v 1 kleci; fotoperioda 12-16 hodin světla • Ptáci jsou krmeni potravou obsahující testovanou látku v různých koncentracích po dobu 5 dnů. • Další 3 dny jsou krmeni základní krmnou směsí bez testované látky. • V průběhu testu se kontroluje stav a chování ptáků a odstraňují se uhynulí jedinci. V časovém úseku 24, 48, 72, 96 a 120 hodin
104
Test reprodukční toxicity na ptácích (OECD 206) • Test No. 206: Avian Reproduction Test OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. • Stanovení reprodukční toxicity látky podávané rodičovským jedincům. • Testy reprodukční toxicity zahrnují účinky látek na reprodukci, fertilitu a teratogenitu. • Ptáci jsou chováni v klecích v párech nebo ve skupinách o jednom samci a dvou samicích. • Ptáci jsou krmeni potravou obsahující testovanou látku v různých koncentracích po dobu minimálně 20 týdnů. • Prodloužením fotoperiody je navozena snáška vajec. • Vejce se sbírají 10 týdnů, jsou uměle inkubována a líhnutá kuřata jsou chována po dobu 14 dní. • Sledované odezvy: mortalita dospělců, produkce vajec, výskyt křapek, tloušťka skořápky, životnost, líhnivost a účinky na kuřata. 105
Testy toxicity se savci • Testy pesticidních látek a přípravků • Testy ošetřování zemědělských surovin
• Myš, potkan, křeček, morče • V rutinních ekotoxikologických pracích se nevyužívají – pouze pro speciální studie (např. bioakumulace kovů v srsti) • Složí spíše pro účely humánní toxikologie • Specifické testy účinku: – Embryotoxicity, teratogenita, imunotoxicita, kožní iritance • Dlouhodobé testy – Akutní expozice 24-96 hodin – Chronická expozice 56-90 dní 106
Mezidruhové rozdíly v citlivosti • Mezidruhové rozdíly v citlivosti nejsou předpověditelné – Nutný je experiment
• Validace laboratorních testů na podmínky ve volné přírodě obvykle chybí – platí pro většinu testů. – Neznáme účinky látek na společenstva • Posun kupředu může přinést simultánní testování více organismů současně – za stejných podmínek – Poskytuje odhady dopadů jedů na společenstva
107
