Řasový test toxicity

Laboratoř ekotoxikologie Laboratorní návod č. 2

Laboratoř ekotoxikologie a LCA Ústav chemie ochrany prostředí, VŠCHT v Praze

Řasový test toxicity 1. Účel Řasové testy toxicity slouží k testování možných toxických účinků látek a vzorků na vodní producenty. Zelené řasy patří do skupiny necévnatých rostlin hojně se vyskytujících v našich vodách a představujících důležitý článek potravního řetězce. Test umožňuje sledovat nejen inhibiční (toxické) účinky látek, ale také stimulační efekty, tzv. úživnost. Díky rychlému nárůstu řas je možné kromě akutního působení pozorovat i chronické účinky testovaných látek.

2. Charakteristika testu Test spočívá v měření nárůstu koncentrace biomasy řas v jednotlivých testovaných koncentracích toxického vzorku ve srovnání s kontrolou tvořenou řasovým živným médiem. Řasy jsou kultivovány za stálých světelných i teplotních podmínek. Dle doby expozice lze test uspořádat jako akutní (cca 72 hodin), semichronický (cca 96 hodin) či chronický (více než 96 hodin). Zásobní kultury řas se pěstují v zábrusových baňkách za stálé aerace. Přiváděný vzduch je nejprve čištěn na bakteriálním filtru od řas či bakterií volně poletujících v okolním prostředí, poté je veden přímo do řasové suspenze. Přívodem vzduchu je kultuře dodáván dostatek CO2 nutný pro její růst.

3. Materiál a metodika 3.1 Testovací organizmus Desmodesmus subspicatus (dříve Scenedesmus subspicatus) 3.2 Živné médium a vzorek Testovaný vzorek - roztok neznámé látky Živné médium - řasové médium pro kultivaci řas se skládá z deionizované vody a do ní nadávkovaných předepsaných koncentrací určitých solí (viz Tab. I, Tab. I) 3.3 Přístroje a pomůcky Termoluminostat (kultivační komora zajišťující stálé osvětlení a konstantní teplotu) Laminární flow-box (zařízení pro práci ve sterilním prostředí) Mikroskop s počítací komůrkou Cyrrus Kultivační Erlenmayerovy baňky Buničinové zátky Automatické pipety Orbitální třepačka

1



Tab. I – Kultivační médium

Chemikálie NaNO3 Ca(NO3)2·4H2O K2HPO4 MgSO4·7H2O Na2CO3 FeCl3 Gaffronův roztok

Koncentrace [mg/l] 467 59 31 25 21 1 koncentrace [ml/l] 0,08

Tab. II – Roztok stopových prvků podle Gaffrona

Koncentrace [mg/l] H3BO3 3100 MnSO4·4H2O 2230 Na2VO4·2H2O 33 (NH4)6Mo7O24·4H2O 88 KBr 119 KI 83 ZnSO4·7H2O 287 Cd(NO3)2·4H2O 154 Co(NO3)2·H2O 146 CuSO4·5H2O 125 NiSO4·(NH4)2SO4·6H2O 198 Cr(NO3)3·7H2O 37 V2O4(SO4)3·16H2O 35 Al2(SO4)3·K2SO4·24H2O 474 Chemikálie

2



4. Obsah práce 1. den laboratorní práce Účel a podstata testu Kultivace řas, podmínky kultivace Práce s mikroskopem Sterilizace pomůcek, autoklávování Určení koncentrace zásobní kultury řas Výpočet dávkování toxikantu, řasového média a inokula Příprava testovaných koncentrací toxikantu Dávkováni inokula řas Začátek expozice 2. den laboratorní práce Určení koncentrace řasové suspenze v exponovaných kulturách Zpracování výsledků

5. Úkol Stanovte experimentálně toxické účinky roztoku neznámé látky na řasovou kulturu. Určete křivky koncentrace-odpověď pro následující odezvy testu: Inhibice růstové rychlosti řas (interval 0 - 72 hodin) Inhibice nárůstu biomasy (plochy pod růstovou křivkou (interval 0 - 72 hodin). Vypočítejte indexy toxicity pro jednotlivé odezvy testu.

6. Pracovní postup 1. den laboratorní práce Vysterilizujte potřebné laboratorní náčiní v autoklávu po dobu 20 minut. Následující laboratorní náčiní je třeba vysterilizovat: 25 ml Erlenmayerovy baňky, kultivační médium, pipetové špičky, buničinové zátky. Ukázka práce s mikroskopem, počítací komůrky. Určete v mikroskopu koncentraci buněk v zásobní kultuře řas. Pozorováním v mikroskopu se určí počet buněk ve 20 čtvercích. Ze známého objemu jednoho čtverce se přepočte získaný průměrný údaj o počtu buněk ve čtvercích na koncentraci řas v ml. Vypočtěte množství inokula řas, které je třeba dávkovat do testované koncentrace toxikantu o objemu 25 ml tak, aby počáteční koncentrace řas v baňkách byla 80 000 ks/ml. Vypočtěte, jaká množství toxikantu a ředícího media budou třeba pro přípravu testované koncentrační řady. Objem ředícího média zmenšete o objem inokula řas.

3



Do kultivačních baněk nadávkujte určené objemy ředícího média a toxikantu pro všechny testované koncentrace a pro kontrolu (pouze živné medium). Na závěr přidejte stejné objemy řasového inokula. Baňky uzavřete sterilními zátkami z buničiny. Umístěte kultivační baňky do termoluminostatu s podmínkami 27 ± 2 °C, 6 000 lux - 10 000 lux. 2. den laboratorní práce Po akutní době expozice (cca 72 hodin) odeberte kapátkem po důkladném protřepání kultivační baňky vzorek řasové kultury a v mikroskopu určete koncentraci řasové suspense. Sestrojte graf růstových křivek po době expozice 72 hodin. Vypočtěte růstové rychlosti pro jednotlivé koncentrace toxikantu dle následujícího vzorce. ln N 72 c

ln N 0 t

N0

koncentrace buněk řas na začátku testu (80 000 ks/ml)

N72

koncentrace buněk řas po době expozice 72 hodin

t

doba expozice (72 hodin)

Vypočtěte inhibice (stimulace) v % pro jednotlivé koncentrace toxikantu dle následujícího vzorce. Je-li výsledná inhibice záporná, jedná se o stimulaci.

K

I c

K

růstová rychlost v kontrole

c

růstová rychlost koncentrace c

Ic

c

100

K

inhibice růstu v % pro koncentraci toxikantu c

Sestrojte křivku koncentrace – odpověď pro zjištěné hodnoty inhibic. Vyneste do grafu závislost inhibice na dekadickém logaritmu koncentrace. S použitím získaných dat inhibicí vypočtěte indexy toxicity NOEC, LOEC s použitím programu GraphPad InStat. Plocha pod růstovou křivkou odpovídá celkovému nárůstu biomasy. Dle následujícího vzorce určete plochy pod růstovými křivkami v jednotlivých kulturách včetně kontroly.

4


Ac

Ac c0 c1 cn t1 t2

(c1 c0 ) t1 2


(c1 c2

2c0 ) (t 2 t1 ) (cn  2

1

cn

2c0 ) (t n t n 1 ) 2

plocha pod růstovou křivkou pro danou koncentraci počáteční koncentrace řas [ks/ml] změřená koncentrace řas v čase t1 [ks/ml] změřená koncentrace řas v čase tn [ks/ml] doba prvního měření od počátku testu [hod] doba n-tého měření od počátku testu [hod]

Z hodnot ploch pod jednotlivými křivkami určete % inhibice pro jednotlivé testované koncentrace. AK

I c

Ac A

100

K

Ic Ak Ac

inhibice růstu biomasy v % pro koncentraci toxikantu i průměrná plocha pod růstovou křivkou u kontroly průměrná plocha pod růstovou křivkou u testované koncentrace i

Rozšiřte původní graf koncentrace – odpověď pro růstové rychlosti I o křivku koncentrace – odpověď pro plochy pod křivkou. S použitím získaných dat inhibicí vypočtěte indexy toxicity NOEC, LOEC s použitím programu GraphPad InStat.

7.

Použitá literatura

ČSN EN (2005): Jakost vod. Zkouška inhibice růstu sladkovodních řas. ČNI Praha.

5

Řasový test toxicity

Recommend Documents