UNIVERSITAS GADJAH MADA LABORATORIUM GENETIKA DAN PEMULIAAN

UNIVERSITAS GADJAH MADA LABORATORIUM GENETIKA DAN PEMULIAAN INSTRUKSI KERJA UJI PREPARASI KROMOSOM TUMBUHAN

No. Dokumen Halaman Tgl. Terbit Revisi

: IKU/5.4/BI-GT/Krom-04 : 1 dari 5 : 03/09/14 :0

METODE PREPARASI KROMOSOM TUMBUHAN DENGAN METODE SQUASH

1. RUANG LINGKUP Metode ini digunakan untuk penentuan jam pembelahan sel dan jumlah kromosom.

2. ACUAN NORMATIF Aristya, G.R., Daryono, B.S., Handayani, N.S.N., dan Arisuryanti, T. 2015. Karakterisasi Kromosom Tumbuhan dan Hewan. Gadjah Mada University Press. Yogyakarta. Ostergren, G., and Heneen, W.K. 1962. A Squash Technique For Chromosome Morphological Studies. Insitute of Genetics,University of Lund, Sweden. Suryo. 1995. Sitogenetika. Gadjah Mada University Press. Yogyakarta

3. ISTILAH DAN DEFINISI A. larutan asam asetat glasial 45% (AAG 45%) Larutan yang mempunyai kadar Asam Asetat Glasial (AAG) sebanyak 45% dalam akuades. Larutan AAG 45% ini berfungsi sebagai larutan fiksatif sel. B. larutan HCL 1N Larutan yang mempunyai kadar normalitas HCl 1 N dalam akuades. Larutan HCl ini berfungsi dalam membantu pemutusan lamela tengah sel tanaman sehingga sel dapat terpisah-pisahkan secara sempurna. C. larutan Aceto Orcein 1% Larutan yang mempunyai kadar Orcein 1% dalam larutan asam asetat. Larutan Aceto Orcein 1% berfungsi sebagai senyawa yang dapat berikatan dengan kromosom sehingga akan meningkatkan visualisasi kromosom pada saat pengamatan menggunakan mikroskop. D. indeks sentromer (IS) Panjang lengan pendek kromosom (p) dibagi panjang kromosom (p+q) dikali 100. Perhitungan IS ini bertujuan dalam klasifikasi bentuk-bentuk kromosom.

Isi Dokumen ini tidak diperkenankan untuk disalin atau digandakan tanpa seijin dari Manajer Puncak Laboratorium Penelitian Pengujian Terpadu Universitas Gadjah Mada.




E. karyogram Suatu gambar pengaturan dari set kromosom somatis individu (e.g. Tanaman normal= 2n) berdasarkan jumlah dan disusun berdasarkan IS (letak sentromer) kromosom.

4.

CARA UJI

4.1.Prinsip Sampel tanaman (e.g. ujung akar ± 1 cm) difiksasi menggunakan larutan AAG 45% selama 15 menit pasa suhu 4oC, selanjutnya dilakukan pembilasan akar menggunakan akuades sebanyak 3 kali, kemudian dimaserasi menggunakan larutan HCl 1N selama 3 menit pada suhu 55oC (hingga akar transparan), ; lalu dilakukan pembilasan akar menggunakan akuades sebanyak 3 kali, dan setelahnya diwarnai dengan larutan aceto orcein 1% selama 1-3 jam pada suhu ruang, selanjutnya di squash. 4.2. Bahan a) aceto orcein 45%, AAG 45%; b) asam klorida, HCl 1 N; c) aceto orcein 1%; d) akuades; e) gliserin; f) kutek 4.3. Peralatan a) labu ukur 100 mL;

e) gelas benda;

b) gelas ukur 50 mL;

f) gelas penutup;

c) gelas ukur 100 mL;

g) silet;

d) tabung gelap;

h) botolflakon;





i) kuas;

n) mikroskop;

j) pipet tetes;

o) pensil;

k) pipet penghisap;

p) software AutocadMap;

l) kulkas;

q) kertas tissue;

m) oven;

r) cawan petri

4.4. Persiapan Pengujian Biji tanaman dikecambahkan pada cawan petri yang telah dilapisi dengan kapas basah hingga menghasilkan akar. 4.5. Prosedur Pengujian 1. Akar yang telah tumbuh dipotong pada bagian ujung (±1 cm) lalu dimasukkan ke dalam botol flakon yang berisi larutan fiksatif (asam asetat glasial 45 %), inkubasi pada suhu 4oC selama 15 menit. 2. Setelah difiksasi, cuplikan dicuci dengan akuades hingga bersih (3 kali) lalu sampel akar dimasukkan ke dalam botol flakon yang berisi larutan maserasi (HCl 1 N), inkubasi pada suhu 55oC selama 2-5 menit 3. Cuplikan dicuci dengan akuades (3 kali) dan kemudian sampel akar dimasukkan ke dalam botol flakon yang berisi larutan pewarna kromosom (aceto-orcein 1 %), inkubasi pada suhu ruang (RT) selama 45 menit. 4. Sampel akar diambil dan dilektaan pada obyek gelas dan aceto orcein yang masih menempel pada bagian pinggir sampel diserap dengan tissue, kemudian dipotong sekitar 1-2 mm pada bagian ujung yang paling pekat menyerap warna aceto orcein. 5. Selanjutnya sampel ditetesi dengan gliserin dan ditutup dengan gelas penutup, selanjutnya squashing sampel menggunakan ujung kuas. 6. Pada pinggir gelas penutup, diberi kutek untuk mensegel gelas objek dengan kaca penutup, kemudian diamati di bawah mikroskop.


UNIVERSITAS GADJAH MADA LABORATORIUM PENELITIAN DAN PENGUJIAN TERPADU INSTRUKSI KERJA UJI PREPARASI KROMOSOM TUMBUHAN



4.6. Pengamatan dan Pemotretan 1. Setelah preparasi selesai, preparat diamati dibawah mikroskop cahaya di Laboratorium Genetika Fakultas Biologi UGM dengan perbesaran 10x, 40x, dan 100x untuk mengamati fase mitosis yang terjadi 2. Pemotretan dilakukan ketika perbesaran 40x menggunakan kamera digital 3. Berdasarkan gambar tersebut kemudian diamati dan ditentukan jenis fase mitosis yang tampak 4. Selanjutnya, preparat juga diamati menggunakan mikroskop milik LPPT UGM dengan perbesaran 100x, agar kromosom pada fase prometafase terlihat jelas 5. Dari sekian foto, diambil foto yang menunjukkan fase prometafase yang paling jelas untuk dijadikan dasar dalam menghitung jumlah kromosom stroberi.

5. PENGENDALIAN MUTU a) Gunakan silet berkarat untuk memotong ujung akar yang telah tumbuh b) Gunakan mikroskop dengan perbesaran tinggi agar kromosom yang diamati tampak jelas saat dipotret. c) Lakukan preparasi triplo untuk kontrol presisi analisis.


UNIVERSITAS GADJAH MADA LABORATORIUM PENELITIAN DAN PENGUJIAN TERPADU INSTRUKSI KERJA UJI PREPARASI KROMOSOM TUMBUHAN

Disiapkan Oleh

Diperiksa Oleh

Subakir

Ganies



Disahkan Oleh

Nama

Tanggal

26 Oktober 2015

Riza

Aristya, Dr.

Niken

Satuti

S.Si., M.Sc.

Handayani, M.Sc.

26 Oktober 2015

26 Oktober 2015


Nur

UNIVERSITAS GADJAH MADA LABORATORIUM GENETIKA DAN PEMULIAAN

Recommend Documents