UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA. PREPARASI DAN UJI STABILITAS 177 Lu-DOTA-F(ab ) 2 - NIMOTUZUMAB SEBAGAI KANDIDAT RADIOFARMAKA TERAPI KANKER

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA PREPARASI DAN UJI STABILITAS 177Lu-DOTA-F(ab’)2NIMOTUZUMAB SEBAGAI KANDIDAT RADIOFARMAKA TERAPI KANKER

SKRIPSI

CITRA REZZA AURORA PUTRI PALANGKA 1110102000028

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN PROGRAM STUDI FARMASI JAKARTA JULI 2014

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA PREPARASI DAN UJI STABILITAS 177Lu-DOTAF(ab’)2-NIMOTUZUMAB SEBAGAI KANDIDAT RADIOFARMAKA TERAPI KANKER

SKRIPSI Diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi

CITRA REZZA AURORA PUTRI PALANGKA 1110102000028

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN PROGRAM STUDI FARMASI JAKARTA JULI 2014 ii

iii

iv

v

ABSTRAK

Nama Program Studi Judul Skripsi

: Citra Rezza Aurora Putri Palangka : Farmasi 177 : Preparasi dan Uji Stabilitas Lu-DOTA-F(ab’)2Nimotuzumab Sebagai Kandidat Radiofarmaka Terapi Kanker.

Antibodi monoklonal sudah banyak digunakan untuk terapi kanker salah satunya adalah nimotuzumab yang merupakan kelompok inhibitor EFGR. Namun karena berat molekul yang cukup besar berpengaruh negatif terhadap penetrasi, kecepatan bersirkulasi dan eliminasi oleh sebab itu dalam penelitian ini digunakan F(ab’)2-nimotuzumab yang difragmentasi untuk penyiapan sediaan 177Lu -DOTAF(ab’)2-nimotuzumab. Penyiapan sediaan 177Lu -DOTA-F(ab’)2-nimotuzumab dilakukan dalam beberapa tahap yaitu fragmentasi nimotuzumab dengan pepsin, konjugasi dengan p-SCN-Bz-DOTA (F(ab’)2-nimotuzumab : p-SCN-Bz-DOTA ,1:20 dan 1: 50), dan penandaan dengan 177Lu. Hasil penelitian ini diperoleh kemurnian F(ab’)2- nimotuzumab setelah dimurnikan dengan PD-10 sebesar 89,1 % dengan efisiensi penandaan pada perbandingan F(ab’)2- nimotuzumab dengan p-SCN-Bz-DOTA 1 : 20 dan 1 : 50 sebesar 4,91 % dan 14,13 %. Kemurnian 177Lu -DOTA-F(ab’)2-nimotuzumab setelah dimurniakan dengan kolom sephadex G-25 M sebesar 99,9 % dan berdasarkan uji stabilitas dari sediaan177Lu -DOTAF(ab’)2- nimotuzumab pada suhu kamar dan 4 0C selama 96 jam menunjukan sediaan masih stabil. Kata kunci : 177Lu-DOTA-F(ab’)2-nimotuzumab, Fragmentasi, Nimotuzumab.

vi

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

ABSTRACT

Name Program Study Tittle

: Citra Rezza Aurora Putri Palangka : Pharmacy : Preparation and stability testing of 177Lu-DOTA-F(ab')2 – nimotuzumab as a candidate radiophamaceutical for cancer therapy.

Monoclonal antibodies have been widely used for cancer therapy. One of them is nimotuzumab which is one of EFGR inhibitor group. However, because the relatively high molecular weight has negative effect on penetration, circulation rate and elimination, therefore this study was used the F(ab')2-nimotuzumab for the preparation of 177Lu-DOTA-F(ab')2-nimotuzumab. The preparation of 177LuDOTA-F(ab')2-nimotuzumab carried out in several stages: fragmentation of nimotuzumab with pepsin, conjugation with p-SCN-Bz-DOTA (F(ab')2nimotuzumab: p-SCN-Bz-DOTA, 1 : 20 and 1: 50), and labeled with 177Lu. The results of this study showed that the purity of the F(ab')2- nimotuzumab after purification was 89,1% with labeled efficiency in comparison with F(ab')2 nimotuzumab : p-SCN-Bz-DOTA 1 : 20 and 1 : 50 were 4,91% and 14,13%. The purity of 177Lu-DOTA-F(ab')2-nimotuzumab after purification was 99,9% and based on stability testing of 177Lu-DOTA-F(ab')2-nimotuzumab at room temperature and 40C for 96 hours, 177Lu-DOTA-F(ab')2-nimotuzumab still showed stable. Keywords :177Lu -DOTA-F(ab’)2-nimotuzumab, Fragmentation, Nimotuzumab.

vii


KATA PENGANTAR/UCAPAN TERIMA KASIH

Puji syukur saya panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa, karena atas berkat dan rahmat-Nya, saya dapat menyelesaikan skripsi ini. Penulisan skripsi ini dilakukan dalam rangka memenuhi salah satu syarat untuk mencapai gelar Sarjana Farmasi pada Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta. Saya menyadari bahwa, tanpa bantuan dan bimbingan dari berbagai pihak, dari masa perkuliahan sampai pada penyusunan skripsi ini, sangatlah sulit bagi saya untuk menyelesaikan skripsi ini. Oleh karena itu, saya mengucapkan terima kasih kepada : 1) Ibu Dr. Martalena, M.Sc. selaku pembimbing pertama dan Ibu Lina Elfita, M.Si., Apt. selaku pembimbing kedua, yang memiliki andil besar dalam proses penelitian dan penyelesaian tugas akhir saya ini, semoga segala bantuan dan bimbingan ibu mendapat imbalan yang lebih baik di sisi-Nya. 2) Bapak-bapak dan Ibu-ibu karyawan PTRR BATAN yang telah banyak membantu dalam penelitian saya. 3) Ibu Ofa Suzanti Betha, Msi., Apt selaku Penasehat Akademik yang telah banyak membantu dalam kelancaran studi. 4) Bapak Prof.(hc) dr MK. Tadjudin, selaku Dekan Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta. 5) Bapak Drs. Umar, M.sc, Apt selaku ketua Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta. 6) Rekan-rekan mahasiswa Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta. 7) Kak Titis, Kak Ratna, Kak Rien, Ibu Nilda, dan Kak Diani yang telah banyak membantu selama penelitian.

viii


8) Sahabat dan teman-teman seperjuangan Chaya, Maya, Hani, Niswah, dan Meta. 9) Sahabat Jejak 22 yang selalu memberikan semangat mencapai titik tertinggi. 10) Keluarga besar Saidi Karto yang selalu memberi semangat dan doa. 11) Adik-adik saya, Rindie, Dinda, Randu, Vivi, dan Mareta. Tak lupa kedua orang tua saya, ayahanda Budi Fajar Purwanto dan bunda tercinta Sri Hartuti atas kasih sayang dan cintanya, semoga segala amalan dan jerih payah keduanya mendapat balasan yang jauh lebih baik disisi-Nya. Akhir kata, saya berharap Tuhan Yang Maha Esa berkenan membalas segala kebaikan semua pihak yang telah membantu. Semoga skripsi ini membawa manfaat bagi pengembangan ilmu.

Ciputat, Juli 2014 Penulis

ix


DAFTAR ISI

Halaman HALAMAN JUDUL .............................................................................. HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS .................................. HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING .................................. HALAMAN PENGESAHAN ................................................................. ABSTRAK ............................................................................................... ABSTRACT ............................................................................................. KATA PENGANTAR ............................................................................. DAFTAR ISI ........................................................................................... DAFTAR GAMBAR .............................................................................. DAFTAR TABEL ................................................................................... DAFTAR LAMPIRAN .......................................................................... DAFTAR ISTILAH ............................................................................... BAB I PENDAHULUAN .................................................................. 1.1 Latar Belakang .............................................................. 1.2 Batasan Masalah ........................................................... 1.3 Perumusan Masalah ...................................................... 1.4 Tujuan Penelitian .......................................................... 1.5 Hipotesis ....................................................................... 1.6 Manfaat Penelitian ........................................................ BAB II TINJAUAN PUSTAKA ........................................................ 2.1 Kanker ............................................................................ 2.2 Etiologi Kanker ............................................................. 2.3 Antibodi ......................................................................... 2.4 Fragmentasi Antibodi Oleh Enzim ................................ 2.5 Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) ................. 2.6 Radionuklida .................................................................. 2.7 Lu-177 ............................................................................ 2.8 Nimotuzumab................................................................. 2.9 p-SCN-Bz-Dota ............................................................. 2.10 Sediaan Radiofarmasi .................................................... 2.11 Kromatografi Eksklusi Ukuran atau Size Exclusion Chromatography (SEC) ................................ 2.12 KLT ................................................................................ 2.13 SDS-PAGE .................................................................... BAB III METODE PENELITIAN ..................................................... 3.1 Lokasi dan Waktu Penelitian ........................................ 3.2 Metode Penelitia ............................................................ 3.3 Alat dan Bahan 3.3.1 Alat Penelitian .................................................... 3.3.2 Bahan Penelitian ................................................. 3.4 Fragmentasi Nimotuzumab ............................................ 3.4.1 Pemurnian Nimotuzumab ....................................

x

ii iii iv v vi vii viii x xii xiii xiv xv 1 1 4 4 4 4 5 6 6 6 8 11 11 14 15 15 16 17 18 19 19 22 22 22 22 23 23 23


3.4.2 Fragmentasi Nimotuzumab Menjadi F(ab’)2 ....... 3.4.3 Pemurnian F(ab’)2-Nimotuzumab ....................... 3.4.4 Analisis F(ab’)2-Nimotuzumab Menggunakan KCKT .................................................................. 3.4.5 Analisis F(ab’)2-Nimotuzumab Menggunakan SDS-PAGE .......................................................... 3.4.6 Pemekatan Protein dengan Protein Filter ............ 3.5 Penyiapan 177LuCl3 ........................................................ 3.6 Konjugasi p-SCN-Bz-DOTA Pada F(ab’)2 – Nimotuzumab ................................................................. 3.7 Analisis p-SCN-Bz-DOTA-F(ab’)2 -Nimotuzumab dengan KCKT ................................................................ 3.8 Penandaan Immunokonjugat p-SCN-Bz-DOTA-F(ab’)2 Nimotuzumab dengan 177Lu ........................................... 3.9 Pemurnian 177Lu-SCN-Bz-DOTA-F(ab’)2Nimotuzumab ................................................................. 3.10 Uji Stabilitas 177Lu-SCN-Bz-DOTA-F(ab’)2Nimotuzumab Pada Suhu Kamar dan Pada 4 0C ........... BAB IV PEMBAHASAN ...................................................................... 4.1 Dialisis Nimotuzumab ................................................... 4.2 Fragmentasi Nimotuzumab ............................................ 4.3 Pemurnian F(ab’)2 -Nimotuzumab ................................. 4.4 Analisis Kemurnian F(ab’)2-Nimotuzumab ................... 4.5 Konjugasi F(ab’)2-Nimotuzumab dengan p-SCN-BzDOTA ............................................................................ 4.6 Penandaan ...................................................................... 4.7 Uji stabilitas ................................................................... BAB V KESIMPULAN DAN SARAN............................................... 5.1 Kesimpulan .................................................................... 5.2 Saran .............................................................................. DAFTAR PUSTAKA ............................................................................. LAMPIRAN .............................................................................................

xi

24 24 24 25 25 25 25 26 26 27 27 28 28 30 30 31 34 36 41 43 43 43 44 49


DAFTAR GAMBAR

Gambar 2.1. Gambar 2.2. Gambar 2.3. Gambar 2.4. Gambar 2.5. Gambar 2.6. Gambar 2.7. Gambar 2.8. Gambar 4.1. Gambar 4.2. Gambar 4.3.

Gambar 4.4. Gambar 4.5. Gambar 4.6. Gambar 4.7. Gambar 4.8. Gambar 4.9. Gambar 4.10.

Struktur molekul antibodi ................................................. Murine, chimerized, humanized and human Abs .............. Digesti dari antibodi klas IgG dengan enzim pepsin, merkaptoetanol, dan enzim papain.................................... Ilustrasi skematik jalur EGFR pengaruh terhadap sel dan jaringan ....................................................................... Mekanisme kerja obat anti-EGFR pada sel kanker ........... Struktur DOTA (kiri) dan p-SCN-Bz-DOTA ................... Pemisahan 2 ukuran molekul dengan SEC ....................... Pola pemisahan protein dengan SDS-PAGE .................... Kromatogram standar protein ........................................... Kromatogram nimotuzumab ............................................. Cuplikan fraksi-fraksi hasil pemisahan F(ab’)2– nimotuzumab dan Fc nimotuzumab setelah diberi pewarna protein ................................................................. Hasil analisis nimotuzumab sebelum dan setelah fragmentasi ........................................................................ Kromatogram fraksi F(ab’)2-nimotuzumab setelah dimurnikan......................................................................... Skema reaksi pembentukan imunokonjugat p-SCN-Bz-DOTA- F(ab’)2-nimotuzumab ........................ Skema reaksi pembentukan radioimunokonjugat 177 Lu-SCN-Bz-DOTA- F(ab’)2-nimotuzumab. ................ Grafik optimasi waktu penandaan SCN-Bz-DOTAF(ab’)2-nimotuzumab dengan 177Lu .................................. Radiokromatogaram hasil pemurnian 177 Lu-SCN-BzDOTA- F(ab')2-nimotuzumab ........................................... Radiokromatogram Fraksi 17 dan Fraksi 39 .....................

xii

Halaman 8 10 11 12 13 17 18 20 28 29

31 32 34 35 36 38 40 41


DAFTAR TABEL Halaman Tabel 4.1. Komponen standar protein ...................................................... Tabel 4.2. Rf pita-pita standar Vs BM protein – standar. ....................... Tabel 4.3. Hasil analisis nimotuzumab sebelum dan setelah fragmentasi dengan SDS-PAGE ............................................. Tabel 4.4. Waktu retensi (rt) p-SCN-Bz-DOTA-F(ab’)2nimotuzumab dan rt F(ab’)2-nimotuzumab serta nimotuzumab hasil analisis dengan KCKT ............................. Tabel 4.5. Rf dari komponen-komponen yang terlibat pada proses penandaan SCN-Bz-DOTA-F(ab’)2-nimotuzumab dengan 177Lu.beberapa senyawa ............................................. Tabel 4.6. Efisiensi penandaan p-SCN-Bz-DOTA- F(ab’)2– nimotuzumab dengan 177Lu ..................................................... Tabel 4.7. Persentase kemurnian pada suhu kamar dan suhu 4 0C ..........

xiii

29 32 33

36

37 39 42


DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Lampiran 2. Lampiran 3. Lampiran 4. Lampiran 5. Lampiran 6.

Lampiran 7.

Skema Prosedur Penelitian Secara Umum ....................... Pembuatan Pereaksi .......................................................... Kadar Protein Nimotuzumab Hasil Dialisa..................... Gambar Kurva Kalibrasi Kondisi Reduksi ....................... Kromatogram Absorbansi Fraksi Hasil Pemurnian Dengan PD-10 ................................................................... Komponen-Komponen yang Terlibat Pada Proses Penandaan SCN-Bz-DOTA-F(Ab’)2-Nimotuzumab dengan 177Lu...................................................................... Alat Penelitian ...................................................................

xiv

Halaman 49 50 54 55 55

56 57


DAFTAR ISTILAH

APS BFCA CDR EBV EGFR Fab Fc GFC HAMA HER HPLC ITLC-SG KCKT KLT mAb MAPK NSCLC SDS SDS-PAGE TEMED TKIs TLC VEGF 2-ME

: Amonium Per Sulfat : Bifunctional Chelating Agen : Complementary Binding Region : Eipstein Barr virus : Epidermal Growth Factor Receptors : Antigen-Binding Fragment : Constant Fragment : Gel-Filtration Chromatography : Human Anti-Mouse Antibody : Human Epidermal Growth Factor Receptors : High Performance Liquid Chromatography : Instan Thin Layer Chromatography – Silica Gel : Kromatografi Cair Kinerja Tinggi : Kromatografi Lapis Tipis : Monoklonal Antibodi : Mitogen-Activated Protein Kinase : Non-Small Cell Lung Cancer : Sodium Dodecyl Sulfate : Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrilamide Gel Electrophoresis : Tetrametiletilendiamin : Tyrosine Kinase Inhibitor : Thin Layer Chromatography : Vascular Endothelial Growth Factor : 2-Mekaptoetanol

xv


BAB I PENDAHULUAN

1.1

Latar Belakang Kanker merupakan salah satu penyakit tidak menular yang telah menjadi masalah kesehatan di Indonesia bahkan di dunia. Jumlah penderita baru diperkirakan 100 penderita dari setiap 100.000 penduduk, dimana dua per tiga penderita kanker berada di negara berkembang. Penyakit ini menduduki peringkat ke 6 penyebab terbesar kematian di Indonesia dengan prevalensi kanker pada masyarakat secara nasional sebesar 4‰ berdasarkan Riset Kesehatan Dasar (Riskesdas) 2007 (Oemiati, 2011). Terapi utama untuk kanker berdasarkan pada jenis, lokasi, stadium kanker, dan kondisi fisik pasien dengan cara operasi atau pembedahan, radiasi, kemoterapi, immunoterapi, terapi gen atau terapi hormonal. Semua terapi tersebut memiliki kekurangan dan kelebihan masing-masing. Sesuai tujuan utama dalam pengembangan terapi kanker adalah untuk merusak sel kanker namun mempunyai efek minimal pada jaringan sel yang normal. Dalam beberapa tahun belakangan ini telah mulai banyak digunakan terapi kanker yang bersifat terarah (targeted therapy) dengan menggunakan antibodi monoklonal (mAb) (Copper, 1993; Schwartz, Solin, Olivotto, Ernster, & Pressman, 2000; Tjay & Raharja, 2007; Deter, 2010; Campbell, Rini, Uzzo, & Lane, 2009). Antibodi monoklonal (mAb) merupakan kelompok medikasi/ farmaka yang sangat penting dalam terapi terarah. Antigen yang menjadi sasaran mAb dalam terapi kanker adalah antigen yang terekspresikan secara homogen pada sel kanker namun sedikit terekspresikan pada sel normal (Widyastuti, 2007). Epidermal growth factor receptors (EGFR) adalah sekolompok reseptor yang mengatur diferensasi sel dan poliferasi. Empat jenis reseptor yang termasuk kelompok EGFR yang telah diidentifikasi adalah human epidermal growth receptor 1 (HER1/EGFR), HER2, HER3 and HER4.

1


2

HER1/EGFR sementara itu over expressed

(diekspresikan secara

berlebih) pada beberapa kanker manusia, termasuk non-small cell lung cancer (NSCLC), kanker payudara, dan kanker pankreas (Fried & Hadensenos, 2006; Herbst & Bunn, 2003). Nimotuzumab sebagai inhibitor EGFR/HER1 mencegah sel kanker menerima pesan yang dibutuhkan sel untuk tumbuh, berkembang dan menyebar dengan cara menghambat protein EGFR yang terdapat pada permukaan sel kanker dan dapat menghambat hasil vascular endothelial growth factor (VEGF) (Reddy & Couvreur, 2010). Nimotuzumab dilaporkan lebih efektif untuk terapi kanker over expressed HER-1 jika dikombinasikan dengan regimen yang mengandung radiasi (Tikhomirov, Garrido, Yang, Sherman, & Perez, 2008). Radiofarmaka

berbasis

mAb

atau

dikenal

juga

sebagai

radioimmunokonjugat adalah antibodi monoklonal yang ditandai / dikonjugasikan dengan radionuklida pemancar partikel bermuatan misalnya beta (β) atau alfa (α) dan juga radionuklida pemancar sinar gamma () (Reddy, 2010 ; Godewijckstraat, 2012; Acton, 2013;). Radioimmunoterapi sementara itu (RIT) merupakan terapi kanker terarah dengan

menggunakan

radioimmunokonjugat.

Pada

teknik

ini

radioimmunokonjugat akan berkerja secara sinergis dimana antibodi monoklonal akan membawa radionuklida pada target yang spesifik yang ada pada permukaan jaringan kanker sedangkan radionuklida akan mentransfer

energi

(cross

fire)

pada

sel

kanker

dimana

radioimmunokonjugat terikat dan juga pada sel kanker yang ada disekitarnya yang akan menyebabkan hancurnya sel kanker tersebut (Humani, Ramli, Rustendi, & Subur, 2010; Widyastuti, 2007). Penggunaan mAb dalam RIT memiliki keterbatasan yang cukup signifikan salah satunya yaitu berat molekul mAb yang relatif besar menyebabkan proses akumulasi pada jaringan menjadi lambat dan kecil, clearance pada darah juga lambat sehingga visualisasi sasaran yang tidak begitu jelas (Nurlaila, 2007). Keterbatasan mAb karena berat molekulnya yang besar sementara itu dapat diatasi dengan menggunakan fragmen mAb


3

seperti F(ab’)2 hasil fragmentasi mAb utuh dengan menggunakan pepsin (Hermanson, 1996). Berat molekul F(ab’)2 mAb yang relatif kecil mempunyai kemampuan penetrasi lebih baik dan cepat, bersirkulasi lebih cepat, dan eliminasi yang sempurna dimana ikatan dengan hati berkurang. Penggunaan

fragmen

F(ab’)2-nimotuzumab

dilaporkan

tidak

mengguranggi kemampuan / efektifitasnya berikatan secara bivalent dengan reseptor pada permukaan jaringan kanker dan sebagai penghambat EGFR. Salah satu radionuklida yang akhir-akhir ini banyak diteliti / digunakan untuk terapi kanker adalah lutesium-177 (Lu-177 /

177

Lu).

Penggunaan 177Lu secara in vivo perlu memperhatikan sifat Lu yang dalam keadaan bebas (Lu3+) akan ditangkap secara alami oleh hati, limpa dan tulang (Palasz & Czekaj, 2000). Oleh sebab itu untuk meminimalkan pelepasan

177

Lu pada organ bukan target, maka dalam penggunaannya

secara in vivo

177

Lu digunakan dalam bentuk kompleks logam yang stabil

secara termodinamika dan kinetis yang terkonjugasi pada biomolekul seperti mAb atau immunoprotein melalui bifunctional chelating agent (BFCA) (E′ VA TO′ TH., 1994; Gansow, 1991; Kadarisman, Herlina, & Sriyono, 2011). Pada

penelitian

ini

akan

dilakukan

penyiapan

kandidat

radiofarmaka berbasis fragmen F(ab’)2-nimotuzumab bertanda dengan

menggunakan

BFCA

p-benzyl

tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic

177

Lu

isothiocyanate-1,4,7,10-

acid

(p-SCN-Bz-DOTA).

Penyiapan dilakukan dalam beberapa tahap yaitu: 1) Fragmentasi nimotuzumab dengan pepsin untuk menghasilkan fragmen F(ab’)2nimotuzumab; 2) Konjugasi p-SCN-Bz-DOTApada fragmen F(ab’)2nimotuzumab; dan 3) Penandaan p-SCN-Bz-DOTA-fragmen-F(ab’)2nimotuzumab radiofarmaka

dengan 177

177

Lu.

Radioimmunokonjugat

/

kandidat

Lu-SCN-Bz-DOTA-fragmen-F(ab’)2-nimotuzumab yang

terbentuk kemudian diuji stabilitasnya pada 4 C dan suhu kamar.


4

1.2

Batasan Masalah Agar penulisan skripsi ini tidak menyimpang dan mengambang dari

tujuan

yang

semula

direncanakan

sehingga

mempermudah

mendapatkan data dan informasi yang diperlukan, maka penulis menetapkan batasan-batasan sebagai berikut: 1. Penandaan F(ab’)2-nimotuzumab dengan 177Lu. 2. Uji kestabilan 177Lu-SCN-Bz-DOTA-fragmen-F(ab’)2-nimotuzumab.

1.3

Perumusan Masalah 1. Bagaimana cara peparasi atau penyiapan kandidat radiofarmaka 177LuSCN-Bz-DOTA- F(ab’)2-nimotuzumab? 2. Bagaimana uji stabilitas sediaan kandidat radiofarmaka 177Lu-SCN-BzDOTA-F(ab’)2-nimotuzumab?

1.4

Tujuan Penelitian Penelitian ini dilakukan untuk memperoleh kandidat radiofarmaka 177

Lu-SCN-Bz-DOTA-F(ab’)2-nimotuzumab

dan

mengetahui

kestabilannya.

1.5

Hipotesa Hipotesis dari penelitian ini adalah : 177

Lu–SCN-Bz-

dilakukan

dengan

1. Peparasi atau penyiapan kandidat radiofarmaka DOTA-F(ab’)2-nimotuzumab

dapat

mengkonjunggasikan p-SCN-Bz-DOTA pada F(ab’)2-nimotuzumab yang

diikuti

dengan

Nimotuzumab dengan 2. Sediaan

kandidat

penandaan

p-SCN-Bz-DOTA-F(ab’)2

177

Lu.

radiofarmaka

177

Lu–SCN-Bz-DOTA-F(ab’)2-

Nimotuzumab memiliki stabilitas yang baik dilihat dari

177

Lu yang

tidak terlepas dari 177Lu-DOTA-nimotuzumab.


5

1.6

Manfaat Penelitian 1. Untuk memberikan informasi tentang fragmen F(ab’)2-nimotuzumab yang ditandai dengan 177Lu sebagai kandidat radiofarmaka untuk terapi kanker over expressed HER-1. 2. Jika dimungkinkan, hasil dari penelitian ini dapat dikembangkan menjadi radiofarmaka setelah diuji preklinis dan klinis. Sehingga dapat menambah daftar obat baru sebagai salah satu alternatif terapi kanker over expressed HER-1 yang lebih efektif. 3. Hasil penelitian ini bisa dipublikasikan pada jurnal ilmiah.


BAB II TINJAUAN PUSTAKA

2.1

Kanker Sel abnormal terjadi karena kerusakan gen untuk mengontrol pertumbuhan, mitosis dan apoptosis sel yang berakumulasi menjadi tumor. Kerusakan ini bisa disebabkan oleh bawaan atau hereditas yang diturunkan dari gen ayah atau ibu dan mutasi gen yang disebabkan dari lingkugan seperti polusi, rokok, zat kimia dan lain-lain. Mutasi gen dapat menekan terjadinya proses apoptosis sehingga sel kanker tidak mengalami kematian sel layaknya sel normal. Sel kanker dapat menyebar ke tempat atau organ tubuh lain melalui aliran darah dan sistem limphatik disebut metastasis dan juga dapat langsung menginvasi jaringan di sekitarnya (Galsky, 2010). Tumor atau neoplasma dibagi menjadi dua jenis yaitu benign dan malignant

tumor.

Benign

tumor

merupakan

tumor

yang

tidak

bermetastasis dan menginvasi jaringan di sekitarnya. Sedangkan malignant tumor yang juga disebut sebagai kanker dapat menginvasi dan bermetastasi sehingga dalam penangannya tidak bisa hanya dilakukan operasi (Copper, 1993).

2.2

Etiologi Kanker Penyebab utama untuk terjadinya kanker pada manusia belum diketahui. Pada tahun 1775 Persival Pott, menemukan scrotum banyak dijumpai pada

orang yang

bekerja

bahwa kanker di pabrik yang

memakai cerobong asap. Setelah dipelajari, ternyata hidrokarbon yang berhasil diisolasi dari batu bara merupakan carcinogenic agent. Berbagai faktor penyebabnya antara lain : 1. Zat-zat karsinogenik a. Kimia Contoh zat kimia yang dihubungkan dengan terjadinya kanker yaitu : -

Benzene

: Leukemia akut.

6


7

-

Jelaga batu bara: kanker kulit, laring, dan bronkhus.

b. Fisika Karsinogenik fisik yang utama adalah radiasi ion. c. Drug- Induced Cancer Contoh obat yang dihubungkan dengan terjadinya kanker yaitu: -

Alkilator seperti melphalan dan cyclophosphamide: leukemia dan kanker kandung kemih.

2. Virus-virus onkogenik Dua jenis virus yang dikenal dapat menyebabkan keganasan yaitu: a. RNA virus : leukemia, sarkoma dan urinari papiloma serta kanker payudara. b. DNA virus dianggap sebagai penyebab kanker : Eipstein Barr virus, papilloma virus, Hepatitis B virus. Eipstein (EBV) dianggap

sebagai

Barr virus

penyebab dari kanker nasofaring.

Hepatitis B virus berhubungan dengan hepatocelluler carcinoma primer. 3. Faktor herediter Beberapa kanker diturunkan secara autosomal dominant seperti neuroblastoma rectum, kanker tiroid dan ada yang diturunkan secara autosomal recessive seperti xeroderma pigmentosa. Namun sulit ditentukan apakah kanker terjadi karena faktor herediter sendiri atau karena kombinasi faktor-faktor lain seperti lingkungan, kebiasaan hidup dan makanan. 4. Faktor lingkungan Faktor lingkungan seperti polusi udara, kontaminasi air, proses makanan termasuk pemakaian nitrat, nitrosamin untuk pengawetan daging serta sakarin, diduga mempunyai sifat karsinogen yang potensial. 5. Faktor sosio ekonom Walaupun belum diketahui dengan pasti, faktor sosial ekonomi ternyata tampak mempengaruhi insidensi kanker. Kanker gaster dan cervix dijumpai lebih tinggi pada golongan sosio ekonomi rendah,


8

sekitar tiga sampai empat kali lebih banyak daripada golongan sosio ekonomi menengah dan tinggi (Pasaribu, 2006).

2.3

Antibodi Antibodi merupakan protein-protein globular yang dikodekan oleh gen-gen yang spesifik, dihasilkan oleh sistem imun sebagai

respon

terhadap keberadaan antigen. Antibodi ini terdiri dari dua fragmen Fab (antigen-binding fragment) dengan fragmen Fc (constant fragment). Sebuah antibodi terususun atas 4 rantai polipeptida yaitu dua rantai berat (heavy chain) identik dan dua rantai ringan (light chain) identik yang saling berhubungan dengan ikatan disulfida membentuk molekul berbentuk Y yang mempunyai area hinge (engsel) fleksibel (Gambar 2.1).

Gambar 2.1. Struktur molekul antibodi. [Fried & Hadensenos, 2006] Keterangan : CL: light chain domain, VH : heavy chain variable domain, CH : heavy chain constant.

Daerah variabel suatu antibodi yang berada pada rantai berat dan ringan terletak di bagian ujung lengan Y membentuk dua sisi pengikat (bivalent) antigen dimana berperan dalam spesifitas suatu antibodi terhadap antigen tertentu. Sedangkan daerah konstan berperan dalam pembagian kelas antibodi dimana lengan Y dan batang molekul selalu


9

identik pada semua antibodi dari kelas yang sama. Salah satu kelas antibodi yaitu molekul IgG merupakan antibodi berjumlah 80 - 85% dari keseluruhan antibodi yang bersirkulasi dan merupakan satu-satunya antibodi yang dapat menembus plasenta. Molekul IgG berfungsi sebagai pelindung terhadap mikroorganisme dan toksin yang bersirkulasi, mengatifasi sistem komplemen, dan meningkatkan keefektifan sel fagosit (Sloane, 2003). Kohler

dan

Milstein

menjelaskan

cara

mengisolasi

dan

mengembangkan antibodi monoklonal murni spesifik dalam jumlah banyak yang didapat dari campuran antibodi hasil respon imun. Tikus yang telah diimunisasi dengan antigen khusus ke dalam sumsum tulang akan menghasilkan sel limfosit B yang memiliki masa waktu hidup terbatas

dalam

kultur,

hal

tersebut

dapat

diatasi

dengan

cara

menggabungkan dengan sel limfosit B tumor yang abadi. Hasil campuran hibridoma dipilih hibridoma yang memiliki dua kemampuan yaitu menghasilkan antibodi khusus dan dapat tumbuh dalam kultur. Hibridoma yang berasal dari satu limfosit akan menghasilkan satu jenis antibodi yang akan mengenali satu jenis antigen. Antibodi tersebutlah yang disebut dengan Antibodi monoklonal (mAb) (Alberts, Johson, Lewis, Raff, Robert, & Walter, 2002; Abbas & Lichtman, 2005). Antibodi monoklonal diklasifikasikan menjadi 4 tipe (Gambar 2.2), yaitu: 1. Antibodi monoklonal Murine Antibodi monoklonal murine merupakan antibodi murni dari tikus yang dapat menyembabkan human anti-mouse antibodies HAMA. HAMA menyebabkan eliminasi terapi antibodi menjadi cepat dan menimbulkan efek samping serius yang merugikan. Contoh antibodi ini adalah muromunab.


10

2. Antibodi monoklonal Chimeric Antibodi monoklonal chimeric adalah antibodi gabungan tikus dan manusia dimana Fc antibodi manusia dan Fab antibodi monoklonal tikus dimana hampir 70% human sequences. Contoh antibodi ini adalah infiliximab.

3. Antibodi monoklonal Humanized Antibodi monoklonal humanized mengandung 5 - 10% murine yang cara pembuatannya sama dengan cara membuat antibodi monoklonal chimerics. Antibodi ini menunjukan sedikit atau tidak ada respon human immunological yang merugikan. Contoh dari antibodi golongan ini adalah nimotuzumab.

4. Antibodi monoklonal Fully human Antibodi monoklonal fully human merupakan antibodi yang keseluruhannya antibodi manusia. Contoh antibodi ini adalah adalimumab (Pandit, 2007; T. Smith, 2008).

Gambar 2.2. Murine, chimeric, humanized, dan human Abs. [Pelat, Thibaut., Avril, Arnaud., Chahboun, Siham., Mathieu, Jacques., & Thullier, Philippe., 2011] Empat Tipe Antibodi Monoklonal


11

2.4

Fragmentasi Antibodi Monoklonal Oleh Enzim

Gambar 2.3. Fragmentasi antibodi klas IgG dengan papain, pepsin, dan merkaptoetanol. [T. Smith, 2008]

Antibodi monoklonal dapat difragmentasi menjadi beberapa jenis fragmen dengan menggunakan enzim seperti pepsin dan papain dan juga dengan merkaptoetanol (Gambar 2.3) memperlihatkan skema fragmentasi. Enzim pepsin memotong molekul imunoglobulin pada sisi terminal-C hinge region menghasilkan fragmen F(ab’)2 dan degradasi fragmen Fc. Sementara itu merkaptoetanol menghasilkan dua heavy chain dan dua light chain (Hermanson, 1996). 2.5

Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) Growth factor dan reseptor kinase transmembran berperan penting dalam proliferasi, survival, adesi, migrasi dan differensiasi. EGFR terdiri dari empat reseptor transmembran, yaitu: EGFR (HER1/erbB-1), HER2 (erbB-2/neu), HER3 (erbB-3) dan HER4 (erbB-4). EGFR (HER1/erbB-1) merupakan glikoprotein 170 kDa yang terdiri dari 3 domain fungsional utama yaitu domain ligan ikatan ekstraseluler, domain transmembran hidrofilik dan domain tirosin kinase sitoplasmik (Gambar 2.4).


12

Gambar 2.4. Ilustrasi skematik jalur EGFR pengaruh terhadap sel dan jaringan. [Santoso & Suharti, 2009] Keterangan: Lokasi inhibitor EGFR dapat ditempati monoklonal antibodi (Abs) dan tyrosine kinase inhibitor (TKIs)

EGFR memberikan jalur sinyal transduksi intraseluler seperti Ras/mitogen-activated protein kinase (MAPK). Ikatan growth factor dan reseptornya merupakan awal organisasi dan proses biokimia sel. Proses tersebut adalah aktivasi reseptor, kaskade fosforilasi dengan identifikasi protein kinase dan pada tingkat nukleus terjadi aktivasi faktor transkripsi. Interaksi sistem EGFR dan kaskade Ras / kaskade MAPK yang merupakan salah satu jalur sinyal seluler utama. Respon biologi terhadap sinyal EGFR adalah pleiotropik, yaitu: mitogenesis, penurunan apoptosis, mempercepat motilitas sel, sekresi protein dan differensiasi atau dedifferensiasi. Efek aktivasi EGFR pada sel tumor beragam dan konvergen sehingga terjadi pertumbuhan sel yang tidak terkontrol, peningkatan mobilitas, proliferasi sel, invasi, metastasis, penurunan kemampuan apoptosis serta stimulasi angiogenesis. Pada keadaaan normal EGFR terekspresi oleh banyak jenis sel seperti epitel dan jaringan mesenkim. Tetapi terdapat variabilitas rekspresi atau disregulasi EGFR pada keganasan. Sebagian besar kanker epitel banyak mengekspresikan EGFR


13

dengan kata lain overekspresi. Overekspresi EGFR terjadi pada kanker kandung kemih, otak, payudara, servik, uterus, kolon, esofagus, glioma, ovarium, ginjal dan paru non-small-cell. Tumor dengan ekspresi EGFR cenderung lebih agresif dan invasif (Santoso & Suharti, 2009). Antibodi monoklonal (mAb) menargetkan komponen ekstraselular EGFR

dan

protein

sinyal

lain

dianggap

berhubungan

dengan

tumorigenesis, seperti ErbB230 dan vascular endothelial growth factor (VEGF). Antineoplastik berikatan EGFR mAb yang menunjukkan potensi antikanker termasuk cetuximab, panitumumab, zalutumumab, matuzumab, necitumumab, dan nimotuzumab. Diyakini agen tersebut bekerja dengan menempel pada epitop EGFR ekstraseluler dan secara sterik menghambat protein membentuk konformasi dimerisasi optimal atau alternatif menghalangi interaksi EGFR (Boland & Bebb, 2009).

Gambar 2.5. Mekanisme kerja obat anti-EGFR pada sel kanker. [Ciardiello & Tortora, 2008]


14

2.6

Radionuklida Radionuklida dalam bidang kedokteran sekitar 95% digunakan untuk diagnosa (Aziz & Suherman, 2013). Namun dengan berkembangnya penelitian, aplikasi radionuklida dalam terapi mulai berkembang pesat. Dalam terapi radiasi dikenal dua jenis teknik pemberian radiasi yaitu teleterapi (radiasi eksternal) yang menggunakan radiasi dari luar tubuh dan brakiterapi (terapi radiasi jarak singkat) dimana menggunakan sumber radioaktif yang ditanamkan di dekat kanker dalam tubuh pasien. Sifat radiasi ionisasi dapat berupa radiasi elektromagnetik (sinar-X dan sinar gamma) atau partikel (partikel alfa, neutron, meson pi negatif dan ion berat). Secara klinik, terapi radiasi dengan radiasi elektron dan sinar beta (elektron dihasilkan selama peluruhan inti) paling bermanfaat. Untuk terapi secara in vivo, radionuklida yang banyak digunakan adalah pemancar-β (Sabiston, 1987; Rasjidi, 2009; Venkatesh & Chakraborty, 2005). Pemilihan suatu radionuklida untuk suatu radiofarmaka sangat tergantung pada aplikasinya. Radiofarmaka untuk pencitraan digunakan radionuklida pemancar positron atau gamma dengan waktu paruh (T ½) minimum.

Radiofarmaka

untuk

terapi

sementara

itu

pencitraan

karakteristik peluruhan, jarak tembus dan energi dari partikel yang dipancarkan, lokalisasi yang spesifik, mudah diproduksi, farmakokinetik dan aktivitas jenis yang memadai (Aziz & Suherman, 2013; Leswara, 2007). Radionuklida untuk penandaan peptida dan antibodi harus memiliki kemurnian radiokimia dan kemurnian radionuklida yang sangat tinggi, dimana persyaratan kemurnian radiokimia yang baik biasanya adalah 95% - 100%. Kemurnian radiokimia ini penting untuk mengetahui apakah sediaan tersebut berada dalam bentuk senyawa kimia seperti yang diinginkan atau tidak sehingga dapat memperkecil terjadinya penimbunan pada organ lain (Nurlaila, 2007).


15

2.7

Lu-177 Salah satu radionuklida golongan lantanida yang saat ini banyak diteliti dan juga digunakan untuk terapi kanker adalah radionuklida

177

Lu.

Studi literatur memperlihatkan saat ini setidaknya tidak kurang dari 30 macam senyawa bertanda 177Lu telah digunakan dan / atau dalam status uji klinis untuk penanganganan kanker colon, kanker tulang metastasis, limpoma non-Hodgkin dan kanker paru-paru (Kadarisman, Herlina, & Sriyono, 2011). Lu-177 mempunyai waktu paruh (T1/2) 6,7 hari dimana ketika meluruh mengemisikan partikel β- berenergi sedang dengan energi maksimum sebesar 497 keV (78%) yang ideal untuk terapi tumor jaringan lunak. Kemampuan penetrasi emisi partikel β- antara 0,04 sampai 1,8 mm sehingga dapat membunuh sekitar 4 sampai 180 sel tumor.

177

Lu juga

memancarkan radiasi γ 208 keV yang memungkin scintigraphy dan dosimetry.

Toksisitas

invivo

dapat

diminimalkan

meminimalkan pelepasan isotop dengan membuat

177

dengan

cara

Lu sebagai kompleks

logam yang stabil secara termodinamika dan kinetis untuk antibodi monoklonal (mAb) atau immunoprotein dengan bifunctional chelating agent (Kassis, 2011; Gansow, 1991; Kadarisman, Herlina, & Sriyono, 2011). . 2.8

Nimotuzumab Nimotuzumab yang sebelumnya diketahui sebagai hR3 merupakan anti kanker Humanized antibodi IgG 1 kelompok inhibitor epidermal growth factor receptor (EGFR) turunan dari plasenta manusia. Senyawa ini mencegah sel kanker menerima pesan yang dibutuhkan sel untuk tumbuh, berkembang dan menyebar dengan cara menghambat protein epidermal growth factor reseptor yang terdapat pada permukaan sel kanker dan dapat menghambat hasil vascular endothelial growth factor (VEGF). Penghambatan ikatan ligan dan aktivitas reseptor ini terjadi karena nimotuzumab menghambat aktivitas protein tirosin kinase dan berikatan dengan afinitas yang optimal serta spesifisitas tinggi pada daerah


16

ekstraseluler dari EGFR (Reddy & Couvreur, 2010; Godewijckstraat, 2012; Acton, 2013; Humani, Ramli, Rustendi, & Subur, 2010). Nimotuzumab mengikat reseptor berdasarkan densitas EGFR, tidak berakumulasi pada permukaan sel pada jaringan yang sehat seperti kulit, mukosa GI, dan ginjal. Hal ini membuktikan bahwa nimotuzumab mempunyai aktivitas yang sama dengan antitumor penghambat EGFR lain tanpa menimbulkan efek samping yang berat terhadap jaringan yang sehat. Nimotuzumab diharapkan memiliki aktivitas sinergis dengan agen yang lebih lanjut meningkatkan aktivitas EGFR, seperti radiasi yang mengandung rejimen (Tikhomirov, Garrido, Yang, Sherman, & Perez, 2008). Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan oleh Martalena et al., (2012) nimotuzumab yang ditandai dengan

177

Lu lebih banyak membunuh

sel kanker (kanker paru-paru) dari pada nimotuzumab yang tidak ditandai. Dengan demikian agar efektivitas nimotuzumab meningkat seperti yang telah dilakukan pada penelitian Martalena et al., nimotuzumab sebaiknya dilabelkan dengan

177

Lu, dimana ketika nimotuzumab mengikat EFGR,

mengemisikan alpha-beta atau emitor-partikel yang diharapkan dapat menghentikan proliferasi dan metastasis sel kanker dengan mentransfer energi kepada sel kanker sekitarnya agar sel kanker lisis (Ramli, et al., 2012).

2.9

p-SCN-Bz-Dota Bifunctional chelating agent (BFCA) adalah senyawa khelat asiklik ataupun makrosiklik bifungsi yang mempunyai 2 fungsi yang berbeda dimana dapat membentuk komplek dengan mengikat logam seperti

177

Lu yang stabil secara termodinamika dan kinetik serta berfungsi

mengikat vektor terarah secara kovalen salah satu contohnya adalah mAb oleh gugus fungsi yang reaktif (E′ VA TO′ TH., 1994). Salah satu derivat tetraaza siklododekan tetra asam asetat yang banyak digunakan sebagai BFCA

adalah

2-(4-isothiocyanatobenzyl)-1,4,7,10-tetraazacyclo-


17

dodecane-1,4,7,10- tetraacetic acid (p-SCN-Bz-DOTA) (DOTA, Gambar 2.6) yang mempunyai berat molekul 688 g/mol dan larut baik dalam air

Gambar 2.6. Struktur DOTA (kiri) dan p-SCN-Bz-DOTA(kanan). [Brechbiel,2008]

Konjugasi mAb dengan p-SCN-Bz-DOTA didasarkan pada interaksi gugus amino dari mAb yang berikatan dengan gugus tiosianat dari p-SCN-Bz-DOTA oleh ikatan tiourea. Stabilitas

p-SCN-Bz-DOTA

dalam membentuk komplek dengan logam dipengaruhi oleh empat lengan karboksilat untuk membentuk komplek dan benzil yang terikat ke kerangka karbon (Patterson, 2013).

2.10

Sediaan Radiofarmasi Sediaan radiofarmaka menurut Wolf & Tubis (Leswara, 2007) adalah suatu senyawa radioaktif yang dimaksudkan untuk dimasukkan ke dalam tubuh manusia, baik untuk tujuan terapi maupun diagnosis serta mengalami perubahan metabolism di dalam tubuh. Menurut Y. Cohen sementara itu sediaan radiofarmaka adalah suatu senyawa radioaktif yang dimasukkan ke dalam tubuh manusia, baik secara oral maupun parenteral, serta tidak berada dalam wadah tertutup (sealed sources), karena itu akan ikut mengalami perubahan metabolisme di dalam tubuh. Sediaan radiofarmaka dapat digolongkan kedalam dua kelompok, yaitu berupa: a) Isotop perimer (primary radionuclide); b) Senyawa bertanda (labeled compound). Sediaan radiofarmaka dapat berupa larutan untuk pemakaian oral, kapsul gelatin untuk pemakaian oral dan larutan


18

injeksi. Ada beberapa persyarat untuk larutan injeksi yang biasanya harus dipenuhi, seperti sterilitas, isotonisitas, dan bebas pirogen. Pemeriksaan kemurnian sediaan radiofarmaka terdiri dari : 1. Pemeriksaan fisika, pemeriksaan ini meliputi pengujian kemurnian radiokimia dan konsentrasi radioaktif. 2. Pemeriksaan kimia, pemeriksaan ini termasuk pengujian kemurnian radiokimia untuk mengetahui apakah zat aktif yang telah ditentukan berada pada bentuk kimianya, penentuan pH, dan penetapan kadar. 3. Pemeriksaan

biologi,

pemeriksaan

biologi

meliputi

uji

sterilitas, pirogenitas, dan toksisitas. (Leswara, 2007).

2.11

Kromatografi Eksklusi Ukuran atau Size Exclusion Chromatography (SEC)

Gambar 2.7. Pemisahan 2 ukuran molekul dengan SEC. Keterangan :1) campuran sampel sebelum masuk ke kolom; 2) campuran kolom mulai masuk ke bagian atas koom; 3) pemisahan berdasarkan ukuran; dan 4) pemisahan sempurna

Kromatografi eksklusi ukuran merupakan pemisahan kromatografi cair dengan sinonim diantaranya GFC (gel-filtration chromatography), GPC (gel permeation chromatography) dan kromatografi gel (Wu, 1995).


19

Pemisahan campuran menggunakan GFC (gel-filtration chromatography) berprinsipkan memisahkan campuran berdasarkan ukuran molekul. Berat molekul yang kecil akan terjebak masuk kedalam pori-pori gel sedangkan berat molekul yang besar akan terbawa dengan pelarut menurunin kolom dan keluar terlebih dahulu (Gambar 2.7). Dengan demikian pemisahan dapat dilakukan pada molekul-molekul yang mempunyai ukuran yang berbeda. Contoh GFC yaitu Sephadex G-25 berguna untuk memisahkkan molekul-molekul dengan berat molekul sekitar 1000 sampai 5000 (Day & Underwood, 2001).

2.12

Kromatografi kertas atau lapis tipis (KLT) Kromatografi lapis tipis atau TLC (thin layer chromatography) dapat disebut juga kromatografi planar merupakan kromatografi berupa lempeng kaca, plastik, atau alumunium yang dilapisi dengan adsorben berupa

alumina, gel silica, dan selulosa dengan ketebalan adsorben

tersebut sekitar 0,1 mm sampai 0,3 mm. Lempeng yang paling umum digunakan berukuran 8 x 2 inci (Day, 2001). Jarak yang ditempuh oleh senyawa dari garis awal (tempat senyawa ditotolkan pada pelat) dibagi dengan jarak yang ditempuh oleh pelarut disebut ‘nilai Rf’ senyawa tersebut (Watson, 2005).

2.13

SDS- PAGE Sodium deodesil sulfat / soduim lauril sulfat (SDS–PAGE) merupakan metode yang digunakan untuk analisis protein secara kuantitatif dengan memisahkan

protein

berdasarkan

ukurannya.

SDS-PAGE

sering

digunakan untuk menentukan berat molekul protein (walaupun tidak akurat untuk beberapa kasus), memonitoring kemurnian protein, dan mengidentifikasi protein pada sampel yang komplek. Kekuatan dari sistem SDS-PAGE tidak hanya dari gel yang digunakan tapi juga denaturasi oleh SDS. SDS merupakan detergen yang memberikan muatan negatif sehingga terjadi unfolding membentuk konfigurasi linier. Banyaknya ikatan molekul SDS sebanding dengan


20

banyaknya asam amino pada protein. Mobilitas protein yang terdenaturasi oleh SDS berbanding terbalik dengan log berat molekulnya dimana protein yang besar bermigrasi lebih lama dibanding protein yang kecil.

Gambar 2.8. Pola pemisahan protein dengan SDS-PAGE. [Walker & Rapley, 2008] Keterangan : Protein terdiri dari subunit 50 dan 30 kDa yang terikat oleh jembatan sulfida akan bermigrasi menjadi 80 kDa pada kondisi dibawah nonreducing (ME; tidak terdapat 2-mercaptoetanol) dan terlihat dua pita (50 dan 30 kDa) pada kondisi dibawah reducing.

SDS-PAGE pada kondisi reduksi menggunakan agen pereduksi ikatan disulfida seperti 2-mekaptoetanol (2-ME). Dua kegunaan 2-ME yaitu: a) Sebagai pereduksi ikatan kovalen yang mungkin ada antar protein multimerik komplek b) Pereduksi ikatan kovalen yang ada dalam protein dimana meningkatkan resolusi dan memungkinkan keakuratan dari massa molekul. Perbandingan protein terisolasi pada reduksi dan non reduksi SDS-PAGE memudahkan penentuan apakah protein mungkin berikatan secara kovalen dengan protein lain dalam sel. Identifikasi protein pada gel menggunakan pewarna untuk memvisualisasikan pita atau spot pada gel. Pewarna yang sering dipakai salah satu contohnya yaitu Commassie Briliant Blue sebagai pewarna yang dapat berikatan dengan protein. Protein diwarnai pada gel PAGE dengan


21

pelarut metanol atau asam asetat. Pewarnaan Commassie Briliant Blue mempunyai batas deteksi 0,3 µg sampai 1 µg protein pada pita menunjukan tidak begitu sensitif sehingga penggunaan perwarna ini untuk protein yang komplek dan banyak pada gel (Corley, 2005).


BAB III METODOLOGI PENELITIAN

3.1.

Lokasi dan Waktu Penelitian Penelitian dilaksanakan dari bulan Februari hingga Juni 2014 di Laboratorium Pusat Teknologi Radioisotop dan Radiofarma (PTRR), Badan Tenaga Nuklir Nasional (BATAN), Gd. 11, Kawasan PUSPIPTEK, Serpong, Kota Tangerang Selatan.

3.2.

Metode Penelitian Penelitian

ini

dilakukan

secara

eksperimental.

Metodologi

penelitian meliputi fragmentasi antibodi monoklonal nimotuzumab, pengikatan bifunctional chelating agent (BFCA) p-benzyl isothiocyanate1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic

acid

(p-SCN-Bz-

DOTA) pada fragmen F(ab’)2-nimotuzumab, penandaan p-SCN-BzDOTA-fragmen F(ab’)2-nimotuzumab dengan diikuti dengan pemurnian dan uji stabilitas

177 177

Lu yang kemudian

Lu-p-SCN-Bz-DOTA-

fragmen F(ab’)2 -nimotuzumab.

3.3.

Alat dan Bahan

3.3.1

Alat Magnetic stirer (Labcompanion), Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) (Shimadzu VP Series Means) yang terdiri dari system controller (SCL-10A vp), HPLC pump (LC-10AD vp), solvent selector (FCV 10AL vp), detektor UV-Vis (SPD-10A vp),dan size exclusion column (SEC, Aglient Bio SEC-3, 7,8 x 300 mm), thermomixer (Eppendrof), termometer, water bath, Mini-PROTEAN Tetra Cell Electrophoresis (Bio-Rad), Scanner (HP Photosmart C4780), orbital shaker (Fisher Scientific), plate reader (Biotek), mikropipet, labu ukur, bakker glass, statif, kolom (10 x 1,2 cm) (Bio-Rad), neraca analitik (Satorius, BSA3235-CW, max. 320 g), neraca analitik (Denver, 210 g-

22


23

0,001 g), spatula, batang pengaduk, pipet tetes, sentrifus (Hettich EBA 8 S) dose calibrator, rotor, dan sentrifus berpendingin (Alegra 64 R).

3.3.2

Bahan Nimotuzumab (Innogene, Kalbe Tech), HCl, NaOH, Lu-177 (177LuCl3) diperoleh

dengan cara mengirradiasi

176

Lu (176Lu2O3,

pengkayaan 39,60%, Isoflex,) di RSG-GAS yang kemudian diproses di laboratorium PTRR, bovine serum albumin (BSA, Sigma), resin penukar ion Chelex 100 (Bio-Rad), NaCl, asam asetat glasial, natrium asetat, dipotasium hidrogen fosfat, metanol, potasium dihidrogen fosfat, sodium dodecyl sulfat (SDS) 10%, pewarna protein (Bio-Rad), p-SCN-Bz-DOTA, larutan pewarna Coomasie Blue G-250 (Bio-Rad), pepsin serbuk (Sigma), Trizma base, air bebas ion (hambatan 18,2 MegaOhm), EDTA (E.Merck), N,N,N’N’-tetramethylenthylenediamine (TEMED), ammonium peroxide disulfate (APS), amonium asetat, protein filter (10.000 MWCO, 5ml, Viva Science), bromophenol blue, β-merkaptoetanol, gliserol, phosphate buffered salin (PBS), Mini-PROTEAN TGX 4-20% (Bio-Rad), N’N’-bismethylene-acrylamide, celex (Bio-Rad), akrilamid, Sephadex G-25, PD-10 dan glisin.

3.4

Fragmentasi Nimotuzumab

3.4.1

Pemurnian Nimotuzumab Nimotuzumab dimurnikan dari zat tambahan lainnya dengan cara dialisis. Sejumlah nimotuzumab (12,5 mg, 2,5 mL) dimasukkan kedalam kaset dialisis (20 KD MWCO) dan kemudian didialisis dalam 0,02 M dapar asetat pH 4,5 pada suhu 4 0C selama 72 jam dengan penggantian dapar setiap 24 jam. Nimotuzumab hasil dialisis diukur konsentrasinya menggunakan spektofotometri UV-Vis dan dianalisis lebih lanjut dengan KCKT (Humani, Ramli, Rustendi, & Subur, 2010).


24

3.4.2

Fragmentasi Nimotuzumab Menjadi F(ab’)2 0,625 mg pepsin (3200 U/mg) ditambahkan ke dalam 2,5 mL larutan nimotuzumab (5mg/mL)

dengan perbandingan 1:4 (mg/mL).

Campuran diinkubasi dengan Thermomixer pada 300 rpm selama 14 jam pada suhu 37 0C.

Proses fragmentasi kemudian dihentikan dengan

penambahan 3,75 mL tris-HCl pH 8,0. Campuran siap untuk proses pemurnian (Haryuni, et al., 2014).

3.4.3

Pemurnian F(ab’)2-Nimotuzumab Fragment F(ab’)2-nimotuzumab dipisahkan dari fragmen Fc dengan menggunakan kolom PD-10 di pre-blocked dengan bovine serum albumin dan pre-equilibrated dengan dapar fosfat 0,01 M pH 7,4. Sejumlah (0,5 µL) campuran hasil fragmentasi dimasukan ke bagian atas kolom yang diikuti dengan proses fraksinasi dengan eluen dapar fosfat 0,01 M pH 7,4. Eluat kemudian ditampung dalam tabung mikro (20 tabung, 0,25 mL/ tabung). Sejumlah cuplikan (10 µL) kemudian diambil dari setiap fraksi dan dimasukkan kedalam 96 micro well. Ke dalam setiap cuplikan ini kemudian ditambahkan 90 µL pewarna protein (BioRad, ¼ v/v dalam H2O) yang dilanjutkan dengan pengamatan perubahan warna / absorbansi untuk melihat keberadaan protein hasil fraksinasi. Fraksi-fraksi yang memberikan warna biru / absorbansi kemudian dianalisis lebih lanjut dengan KCKT dan SDS-PAGE (non-pereduksi dan pereduksi) (Haryuni, et al., 2014).

3.4.4

Analisis F(ab’)2-Nimotuzumab Menggunakan KCKT Analisis F(ab’)2-nimotuzumab menggunakan perangkat KCKT (Shimadzu) yang dilengkapi dengan size exclusion column (SEC, Bio-SEC S250,7,7 x 300 mm) dan detektor UV-Vis (280 nm). Kolom kemudian dielusi secara isokratik dengan 0,01 M PBS pH 7,4 (laju alir 1mL/menit) (Hermanto, Haryuni, Ramli, Mutalib, & Hudiyono, 2012).


25

3.4.5

Analisis F(ab’)2-Nimotuzumab Menggunakan SDS-PAGE Analisis F(ab’)2-nimotuzumab dengan SDS-PAGE dilakukan dengan

menggunakan

perangkat

Mini-PROTEAN

Tetra

Cell

Electrophoresis (Bio Rad). Elektroforesis dilakukan selama 60 menit dengan tegangan 150 volt. Penanda yang digunakan adalah standar protein dengan rentang berat molekul antara 7,1 sampai 209 kDa. Coomasie briliant blue 0,1 % sebagai pewarna protein. Pencucian menggunakan stained gel campuran metanol : larutan asam asetat (40% : 7,5%) (Hermanto, Haryuni, Ramli, Mutalib, & Hudiyono, 2012).

3.4.6

Pemekatan Protein dengan Protein Filter F(ab’)2-nimotuzumab dipekatkan dengan protein filter (MWCO 10.000) yang telah dijenuhkan dengan 10µL BSA 2,5% yang kemudian dikondisikan dengan fosfat

(K2HPO4) 0,1 pH 7,4. Sejumlah F(ab’)2

Nimotuzumab (2 mL) dimasukan kedalam protein filter (MWCO 10.000) yang kemudian disentrifuse pada 2.500 rpm selama 1 jam sampai volume menjadi 1 mL (Haryuni, et al., 2014).

3.5

Penyiapan 177LuCl3 177

LuCl3 disiapkan dengan cara mengiradiasi

0,4 mg

177

Lu

(176LuO3, pengkayaan 39,60%, di RSG-GAS selama 4 hari). Target yang telah diiradiasi kemudiaan dipindahkan kedalam gelas beaker dan kemudian diikuti dengan penambahan 2 mL HCl 6M. Campuran kemudian didiamkan selama 30 menit sebelum penambahan 2 mL H2O2. Campuran reaksi kemudian dipanaskan dengan pengadukan sampai kering. Garam Lu-177 yang terbentuk kemudian dilarutkan dengan 3 mL HCl 0,025 M (Humani, Ramli, Rustendi, & Subur, 2010).

3.6

Konjugasi p-SCN-Bz-DOTA pada F(ab’)2-Nimotuzumab Kedalam sejumlah (1,27 x 10-5mmol) F(ab’)2-nimotuzumab ditambahkan larutan p-SCN-Bz-DOTA (2,545 x 10-4 mmol, dalam 1 mL dapar fosfat pH 8,5). Campuran kemudian diatur pHnya menjadi 8,5


26

dengan penambahan 0,1 M NaOH. Campuran kemudian diinkubasi pada 4 0C seharian. Immunokonjugat p-SCN-Bz-DOTA- F(ab’)2-nimotuzumab yang terbentuk kemudian dimurnikan dari hasil samping reaksi dengan cara dialisis menggunakan kaset dialisa (20 KD MWCO) (Vera, Eigner, Henke, Lebeda, Melichar, & Beran, 2012).

3.7

Analisis p-SCN-Bz-DOTA-F(ab’)2-Nimotuzumab dengan KCKT Analisis p-SCN-Bz-DOTA-F(ab’)2-nimotuzumab menggunakan perangkat KCKT (Shimadzu) yang dilengkapi dengan size exclusion column (SEC, Bio-SEC S250,7,7 x 300 mm) dan detektor UV-vis (280 nm). Kolom kemudian dielusi secara isokratik dengan PBS 0,01M pH 7,4 (laju alir 0,8 mL/menit) (Hermanto, Haryuni, Ramli, Mutalib, & Hudiyono, 2012).

3.8

Penandaan p-SCN-Bz-DOTA-F(ab’)2-Nimotuzumab dengan 177Lu Kedalam

sejumlah

ditambahkan sejumlah

177

p-SCN-Bz-DOTA-F(ab’)2-nimotuzumab

LuCl3 (1/3, v/v ammonium asetat 0,25 M pH 7,0).

Campuran reaksi kemudian diatur pH nya sampai menjadi 6,5 dengan penambahan larutan HCl 0,01 M atau 0,01 M NaOH yang dilanjutkan dengan proses inkubasi pada suhu 37 0C selama 1 jam. Pada akhir reaksi sejumlah larutan EDTA 0,01 M pH 6,0 ditambahkan secara berlebih (perbandingan mol EDTA : 177Lu = 20 : 1) yang dilanjutkan dengan proses inkubasi pada 37 0C selama 5 menit. Sejumlah cuplikan (5µL) kemudian diambil dan dianalisis untuk menentukan persentase penandaan dengan menggunakan kromatografi lapis tipis (KLT) dengan fase diam strip ITLC-SG (1 x 10 cm) dan fase gerak berupa larutan salin (NaCl 0,9%). Persentase penandaan dihitung berdasarkan total cacah yang berada dibawah puncak radioimmunokonjugat dibandingkan terhadap cacah total yang diaplikasikan pada strip KLT (Humani, Ramli, Rustendi, & Subur, 2010).


27

3.9

Pemurnian 177Lu-SCN-Bz-DOTA-F(ab’)2-Nimotuzumab Pemurnian

177

Lu-SCN-Bz-DOTA-F(ab’)2-nimotuzumab dilakukan

dengan menggunakan kolom Sephadex G-25 Medium (1,2 x 10 cm) yang sudah dijenuhkan dengan 2 mL larutan BSA 10%.

Campuran hasil

penandaan (4.7) dimasukan pada bagian atas kolom dan kolom kemudian dielusi dengan dapar pospat 0,01 M, pH 7,4 dengan kecepatan alir 1 mL/ menit. Eluat kemudian ditampung dalam tabung mikro (50 tabung, 0,5 mL tabung). Setiap fraksi eluat kemudian diukur radioaktifitasnya dengan Dose Calibrator. Fraksi yang menunjukan adanya radioaktifitas kemudian dianalisis dengan sistim KLT [(fase diam strip ITLC-SG,1 x 10 cm) dan fase gerak berupa fase gerak berupa larutan salin (NaCl 0,9%)]. Fraksifraksi yang mengandung

177

Lu- p-SCN-Bz-F(ab’)2-nimotuzumab dengan

kemurnian ~ 99,9% dikumpulkan dan siap digunakan untuk uji lebih lanjut (Humani, Ramli, Rustendi, & Subur, 2010).

3.10

Uji Stabilitas

177

Lu-SCN-Bz-DOTA-F(ab’)2-Nimotuzumab Pada Suhu

Kamar dan Pada 4 0C. Sejumlah

177

Lu-SCN-Bz-DOTA-F(ab’)2-nimotuzumab (100 μL)

disimpan pada suhu kamar dan pada suhu 4 0C. Secara berkala sejumlah cuplikan diambil dan kemudian dianalisis kemurnian radiokimianya dengan sistim KLT (fase diam strip ITLC-SG, 1 x 10 cm) dan fase gerak berupa larutan salin (NaCl 0,9%) (Humani, Ramli, Rustendi, & Subur, 2010).


BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

Dialisis Nimotuzumab Sediaan nimotuzumab seperti yang tertera pada brosurnya mengandung bahan utama nimotuzumab dan bahan pendukung lainnya seperti dibasik sodium pospat (Na2HPO4), monobasik sodium pospat (NaH2PO4), sodium klorida (NaCl), dan polisorbat 80 (Haryuni, 2013). Dialisis

dimaksudkan

untuk

memurnikan

dan

mengkondisikan

nimotuzumab dalam larutan dapar yang diinginkan. Pada penelitian ini sediaan nimotuzumab didialisis menggunakan kaset dialisis (20 KD MWCO) dalam 0,02 M dapar asetat pH 4,5 pada suhu 4 0C selama 72 jam dengan penggantian dapar setiap 24 jam. Sediaan nimotuzumab yang telah di dialisis selanjutnya dianalisis dengan KCKT. KCKT yang dilengkapi dengan kolom eksklusi ukuran dan detektor uv digunakan untuk menentukan kemurnian dan waktu retensi (rt) nimotuzumab sebelum dan sesudah dialisis serta setelah proses fragmentasi. Penentuan kemurnian nimotuzumab dilakukan dengan membandingkan persentase area puncak nimotuzumab terhadap total area puncak-puncak kromatogram cuplikan.

Penentuan rt yang merupakan

fungsi berat molekul (BM) dilakukan dengan membandingkan terhadap rt protein standar dengan BM antara 670000 – 1350 Dalton.

Respon Alat (mV)

4.1

Waktu Retensi (menit)

Gambar 4.1. Kromatogram standar protein.

28


29

Tabel 4.1. Komponen standar protein Protein Thyroglobuin γ-globulin ovalbumin myoglobin vitamin B12

Berat Molekul (Dalton) 670000 158000 44000 17000 1350

Retention Time (menit) 5,187 5,637 6,497 7,563 10,233

Gambar 4.1 dan Tabel 4.1 berturut-turut memperlihatkan kromatogram standar protein dan komponen, BM dan rt standard protein, sedangkan kromatogram nimotuzumab sebelum dan sesudah dialisis dapat

Respon Alat (mV)

dilihat pada Gambar 4.2.


Respon Alat (mV)

A


Respon Alat (mV)

B

C


Gambar 4.2. Kromatogram nimotuzumab. Keterangan : (A) nimotuzumab sebelum dialisis, (B) nimotuzumab sesudah dialisis dan (C) kondisi kolom SEC (Aglient Bio SEC-3) yang diinjeksikan blanko (air).


30

Nimotuzumab sebelum dan sesudah dialisis memberikan puncak dengan rt berturut-turut pada 5,743 dan 5,737 menit. Puncak nimotuzumab dengan rt tersebut jika dibandingkan rt standar protein (Tabel 4.1) maka BM

nimotuzumab

diperkirakan

sekitar

150.000

Da.

Kemurnian

nimotuzumab sebelum dan setelah didialisis berdasarkan persentase luas puncak berurut-turut adalah 96,6% dan 100%.

4.2

Fragmentasi Nimotuzumab Fragmentasi antibodi monoklonal atau imunoglobulin seperti nimotuzumab menjadi F(ab’)2 dapat dilakukan dengan menginkubasi antibodi monoklonal atau imunoglobulin dengan pepsin, dimana pepsin memotong molekul antibodi monoklonal atau imunoglobulin pada sisi terminal-C hinge region untuk menghasilkan fragmen F(ab’)2 dan degradasi fragmen Fc (Hermanson, 1996). Fragmentasi nimotuzumab untuk mendapatkan fragmen F(ab’)2 menggunakaan pepsin dilakukan selama 14 jam pada suhu 37 0C (Haryuni, et al., 2014). Proses fragmentasi kemudian dihentikan dengan tris HCl 10 mM pH 8 untuk inaktivasi pepsin. Hasil fragmentasi nimotuzumab dengan pepsin berupa F(ab')2 dan Fc kemudian dicuplik dan dianalisis dengan SDS-PAGE dan KCKT untuk melihat profil nimotuzumab sebelum dan sesudah

fragmentasi.

Fragmen

F(ab’)2-niomotuzumab

kemudian

dimurnikan dengan kolom PD-10 (Sephadex G-25 M).

4.3

Pemurnian F(ab’)2-Nimotuzumab Pemurnian F(ab’)2-nimotuzumab dari Fc nimotuzumab dilakukan dengan kolom PD-10 yang merupakan kolom kromatografi eksklusi ukuran. Pada proses pemisahan dengan kolom kromatografi eksklusi ukuran, molekul dengan BM yang besar akan terbawa dengan eluen melewati sela-sela gel sehingga keluar terlebih dahulu

dari kolom,

sedangkan molekul dengan BM yang kecil akan terjebak masuk kedalam pori-pori gel sehingga keluar lebih belakangan (Day & Underwood, 2001). Berdasarkan prinsip tersebut F(ab’)2-nimotuzumab akan turun terlebih


31

dahulu dibanding Fc nimotuzumab. Gambar 4.4. memperlihatkan cuplikan fraksi-fraksi hasil pemisahan F(ab’)2-nimotuzumab dari Fc nimotuzumab dengan kolom PD-10 yang telah diberi pewarna protein.

Gambar 4.3. Cuplikan fraksi-fraksi hasil pemisahan F(ab’)2 nimotuzumab dan Fc nimotuzumab setelah diberi pewarna protein. Gambar 4.3. diatas memperlihatkan bahwa hanya fraksi 13, 14, dan 15 memberikan memberikan warna biru yang mengindikasikan keberdaan protein. Fraksi-fraksi ini kemudian dianalisis lebih lanjut dengan KCKT dan SDS-PAGE.

4.4

Analisis Kemurnian F(ab’)2-Nimotuzumab SDS-PAGE merupakan metode yang digunakan untuk analisis protein secara kuantitatif dengan memisahkan protein berdasarkan BM nya. SDS-PAGE sering digunakan untuk menentukan BM protein (walaupun tidak akurat untuk beberapa kasus), memonitoring kemurnian protein, dan mengidentifikasi protein pada sampel yang kompleks (Corley, 2005). Gambar 4.4 memperlihatkan hasil analisis nimotuzumab sebelum dan setelah fragmentasi, standar protein dalam kondisi reduksi (4.4.a) dan non reduksi (4.4.b) dengan SDS-PAGE. Penentuan BM nimotuzumab sebelum dan setelah fragmentasi dengan SDS-PAGE dilakukan dengan membandingkan nilai Rf pita nimotuzumab (nilai Rf ini sebanding dengan BM) sebelum dan sesudah difragmentasi pada kondisi reduksi dengan βmerkaptoetanol dan kondisi non reduksi dengan nilai Rf pita-pita standar protein pada kondisi yang sama. Tabel 4.2 memperlihatkan Rf pita-pita standar dan BM protein - standar.


32

(c)

Gambar 4.4. Hasil analisis nimotuzumab sebelum dan setelah fragmentasi, serta fraksi hasil pemurnian dengan SDS-PAGE. Keterangan : (a) Reduksi dengan β-merkaptoetanol; (b) Non reduksi; S : Standar protein; N : Nimotuzumab; F : Nimotuzumab setelah fragmentasi (Fraksi No. 13; 14 dan 15); (c) Perbesaran pita F.

Tabel 4.2. Rf pita-pita standar Vs BM protein –standar.

No. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

BM (KDa) Myosin 250 Β-Galaktosidase 150 Phosphorylase b 100 BSA 75 Ovalbumin 50 Carbonic anhydrase 37 Soybean trypsin inhibitor 25 Lysozyme 20 Aprotinin 15 Insulin 10 Persamaan Protein

Log BM 2,398 2,176 2 1,875 1,699

0,194805 0,305195 0,396104 0,467532 0,584416

1,568

0,662338

1,398 1,301 1,176 1

0,785714 0,844156 0,922078 1 y = -1.659x + 2.682

Rf


33

Berdasarkan Tabel 4.2 kemudian disiapkan kurva kalibrasi standar potein (BM vs Rf) yang persamaannya adalah y = -1.659x + 2.682. Berdasarkan persamaan kurva kalibrasi standar protein, berat molekul dari 2 pita nimotuzumab dan 2 pita dari nimotuzumab setelah fragmentasi (heavy chain Fab, dan campuran dari light chain Fab dan fragmen Fc) pada kondisi reduksi berturut-turut adalah 49.08 kDa; 22.19 kDa; 21.65 kDa; dan 22.75 kDa. Hasil tersebut tidak jauh berbeda dengan berat molekul heavy chain Fab, dan campuran dari light chain Fab dan fragmen Fc dari F(ab’)2-trastuzumab yang telah dilaporkan Hermanto et al., yaitu sebesar 23 kDa dan 22 kDa.

Tabel 4.3. Hasil analisis nimotuzumab sebelum dan setelah fragmentasi dengan SDS-PAGE

Reduksi No Protein Berat Molekul Rf(cm) (kDa) mAb 0,597 49,08 1 nimotuzumab 0,805 22,19 heavy chain 0,799 21,65 2 Fab lightchain Fab dan 0,812 22,75 3 fragmen Fc 4 F(ab')2 tidak 5 diketahui

Non reduksi Berat Molekul Rf(cm) (kDa) 0,306

149,40

-

-

-

-

0,395

106,34

0,5

71,2

Sedangkan pada kondisi non reduksi,

berat molekul yang

diperoleh untuk nimotuzumab, dan 2 pita nimotuzumab setelah fragmentasi (F(ab')2-nimotuzumab dan protein yang tidak diketahui) berturut-turut adalah 149,40 kDa; 106,34 kDa; dan 71,20 kDa. Dibandingkan dengan literatur, berat molekul nimotuzumab, F(ab’)2, dan protein yang tidak diketahui pada kondisi non reduksi tidak jauh berbeda pula dengan yang telah dilaporkan oleh Xiques et.al., yaitu sebesar 153,44


34

kDa ;110,49 kDa; dan 72,44 kDa. Hasil analisa berat molekul terangkum pada Tabel 4.3. Berdasarkan hasil analisa SDS-PAGE pada kedua kondisi yaitu reduksi dan non reduksi menunjukan bahwa nimotuzumab telah terfragmen sempurna. Kromatogram hasil analisis kemurnian F(ab')2-nimotuzumab yang dimurnikan dengan kolom PD-10 dengan menggunakan KCKT yang dilengkapi dilengkapi dengan kolom eksklusi ukuran ditampilkan pada

Respon Alat (mV)

Gambar 4.5.


Gambar 4.5. Kromatogram F(ab’)2-nimotuzumab setelah dimurnikan dengan kolom PD-10. Kromatogram pada Gambar 4.5 memperlihatkan dua puncak dengan rt berurut-turut 6,037 dan 7,423 menit. Puncak pertama dengan rt menit dapat dipastikan adalah F(ab’)2-nimotuzumab karena rt nya lebih besar dari rt γ-globulin (5,637 menit, BM 158000 Dalton) dan lebih kecil dari rt ovalbumin (6,497 menit, BM 44000). Puncak kedua dengan rt 7,423 menit sedikit lebih besar dari rt myoglobin

(7,563 meit, BM 17000

Dalton) sementara itu adalah pengotor. Berdasarkan luas puncak kromatogram hasil analisa KCKT F(ab’)2-nimotuzumab yang telah dimurnikan dengan kolom PD-10 menunjukan kemurnian sebesar 89,1%. 4.5

Konjugasi F(ab’)2-Nimotuzumab dengan p-SCN-Bz-DOTA Proses konjugasi F(ab’)2-nimotuzumab dengan p-SCN-Bz-DOTA melibatkan pembentukan ikatan tiourea antara gugus –NH2 dari F(ab’)2nimotuzumab dengan gugus tiosianat dari p-SCN-Bz-DOTA (Patterson,


35

2013). Skema reaksi konjugasi antara F(ab’)2-nimotuzumab dengan pSCN-Bz-DOTA ditampilkan pada Gambar 4.6. Konjugat yang terbentuk didialisis menggunakan kaset dialisa dengan MWCO 20 kDa di dalam dapar amonium asetat untuk memurnikan

dari

p-SCN-Bz-DOTA

yang

tidak

terikat

dan

mengkondisikan dalam dapar yang sesuai untuk penandaan.

p-SCN-Bz-DOTA

Imunokonjugat p-SCN-Bz-DOTAF(ab’)2-nimotuzumab


Gambar 4.6. Skema reaksi konjugasi antara F(ab’)2-nimotuzumab dengan p-SCN-Bz-DOTA. Dalam penelitian ini dilakukan dengan perbandingan mol F(ab’)2 nimotuzumab terhadap p-SCN-Bz-DOTA yaitu 1 : 20 dan 1 : 50. Konjugat p-SCN-Bz-DOT-F(ab’)2-nimotuzumab yang terbentuk kemudian didialisis menggunakan kaset dialisis dengan MWCO 20 KDalton di dalam dapar amonium asetat untuk memurnikan dari p-SCN-Bz-DOTA yang tidak terikat dan mengkondisikan dalam dapar yang sesuai untuk penandaan. Konjugat kemudian dianalisis menggunakan KCKT yang dilengkapi dengan kolom eksklusi ukuran dan detektor UV dan dielusi dengan eluen PBS 0,01M dan kecepatan alir 0,8 mL/menit. Tabel 4.4 memperlihatkan rt p-SCN-Bz-DOTA-F(ab’)2-nimotuzumab dan

rt F(ab’)2-nimotuzumab

serta nimotuzumab sebagai pembanding. Pada Tabel 4.4 dapat dilihat rt puncak p-SCN-Bz-DOTA-F(ab’)2 nimotuzumab sedikit lebih kecil dibandingkan dengan

F(ab’)2-

nimotuzumab yang mengindikasikan telah terjadi konjugasi p-SCN-BzDOTA pada F(ab’)2-nimotuzumab sehingga BM menjadi sedikit lebih besar dibandingkan F(ab’)2-nimotuzumab.


36

Tabel 4.4. Waktu retensi (rt) p-SCN-Bz-DOTA-F(ab’)2-nimotuzumab dan rt F(ab’)2-nimotuzumab serta nimotuzumabhasil analisis dengan KCKT. Waktu retensi

Senyawa

(rt) (menit)

Nimotuzumab

6,98

F(ab')2nimotuzumab

7,60


7,26

Catatan: Kolom: eksklusi ukuran (SEC-18 Agilent), laju alir 0,8 mL/menit.

4.6

Penandaan Pembentukan F(ab’)2-nimotuzumab 177

radioimmunokonjugat

177

Lu-SCN-Bz-DOTA-

dilakukan dengan menambah sejumlah larutan

LuCl3 kedalam SCN-Bz-DOTA-F(ab’)2-nimotuzumab

yang diikuti

dengan pengaturan pH dan pemanasan. Skema reaksi pembentuan

177

Lu-

SCN-Bz-DOTA-F(ab’)2-nimotuzumab ditunjukan pada Gambar 4.7.

+ Imunokonjugat p-SCN-Bz-DOTAF(ab’)2-nimotuzumab

Radioimunokonjugat 177 Lu-SCN-BzDOTA-F(ab’)2nimotuzumab

Gambar 4.7. Skema reaksi pembentukan radioimunokonjugat 177

Lu-SCN-Bz-DOTA- F(ab’)2-nimotuzumab.

Radioimmunokonjugat

atau

177

Lu-SCN-Bz-DOTA-F(ab’)2-

nimotuzumab yang terbentuk seperti senyawa radiofarmaka yang lain harus memenuhi beberapa persyaratan yang salah satunya adalah kemurnian radiokimia. Kemurnian radiokimia yang tinggi (95% - 100%), dimaksudkan untuk mencegah atau memperkecil terjadinya penimbunan pada organ bukan target (Nurlaila, 2007).


37

Kemurnian radiokimia pada penelitian ini dilakukan dengan mengacu pada sistim KLT pada penandaan antibodi monoklonal dengan 177

Lu yang dilaporkan oleh Humani et al., (2010) yaitu menggunakan

sistim KLT dengan fasa diam ITLC-SG dan fasa gerak larutan salin. Humani et al., melaporkan bahwa antibodi monoklonal bertanda 177Lu dan 177

Lu bebas (177Lu yang tidak terikat pada antibodi monoklonal)

memberikan retardation factor (Rf) yang sama (0) pada KLT dengan fasa diam ITLC-SG dan fasa gerak larutan salin. Pada pengujian radiokimia antibodi monoklonal bertanda EDTA untuk mengikat

177

177

Lu oleh sebab itu selalu ditambahkan

Lu bebas yang akan membentuk

177

Lu-EDTA

dengan Rf = 1. Tabel 4.5 memperlihatkan Rf dari komponen-komponen yang

terlibat

pada

nimotuzumab dengan

proses

penandaan

SCN-Bz-DOTA-F(ab’)2-

177

Lu yang diuji dengan menggunakan sistim KLT

dengan fasa diam ITLC-SG dan fasa gerak larutan salin. Tabel 4.5. Rf dari komponen-komponen yang terlibat pada proses penandaan SCN-Bz-DOTA-F(ab’)2-nimotuzumab dengan 177Lu. Komponen

Rf

177

Lu

0

177

Lu + EDTA

1

177

Lu + F(ab’)2-nimotuzumab + EDTA

1

Nimotuzumab

0

177

0

Lu

+ SCN-Bz-DOTA-F(ab’)2-nimotuzumab + EDTA

(setelah dimurnikan)

Catatan: Sistim KLT dengan fasa diam ITLC-SG dan fasa gerak larutan salin (NaCl 0,9%).

Berdasarkan Tabel 4.5 dapat dilihat bahwa kemurnian radiokimia SCN-Bz-DOTA-F(ab’)2-nimotuzumab bertanda

177

Lu

dapat ditentukan

dengan sistim KLT dengan fasa diam ITLC-SG dan fasa gerak larutan salin, dimana SCN-Bz-DOTA-F(ab’)2-nimotuzumab bertanda memberikan Rf = 0 sedangkan

177

177

Lu

Lu bebas yang tidak terikat dengan

SCN-Bz-DOTA-F(ab’)2-nimotuzumab tetapi terikat pada EDTA (177Lu-


38

EDTA) memberikan Rf = 1. Tabel 4.5 juga memperlihatkan bahwa tidak ada

177

Lu yang terikat pada F(ab’)2-nimotuzumab yang tidak mempunyai

ligand DOTA. Penandaan SCN-Bz-DOTA-F(ab’)2-nimotuzumab dengan

177

Lu

dilakukan dengan rasio mol SCN-Bz-DOTA-F(ab’)2 nimotuzumab 1 : 1 terhadap 177Lu, dan pada akhir reaksi ditambahkan EDTA berlebih dengan rasio mol

20 : 1 terhadap

177

Lu. Langkah pertama dalam proses

penandaan yaitu menambahkan sejumlah

177

Lu kedalam amonium asetat

0,25 M yang kemudian dimasukan dalam tabung reaksi yang berisi larutan SCN-Bz-DOTA-F(ab’)2-nimotuzumab, yang kemudian dikuti dengan pengaturan pH, pemanasan pada 37 0C. ditambahkan

EDTA secara berlebih.

Pada akhir reaksi kemudian Efisiensi penandaan kemudian

ditentukan dengan pengujian sejumlah cuplikan dengan menggunakan sistim KLT dengan fasa diam ITLC-SG dan fasa gerak larutan salin. Gambar 4.8 memperlihatkan efisiensi penandaan SCN-Bz-DOTA-F(ab’)2 -nimotuzumab dengan

177

Lu terhadap lama waktu penandaan pada suhu

37 0C.

Gambar 4.8. Grafik optimasi waktu penandaan SCN-Bz-DOTAF(ab’)2-nimotuzumab dengan177Lu.

Pada Gambar 4.8 dapat dilihat bahwa lama waktu penandaan yang optimum adalah 45 menit, karena tidak ada lagi peningkatan efisiensi penandaan setelah pemanasan selama 45 menit..


39

Pada penelitian ini ada batch konjugat SCN-Bz-DOTA-F(ab’)2nimotuzumab yang berhasil disiapkan. Batch pertama disiapkan dengan rasio mol p-SCN-Bz-DOTA 20 : 1 terhadap F(ab’)2-nimotuzumab dan batch kedua dengan rasio mol p-SCN-Bz-DOTA 50 : 1 terhadap F(ab’)2nimotuzumab. Efisiensi penandaan kedua batch SCN-Bz-DOTA-F(ab’)2nimotuzumab tersebut dengan 177Lu diperlihatkan pada Tabel 4.6.

Table 4.6. Efisiensi penandaan p-SCN-Bz-DOTA-F(ab’)2nimotuzumabdengan 177Lu. p-SCN-BzDOTA 20

p-SCN-BzDOTAF(ab’)2 nimotuzumab

50

Efisiensi dengan

177

Ratio mol: F(ab’)2 nimotuzumab 1

Efisiensi penandaan 4,91%

1

penandaan

14,13%


Lu seperti terlihat pada Tabel 4.6 meningkat dari 4,91% (rasio

mol F(ab’)2-nimotuzumab dengan p-SCN-Bz-DOTA 1 : 20) menjadi 14,13% (rasio mol F(ab’)2-nimotuzumab dengan p-SCN-Bz-DOTA 1 : 50).

Peningkatan

efisiensi

penandaan

ini

diperkirakan

karena

meningkatnya jumlah DOTA yang terikat pada F(ab’)2-nimotuzumab sehingga pada saat ditandai dengan

177

Lu jumlah

177

Lu yang terikat pada

p-SCN-Bz-DOTA-F(ab’)2-nimotuzumab juga akan meningkat. Sesuai

dengan

persyaratan

kemurnian

radiokimia

suatu

radioimunokonjugat yang akan digunakan harus memiliki kemurnian radiokimia 95% - 100% oleh sebab itu perlu dimurnikan lebih lanjut. Pemurnian 177Lu-p-SCN-Bz-DOTA-F(ab’)2-nimotuzumab dari 177Lu bebas dalam bentuk

177

Lu-EDTA dilakukan dengan melewatkan campuran pada

kolom Sephadex G-25M yang kemudian dielusi dengan eluent dapar pospat 0,01 M pH 7,4. Sejumlah fraksi (0,5 mL/fraksi, sebanyak 50 fraksi) ditampung. calibrator.

Setiap fraksi kemudian diukur aktifitasnya dengan dose Gambar

4.9

memperlihatkan

radiokromatogram

hasil

pemurnian 177Lu-p-SCN-Bz-DOTA-F(ab’)2-nimotuzumab.


40

Gambar 4.9. Radiokromatogram hasil pemurnian 177Lu-SCN-Bz-DOTAF(ab’)2-nimotuzumab. Sesuai dengan prinsip kromatografi eksklusi ukuran molekul dengan BM yang besar akan keluar terlebih dahulu diikuti oleh molekul dengan BM yang lebih kecil. Berdasarkan radiokromatogram pada Gambar 4.9 dapat diperkirakan bahwa puncak pertama adalah

177

SCN-Bz-DOTA-F(ab’)2-nimotuzumab sedangkan puncak ke dua bebas dalam bentuk

177

Lu-p177

Lu

Lu-EDTA. Gambar 4.10a dan 4.10b berikut

memperlihat radiokromatogram fraksi yang diambil puncak pertama (Fraksi 17) dan puncak kedua (Fraksi 39).

a)


41

b)

Gambar 4.10. Radiokromatogram (a) Fraksi 17 dan (b) Fraksi 39. Berdasarkan radiokromatogram fraksi 17 memberikan Rf = 0 yang mengindikasikan

keberadaan

177

Lu-p-SCN-Bz-DOTA-F(ab’)2-

nimotuzumab dengan kemurnian radiokimia 99,9%. Fraksi 39 sementara itu memberikan Rf = 1 yang mengindikasikan keberadaan dalam bentuk 4.7

177

177

Lu

bebas

Lu-EDTA.

Uji Stabilitas Sediaan radiofarmaka sama halnya dengan sediaan obat yang lainnya harus cukup stabil dalam penyimpanan. Uji stabilitas penyimpanan dilakukan pada dua kondisi yaitu pada suhu kamar dan suhu 40C dalam beberapa waktu. Kestabilan

177


diuji dengan ITLC-SG dengan fasa gerak larutan salin utuk mengetahui kemurnian radiokimia. Syarat kemurnian radiokimia dari sediaan radiofarmaka harus memiliki kemurnian 95% - 100% (Nurlaila, 2007). Berdasarkan tabel 4.7 hasil uji stabilitas yang telah dilakukan pada 0, 24, 48, 72, dan 96 jam menunjukan bahwa

177

Lu-SCN-Bz-DOTA-

F(ab’)2-nimotuzumab yang disimpan pada suhu kamar dan 40 C masih stabil karena kemurniannya diatas 95 % yaitu berkisar antara 98,9% 99,9%.


42

Tabel 4.7. Persentase kemurnian pada suhu kamar dan 4 0C.

Jam

Suhu kamar

4 0C

0

99,9 ± 0,02%

99,9 ± 0,02%

24

99,9 ± 0,23%

99,5 ± 0,26%

48

99,6 ± 0,26%

99,9 ± 0,25%

72

99,8 ± 0,06%

98,5 ± 1,28%

96

99,6 ± 2,05%

98,9 ± 2,42%


BAB V KESIMPULAN DAN SARAN

5.1

Kesimpulan 177

Preparasi


sebagai

kandidat radiofarmaka telah berhasil dilakukan walaupun efisiensi penandaan

masih

kecil.

Penyiapan

177

Lu-SCN-Bz-DOTA-F(ab’)2-

nimotuzumab diawali dengan proses fragmentasi nimotuzumab dengan pepsin menjadi F(ab’)2-nimotuzumab selama 14 jam yang kemudian dimurnikan dengan kolom PD-10. Fraksi yang megandung F(ab’)2nimotuzumab dikonjugasi dengan p-SCN-Bz-DOTA untuk membentuk konjugat p-SCN-Bz-DOTA-F(ab’)2-nimotuzumab. Konjugat kemudian ditandai dengan

177

Lu selama 1 jam pada suhu 370C dilanjutkan dengan

pemurnian dengan kolom sephadex G25 M. Kemurnian radiokimia

177

Lu-

SCN-Bz-DOTA-F(ab’)2-nimotuzumab yang berhasil diperoleh pada penelitian adalah sebesar 99,9%. Uji stabilitas

177

Lu-SCN-Bz-DOTA-

F(ab’)2-nimotuzumab pada suhu 4 0C dan suhu kamar selama 96 jam menunjukan

177

Lu-SCN-Bz-DOTA-F(ab’)2-nimotuzumab stabil dengan

kemurnian radiokimia berkisar 98,9% - 99,9%.

5.2

Saran Pada penelitian lebih lanjut disarankan melakukan optimasi kondisi penandaan SCN-Bz-DOTA-F(ab’)2-nimotuzumab

177

Lu agar didapatkan

efisiensi penandaaan tinggi. Karakterisasi jumlah ligan dan

177

Lu yang

terikat pada F(ab’)2-nimotuzumab serta melihat stabilitas F(ab’)2nimotuzumab juga disarankan untuk dilakukan.

43


Daftar Pustaka Abbas, A. K., & Lichtman, A. H. (2005). Antibodies and antigens. Philadelphia: Elsevier Saunders. Acton, Q. A. (2013). Pancreatic Cancer : New Insights for the Healthcare Professional. Atlanta Georgia: Scholarly Editions. Alberts, B., Johson, A., Lewis, J., Raff, M., Robert, K., & Walter, P. (2002). Molecular biology of the cell. New York: Garland Science. Aziz, A., & Suherman, N. (2013). Karateristik Fisiko-Kimia Sediaan Radioisotop 175

YbCl3 Hasil Iradiasi Bahan Sasaran 174Yb Diperkaya 98,4%. J. Iptek

Nuklir Ganendra, 16, 48-58. Boland, W. K., & Bebb, G. (2009). Nimotuzumab: a novel anti-EFGR monoklonal antibody that retains anti-EFGR activity while minimizing skin toxicity. Expert.opin.bio.ther , 9. Brechbiel. (2008, Mei 6). Backbone-Substituted Bifunctional Dota Ligands, Complexes and Compositions Thereof, And Methods Of Using Same. Campbell, S. C., Rini, B. I., Uzzo, R. G., & Lane, B. (2009). 100 Questions & Answers About Kidney Cancer. Canada: Jones and Bartlett Publishers. Ciardiello, F., & Tortora, G. (2008, Maret 13). EGFR Antagonists in Cancer Treatment . N Engl J Med , 1160-1174. Copper, G. (1993). The Cancer Book. UK: Jones and Bartlleth Publisher. Corley, R. B. (2005). A Guide to Methods in the Biomedical Sciences. Boston: Springer Science. Day, R., & Underwood, A. (2001). Analisis Kimia Kualitatif edisi keenam. Jakarta: Erlangga. Deter, L. L. (2010). Medication Administration. USA: Delmar, Cengange Learning.

44


45

E′ VA TO′ TH., B. E. (1994). Kinetics of formation and dissociation of lathanide (III)–DOTA complexes. Inorg.Chem. , 4070-4076. Fried, G. H., & Hadensenos, G. J. (2006). Schaum's Outlines of Theory and Problems of BIOLOGY Second Edition. Jakarta: Penerbit Erlangga. Galsky, M. D. (2010). Everything You Need to Know about Cancer in Languange You Can Actually Understand. USA: Jones and Bartlett. 4-9. Gansow. (1991). Int. J. Rad.Appl. Instrum. [B]. Nucl.Med Biol , 369-381. Godewijckstraat, V. (2012). Phase II study of nimotuzumab, a humanized monoclonal anti-epidermal growth factor receptor (EFGR) antibody, in patien with locally

advanced

or

metastatic pancreatic

cancer,

investigational new drugs. springer Netherlands. Haryuni, R. D. (2012). Fragmentasi Nimotuzumab untuk Preparasi 125I-F(ab’)2Nimotuzumab Sebagai Radiofarmaka Terapi Kanker. Depok: Fakultas Farmasi Universitas Indonesia. Haryuni, R. D., Bahtiar, A., Soenarjo, S., Harahap, Y., Mutalib, A., Ramli, M., et al. (2014). Fragmentation of Nimotuzumab for Preparation of 125 IF(ab')2-Nimotuzumab-NLS Radiopharmaceutical for Cancer Therapy. Atom Indonesia. Herbst, R., & Bunn, P. J. (2003). Targeting HER1:Oncogenic overexpression in multiple tumor types. Clin Cancer Res , 5813-5824. Hermanson, G. T. (1996). Bioconjugate Techniques. Academic Press. Hermanto, S., Haryuni, R. D., Ramli, M., Mutalib, A., & Hudiyono, S. (2012). Preparation of F(ab')2 transtuzumab fragment for Radioimmunoconjugate synthesis of 177Lu-DOTA-F (ab')2-transtuzumab. IOSR Journal of Pharmacy , 12-18. Humani, T. S., Ramli, M., Rustendi, C. T., & Subur, M. (2010). Peparasi dan Uji Stabilitas 177-Lu-Dota-Nimotuzumab Sebagai Radiofarmaka Terapi


46

Kanker. Seminar Nasional VI SDM Teknologi Nuklir. Yogyakarta.663669. Kadarisman, S. S., Herlina, & Sriyono. (2011). Pemisahan Radioisotop Medis Lu177 Dari Matrik Yb-Lu Paska Iradiasi Melalui Resin Penukar Ion degan Eluen alfa-HIBA dan Larutan HNO3. Kassis, A. I. (2011). Therapeutic Rations of Targeted Radionuclides. Philadelphia: LIPPINCOTT WILLIAMS & WILKINS,a WOLTERS KLUWER business. King, D. J. (1998). Applications and Engineering Of Monoclonal Antibodies. CRC Press. Leswara, N. D. (2007). Buku Ajar Radiofarmasi. Jakarta: EGC. Limantara, L., & Heriyanto. (2011). Optimasi Proses Ekstraksi Fukosantin Rumput Laut Coklat Padina Australis Hauck Meggunakan Pelarut Organik Polar. Ilmu Kelautan , 86-94. Nurlaila, Z. (2007). Radiofarmaka Peptida untuk Diagnosis dan Terapi . Maj Kedokt Indon.Volum: 57. Nomor: 8. 265-273 . Oemiati, R. (2011). Prevalensi Tumor dan Beberapa Faktor yang Mempengaruhi di Indonesia. Bul. Penelit. Kesehat, 39, 190-204. Palasz, A., & Czekaj, P. (2000). Toxicological and cytophysiological aspects of lanthanides action. Acta Biochimica Polonica.1107-1114 . Pandit, N. K. (2007). Introduction to The Pharmaceutical Sciences. USA: Lippincott Williams & Wilkins. Pasaribu, E. T. (2006). Epidemiologi dan Etiologi Kanker. Majalah Kedokteran Nusantara, 39, 266-269. Patterson, C. (2013). Development of a New Positron Emission Tomography Tracer for Targeting Tumor Angiogenesis : Synthesis, Small Animal Imaging, and Radiation Dosimetry. Molecules , 5594-5610.


47

Ramli, M., Hidayat, B., Rustendi, C. T., Subur, M., Ardiyanto, C. N., Karyadi, et 177

al. (2012). In Vitro and In Vivo Testing of

Lu-DOTA-Nimotuzumab, a

Potential Radioimmunotherapeutical Agent of Cancers. ITB J., 333-345. Rasjidi, I. (2009). Epidemiologi Kanker Serviks. Indonesian Journal of Cancer , 103-108. Reddy, L. H., & Couvreur, p. (2010). Macromoncular anticancer trapeutics. New Jarsey: Human Press. 425. Sabiston, D. C. (1987). Sabiston's Essentials Of Surgery. (J. Oswari, Ed.) Jakarta: EGC. Santoso, & Suharti. (2009). Epidermal growth factor receptor (EFGR) sebagai sasaran terai kanker kolorektal. Cermin Dua Kedokteran, 36, 5-12. Schwartz, G. F., Solin, L. J., Olivotto, I. A., Ernster, V. L., & Pressman, P. I. (2000). Consensus conference on the treatment on in situ ductal carcinoma of the breast. Cancer , 946-954. Sloane, E. (2003). Anatomi dan Fisiologi untuk Pemula. Jakarta: EGC. T. Smith, B. (2008). Concepts in Immunology and Immunotherapeutics fourth edition. american society of health-system pharmacists. 29-30. Tikhomirov, I. A., Garrido, G., Yang, E., Sherman, I., & Perez, R. (2008). Bivalent Binding Properties of Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) Targeted Monoclonal Antibodies : factors Contributing ti Difference in Observed Clinical Profiles. Tjay, T. H., & Raharja, K. (2007). OBAT-OBAT PENTING Khasiat, Penggunaan, dan Efek Samping. Jakarta: PT Elex Media Komputindo. Venkatesh, M., & Chakraborty, S. (2005, November 14-18). Production of Therapeutic

Radionuclides

in

Medium

Flux

Research

Reactors.

Proceedings of International Symposium, International Atomic Energy Agency , 285-299.


48

Vera, D. R., Eigner, S., Henke, K. E., Lebeda, O., Melichar, F., & Beran, M. (2012). Preparasi and preclinical evaluation of

177

Lu-nimotuzumab

targeting epidermal growth factor receptor overexpressing tumors. Nuclear Medicine and Biology , 3-13. Watson, D. (2005). Pharmaceutical Analysis. UK: Elsevier Limited. Widyastuti. (2007). Radiofarmaka Berbasis Antibodi. Jurnal Radioisotop dan Radiofarmaka , 37-46. Walker, J. M., & Rapley, R. (2008). Molecular Biomethods Handbook. New Jarsey: Humana Press. Wu, C.-S. (1995). Handbook of Size Exclution Chromatography. USA: Marcel Dekker,Inc. Xiques, A. (2010). Local Production of 90Y And 188Re Radionuclides and Development of Radiopharmaceuticals for Therapy, “REPORT on the 2nd Research

Coordination

Meet".

REPORT

on

the

2nd

Research

Coordination Meet on 'The Development of Therapeutic'. 41-54.wwwpub.iaea.org/MTCD/publications/PDF/trs470_web.pdf.


49

Lampiran 1. Skema Prosedur Penelitian Secara Umum Sediaan injeksi nimotuzumab Pemurnian dengan kaset dialisa Zat tambahan

Nimotuzumab Fragmentasi dengan pepsin Kolom dengan PD-10


Fragmen Fc

Analisa dengan KCKT dan SDS-PAGE Konjugasi p-SCN-Bz-DOTA pada F(ab’)2-nimotuzumab Immunokonjugat DOTA- F(ab’)2 -nimotuzumab Pemurnian dengan kaset dialisa Penandaan dengan 177Lu dan analisa persen penandaan dengan KLT Kolom dengan Sephadex G-25 M

177

Lu-DOTA-F(ab’)2-nimotuzumab

177

Lu bebas

Pengukuran radioaktivitas dengan Dose Calibrator Uji stabilitas

Suhu 4 0C

Suhu Kamar

Gambar 2. Bagan Kerangka Konsep Penelitian.


50

Lampiran 2. Pembuatan Pereaksi

a. Dapar asetat 0,02 M pH 4,5 Ditimbang natrium asetat 1,31 g dan ambil asam asetat 1,74 mL. Keduanya dicampur dan ditambahkan 1 L air kemudian diaduk dengan magnetik stirer. Cek pH larutan jika tepat pH 4,5 genapkan air hingga 2 L.

b. Dapar fosfat 0,1 M pH 7,4 Ditimbang 1,07 g natrium dihidrogen fosfat monobasik dan 2,18 g dinatrium hidrogen fosfat dibasik. Campuran dilarutkan dalam 1 L air kemudian diaduk dengan magnetik stirer. Cek pH larutan jika tepat pH 7,4 genapkan air hingga 2 L.

c. Tris HCl 10 mM pH 8 Ditimbang 60,60 mg trizma base, kemudian larutkan dalam 40 mL air. Diaduk menggunakan magnetik stirer, pH diatur menjadi 8,0 dengan penambahan HCl 1 M. Larutan dimasukan dalam labu ukur 50 mL, kemudian ditambahkan air hingga volume tepat 50 mL.

d. HCl 1 M Diambil 4,9 mL HCl 32 % kemudian dimasukan dalam gelas ukur yang telah diisi air 25 mL. HCl dimasukan perlahan melewati dinding gelas ukur dan selanjutnya digenapkan air menjadi 50 mL.

e. HCl 6 N Diambil 11,8 mL HCl 32 % kemudian dimasukan dalam gelas ukur yang telah diisi air 5 mL. HCl dimasukan perlahan melewati dinding gelas ukur dan selanjutnya digenapkan air menjadi 20 mL.


51

f. Tris HCl 0,5 M pH 6,8 (dapar stacking) Ditimbang 3 g trizma base, kemudian larutkan dalam 40 mL air. Diaduk menggunakan magnetik stirer, pH diatur menjadi 6,8 dengan penambahan HCl 6 N. Larutan dimasukan dalam labu ukur 50 mL, kemudian ditambahkan air hingga volume tepat 50 mL.

g. Tris HCl 1,5 M pH 8,8 (dapar resolving) Ditimbang 18,15 g trizma base, kemudian larutkan dalam 75 mL air. Diaduk menggunakan magnetik stirer, pH diatur menjadi 8,8 dengan penambahan HCl 6 N. Larutan dimasukan dalam labu ukur 100 mL, kemudian ditambahkan air hingga volume tepat 100 mL.

h. SDS 10% Ditimbang 1 g SDS kemudian tambahkan 8 mL air. Diaduk dengan magnetik stirer hingga larut. Kemudian larutan dimasukkan ke dalam gelas ukur, ditambahkan air hingga volume mencapai 10 mL.

i. Larutan stok akrilamid / Bis 30% Ditimbang 292 g akrilamid dan 0,8 g N’N’-bis-methyleneacrylamide, dilarutkan dalam 100 mL air, kemudian disaring dan disimpan pada suhu 4 0C. dihindarkan dari cahaya dan maksimum penyimpanan 30 hari.

j. Larutan dapar running 10x Ditimbang 15,5 g trizma base, 72 g glisin, dan 5 g SDS. Dilarutkan dan ditambahkan air 500 mL air.

k. Larutan dapar sampel Diambil 3,55 mL air; 1,25 mL dapar stacking; 2,5mL gliserol; 2 mL 10% SDS; dan 0,2 mL 0,5% bromophenol blue. Semua larutan diaduk dengan magnetik stirer. Sebelum digunakan, 50 µL βmerkaptoetanol ditambahkan ke dalam 950 µL larutan stok.


52

l. NaOH 1 M Ditimbang 8 g NaOH dan dilarutkan dalam 150 ml air sampai larut. Larutan dimasukkan dalam labu ukur dan digenapkan volumnya menjadi 200 mL.

m. Bromophenol blue 0,5% Ditimbang 5 mg bromophenol blue kemudian dilarutkan dalam 1 mL. Catatan : dibuat segar saat ingin digunakan.

n. Larutan APS 10% Ditimbang 100 mg APS kemudian dilarutkan dalam 1 mL. Catatan : dibuat segar saat ingin digunakan.

o. Larutan resolving gel 12% Diambil 3,4 mL air; 4 mL akrilamid/ bis 30%; 2,5 mL dapar resolving; dan 0,1 mL SDS 10%. Semua larutan dicampur hingga homogen. Sebelum larutan dimasukkan ke dalam cetakan gel elektroforesis, ditambahkan 200 µL APS 10% dan 10 µL TEMED.

p. Larutan stacking gel 4% Diambil 6,1 mL air; 1,3 mL akrilamid/ bis 30%; 2,5 mL dapar resolving; dan 0,1 mL SDS 10%. Semua larutan dicampur hingga homogen. Sebelum larutan dimasukkan ke dalam cetakan gel elektroforesis, ditambahkan 200 µL APS 10% dan 10 µL TEMED.

q. Larutan staining Ditimbang 500 mg coomassie brilliant blue kemudian dilarutkan dalam 250 mL metanol. Setelah larut, tambahkan campuran tersebut dengan 35 mL asam asetat glasial dan 215 mL air.


53

r. Larutan destaining Diambil 40 mL methanol dan 7,5 mL asam asetat kedalam gelas ukur kemudian genapkan hingga volume menjadi 100 mL.


54

Lampiran 3. Kadar Protein Nimotuzumab Hasil Dialisa.

Standar Protein

Konsentrasi

Absorban

Rata-rata absorban

Rata-rata absorban Blanko

Blanko

0,16

0,163

0,1615

0,05

0,165

0,165

0,165

0,0035

0,1

0,204

0,207

0,2055

0,044

0,25

0,327

0,313

0,32

0,1585

0,5

0,477

0,444

0,4605

0,299

0,446

0,448

0,447

0,2855

Sampel 10x pengenceran

y

= 0,6537x - 0,0208

0,2855

= 0,6537x - 0,0208

X

=

X

= 0,468564 mg/mL

[sampel] = 10 x 0,4678564 mg/mL = 4,68564 mg/mL = 5 mg/mL


55

Lampiran 4. Gambar Kurva Kalibrasi SDS-PAGE Kondisi Reduksi.

Lampiran 5. Kromatogram Absorbansi Fraksi Hasil Pemurnian Fragmen Nimotuzumab dengan PD-10.


56

Lampiran 6. Kromatogram dan Gambar Hasil KLT Komponen-Komponen yang Terlibat Pada Proses Penandaan SCN-Bz-DOTA-F(Ab’)2Nimotuzumab dengan 177Lu.


57


Lampiran 7. Alat Penelitian.

Kaset dialisa

Protein Filter

ᵧ- Counter

Termomixer

KLT

Plate reader

Kolom Sephadex

KCKT

Kolom PD-10

Dose Calibrator


UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA. PREPARASI DAN UJI STABILITAS 177 Lu-DOTA-F(ab ) 2 - NIMOTUZUMAB SEBAGAI KANDIDAT RADIOFARMAKA TERAPI KANKER

Recommend Documents