3 Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan untuk mengkaji keragaman bakteri endofit yang terdapat pada tanaman kunyit putih dan mengetahui kemampuannya dalam menghasilkan senyawa bioaktif yang dapat dimanfaatkan sebagai kandidat obat. Manfaat Penelitian Luaran yang diharapkan dari penelitian ini yaitu tersedianya isolat bakteri endofit penghasil senyawa bioaktif yang dapat dijadikan sebagai kandidat obat yang akan memberikan kontribusi bagi pengembangan penelitian dalam bidang kesehatan. Hipotesis Penelitian Terdapat banyak spesies bakteri endofit yang berbeda yang berasosiasi dengan tanaman kunyit putih dan bakteri endofit dari tanaman kunyit putih diduga berpotensi sebagai penghasil senyawa bioaktif kandidat obat. Ruang Lingkup Penelitian Ruang lingkup dalam penelitian ini meliputi isolasi bakteri endofit, seleksi berdasarkan karakteristik morfologi, identifikasi berdasarkan sekuen 16S rDNA, serta analisis kemampuannya dalam menghasilkan senyawa bioaktif yang berpotensi sebagai kandidat obat melalui uji pendahuluan uji toksisitas menggunakan embrio ikan zebra. Karakteristik morfologi yang diamati antara lain warna, tepian, permukaan dan penentuan sifat Gram menggunakan uji KOH, sedangkan analisis 16S rDNA meliputi ekstraksi DNA, amplifikasi dan konstruksi pohon filogenetik.
2 TINJAUAN PUSTAKA Bakteri Endofit Bakteri endofit dikategorikan sebagai mikrob yang banyak manfaatnya terutama dalam bidang pertanian dan kesehatan. Bakteri endofit mempunyai arti ekonomi yang sangat berharga dalam bidang kesehatan dikarenakan beberapa spesies endofit memiliki kemampuan dalam menghasilkan senyawa bioaktif. Beberapa penelitian dalam bidang kesehatan menunjukkan bahwa bakteri endofit mampu menghasilkan berbagai jenis senyawa bioaktif seperti antikanker, antioksidan, antibiotik, dan anti inflamasi (Strobel dan Daisy 2003; Ryan et al. 2007; Pimentel et al. 2011). Bakteri endofit penghasil senyawa fitokimia biasanya berhubungan dengan karakteristik fitokimia dari tanaman inangnya (Tan dan Zou 2001). Hal ini kemungkinan diakibatkan oleh adanya transfer genetik antara tanaman dan endofit dan diperkirakan bahwa efek menguntungkan atau merugikan merupakan kombinasi dari aktivitas mikrob dengan tanaman. Bakteri
4 endofit penghasil senyawa bioaktif yang bermanfaat dalam bidang kesehatan sangat beragam. Keragaman bakteri tersebut sebagian besar diisolasi dari tanaman obat, walaupun beberapa diisolasi dari tanaman non-obat. Senyawa bioaktif yang dihasilkan diantaranya bermanfaat sebagai antimikrob, antidiabetes, dan antitumor (Tabel 1). Ratusan spesies bakteri endofit dapat diisolasi dari satu jenis tanaman, dan sedikitnya satu spesies tersebut menunjukkan karakteristik dari tanaman inangnya (Tan dan Zou 2001). Tanaman obat dengan sejarah etnobotani tinggi memiliki peluang ditemukannya spesies mikrob endofit yang membawa karakteristik tanaman inangnya. Penggunaan mikrob endofit spesifik dari bagian tanaman tertentu diperkirakan mampu mengurangi pemakaian bagian tanaman dalam jumlah yang sangat banyak. Hal ini lebih efisien dan diharapkan mampu menghasilkan sejumlah senyawa bioaktif yang sama dengan tanaman inangnya tanpa harus mengekstrak dari tanamannya. Tabel 1 Beberapa bakteri endofit yang bermanfaat dalam bidang kesehatan Bakteri
Tanaman
Pseudomonas syringe Streptomyces spp. strain NRRL 30562 Streptomyces spp. strain NRRL 30566
Kennedia nigriscans Grevillea pteridifolia
Streptomyces ssp.
Monstera sp.
Pseudomonas viridiflava Pseudomassaria sp.
Rumput
Mikrob endofit Paenibacillus polymyxa Paenibacillus polymyxa Bacillus pumilus Bacillus sp. Serratia marcescens Bacillus subtilis Aktinomisetes Bacillus amyloliquefaciens
Senyawa yang dihasilkan Antifungi pseudomycin Munumbicin
Harrison et al. 1991 Castillo et al. 2002
Antibiotik Castillo et al. 2003 kakadumycin A dan echinomycin Antibiotik Ezra et al. 2004 coronamycin Ecomycin Radji 2005
Tanaman hutan Antidiabetes lindung C. zedoaria Senyawa Antimikrob Stemona Antioksidan japonica Canola Antifungi fusaricidin A-D Cassava Antifungi pumilacidin Platycodon Antimikrob grandiflorum Rhyncholacis Antifungi oocydin penicillata Mulbery Antimikrob Curcuma aeruginosa Ophiopogon japonicas
Referensi
Radji 2005 Srikandace et al. 2007 Fengxia et al. 2007 Ryan et al. 2007 Melo et al. 2009
Jalgaonwala dan Mahajan 2011 Jalgaonwala dan Mahajan 2011 Qiong-Ying et al. 2012 mampu menghambat Pujiyanto et al. 2012 α-glukosidase Antitumor Chen et al. 2013
5 Keragaman Mikroba Endofit pada Famili Zingiberaceae Famili Zingiberaceae merupakan kelompok penting dari tanaman obat dan aromatik yang disebabkan oleh kandungan minyak atsiri dan oleoresin. Beberapa genus yang penting dari famili ini adalah Curcuma, Kaempferia, Hedychium, Amomum, Zingiber, Alpinia, Elettaria, Costus dan masing-masing memiliki senyawa aktif yang bervariasi yang dapat dimanfaatkan dalam bidang kesehatan. Manfaat yang beragam ini diduga karena adanya interaksi antara tanaman dan endofit yang dikontrol oleh gen dari kedua organisme dan diatur oleh lingkungan. Banyak mikrob endofit yang berhasil diisolasi dari famili Zingiberaceae dan mampu menghasilkan senyawa aktif yang dapat dimanfaatkan dalam bidang kesehatan. Mikrob endofit yang berhasil diisolasi antara lain Streptomyces aureofaciens dari CMUAc130 dari Zingiber officinale (Taechowisan dan Lumyong 2003). Streptomyces sp. Tc052 dari Alpinia galanga (Taechowisan et al. 2008), Pyricularia kookicola, Pyricularia longispora dan Pyricularia variabilis dari Alpinia malaccensis dan Amomum siamense (Bussaban et al. 2001), Colletotrichum "gloeosporioides" (Penz.) Penz. & Sacc. in Penz., Glomerella spp., Phomopsis spp., Gaeumannomyces amomi, Leiosphaerella amomi, dan Pyricularia telah diisolasi dari Amomum siamense (Lumyong et al. 2003). Cylindrocephalum sp. dari Alpinia calcarata (haw.) Roscoe (Sunitha et al. 2012). Kunyit Putih (C. zedoaria) Tanaman Kunyit Putih Kunyit putih secara ilmiah memiliki nama latin C. zedoaria dan nama daerah antara lain kunyit putih, kunir putih, temu bayangan, temu poh (Jawa), temu pao (Madura), temu mangga, temu putih (Melayu), koneng joho, koneng lalap, koneng pare (Sunda). Secara ilmiah kunyit putih diklasifikasikan sebagai berikut: kingdom divisi subdivisi kelas ordo famili genus species
: Plantae : Angiosperma : Monocots : Commelinids : Zingiberales : Zingiberacea : Curcuma : C. zedoaria
Gambar 1 Tanaman kunyit putih Tanaman kunyit putih sering dianggap sebagai kunyit mangga, akan tetapi yang dipercaya mampu membunuh sel-sel kanker adalah kunyit putih. Tanaman kunyit putih secara tradisional sering digunakan sebagai bumbu masak dan tanaman obat di banyak negara, terutama di negara-negara bagian Asia Tenggara (Maua et al. 2003; Wilson et al. 2005). Tanaman ini dapat ditemukan tumbuh liar pada kondisi iklim di daerah tropik seperti Asia Tenggara. Asal usul kunyit putih
6 tidak diketahui dengan pasti, tetapi diduga dari India bagian barat laut, dan di Indonesia banyak ditemukan di daerah Jawa Barat, Jawa Tengah, Sumatera, Ambon, hingga Irian. Kunyit putih ini lebih menyukai daerah-daerah dengan curah hujan musiman 900-1250 mm dengan musim kering yang pasti, dan ditemukan pada tempat-tempat basah yang rindang dengan ketinggian mencapai 1000 m dpl, dapat tumbuh pada semua macam tipe tanah, tetapi lebih menyukai tanah berpasir dengan drainase yang bagus. Tanaman tahunan ini tingginya dapat mencapai 2 m dengan batang semu yang dibentuk dari pelepah-pelepah daun yang tumbuh dari rimpang. Daun tunggal, bertangkai panjang, helaian daun berbentuk runcing dengan tepian rata, pertulangan menyirip, warna hijau dengan sisik kirikanan, ibu tulang daun terdapat semacam pita memanjang berwarna merah gelap atau lembayaung, panjang 25-70 cm, lebar 8-15 cm (Gambar 1) (Joy et al. 1998; Dalimartha 2003). Rimpang utama berdaging berbentuk membulat telur lebar dengan cabangcabang rimpang berbentuk memanjang, berukuran lebih kecil, dan tumbuh ke arah samping. Bagian rimpang keluar akar-akar yang kaku dan pada ujungnya terdapat kantong air. Rimpang berwarna kuning pucat sampai putih dengan hati yang berwarna kuning muda. Buah berbentuk bundar, berserat, segitiga, serta kulit lunak dan tipis. Biji berbentuk lonjong, berselaput, dengan ujung bewarna putih (Joy et al. 1998; Dalimartha 2003). Khasiat Kunyit Putih Tanaman kunyit putih memiliki banyak manfaat di masyarakat. Seluruh bagian tanaman dapat dimanfaatkan mulai dari daun, bunga, rimpang muda, dan rimpang tua, akan tetapi bagian tanaman yang paling banyak dimanfaatkan adalah rimpang tua. Daun kunyit putih dimanfaatkan dalam pembuatan minyak wangi di India dan Indonesia. Rimpang kunyit putih dalam pengobatan tradisional lebih cocok untuk mengobati penyakit yang terkait dengan kanker. Beberapa penyakit yang bisa diobati dengan tanaman ini adalah kanker mulut rahim, kista rahim, nyeri haid, tumor rahim, perangsang, pembersih, obat luka bernanah, obat kulit, obat sakit perut, melancarkan peredaran darah, masalah pernafasan, salesma, dan terutama digunakan setelah melahirkan (Dalimartha 2003; Chen et al. 2008). Pemanfaatan kunyit putih secara tradisional untuk pengobatan kanker dilakukan dengan meminum air perasan atau rebusan rimpang kunyit putih yang direbus dengan beberapa tanaman obat lain seperti daun dewa, herba baru cina segar, rumput mutiara segar, sambiloto kering dan biji jali (Dalimartha 2003). Senyawa Kimia Rimpang Kunyit Putih Rimpang kunyit putih mengandung minyak atsiri dengan komposisi αpinene, d-camphene, cineole, d-camphor, sesquiterpen, dan sesquiterpene alkohol. Kelompok sesquiterpen yang berhasil diisolasi adalah curzerenone (zedoarin), epicurzerenon, isofuranogermerene, curcumadiol, curcumol, curcumenol, isocurcumenol, procurcumenol, dehydrocurdion, germacrone-4,5-epoxid, germacrone, germacrone furanodienon, curcumenon, pyrocurcuzerenon, curcumin, epicurcumenol, isofuranodienon, furanodien, zederon, dan curdion (Joy et al. 1998; Dalimartha 2003). Flavonoid, sulfur, gum, resin, tepung, dan sedikit lemak juga ditemukan pada rimpang kunyit putih (Dalimartha 2003). Kelompok
7 sesquiterpen pada kunyit putih yang berkhasiat sebagai antikanker adalah curcumol, curdion (Dalimartha 2003), dan isocurcumenol (Lakshmi et al. 2011). Beberapa penelitian menyatakan bahwa rimpang kunyit putih memiliki efek farmakologis diantaranya memiliki aktivitas analgesik pada tikus albino (Ali et al. 2004), antikanker (Muthu-Kumar et al. 2012), aktivitas insektisida (Hewage et al. 1997), antibakteri (Banisalam et al. 2011), antifungi (Shinobu-Mesquita et al. 2011), antioksidan (Dhal et al. 2012; Muthu-Kumar et al. 2012), antitirosin (Narayanaswamy et al. 2011), antihiperglikemi (Rahmatullah et al. 2012), antiinflamasi (Kaushik dan Jalalpure 2011), dan antihiperlipidemi (Srividya et al. 2012). Beberapa senyawa bioaktif yang telah diisolasi dari C. zedoaria seperti kurkumin mampu menunjukkan aktivitas penghambatan terhadap sel kanker ovarium (Ovcar-3). Bioassay Senyawa Aktif Banyak sistem bioassay yang telah diketahui dan digunakan untuk mengkaji penemuan kandidat obat baru. Berdasarkan mekanisme patologi, dapat dilakukan secara in vitro dan in vivo. Embrio ikan zebra (Danio rerio) merupakan salah satu model yang secara in vivo dapat digunakan untuk skrining awal toksisitas dari suatu senyawa. Embrio ikan zebra tidak hanya digunakan sebagai model pengembangan, tetapi juga sebagai alat untuk mempelajari berbagai penyakit manusia termasuk kanker (Truong et al. 2013). Assay menggunakan embrio ikan zebra memiliki beberapa kelebihan yaitu pembuahan terjadi secara eksternal, mudah dirawat, telur yang transparan sehingga perkembangan embrionya mudah diamati, permeabel terhadap molekul yang kecil, pematangan embrio yang cepat, homologi dengan perkembangan mamalia, dan urutan genom yang hampir lengkap (Seabra dan Bhogal 2010) (Gambar 2). Ikan zebra adalah vertebrata yang memiliki kekerabatan lebih dekat dengan manusia daripada yang umum digunakan di laboratorium. Ikan zebra populer di sebagian besar laboratorium biologi sebagai organisme model yang potensial untuk uji toksisitas, teratogenisitas, embriotoksisitas yang dapat dilakukan secara cepat dan efisien. Ikan ini dapat dijadikan model dengan mengkombinasikan assay biokimia, seluler, dan molekuler melalui pengamatan struktur dan fungsifungsi tertentu dalam suatu individu (de Esch et al. 2012). Ikan zebra muncul sebagai model yang ideal untuk skrining senyawa kandidat obat dengan toksisitas rendah (Scholz 2013). Hasil uji toksisitas pada embrio ikan zebra telah terbukti memiliki korelasi positif dengan hasil uji toksisitas pada mamalia (Ma et al. 2007). Pengujian senyawa antikanker (Jianhong et al. 2013) dan hiperglikemia (Eunji et al. 2012) telah dilakukan secara in vivo pada embrio ikan zebra. A
B
Gambar 2 Tahap perkembangan ikan zebra (A) embrio dan (B) dewasa
