PENGARUH SUHU ANNEALING DAN JUMLAH SIKLUS YANG BERBEDA PADA PROGRAM peR TERHADAP KEBERHASILAN ISOLASI DAN AMPLIFlKASI mtDNA lKAN PATIN (Pangasius ltypophthalmus)
Oleh:
TRI HARSO WAHYUDI C01497077
SKRIPSI
PROGRAM STUDI BUDIDAYA PERAIRAN FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2001
"5esul1ggubl1;ga paoa pertukaral1 malam oal1 sial1g itu oal1 paoa ;gal1g oiciptakal1 A[[ab oi lal1git oal1 oi bumij bel1ar-bej1aJ teroapat tal1oa-tal1oa (Kekuasaal1-N;ga) bagi oral1g-oral1g ;gal1g ·bertakwa. "(Q.5. YUl1US : 6)
KaY;)Ia ked ini kupersel11ba&kan untuk orang-orang ;)lang aku 5a;)laJ1gi
PENGARUH SUHU ANNEALING DAN JUMLAH SIKLUS YANG BERBEDA PADA PROGRAM peR TERHADAP KEBERHASILAN ISOLASI DAN AMPLIFIKASI mtDNA IKAN PATIN (Pangasius hypophtlzalmus)
Oleh: TRI HARSO WAHYUDI C01497077
SKRIPSI Sebagai Salah Satu Syarat untuk Memperoleh Gelar Sarjana pada Fakultas Perikanan dan IImu Kelautan
PROGRAM STUDI BUDIDAYA PERAIRAN FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2001
Tri Harso Wahyudi (C01497077). Pengaruh Suhu Annealing dan Jumlah Siklus yang Berbeda pada Pogram PCR terhadap Keberhasilan Isolasi dan Amplifikasi mtDNA limn Patin (Pangasius ltypoplttltalmus) di bawah bimbingan Dr. Ir. Odang Carman, M.Sc sebagai ketua dan Ir. Harton Arfah, M.Si sebagai anggota. RlNGKASAN PCR (Polymerase mengisolasi dan
Chain Reaction)
pada dasarnya
bertujuan untuk
mengamplifikasi DNA yang akan menentukkan keberhasilan
analisis berikutnya, salah satunya adalah analisis DNA mitokondria melalui metode RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) yang membutuhkan DNA dalam jumlah banyak dan berkualitas baik.
Salah satu tahap dalam PCR ini adalah
annealing yaitu proses penempelan primer pada DNA template yang menentukan spefisitas dan
banyaknya DNA yang dihasilkan.
Salah satu faktor yang
mempengaruhi keberhasilan isolasi dan amplifikasi DNA template pada tahap
annealing ini adalah suhu, jika terlalu tinggi maka akan menyebabkan gagalnya proses amplifikasi sedangkan jika terlalu rendah maka DNA yang terbentuk memiliki spesifisitas rendah. sehingga sangat penting untuk mencari suhu annealing yang optimum bagi proses isolasi dan amplifikasi tadi. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh suhu annealing dan jumlah siklus yang berbeda pada program PCR terhadap keberhasilan isolasi dan ampllfikasimtDNA ika.n""patin (PiingasiiishypdplilhaliJfI1s)sehinggadidapatsuhu
annealing dan jumlah siklus yang paling optimum untuk mendapatkan kuantitas DNA hasil PCR yang cukup banyak dengan spesifisitas yang cukup tinggi. Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Pengembangbiakan dan Genetika Ikan Jurusan Budidaya Perairan Fakultas Perikanan dan 11mu Kelautan, IPB dari bulan April sampai dengan bulan Juli 2001. Bahan-bahan yang digunakan adalah jaringan hati ikan patin sebagai sumber DNA, kit Genomic PrepTM, Buffer Ex Taq, Ex Taq, dNTP, primer forward (tRNA-prol) sepanjang 30 basa dengan melting
temperature 65,4°C dan primer refers (tRNA- phel) sepanjang 29 basa dengan melting temperature 62,6°C. Penelitian dimulai dengan mengekstraksi sampel
jaringan hati ikan patin yang kemudian dicek secara kuantitatif dengan gene-quant dan secara kualitatif dengan elektoforesis, DNA yang terekstrak kemudian diisolasi dan diamplifikasi melalui PCR yang hasilnya dicek kembali secara kualitatif melalui elektroforesis dan dianalisis datanya.
Ekstraksi dilakukan menggunakan 20 mg
jaringan hati ikan patin dan kit Genomic prepTM, elektroforesis dilakukan dalam gel agaros dengan konsentrasi 0,7% untuk mengecek DNA terekstrak dan 1% untuk mengecek DNA hasil PCR dengan menggunakan buffer Tris Borate-EDTA yang mengandung 30 j.tg Etidium Bromida per liternya kemudian dialiri arus listrik sebesar 80 rnA dan tegangan 200 V selama kurang lebih 45 menit, PCR dilakukan dalam volume total reagen 25 j.tl menggunakan primer khusus (tRNA-prol dan tRNA- phel) yang programnya merupakan kombinasi antara suhu annealing berbeda (50°C, 53°C, 56°C, 59°C, 62°C, 65°C, dan 68°C) danjumlah siklus yang berbeda pula (30,35, dan 40 siklus), analisis data dilakukan secara deskriptif dengan membandingkan antar kombinasi perlakuan dengan parameter yang diamati berupa ketebalan dan intensitas pita hasil PCR dan ketebalan dan intensitas bayangan ("smear") yang terbentuk pada elektroforegram. Hasil yang didapat dari serangkaian percobaan yang dilakukan adalah DNA yang berhasil diekstrak sebanyak 390 ng/mg sampel, tanpa kontaminasi protein, dengan tingkat kemurnian 81 %. DNA yang terekstrak ini cukup kecil namun masih mencukupi bagi proses amplifikasi pada PCR.
Hasil PCR yang didapat adalah
sampai suhu annealing 65°C amplifikasi masih berlangsung tetapi disertai penurunan kuantitas DNA, berbeda dengan suhu di bawahnya yaitu suhu 62°C amplifikasi berlangsung dengan baik tanpa ada penurunan kuantitas DNA, sedangkan pada suhu 68°C sudah tidak terjadi lagi amplifikasi. Pada jumlah siklus 30 DNA non target belum terbentuk berbeda dengan jumlah siklus 35 dan 40 DNA non target terbentuk dengan jumlah yang cukup besar yang dicirikan dengan intensitas smear yang terbentuk cukup tinggi. Dari penelitian ini didapat bahwa suhu annealing terbaik untuk isolasi dan amplifikasi mtDNA ikan patin adalah 62°C dengan jumlah siklus 30.
SKRIPSI
Pengaruh Suhu Anneaiing dan Jumlah Siklus yang
Judul
Berbeda pada Program PCR terhadap Keberhasilan Isolasi dan Amplifikasi mtDNA Ikan Patin (?angasius hypophthalmus) Nama Mahasiswa
: Tri Harso Wahyudi
NomorPokok
: C01497077
Program Studi
: Budidaya Perairan
Disetujui : I. KOMISI PEMBIMBING
fblo Dr. Ir. Odang Carman, M,Sc. ... Ketll a
Dr. Ir. Odang Carman, M.Sc. Ketua Program Studi Tanggallulus : 13 November 200 I
I) H:n Arfah, M.Si. J\.l1ggota
DAFTARRIWAYAT HIDUP
Penulis lahir di Cirebon pada tanggal 24 November 1978 dari pasangan Bapak Sugani Hardjo dan Ibu Julaeha. Pendidikan formalnya dimulai di SDN Waled Kota I pada tahun 1985 kemudian pada tahun 1991 penulis melanjutk;an ke SMPN 2 Ciledug dan pada tahun 1994 ke SMUN 1 Lemahabang Kabupaten Cirebon. Pada tahun 1997 penulis diterima sebagai mahasiswa IPB melalui jalur UMPTN di Program Studi Budidaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan. Selama menjadi mahasiswa penulis pernah aktif sebagai pengurus Himpunan Mahasiswa Akuakultur (HIMAKUA) dan sebagai staf Himpunan Mahasiswa Islam (HMI). Di bidang akademik penulis pernah menjadi asisten luar biasa di beberapa mata ajaran di antaranya:
m.a. Biologi Perikanan, m.a. Fisiologi Hewan Air,
m.a. Fisiologi Reproduksi Ikan, m.a. Manajemen Pembenihan Ikan, m.a. Seleksi Ikan, m.a. Teknik Pembenihan Ikan Hias, dan m.a. Penglolaan Pembenihan Ikan. Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar sarjana perikanan penulis melaksanakan penelitian dengan judul "Pengaruh Suhu Annealing dan J umlah Siklus yang Berbeda pada Program peR terhadap Keberhasilan Isolasi dan Amplifikasi mtDNA Ikan Patin (Pangasius ltypoplztlzalmus)".
KATA PENGANTAR
Segala puji bagi Allah SWT atas lirnpahan rahrnat dan hidayah-Nya sehingga penulis dapat rnenyelesaikan laporan skripsi ini dengan judul "Pengaruh Suhu Annealing dan Jumlah Siklus yang Berbeda pada Program ;PCR terhadap Keberhasilan
ISGlasi
dan
Amplifikasi
mtDNA
Ikan
Patin
(Pangasills
hypophthal11llls)" yang disusun untuk memenuhi salah satu syarat untuk memperoleh
gelar sarjana pada Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor dengan bidang keahlian Budidaya Perairan. Pada Kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih dan penghargaan kepada: 1. Bapak dan Ibu serta keluargaku atas do'a restu, kasih sayang, dan
dukungannya. 2. Bapak Dr. Ir. Odang Carman, M.Sc. selaku pembirnbing I atas bimbingan. arahan, dan petunjuknya. 3
Bapak Ir. Harton Arfah, IVI.Si. selaku pembimbing II atas bimbingan dan arahannya.
4. Bapak Dr. II". Agus Oman Sudrajat, IVI.Sc. selaku dosen penguji tamu atas segala saran dan masukannya. 5. Keluarga besar Laboratorium Pengembangbiakan dan Genetika Ikan Jurusan Budidaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, IPB atas naungan dan dukungannya. 6. Lina, Ibu Rina, Sutrisna, IIvi, Sri, Yuli, Yanti, Nine, Awo, Dehonk, dan T' Yuyun atas bantuan dan dukungannya. 7. Ternan-teman
pertelitianku
amy
dan
lis
atas
kebersarnaan
dan
kerjasamanya. 8. Sobat-sobatku: Catur, Dedi, Adi (boss), Soleh, Rahmat, Komeng serta Jason ('ndut) atas kebersamaan dan dukungannya. 9. Nurul Ainah atas dukungan dan do'anya.
10. Ternan-ternan BDP'34 atas kebersarnaannya. 11. Warga Lagoon dan Al-Fatha : Elm, Yayat, Toni, Fauzan, Wawan, Andi, Mochtar, Victory, Dede, Iskandar, Kurniawan, dan Firman atas bantuan dan kebersarnaannya. 12. Ibu Teti, Dea, Neng, dan Azis atas tumpangan rurnahnya, 13. Serta pihak lain yang tidak bisa disebutkan satu per satu yang telah banyak rnembantu dalarn pelaksanaan penelitian. semoga rnendapat balasan dari Allah SWT atas sernua kebaikannya. Akhir kata penulis berharap sernoga laporan skripsi ini berrnanfaat bagi pembacanya.
Bogor, November 2001
Penulis
DAFTARISI
Teks
Halaman
.iii
DAFTAR TABEL DAFTAR GAMBAR.
:
.iv
DAFTAR LAMPIRAN
v
1. PENDAHULUAN
1.1. Latar Belakang
1
1.2. Tujuan
_
3
II. TINJAUAN PUSTAKA
2.1. Karakter DNA Mitokondria dan Pemanfaatannya 2.2. Metode Ekstraksi DNA Sel dan mtDNA. 2.3. PCR (Polymerase Chain Reaction) 2.3.1. Pengertian dan Tahap-Tahap PCR 2.3.1.1. Denaturasi 2.3.1.2. Primer dan Annealing 2.3.1.3. Extension 2.3.2. Komponen PCR....... 2.3.3. Aplikasi PCR......... 2.4.'peteksi dan Analisa mtDNA
.4 6 8 8 9 10 11 11 1,
.
13
III. BAHAN DAN METODE ·-3clc Waktu-dan Tempat. " '." .,." ,.-. '.'. , ,." ,
3.2. Bahan dan Alat.. 3.2.1. Ekstraksi DNA seI 3.2.2. Elektroforesis 3.2.3. Pengukuran Konsentrasi DNA 3.2.4. PCR (Polymerase Chain Reaction) 3.3. Metode Kerja 3.3.1. Ekstraksi DNA sel 3.3.2. Elektroforesis _ 3.3.3. Pengukuran Konsentrasi DNA 3:3.4. PCR (Polymerase Chain Reaction) 3.4. Rancangan Percobaan 3.5. Analisis Data
" ,
,
_.. _,
I5 I5 15 16 16 16 16 ]7 18 19 20 20
