TESIS
POTENSI EKSTRAK DAUN PRANAJIWA (Euchresta horsfieldii Lesch Benn.) DALAM MENINGKATKAN AKTIVITAS ENZIM SUPEROKSIDA DISMUTASE DAN GLUTATION PEROKSIDASE PADA TIKUS WISTAR (Rattus norvegivus) DENGAN AKTIVITAS FISIK MAKSIMAL
NI WAYAN RIKA KUMARA DEWI NIM 1492061009
PROGRAM MAGISTER PROGRAM STUDI KIMIA TERAPAN FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS UDAYANA DENPASAR 2017
i
POTENSI EKSTRAK DAUN PRANAJIWA (Euchresta horsfieldii Lesch Benn.) DALAM MENINGKATKAN AKTIVITAS ENZIM SUPEROKSIDA DISMUTASE DAN GLUTATION PEROKSIDASE PADA TIKUS WISTAR (Rattus norvegivus) DENGAN AKTIVITAS FISIK MAKSIMAL
Tesis untuk Memperoleh Gelar Magister pada Program Magister, Program Studi Kimia Terapan, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Udayana
NI WAYAN RIKA KUMARA DEWI NIM 1492061009
PROGRAM MAGISTER PROGRAM STUDI KIMIA TERAPAN FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS UDAYANA DENPASAR 2017
ii
iii
PENETAPAN PANITIA PENGUJI TESIS
Tesis Ini Telah Diuji pada Tanggal 30 Januari 2017
Panitia Penguji Tesis Berdasarkan SK Rektor Universitas Udayana, No : 532/UN14.1.28/EP/2017, Tanggal 24 Januari 2017
Ketua
: Dr. I Wayan Gunawan, S.Si., M.Si.
Anggota : 1. Dra. Ni Made Puspawati, M.Phil., Ph.D. 2. Prof. Dr. Drs. I Made Dira Swantara, M.Si. 3. Dr. Drs. I Made Oka Adi Parwata, M.Si. 4. Dr. Dra. Wiwik Susanah Rita, M.Si.
iv
v
UCAPAN TERIMAKASIH
Om Swastyastu Puji syukur penulis panjatkan ke hadapan Ida Sang Hyang Widhi Wasa/Tuhan Yang Maha Esa, karena atas Asung Kertha Wara Nugraha-Nya tesis ini dapat terselesaikan. Bantuan serta bimbingan dari berbagai pihak telah membantu penyusunan tesis ini. Dalam kesempatan ini, penulis menyampaikan terimakasih yang sebesarbesarnya kepada Dr. I Wayan Gunawan, S.Si., M.Si. selaku pembimbing I yang telah memberikan semangat, bimbingan, masukan, dan saran dalam penyelesaian tesis ini. Terimakasih yang setulus-tulusnya juga penulis sampaikan kepada Dra. Ni Made Puspawati, M.Phil., Ph.D. yang dengan penuh perhatian telah banyak membantu penulis, memberikan bimbingan, masukan, dan sarannya kepada penulis. Ucapan yang sama juga penulis sampaikan kepada Prof. Dr. dr. Ketut Suastika, Sp.PD (K) selaku Rektor Universitas Udayana atas kesempatan dan fasilitas yang diberikan kepada penulis untuk mengikuti dan menyelesaikan pendidikan Program Magister di Universitas Udayana. Ucapan terimakasih ini juga ditujukan kepada Drs. Ida Bagus Made Suaskara, M.Si selaku Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Udayana atas kesempatan yang diberikan kepada penulis untuk menjadi mahasiswa Program Magister pada Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Udayana. Ucapan terimakasih penulis sampaikan kepada Ketua Program Studi Kimia Terapan Universitas Udayana, Prof. Dr. Drs. I Made Dira Swantara, M.Si atas kesempatan yang telah diberikan kepada penulis untuk menjadi mahasiswa dan mengikuti Program Magister. Ungkapan terimakasih penulis sampaikan kepada para penguji tesis ini, yaitu Prof. Dr. Drs. I Made Dira Swantara, M.Si, Dr. Drs. I Made Oka Adi Parwata, M.Si., Dr. Dra. Wiwik Susanah Rita, M.Si yang telah
memberikan
saran,
masukan,
sanggahan,
dan
koreksi
untuk
menyempurnakan tesis ini. Ucapan terimakasih yang sebesar-besarnya penulis sampaikan kepada para pengajar dan pengampu mata kuliah selama penulis mengenyam pendidikan
vi
Program Magister di Universitas Udayana. Ucapan terimakasih penulis sampaikan kepada Dr. Ir. I Komang Agusjaya Mataram, M.Kes dan Ni Putu Agustini, SKM., M.Si. atas bantuan, bimbingan, saran, dan semangat selama penelitian. Pada kesempatan ini, penulis juga menyampaikan penghargaan yang tulus kepada Ketua Jurusan Gizi Poltekkes Denpasar beserta staf dan rekan sekerja yang memberikan dorongan dan semangat. Ucapan terimakasih penulis sampaikan kepada Ni Made Dewantari, SKM, M.FOr, G.A. Dewi Kusumayanti, DCN, M.Kes, Ketut Lilik Arwati, S.Gz., M.Biomed yang memberikan dukungan, semangat, pengertian, dan perhatian kepada penulis. Ucapan terimakasih yang sebesar-besarnya penulis sampaikan kepada bapak tercinta Drs. I Made Karda, M.Si dan ibu tercinta Ni Made Rustini, S.Sos yang telah mengasuh, mendidik, membesarkan, dan memberikan dukungan kepada penulis dengan kasih sayang dan doa. Ucapan terimakasih yang setulus-tulusnya penulis sampaikan kepada suami tercinta Putu Pratama Jaya Denria, S.Si yang tidak pernah lelah memberikan semangat, dorongan, perhatian, pengertian, dan kasih sayang kepada penulis. Ucapan terimakasih juga kepada adik-adik tersayang beserta keluarga besar atas kasih sayang, dukungan dan doa yang diberikan kepada penulis. Penulis juga menyampaikan terimakasih kepada bapak mertua tercinta Drs. Ketut Sulenden, ibu mertua tercinta Ni
Luh Nyoman Seriasih, S.Pd dan adik ipar
tercinta yang telah memberikan dukungan, kasih sayang, dan doa kepada penulis. Akhirnya penulis sampaikan terimakasih kepada rekan seperjuangan Program Studi Magister Kimia Terapan angkatan 2014 atas dukungan, semangat, dan bantuannya dalam penyusunan tesis ini. Semoga Ida Sang Hyang Widhi Wasa/Tuhan Yang Maha Esa selalu melimpahkan anugerah-Nya kepada semua pihak yang telah membantu pelaksanaan dan penyelesaian tesis ini, serta kepada penulis sekeluarga.
Om Santhi Santhi Santhi Om Denpasar, 30 Januari 2017
Penulis
vii
ABSTRAK POTENSI EKSTRAK DAUN PRANAJIWA (Euchresta horsfieldii Lesch Benn.) DALAM MENINGKATKAN AKTIVITAS ENZIM SUPEROKSIDA DISMUTASE DAN GLUTATION PEROKSIDASE PADA TIKUS WISTAR (Rattus norvegivus) DENGAN AKTIVITAS FISIK MAKSIMAL
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas antioksidan ekstrak etil asetat daun pranajiwa (Euchresta horsfieldii Lesch Benn.) terhadap superoksida dismutase (SOD) dan glutation peroksidase (GPx) dalam menghambat peroksidasi lipid pada plasma darah tikus Wistar serta menentukan golongan flavonoid yang aktif sebagai antioksidan. Penentuan aktivitas antioksidan secara in vitro dilakukan dengan metode DPPH (1,1-diphenyl-2-pycrylhidrazyl) dan secara in vivo dengan tikus Wistar menggunakan lima kelompok perlakuan. Kelompok kontrol negatif (aquadest 10 mL/200 g BB/hari), kelompok ekstrak etil asetat 10, 20, 30 mg/200 g BB/hari, dan kelompok kontrol positif (vitamin C 10 mg/200 g BB/hari). Masing-masing perlakuan diberikan selama 21 hari. Perlakuan aktivitas fisik maksimal yang diberikan dengan cara merenangkan tikus Wistar sampai hampir tenggelam selama 60 menit. Semua kelompok dilakukan pemeriksaan aktivitas SOD dan kadar GPx darah di awal dan akhir perlakuan. Pemisahan ekstrak etil asetat dilakukan dengan kromatografi kolom, kemudian diidentifikasi dengan spektrofotometer FTIR dan UV-Vis. Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak etil asetat memiliki aktivitas antioksidan dengan nilai IC50 sebesar 393,95 µg/mL dan kadar total flavonoid sebesar 6619,72 mg QE/100g ekstrak atau 6,62 % (b/b). Pemberian ekstrak etil asetat 20 mg/200 g BB/hari memberikan hasil yang terbaik yaitu dapat meningkatkan aktivitas SOD sebanyak 34,93 kali, sedangkan pemberian ekstraketil asetat 30 mg/200 g BB/hari mampu meningkatkan kadar GPx sebanyak 9,76 kali. Pemisahan dan pemurnian ekstrak etil asetat menghasilkan isolat aktif yang positif flavonoid (isolat FE) yang diduga merupakan senyawa flavonoid golongan flavonol yaitu 3,5,7,3’,4’-pentahidroksi flavonol (kuersetin). Kata kunci : Eucresta horsfieldii (Lesch.) Benn, superoksida dismutase, glutation peroksidase, flavonol, kuersetin.
viii
ABSTRACT
THE POTENCY OF PRANAJIWA LEAF (Euchresta horsfieldii Lesch Benn.) EXTRACT IN INCREASING THE ACTIVITY OF SUPEROXIDE DISMUTASE AND GLUTHATION PEROXIDASE IN RATS (Rattusnorvegivus) WITH MAXIMUM PHYSICAL ACTIVITY The present study was conducted to determine antioxidant activity of Pranajiwa leaves ethyl acetate extracts in inhibiting lipid peroxidation through increasing of superoxide dismutase (SOD) and gluthation (GPx) enzymes activity in rats with maximum physical activity and to identify the flavonoid active compounds. In vitro antioxidant activity was d using DPPH (1,1-diphenyl-2pycrylhidrazyl) method and in vivo test was used five groups of rats. A negative control group (received vehicle only), three treatment groups received ethyl acetate extracts with a dose of 10, 20, 30 mg/200 g BB/day respectively, and a positive control group which received vitamin C 10 mg/200 g BB/day. The maximal physical activity condition of rats was achieved by swimming the rats for 60 minutes. All groups were given treatment for 21 days. The bloods were taken before and after treatment to measure SOD and GPx activity. The separation of the ethyl acetate extract was conducted by column chromatography and then identified by using FTIR and UV-Vis spectrophotometer. The results showed that ethyl acetate extract had antioxidant activity with IC50 value of 393,95 µg/mL and total flavonoid content of 6619,72 mg EQ/100g or 6,62% (w/w). The ethyl acetate extract at a dose of 20 mg/200 g BB/day increased of SOD activity by 34,93 times, while at a dose of 30 mg/200 g BB/day increased of GPx activity by 9,76 times. Based on UV-Vis and Infrared spectra analysis, isolate which positive flavonoid (isolates FE) was tentaviey identified as 3,5,7,3',4'-penthadihydroxi flavonols (quercetin). Keywords: Eucresta horsfieldii (Lesch.) Benn, superoxide dismutase, glutathione peroxidase, flavonols, quercetin.
ix
RINGKASAN Pemberian aktivitas fisik maksimal dengan cara merenangkan tikus sampai hampir tenggelam ternyata memicu peningkatan metabolisme dan konsumsi oksigen sehingga dapat meningkatkan terbentuknya ROS. Hal tersebut dapat diketahui dengan mengukur kadar MDA, karena MDA digunakan sebagai biomarker penanda terjadinya stres oksidatif. Superoksida dismutase (SOD) dan glutatión peroksidase (GPx) merupakan antioksidan endogen. Superoksida dismutase berfungsi mengkatalisis reaksi dismutasi radikal bebas anion superoksida menjadi hidrogen peroksida dan molekul oksigen. Sedangkan glutatión peroksidase berfungsi mengkatalisis reduksi hidrogen peroksida dan peroksida lipid oleh glutation. Pembentukan radikal bebas yang terus menerus terjadi dapat mengakibatkan terjadinya penurunan aktivitas SOD dan GPx sehingga diperlukan peranan antioksidan eksogen seperti vitamin, polifenol, dan flavonoid untuk membantu kerja enzim SOD dan GPx dalam mencegah kerusakan sel. Dengan demikian, pada penelitian ini dilakukan penentuan aktivitas antioksidan ekstrak etil asetat daun pranajiwa terhadap kenaikan aktivitas SOD dan kadar GPx pada tikus Wistar dengan pemberian aktivitas fisik maksimal. Selanjutnya dilakukan penentuan senyawa golongan flavonoid yang terkandung dalam ekstrak etil asetat daun pranajiwa. Penelitian ini terdiri dari beberapa tahapan yaitu maserasi, uji fitokimia, penentuan kandungan total flavonoid, uji aktivitas antioksidan secara in vitro dengan metode DPPH, dan secara in vivo dengan mengukur aktivitas SOD dan kadar GPx pada tikus Wistar menggunakan lima kelompok perlakuan yang terdiri dari kelompok kontrol negatif (pemberian aquades), kelompok perlakuan pemberian ekstrak daun pranajiwa 10 mg/200 g BB/hari, kelompok perlakuan pemberian ekstrak daun pranajiwa 20 mg/200 g BB/hari, kelompok perlakuan permberian ekstrak daun pranajiwa 30 mg/200 g BB/hari, dan kelompok kontrol positif (pemberian vitamin C 10 mg/200 g BB/hari). Semua perlakuan diberikan selama 21 hari. Perlakuan aktivitas fisik maksimal yang berikan dengan cara merenangkan tikus wistar sampai hampir tenggelam selama 60 menit. Semua kelompok dilakukan pemeriksaan aktivitas SOD dan kadar GPx darah di awal dan akhir perlakuan. Pemisahan dan pemurnian ekstrak etil asetat daun pranajiwa dilakukan dengan kromatografi kolom konvensional dan kromatografi lapis tipis sedangkan proses identifikasi dilakukan dengan spektrofotometer UV-Vis dan FTIR. Hasil uji fitokimia menunjukkan bahwa ekstrak etil asetat daun pranajiwa mengandung senyawa flavonoid dengan kandungan total flavonoid sebesar 6,62% b/b EQ. Hasil uji aktivitas antioksidan secara in vitro dengan metode DPPH menunjukkan bahwa ekstrak etil asetat memiliki aktivitas antioksidan lemah dengan nilai IC50 sebesar 393,95 µg/mL. Hal ini kemungkinan disebabkan oleh senyawa tersebut masih dalam keadaan tidak murni, sehingga perlu dilakukan fraksinasi dengan harapan agar didapat nilai IC50 dari senyawa spesifik yang memiliki aktivitas antioksidan yang lebih kuat bila dibandingkan dengan ekstrak yang tidak murni. Adanya kandungan metabolit sekunder selain flavonoid kemungkin tidak memberikan respon sinergis sehingga aktivitas antioksidan yang dihasilkan lemah.
x
Hasil uji one way anova terhadap rerata aktivitas SOD dan kadar GPx setelah pemberian ekstrak etil asetat menunjukkan nilai p sebesar 0,000 (p<0,05), sehingga nilai tersebut mengindikasikan bahwa kelima perlakuan yang diberikan terhadap tikus wistar memberikan pengaruh yang berbeda nyata. Hasil uji beda Duncan terhadap rerata aktivitas SOD dan kadar GPx setelah pemberian ekstrak etil asetat menunjukkan perlakuan antara kelompok di dalam subset tidak berbeda nyata, akan tetapi antara subset terdapat perbedaan yang nyata. Jika dilihat dari aktivitas SOD dan kadar GPx sebelum dan setelah pemberian ekstrak etil asetat menunjukkan terjadinya peningkatan aktivitas SOD dan kadar GPx. Pemberian ekstrak etil asetat 20 mg/200 g BB/hari memberikan hasil yang terbaik yaitu dapat meningkatkan aktivitas SOD sebanyak 34,93 kali yaitu 171,44%. Peningkatan tersebut terjadi karena pada pemberian ekstrak dengan konsentrasi 20 mg/200 g BB/ hari sudah menunjukkan aktivitas SOD telah berada pada kisaran normal atau terjadi kondisi homeostasis. Selain itu meningkatnya aktivitas enzim SOD setelah pemberian ekstrak etil asetat juga diduga karena induksi gen yang bertanggung jawab pada sintesis enzim antioksidan melalui translokasi Nrf2 ke inti sehingga meningkatkan ekspresi gen penyandi antioksidan. Selanjutnya Nrf2 akan mengikat ARE (Antioxidant Response Element) pada daerah target gen dan akan menginduksi gen antioksidan. Sedangkan pemberian ekstrak etil asetat 30 mg/200 g BB/hari mampu meningkatkan kadar GPx sebanyak 9,76 kali yaitu 41,80%. Peningkatan kadar GPx karena pada konsentrasi tersebut ekstrak sudah mampu meningkatkan transkripsi gen antioksidan GPx yang dimediasi oleh Nrf2. Pemisahan dan pemurnian ekstrak etil asetat dengan teknik kromatografi kolom menggunakan fase gerak n-heksan:kloroform:etanol (20:1:1). Pemisahan menghasilkan isolat aktif yang positif flavonoid yaitu isolat FE dengan hasil identifikasi pada spektrofotometer FTIR diduga memiliki gugus fungsi –OH, C-H aromatik, C=C, C=O, C-O, dan C-H alifatik. Hasil análisis dengan spektrofotometer UV-Vis mengindikasikan bahwa ekstrak etil asetat diduga mengandung senyawa flavonoid golongan flavonol yaitu 3,5,7,3’,4’-pentahidroksi flavonol (kuersetin) yang berkontribusi sebagai antioksidan.
xi
DAFTAR ISI
Halaman SAMPUL DALAM ………………………………………………….. PRASYARAT GELAR ……………………………………………… LEMBAR PERSETUJUAN …………………………………………. PENETAPAN PANITIA PENGUJI …………………………………. SURAT PERNYATAAN BEBAS PLAGIAT ………………………. UCAPAN TERIMAKASIH …………………………………………. ABSTRAK …………………………………………………………… ABSTRACT …………………………………………………………. RINGKASAN ……………………………………………………….. DAFTAR ISI …………………………………………………………. DAFTAR TABEL ……………………………………………………. DAFTAR GAMBAR ………………………………………………… DAFTAR ARTI LAMBANG, SINGKATAN, DAN ISTILAH……… DAFTAR LAMPIRAN ………………………………………………
i ii iii iv v vi viii ix x xii xv xvi xvii xviii
BAB I PENDAHULUAN ……………………………………………. 1.1. Latar Belakang …………………………………………. 1.2. Rumusan Masalah ……………………………………… 1.3. Tujuan Penelitian ………………………………………. 1.4. Manfaat Penelitian ……………………………………...
1 1 5 6 6
BAB II TINJAUAN PUSTAKA ……………………………………... 2.1. Tumbuhan Pranajiwa (Euchresta horsfieldii Lesch Benn.) 2.2. Antioksidan …………………………………………….. 2.2.1. Superoksida Dismutase …………………………. 2.2.2. Glutation Peroksidase …………………………… 2.2.3. Malondialdehida (MDA)………………………… 2.3. Flavonoid ………………………………………………. 2.4. Vitamin C ………………………………………………. 2.5. Stres Oksidatif ………………………………………….. 2.6. Radikal Bebas dan Oksidan ……………………………. 2.7. Produksi Radikal Bebas Akibat Aktivitas Fisik ……….. 2.8. Isolasi dan Identifikasi Senyawa Flavonoid …………… 2.8.1. Ekstraksi ………………………………………… 2.8.2. Pemisahan dan pemurnian ……………………… 2.8.3. Spektrofotometri UV-Vis ……………………….. 2.8.3.1. Pereaksi diagnostik untuk identifikasi Flavonoid ………………………………. 2.8.4. Spektrofotometri Inframerah ……………………
7 7 13 16 16 17 20 25 27 28 29 30 30 31 33
BAB III KERANGKA BERPIKIR, KONSEP DAN HIPOTESIS ….. 3.1. Kerangka Berpikir ……………………………………… 3.2. Kerangka Konsep ……………………………………….
41 41 44
xii
34 39
3.3. Hipotesis Penelitian ……………………………………. BAB IV METODELOGI PENELITIAN ……………………………. 4.1. Rancangan Penelitian ………………………………….. 4.2. Tempat Penelitian ……………………………………… 4.3. Ruang Lingkup Penelitian ……………………………... 4.4. Penentuan Sumber Data ……………………………….. 4.4.1. Populasi ………………………………………... 4.4.2. Kriteria sampel ………………………………… 4.4.3. Besar sampel …………………………………... 4.5. Variabel Penelitian …………………………………….. 4.6. Bahan Penelitian ………………………………………. 4.7. Alat Penelitian …………………………………………. 4.8. Prosedur Penelitian …………………………………… 4.8.1. Penyiapan sampel …………………………….. 4.8.2. Maserasi ………………………………………. 4.8.3. Penentuan kandungan total flavonoid ………… 4.8.4. Penentuan aktivitas antioksidan secara in vitro . 4.8.5. Penentuan aktivitas antioksidan secara in vivo .. 4.8.5.1. Penetapan dosis ekstrak etil asetat daun pranajiwa ……………………………… 4.8.5.2. Hewan percobaan dan pengambilan sampel ………………………………… 4.8.5.3. Pengukuran kadar malondialdehide (MDA) 4.8.5.4. Pengukuran kadar superoksida dismutase (SOD) …………………………………. 4.8.5.5. Pengukuran kadar glutatión peroksidase (GPx) ………………………………….. 4.8.6. Pemisahan dan pemurnian ekstrak kental etil asetat ……………………………………………. 4.8.6.1. Kromatografi lapis tipis ………………. 4.8.6.2. Kromatografi kolom ………………….. 4.8.7. Uji golongan senyawa flavonoid ………………. 4.8.8. Identifikasi isolat flavonoid pada fraksi aktif ….. 4.8.8.1. Pengukuran dengan spektrofotometer UV-Vis ……………………………….. 4.8.8.2. Pengukuran dengan spektrofotometer FTIR ………………………………….. 4.9. Alur Penelitian ………………………………………… 4.9.1. Ekstraksi, pemisahan, dan pemurnian daun Pranajiwa ……………………………………… 4.9.2. Penentuan aktivitas antioksidan secara in vivo .. 4.10. Analisis Data …………………………………………..
44 45 45 47 47 47 47 48 48 48 49 49 50 50 50 50 52 52
BAB V HASIL DAN PEMBAHASAN ………………………………. 5.1. Uji Fitokimia terhadap Ekstrak Etil Asetat Daun Pranajiwa 5.2. Total Flavonoid ………………………………………….. 5.3. Penentuan Aktivitas Antioksidan Secara In Vitro dengan metode DPPH…………………………………….
62 62 68
xiii
52 53 54 54 55 55 55 56 57 58 58 59 60 60 61 61
70
5.4. Penentuan Aktivitas Antioksidan Secara In Vivo ………. 5.4.1 Analisis Kadar MDA, Aktivitas SOD, dan GPx Sebelum Pemberian Ekstrak Etil Asetat………….. 5.4.2 Analisis Aktivitas Superoksida dismutase (SOD)… 5.4.3 Analisis Kadar Glutation peroksidase (GPx) …….. 5.5. Pemisahan dan Pemurnian Ekstrak Etil Asetat Daun Pranajiwa ……………………………………………….. 5.6. Identifikasi Isolat Flavonoid ……………………………. 5.6.1 Identifikasi dengan spektrofotometri UV-Vis ……. 5.6.2 Identifikasi dengan spektrofotometri FTIR ………. 5.6.3 Hasil penambahan pereaksi geser ………………… BAB VI SIMPULAN DAN SARAN ………………………………... 6.1. Simpulan ………………………………………………… 6.2. Saran …………………………………………………….. DAFTAR PUSTAKA ………………………………………………… LAMPIRAN …………………………………………………………..
xiv
75 76 78 87 96 101 101 104 107 112 112 113 114 124
DAFTAR TABEL Halaman Rentangan serapan spektrum UV-Vis flavonoid ……..…………... Analisis spektrum inframerah senyawa golongan flavonoid ……... Hasil uji fitokimia terhadap ekstrak etil asetat daun pranajiwa ….. Nilai % inhibisi dan nilai IC50 ekstrak etil asetat daun pranajiwa terhadap radikal bebas DPPH ……….…………………………….. 5.3. Hasil pengukuran kadar MDA, aktivitas SOD, dan GPx sebelum pemberian ekstrak etil asetat ……………………………………… 5.4. Hasil uji normalitas kadar SOD setelah pemberian ekstrak etil asetat …………………………………………………………….… 5.5. Rerata kadar SOD antar kelompok perlakuan setelah pemberian ekstrak etil asetat …………………………………………….……. 5.6. Analisis aji Post Hoc Aktivitas SOD perlakuan antar kelompok setelah pemberian ekstrak etil asetat ……………………………… 5.7. Hasil analisis uji beda Duncan terhadap aktivitas SOD setelah pemberian ekstrak etil asetat ……………………………………… 5.8. Kenaikan aktivitas SOD ………………………………………….. 5.9. Hasil analisis peningkatan aktivitas SOD sebelum dan setelah pemberian ekstrak etil asetat …………………………………...… 5.10. Hasil uji normalitas kadar GPx setelah pemberian ekstrak etil asetat ……………………………………………………………… 5.11. Rerata kadar GPx antar kelompok perlakuan setelah pemberian ekstrak etil asetat …………………………………………………. 5.12. Analisis uji Post Hoc LSD kadar GPx perlakuan antar kelompok setelah pemberian ekstrak etil asetat ……………………………... 5.13. Hasil analisis uji beda Duncan terhadap kadar GPx setelah pemberian ekstrak etil asetat ……………………………………... 5.14. Kenaikan kadar GPx …………………………………………..… 5.15. Hasil analisis peningkatan kadar GPx sebelum dan setelah pemberian ekstrak etil asetat ………………………………….…. 5.16. Hasil KLT dengan menggunakan beberapa fase gerak ……….... 5.17. Data KLT penggabungan fraksi dari hasil kromatografi kolom… 5.18. Hasil uji flavonoid dengan fraksi noda tunggal dari hasil kromatografi kolom ……………………………………………… 5.19. Hasil uji kemurnian secara KLT terhadap isolat FE …………….. 5.20. Analisis spektra FTIR isolat FE …………………………………. 5.21. Pergeseran panjang gelombang spektra UV-Vis isolat FE ……… 2.1. 2.2. 5.1. 5.2.
xv
34 40 62 73 76 79 79 83 84 85 86 88 89 92 93 94 96 97 99 100 101 106 109
DAFTAR GAMBAR
Halaman 2.1. Karakteristik tumbuhan pranajiwa (Euchresta horsfieldii Lesch Benn.) 8 2.2. Senyawa prenylflavanon pada akar dan batang Euchresta horsfieldii Lesch Benn. di daerah Yunnan China …………………………… 10 2.3. Senyawa golongan flavonoid pada akar tumbuhan pranajiwa (Euchresta horsfieldii Lesch Benn.) di daerah Thailand ……….... 11 2.4. Mekanisme reaksi flavonoid dengan DPPH ……………………... 15 2.5. Reaksi kondensasi antara satu molekul MDA dengan dua molekul TBA pada kondisi asam …………………………………………... 18 2.6. Peroksidasi lipid asam lemak tak jenuh rantai panjang ………..…. 19 2.7. Tiga struktur dasar senyawa flavonoid ………………………….... 21 2.8. Flavonoid berdasarkan struktur molekul …………………………. 22 2.9. Struktur 3,5,7,3’,4’-pentahidroksi flavonol …………..………...... 25 2.10. Struktur asam askorbat ………..………………………………….. 26 2.11. Pembentukan elektron di sitokrom oksidase mitokondria ……..… 30 3.1. Kerangka konsep penelitian …………………………………..….. 44 4.1. Rancangan penelitian …………………………………………….. 46 4.2. Ekstraksi, pemisahan dan pemurnian daun pranajiwa …………… 60 4.3. Penentuan aktivitas antioksidan secara in vivo …………………... 61 5.1. Reaksi yang terjadi pada uji Meyer ……………………………… 63 5.2. Reaksi yang terjadi pada uji Wagner …………………………….. 64 5.3. Reaksi yang terjadi pada uji Liebermann Burchard ……………… 64 5.4. Reaksi yang terjadi pada uji FeCl3 ……………………………….. 65 5.5. Reaksi yang terjadi dengan uji NaOH ……………………………. 66 5.6. Mekanisme reaksi pembentukan garam flavilium ……………….. 67 5.7. Mekanisme reaksi kuersetin dengan AlCl3 ………………………. 69 5.8. Mekanisme reaksi flavonoid dengan DPPH ……………………... 70 5.9. Struktur flavonoid dengan aktivitas antiradikal bebas yang tinggi.. 71 5.10. Aktivitas enzim SOD setelah pemberian ekstrak etil asetat……… 80 5.11. Mekanisme peredaman radikal oleh flavonoid …………………... 81 5.12. Aktivitas SOD sebelum dan setelah pemberian ekstrak etil asetat. 84 5.13. Reaksi GPx mengubah hidrogen peroksida menjadi air ……….... 87 5.14. Kadar GPx pada plasma darah tikus wistar perlakuan setelah pemberian ekstrak etil asetat ……………………………………... 90 5.15. Kadar GPx sebelum dan setelah pemberian ekstrak etil asetat ….. 93 5.16. Spektrum UV-Vis isolat FE ………………………………………. 102 5.17. Senyawa flavonoid golongan flavonol …………………………… 104 5.18. Spektra FTIR isolat FE ………………………………………….... 105 5.19. Pergeseran spektrum UV-Vis pada isolat FE dengan penambahan pereaksi geser …………………………………………………… 108
xvi
DAFTAR SINGKATAN
AGEs
: Advanced Glycation End Product
ARE
: Antioxidant Response Element
ATP
: Adenosine Triphospate
BSA
: Bovine Serum Albumin
DPPH
: 1,1- diphenyl-2-picrylhydrazyl
DNA
: Deoxyribonucleic acid
EDTA
: Ethylene Diamine Tetra Acid
FTIR
: Fourier Transform Infra Red
GAEAC
: Gallic Acid Equivalent Antioxidant Capacity
GPx
: Gluthation Peroksidase
GSH
: Glutation tereduksi
HED
: Human Equivalen Dose
IC50
: Inhibitory Concentration 50
KLT
: Kromatografi Lapis Tipis
Km
: Faktor Konversi
MDA
: Malondialdehide
NADPH
: Nicotinamid adenine dinukleotida fosfat
NBT
: Nitro Blue Tetrazolium
Nrf2
: Nuclear factor erythroid 2 related factor 2
8-OHdG
: 8-hidroksi-2-dioksiguanosin
ROS
: Reactive oxygen spesies
Rf
: Retention factor
SOD
: Superoxide dismutase
HAT
: Hydrogen atom transfer
ET
: electron transfer
SPLET
: sequential proton loss electron transfer
AITD
: autoinmune thyroiditis
TBAR
: Thiobarbituric Acid Reactive
xvii
DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1. Skema kerja penelitian ………………........................................... 1.1.Skema kerja tahap ekstraksi …………………………………… 1.2.Skema kerja tahap pemisahan, pemurnian, dan identifikasi ….. 1.3.Penentuan aktivitas antioksidan secara in vivo ………………... 1.4.Pengukuran kadar malondialdehida (MDA) …………………... 1.5.Pengukuran aktivitas superoksida dismutase ………………….. 1.6.Pengukuran kadar glutation peroksidase (GPx) ………………. 2. Pembuatan larutan ………………………………………………… 2.1.Larutan uji fitokimia …………………………………………... 2.2.Larutan uji total flavonoid …………………………………….. 2.3.Larutan uji antioksidan metode DPPH ………………………... 2.4.Perhitungan pembuatan larutan sampel ……………………….. 2.5.Pembuatan pereaksi geser ……………………………………... 3. Perhitungan konsentrasi dan kandungan total flavonoid ………….. 4. Pengukuran aktivitas antioksidan ………………………………….. 4.1.Nilai IC50 ………………………………………………………. 4.2.Kapasitas antioksidan …………………………………………. 5. Hasil pengukuran kadar MDA plasma darah tikus yang diberi Aktivitas fisik maksimal …………………………………………… 6. Hasil pengukuran aktivitas SOD dan kadar GPx yang diberi Aktivitas fisik maksimal …………………………………………… 6.1.Data pengukuran aktivitas SOD ……………………………….. 6.2.Data pengukuran kadar GPx …………………………………… 7. Hasil uji statistik masing-masing perlakuan terhadap aktivitas SOD tikus setelah pemberian ekstrak etil asetat …………………… 8. Hasil uji statistik masing-masing perlakuan terhadap kadar GPx tikus setelah pemberian ekstrak etil asetat………………………….. 9. Hasil pengukuran aktivitas SOD dan GPx rata-rata sebelum dan setelah pemberian ekstrak etil asetat ……………………………….. 10. Persentase kenaikan SOD dan GPx ………………………………… 10.1. Persentase kenaikan superoksida dismutase …………………. 10.2. Persentase kenaikan kadar glutation peroksidase ……………. 11. Profil hasil kromatografi lapis tipis ………………………………… 11.1. Profil hasil KLT pemilihan eluen ……………………............. 11.2. Profil hasil KLT penggabungan ……………………………… 11.3. Profil hasil KLT uji kemurnian ………………………………. 12. Perhitungan Rf ……………………………………………………… 13. Penafsiran warna bercak dari segi struktur flavonoid ……………… 14. Penafsiran spektrum dengan penambahan pereaksi geser …………. 15. Hasil determinasi tumbuhan pranajiwa (Euchresta horsfieldii Lesch Benn.) ………………………………………………………………. 16. Foto-foto penelitian ………………………………………………… 16.1. Persiapan sampel ………..……………………………………
xviii
124 124 125 126 126 127 127 128 128 128 129 129 130 131 133 133 134 136 137 137 138 139 142 145 147 147 147 149 149 150 151 152 156 158 161 161 163
16.2. Persiapan sampel dan ekstraksi ……………………………… 16.3. Uji total flavonoid dan uji antioksidan dengan DPPH …..….. 16.4. Uji antioksidan secara in vivo ………………………………..
xix
164 165 166
BAB I PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang Stres oksidatif adalah meningkatnya radikal bebas di dalam tubuh, serta menurunnya kemampuan tubuh untuk menetralisir radikal bebas sehingga dapat terjadi gangguan fungsi sel. Faktor internal utama yang menimbulkan stres oksidatif adalah oksidasi fosforilasi akibat melakukan aktivitas fisik maksimal. Selama aktivitas fisik akan terbentuk radikal bebas bersamaan dengan reaksi oksidasi fosforilasi untuk membentuk Adenosine Triphospate (ATP) dalam mitokondria. Pada reaksi tersebut dibutuhkan oksigen yang mana oksigen akan bereaksi dengan hidrogen untuk membentuk air, tetapi sejumlah oksigen dapat berubah menjadi radikal bebas. Dengan demikian semakin berat aktivitas fisik maka dibutuhkan semakin banyak ATP, juga semakin banyak radikal bebas yang dihasilkan sebagai produk samping (Pangkahila, 2007). Radikal bebas dapat merusak membran sel, protein, dan DNA yang berakibat fatal bagi kelangsungan hidup sel/jaringan. Radikal bebas dapat diredam baik secara enzimatik maupun non-enzimatik oleh senyawa-senyawa yang termasuk antioksidan. Antioksidan enzimatik seperti Superoxide dismutase (SOD), Gluthation peroksidase (GPx), dan Catalase (CAT). Untuk antioksidan non enzimatik dapat berupa mikronutrien pada buah, sayur-sayuran, dan tanaman lain seperti vitamin A, C, E, asam folat, antosianin, senyawa fenol, dan flavonoid (Edyson, 2003).
xx
Tubuh sebenarnya telah mempunyai kemampuan untuk menetralisir radikal bebas dengan adanya antioksidan endogen seperti Superoxide dismutase (SOD) dan Gluthation Peroksidase (GPx). Antioksidan tersebut akan menangkal atau meredam dampak negatif radikal bebas dalam tubuh dengan cara mendonorkan elektronnya kepada radikal bebas sehingga aktivitas radikal bebas tersebut dapat dihambat. Akan tetapi jika aktivitas fisik dilakukan secara maksimal maka dihasilkan radikal bebas yang lebih banyak. Dalam kondisi demikian antioksidan endogen tidak mampu lagi mengimbangi pembentukan radikal bebas sehingga akan menyebabkan terjadinya stres oksidatif (Bagiada, 2001). Untuk meningkatkan aktivitas antioksidan endogen dalam mencegah terjadinya stres oksidatif maka diperlukan tambahan antioksidan dari luar tubuh (antioksidan eksogen) yang dapat diperoleh dari asupan makanan dan minuman yang dikonsumsi tiap hari. Antioksidan tersebut akan meredam radikal bebas dengan cara mendonorkan elektronnya baik pada tahap inisiasi, propagasi maupun tahap terminasi. Antioksidan eksogen merupakan jenis antioksidan alami yang berasal dari kandungan mikronutrien, salah satunya adalah senyawa golongan flavonoid. Keberadaan flavonoid tersebut dapat membantu kerja superoksida dismutase dalam tubuh dengan menangkal radikal bebas yang terbentuk akibat aktivitas fisik maksimal tersebut. Flavonoid berpotensi sebagai antioksidan karena mampu menyumbangkan ion H+ pada senyawa radikal bebas. (Kandaswami dan Midelton, 1997). Hal ini di dukung oleh hasil penelitian yang dilakukan oleh Widayanti (2015) menyatakan bahwa fraksi n-butanol terong belanda memiliki aktivitas antioksidan yang kuat dengan nilai IC50 sebesar 69,89 mg/L dan dapat meningkatkan aktivitas
xxi
SOD dan menurunkan kadar MDA. Fraksi n-butanol tersebut diduga mengandung senyawa flavonoid golongan flavon, flavonol, dan isoflavon yang mungkin berkontribusi sebagai antioksidan alami. Penelitian Sugianto (2011) menyebutkan bahwa pemberian jus delima merah dapat meningkatkan kadar GPx pada darah mencit dengan aktivitas fisik maksimal. Hasil penelitian Wresdiyanti et al. (2013) menyatakan bahwa α-tokoferol dapat meningkatkan SOD dan menurunkan MDA jaringan hati tikus di bawah kondisi stres. Menurut Gunawan et al. (2015) pemberian ekstrak biji pranajiwa dengan dosis 0,5; 2; dan 5 mg/kg bb/ hari dapat memperbaiki laju kerusakan sel-β pankreas dengan indikasi menurunnya kadar glukosa
darah,
AGEs
(Advanced
Glycation
End
Product),
MDA
(Malondialdehid), dan 8-OHdG (8-hidroksi-2-dioksiguanosin) pada tikus Wistar hiperglikemia. Menurut Heyne (1987), tumbuhan Pranajiwa (Euchresta horsfieldii Lesch Benn.) merupakan salah satu tumbuhan tradisional yang digunakan untuk obat kencing manis, obat asma, obat batuk, afrodisiak, dan merangsang muntah akibat keracunan makanan. Akar dan batang tumbuhan pranajiwa mengandung flavonoid, isoflavon, pterocarpan, caumaronochromon dan flavonon. Jenis flavonoid yang terdapat pada daun adalah apigenin. Bijinya mengandung alkaloid berupa cytosine (1,5%), matrine dan matrine-N-oxide (Ardaka et al., 2011 dan Matsuura, et al., 1994). Menurut penelitian Mizuno et al. (1990a,b,c) pada akar dan batang tumbuhan pranajiwa mengandung senyawa golongan flavonoid. Di Yunnan (Cina), pada bagian akar dan batang tumbuhan pranajiwa ditemukan flavanon (glabrol), pterocarpan (maackiain), ester asam firulat, dan dua prenilflavanon (euchrenon a7
xxii
dan a8). Sedangkan di Thailand ditemukan empat isoflavon (warangalone, osajin, 6,8-di(3-metil-2-butenil) genistein dan 8-O-methylretusin) dan dua pterocarpans (maackiain dan sophoracarpan B). Menurut Sari, dkk. (2015), isolat aktif ekstrak n-heksana daun pranajiwa pada konsentrasi 8000 ppm memiliki aktivitas antiradikal bebas dengan persentase peredaman sebesar 94,67%. Sedangkan menurut penelitian Tirta et al. (2010) menyatakan bahwa kapasitas antioksidan pada ekstrak n-heksana daun pranajiwa yaitu sebesar 126,94 ppm GAEAC (Gallic Acid Equivalent Antioxidant Capacity). Berdasarkan hasil penelitian mengenai tumbuhan pranajiwa tersebut, maka dilakukan uji pendahuluan fitokimia untuk daun pranajiwa. Uji pendahuluan fitokimia menunjukkan bahwa daun pranajiwa mengandung senyawa fenol, alkaloid, steroid/terpenoid, saponin, dan flavonoid. Senyawa golongan flavonoid kemungkinan berperan penting dalam aktivitas antioksidan pada daun pranajiwa. Menurut Nijveidt et al. (2001), senyawa flavonoid diketahui memiliki sejumlah kemampuan yaitu dapat menghambat pembentukan radikal bebas hidroksil, anion superoksida, radikal peroksil, radikal alkoksil, singlet oksigen, hidrogen peroksida. Mekanisme kerja antioksidan flavonoid yaitu menekan pembentukan radikal bebas atau ROS (Reactive Oxygen Spesies) dengan cara menghambat enzim, pengkelatan ion logam (metal ion chelating) yang terlibat produksi radikal bebas dan meredam radikal bebas (free radical scavengers). Analisis senyawa golongan flavonoid lebih baik dilakukan dengan memeriksa aglikon flavonoid yang terdapat dalam ekstrak tumbuhan tersebut. Karena senyawa flavonoid glikosida yang mengikat gugus gula cenderung lebih mudah larut dalam air sehingga lebih rumit dalam proses pemisahannya. Aglikon
xxiii
flavonoid yang tidak mengikat gugus gula dan bersifat kurang polar yang cenderung larut dalam pelarut semipolar seperti etil asetat. Senyawa golongan aglikon flavonoid diantaranya isoflavon, flavonon, flavon serta flavonol yang termetoksi (Harborne,1987 dan Markham, 1988). Oleh sebab itu dilakukan analisis aglikon flavonoid pada ekstrak etil asetat daun pranajiwa. Berdasarkan beberapa penelitian tersebut, dapat dinyatakan daun pranajiwa merupakan salah satu sumber antioksidan, akan tetapi belum ada penelitian yang melaporkan tentang peranan ekstrak etil asetat daun pranajiwa dalam meningkatkan aktivitas superoksida dismutase (SOD) dan kadar glutation peroksidase (GPx) pada tikus Wistar yang mengalami stres oksidatif setelah aktivitas fisik maksimal. Dengan dasar pemikiran tersebut maka pemberian ekstrak etil asetat daun pranajiwa pada tikus Wistar setelah mengalami aktivitas fisik maksimal masih perlu diteliti lebih lanjut.
1.2 Rumusan Masalah Berdasarkan uraian di atas, maka permasalahan yang dapat dirumuskan adalah sebagai berikut : 1. Apakah pemberian ekstrak etil asetat daun pranajiwa (Euchresta horsfieldii Lesch Benn.) dapat meningkatkan aktivitas Enzim Superoksida Dismutase (SOD) dan kadar Glutation Peroksidase (GPx) pada darah tikus Wistar (Rattus norvegivus) dengan aktivitas fisik maksimal? 2. Senyawa flavonoid golongan apakah yang aktif memberikan aktivitas antioksidan yang terkandung dalam ekstrak etil asetat daun pranajiwa ?
xxiv
1.3 Tujuan Penelitian Berdasarkan rumusan masalah yang dipaparkan, maka tujuan dalam penelitian ini sebagai berikut : 1. Mengetahui aktivitas ekstrak etil asetat daun pranajiwa (Euchresta horsfieldii Lesch Benn.) dalam meningkatkan enzim superoksida dismutase dan glutation peroksidase pada darah tikus Wistar (Rattus norvegivus) dengan aktivitas fisik maksimal. 2. Menentukan golongan flavonoid yang aktif sebagai antioksidan yang terkandung dalam ekstrak etil asetat daun pranajiwa (Euchresta horsfieldii Lesch Benn.).
1.4 Manfaat Penelitian Manfaat yang dapat diperoleh dari penelitian ini untuk perkembangan ilmu pengetahuan dan teknologi adalah menambah informasi mengenai aktivitas antioksidan ekstrak etil asetat daun pranajiwa (Euchresta horsfieldii Lesch Benn.) terhadap superokside dismutase dan glutation peroksidase pada darah tikus Wistar (Rattus norvegivus) dengan aktivitas fisik maksimal. Selain itu, penelitian ini memperkaya informasi mengenai golongan flavonoid yang aktif sebagai antioksidan yang bersumber dari ekstrak etil asetat daun pranajiwa. Manfaat praktis dalam penelitian ini adalah menambah pengetahuan dan informasi bagi masyarakat tentang khasiat daun pranajiwa bagi kesehatan yaitu sebagai salah satu sumber antioksidan alternatif serta untuk mencegah penuaan.
xxv
xxvi
