EFEK EKSTRAK ETANOLIK DAUN Gynura procumbens (Lour) Merr TERHADAP PROLIFERASI SEL KANKER PAYUDARA TIKUS YANG DIINDUKSI 7,12Dimetilbenz(a)antrasen (DMBA) ANTIPROLIFERATIVE EFFECT OF ETHANOLIC EXTRACT LEAVES OF Gynura procumbens (Lour) Merr ON DMBA INDUCED RAT MAMMARY CARCINOMA CELL Sri Susilowati1, Edy Meiyanto2, Sugiyanto3 Fakultas Farmasi Universitas Wahid Hasyim, Semarang1 , Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada2 INTISARI Ekstrak etanolik daun Gynura procumbens (Lour) Merr yang diberikan pada tahap inisiasi ternyata dapat menurunkan angka kejadian munculnya kanker payudara pada tikus betina galur Sprague Dawley yang diinduksi 7,12-dimetilbenz(a)antrasen (DMBA). Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh ekstrak etanolik daun G. procumbens terhadap aktivitas proliferasi dari sel kanker payudara tikus tersebut. Pengamatan aktivitas proliferasi sel kanker payudara tikus dilakukan dengan metode AgNOR. Pengecatan AgNOR dilakukan terhadap jaringan payudara tikus yang telah diblok paraffin dan sebelumnya difiksasi dengan formalin 10%. Aktivitas proliferasi diketahui dari nilai mAgNOR yaitu rata-rata jumlah titik hitam dalam sel, pada pengamatan 100 sel. Penelitian ini terdiri dari 5 kelompok yaitu kontrol positif, kontrol negatif dan 3 kelompok perlakuan. Kontrol positif merupakan jaringan kanker payudara tikus yang diambil dari kelompok tikus yang hanya mendapat inisiator DMBA. Kontrol negatif adalah jaringan payudara normal dari kelompok tikus yang mendapat minyak jagung sebagai pelarut DMBA. Kelompok perlakuan merupakan jaringan kanker payudara tikus dari 3 kelompok tikus yang mendapat perlakuan ekstrak etanolik daun G. procumbens dengan 3 peringkat dosis masing-masing 250 mg/kg BB; 500 mg/kg BB; dan 750 mg/kg BB. Ekstrak ini diberikan sebelum dan selama inisiasi DMBA. Hasil penelitian menunjukkan ekstrak etanolik daun G. procumbens mampu mengurangi aktivitas proliferasi sel kanker payudara tikus karena induksi DMBA. Rata-rata nilai m AgNOR kelompok kontrol positif adalah 2,69 + 0,42 dan kelompok kontrol negatif adalah 1,06 + 0,11, sedangkan kelompok perlakuan ekstrak dengan tiga peringkat dosis masing-masing adalah 1,01 + 0,08 untuk dosis 250 mg/kg BB, 1,48 + 0,49 untuk dosis 500 mg/kg BB dan 1,55 + 0,49 untuk dosis 750 mg/kg BB. Dengan demikian dapat disimpulkan bahwa ekstrak etanolik daun G. procumbens mampu menghambat pertumbuhan kanker payudara pada model hewan percobaan (tikus) melalui penurunan aktivitas proliferasi.
ABSTRACT Ethanolic extract leaves of Gynura procumbens (Lour) Merr could reduce tumour incident on 7,12- dimethylbenz(a)anthracene (DMBA) induced rat mammary carcinoma. The aim of this study was to evaluate the effect of the extract on activity of tumor cells proliferation. The activity of tumor cells proliferation was carried out with AgNOR methode. AgNOR staining was done to paraffin embedded mammary gland tissue. The activity of tumor cells proliferation was expressed by value AgNOR amount of black dot in cells, determined on 100 cells. This study was divided into 5 group, positive control group, negative control group and 3 treatment groups. Positive control group was mammary carcinoma tissues from rats were given inisiator only, DMBA. Negative control group was normal mammary gland tissues from rats were given corn oil. Treatment groups were mammary carcinoma tissues from rats were given ethanolic extract leaves of G. procumbens with 3 doses, 250, 500 and 750 mg/kg body weight. This extracts were given before and at the time of DMBA inisiation The results showed of this study demonstrated that etanolic extract leaves of G. procumbens could reduce the activity of tumor cells proliferation. Mean AgNOR positive control group was 2,69 + 0,42 and negative control group was 1,06 + 0,11, treatment group was 1,01 + 0,08 for extract dose 250 mg/kg BW, 1,48 + 0,49 for extract dose 500 mg/kg bw and 1,55 + 0,49 for extract dose 750 mg/kg BW. It can be concluded that etanolic extract leaves of G. procumbens are capable to delay the progression of mammary tumour in experimental animal (rat).
1
PENDAHULUAN Kanker merupakan penyakit yang mematikan. Menurut laporan WHO, terdapat lebih dari 10 juta kasus kanker pertahun di dunia. Di Amerika Serikat kanker merupakan penyebab kematian kedua setelah penyakit kardiovaskular. Sedangkan di Indonesia kanker merupakan penyebab kematian ke-6 (Tjindarbumi &Mangunkusumo, 2002). Kanker payudara termasuk jenis kanker yang paling sering diderita kaum wanita disamping kanker kulit dan merupakan penyebab kematian kedua setelah kanker paru. Dari semua kasus kanker pada wanita di Amerika Serikat, kanker payudara menduduki peringkat pertama (32%) dan kematian karena kanker jenis ini mencapai 18% (King, 2000). Sedangkan di Indonesia kanker payudara menduduki peringkat kedua setelah kanker leher rahim (serviks) dan kasusnya mencapai 17,77% (Tjindarbumi & Mangunkusumo, 2002). Beberapa usaha pengobatan terhadap kanker telah dilakukan secara intensif, yaitu dengan pembedahan, kemoterapi dan radioterapi, namun belum mampu secara efektif menanggulangi kanker. Meskipun pengobatan dengan cara-cara tersebut cukup menolong penderita kanker yang terdeteksi dini dan belum mengalami metastasis (Ganiswara, 1995). Kegagalan yang sering terjadi dalam pengobatan kanker, utamanya melalui kemoterapi, dikarenakan rendahnya selektifitas anti kanker dan belum jelasnya proses karsinogenesis itu sendiri. Kendala lain yang dihadapi dalam pengobatan kanker adalah mahalnya biaya pengobatan. Berdasarkan hal-hal tersebut di atas, penelitian dan pengembangan obat kanker menjadi sangat penting untuk terus dilakukan. Namun usaha pencegahan kanker yang dilakukan sejak dini kiranya merupakan jalan terbaik terhindar dari masalah - masalah yang ditimbulkan kanker. Upaya penemuan senyawa kemopreventif dalam rangka pencegahan dan penundaan proses karsinogenesis serta pengurangan kanker untuk terjadi kembali, merupakan strategi baru yang menjanjikan. Senyawa kemopreventif dapat berupa bahan
makanan ataupun senyawa kimia baik natural (fitokimia) atau sintetik. Upaya ini merupakan alternatif yang mudah dan murah terhindar dari kanker terutama bagi masyarakat dengan resiko tinggi. Secara empiris G. procumbens telah digunakan untuk mengobati penyakit kanker payudara dan kanker otak. Disamping itu telah pula dilakukan penelitian laboratorium mengenai khasiat daun G. procumbens sebagai anti kanker baik secara in vitro atau in vivo. Secara in vitro daun G. procumbens mempunyai efek antikarsinogenik, dengan menghambat aktivitas sel vero dan sel mieloma. Penelitian in vivo membuktikan ekstrak etanolik daun G. procumbens mampu menghambat pertumbuhan tumor paru dan lambung pada mencit karena induksi benzo(a)piren. Daun G. procumbens juga terbukti memiliki potensi sebagai antimutagenik dan antiangiogenik. Ekstrak ini juga terbukti mampu menghambat pertumbuhan tumor payudara tikus yang diinduksi DMBA pada tahap inisiasi. Mekanisme penghambatan ataupun penyembuhan kanker sangatlah kompleks. Akhir-akhir ini telah banyak penelitian yang mengungkap mekanisme penghambatan terjadinya tumor ataupun penyembuhannya, salah satunya melalui mekanisme antiproliferasi. Dalam penelitian ini ingin diketahui potensi dari ekstrak etanolik daun G. procumbens sebagai antiproliferasi pada tumor payudara tikus yang diinduksi 7,12dimetilbenz(a)antrasen (DMBA) pada tahap inisiasi. Dengan pemberian ekstrak yang dilakukan sejak awal yaitu sebelum dan selama inisiasi diharapkan dapat diketahui potensi kemopreventif dari daun G. procumbens yang merupakan bahan alam yang berpotensi untuk dikembangkan. METODE PENELITIAN Bahan : ekstrak etanolik daun G. procumbens, CMC Na (E. Merck), DMBA (7,12dimetilbenz(a)ntrasen) (Sigma Chem.), minyak jagung, Akuades, Formalin 10 % (teknis), etanol (teknis), perak nitrat (AgNO3), gelatin dan Asam Formiat 1%. Hewan uji : Tikus betina galur Sprague Dawley
Cara Penelitian : Induksi karsinogenesis dengan DMBA dan perlakuan dengan ekstrak etanolik daun G. procumbens. Tikus betina umur 1 bulan, dibagi menjadi 5 kelompok secara random. Masingmasing kelompok terdiri dari 10 ekor tikus. Kelompok I merupakan kelompok kontrol positif, yang dibuat model kanker payudara dengan pemberian DMBA dalam minyak jagung dengan dosis 20 mg/kg BB secara peroral sebanyak 10 kali, yaitu seminggu 2 kali selama 5 minggu pada umur 1,5 bulan. Kelompok II-IV, yaitu kelompok perlakuan, diberi ekstrak etanolik daun G. procumbens dengan peringkat dosis 250 mg/kg BB, 500 mg/kg BB dan 750 mg/kg BB setiap hari selama 14 hari sebelum inisiasi dan selama inisiasi (pemberian DMBA). Dosis, frekuensi dan cara pemberian DMBA sama dengan kelompok kontrol positif. Kelompok V merupakan kelompok kontrol negatif, tikus umur 1,5 bulan hanya diberi minyak jagung. Minyak jagung diberikan 10 kali, seminggu 2 kali selama 5 minggu. Tikus kelompok kontrol positif dan negatif selama empat belas hari sebelum inisiasi DMBA hanya mendapat pakan kontrol. Pengamatan perkembangan tumor dilakukan setiap minggu selama 16 minggu setelah inisiasi (pemberian DMBA) yang terakhir. Pada akhir pengamatan dilakukan nekropsi untuk mengetahui keadaan seluler dari organ payudara yang terkena kanker dengan pewarnaan AgNOR untuk mengetahui aktivitas proliferasinya. Organ ini difiksasi dengan larutan formalin 10% sebelum dilakukan pengeblokan dengan paraffin. Pemeriksaan aktivitas proliferasi dengan metode AgNOR Irisan jaringan glandula mammae dari blok parafin setebal kurang lebih 3 µm diproses dengan xylen untuk menghilangkan lilinnya (deparafinisasi). Kemudian didehidrasi secara bertingkat dengan etanol, selanjutnya dicuci dengan akuades. Langkah berikutnya irisan ini ditutup dengan larutan pewarna AgNOR yang terdiri dari campuran
satu bagian volume 2% gelatin dalam 1% larutan asam formiat dengan dua bagian volume 50% larutan perak nitrat, pada temperatur kamar di ruangan gelap selama kurang lebih 45 menit untuk mendapatkan hasil optimal. Sediaan kemudian dicuci dengan akuades dan didehidrasi dalam etanol dengan konsentrasi bertingkat dan ditutup dengan kaca penutup menggunakan medium sintetik. Jumlah AgNOR tiap sel dihitung di bawah mikroskop dengan perbesaran 1000X dalam minyak imersi. Pada tiap sampel dihitung minimal 100 sel (rata-rata 110 sel) dengan 3 kali pengamatan (3 daerah lapang pandang yang berbeda). Parameter aktivitas proliferasi digunakan nilai AgNOR yaitu ratarata jumlah titik hitam (NOR) pada setiap sel, yang dilakukan dengan membagi seluruh jumlah titik hitam dalam sel yang teramati dengan seluruh jumlah sel yang teramati (minimal 100 sel). Untuk pengecatan AgNOR dilakukan di Laboratorium Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran, UGM Yogyakarta, sedangkan pemeriksaannya dilakukan di Laboratorium Ilmu Hayati, UGM Yogyakarta di bawah mikroskop binokuler Olympus dengan perbesaran 1000X, hasil direkam dengan kamera digital Canon S-40. HASIL DAN PEMBAHASAN Teknik pewarnaan AgNOR dapat digunakan untuk menganalisis aktivitas proliferasi sel tumor dan mendiagnosa tingkat keparahan (malignancy) tumor (Lee et al., 1999; Bankfalvi et al., 2002). Parameter aktivitas proliferasi dalam penelitian ini dilihat dari nilai m AgNOR, yaitu rata-rata jumlah titik hitam (dot) dalam setiap sel (Gambar 1 dan 2) yang diamati pada minimal 100 sel. Cara m AgNOR ini dapat digunakan untuk menentukan tingkat aktivitas proliferasi beberapa sampel jaringan tumor dari beberapa organ termasuk kanker payudara (Lee et al., 1999 ; Bankfalvi et al., 2002 ; Ghozali dan Harijadi, 1997).
Gambar 1. Gambaran histopatologi hasil pewarnaan AgNOR dari sel normal glandula mammae kelompok kontrol negatif (perbesaran 100x10) : contoh AgNOR (titik hitam dalam sel), terlihat rata-rata AgNOR (m AgNOR) dari sel normal glandula mammae (acinus) adalah 1.
Gambar 2.
Gambaran histopatologi hasil pewarnaan AgNOR dari sel tumor glandula mammae kelompok kontrol positif (perbesaran 100x10) : contoh AgNOR (titik hitam dalam sel), terlihat rata-rata AgNOR (m AgNOR) dari sel tumor glandula mammae tikus yang diinduksi DMBA adalah antara 2-3.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak etanolik daun G. procumbens mampu menurunkan aktivitas proliferasi sel-sel tumor glandula mammae dari tikus yang diinduksi DMBA. Pada kelompok kontrol positif kanker (DMBA) rata-rata nilai m AgNOR adalah 2,69 + 0,42 , sedangkan kelompok yang terkena kanker pada perlakuan ekstrak etanolik daun G. procumbens dosis 250 mg/kg BB adalah 1,01 + 0,08, dosis 500 mg/kg BB adalah 1,48 + 0,49, dan dosis 750 mg/kg BB adalah 1,55 + 0,49. Penurunan nilai m AgNOR pada semua kelompok perlakuan ekstrak dibanding kelompok kontrol positif (DMBA) menunjukkan kebermaknaan (p<0,05) ( Gambar 3). Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak etanolik daun G. procumbens memiliki potensi sebagai antiproliferatif karena mampu menurunkan aktivitas proliferasi sel-sel tumor
payudara tikus karena induksi DMBA. Efek antiproliferatif ini dapat mencegah progresi sel-sel kanker menjadi bentuk malignant (ganas). Mekanisme proliferasi dapat dijelaskan melalui regulasi siklus sel. Progresi siklus sel diregulasi oleh kompleks cyclin cyclin dependent kinase (Cdk). Aktivasi kompleks Cdk4-Cyc D, Cdk6-Cyc D, Cdk2Cyc E dan Cdk2-Cyc A, diperlukan dari fase G1 menuju fase S. Protein tumor suppressor retinoblastoma (pRb) merupakan protein target yang difosforilasi oleh kompleks CdkCyc ini sehingga mampu melepaskan factor transkripsi E2F yang berperan untuk proliferasi sel. Cyclin-dependent kinase inhibitor (CKI) merupakan protein yang mampu menginaktivasi kompleks Cdk-cyclin. Protein yang termasuk dalam golongan CKI adalah p21, p27, p57 serta INK4. Penghambatan proliferasi melalui penundaan siklus sel dapat terjadi dengan adanya
penghambatan aktivitas kinase (aktivitas Cdk) oleh CAK (Cdk activating kinase), penurunan ekspresi cyclin atau peningkatan ekspresi CKI. Efek antiproliferatif dari beberapa senyawa yang berpotensi antikanker salah satunya diketahui melalui kemampuannya dalam menunda siklus sel. Beberapa flavonoid seperti apigenin, genistein dan quercetin dilaporkan mampu menginduksi G2/M arrest pada beberapa cell line (Lepley et al., 1996 cit Pan et al., 2002). Sedangkan beberapa flavonoid yang lain juga dapat menginduksi G1 arrest (Matsukawa et al., 1993 cit Pan et al., 2002). Pan et al., (2002) melaporkan bahwa polimetoksi flavonoid (tangeretin) yang terdapat pada kulit jeruk, dapat menginduksi
G1 arrest dengan adanya peningkatan ekspresi Cdk inhibitors seperti p27, p21 pada colon cacer cell line (COLO 205). Protein p21 dan p27 merupakan anggota Cip/Kip protein yang dapat membentuk trimer dengan kompleks Cyc D-Cdk (holoenzim). Trimer dengan holoenzim akan mengakibatkan holoenzim ini tidak dapat memphosphorilasi pRb, sehingga sel akan arrest pada G1. Tangeretin juga telah terbukti dapat menginhibisi Cdk 4 dan 6, menekan ekspresi Cyc A, Cyc D1 dan Cyc E serta meningkatkan level p53 pada sel COLO 205. Protein p53 merupakan regulator yang dapat memacu ekspresi p21, sehingga dapat menyebabkan cell cycle arrest pada G1 (Guo and Hay, 1999).
aktivitas proliferasi
rata-rata nilai m AgNOR
3
2.687
2.5 2
1.48 1.554
1.5 1.015
1.058
1 0.5 0 Kontrol Ekstrak Ekstrak Ekstrak Kontrol
B B
positif (DMBA) Gynura 250 Gynura 500 Gynura 750 negatif (corn oil)
Gambar 3. Efek ekstrak etanolik daun G. procumbens terhadap aktivitas proliferasi sel-sel tumor payudara tikus yang diinduksi DMBA
A
C
B
D
Gambar 4. Gambaran histopatologi hasil pewarnaan AgNOR dari sel-sel tumor glandula mammae (A) kontrol positif (DMBA), m AgNOR=2,96 ; (B) perlakuan ekstrak etanolik daun G. procumbens dosis 250 mg/kg BB, m AgNOR=1,01 ; (C) dosis 500 mg/kg BB, m AgNOR=1,48 ; (D) dosis 750 mg/kg BB, m AgNOR=1,55 (perbesaran 100x10): contoh AgNOR (NOR yang bersifat argyrofilik, terlihat sebagai titik hitam di dalam sel)
Seperti diketahui ekstrak etanolik daun G. procumbens memiliki kandungan
kimia flavonoid, sterol tak jenuh, triterpen, polifenol, tanin, saponin dan minyak atsiri
(Sudarto dan Pramono, 1985), sedangkan senyawa aktif yang berpotensi sebagai antikarsinogenik adalah flavonoid yang mengarah ke golongan flavon/flavonol (Sugiyanto et al., 2003). Kemungkinan mekanisme aksi antiproliferatif dari ekstrak tersebut sama dengan mekanisme penundaan siklus sel oleh tangeretin. Senyawa flavonoid dalam ekstrak etanolik daun G. procumbens dimungkinkan mampu meningkatkan CKI seperti p21, p27 atau p57, menginhibisi Cdk, menekan ekspresi cyclin atau meningkatkan level p53 sehingga terjadi cell cycle arrest dan pertumbuhan sel tumor pun dapat dihambat. Perlu dilakukan uji khusus untuk membuktikan hal ini. KESIMPULAN Ekstrak etanolik daun G. procumbens yang diberikan pada tahap inisiasi mampu menurunkan aktivitas proliferasi dari sel kanker payudara tikus yang diinduksi DMBA. SARAN Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mengeksplorasi mekanisme molekuler yang mungkin terjadi dari senyawa yang berpotensi sebagai antiproliferatif tersebut. UCAPAN TERIMAKASIH Ucapan terima kasih ditujukan kepada Program Penelitian Hibah Bersaing periode 2002-2004 yang telah memberikan dukungan dana untuk penelitian ini, Dr. Edy Meiyanto, MSi, Apt dan Prof. Dr. Sugiyanto, SU, Apt yang telah membimbing dalam penelitian ini. DAFTAR PUSTAKA Bankfalvi A., Giuffre G., Öfner D., Diallo R., Poremba C., Buchwalow I. B., Barresi V., Bocker W., and Tuccari G., 2002, Relationship between HER2 status and proliferation rate in breast cancer assessed by immunohistochemistry, fluorescence in situ hybridisation and standardised AgNOR analysis, International J. Of Oncol. 23: 1285-1292 Ganiswara, S. G., 1995, Farmakologi dan Terapi, Bagian Farmakologi Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia, Jakarta : 686-687
Ghozali, A. dan Harijadi, 1997, Pewarnaan nucleolar organizer region (AgNOR) pada perubahan fibrokistik payudara, Berkala Ilmu Kedokteran, Vol. 29, No. 2 : 47-52 Guo, M., Hay, B. A., 1999, Cell Proliferation and Apoptosis, Current Opinion in Cell Biol. 11: 745-752 King, R. J. B., 2000, Cancer Biology, 2nd ed, Pearson Eduation Limited, London Lee, Y-C., Chern, J-H., Pan, C-C., Chang, S-C., Perng, R-P., 1999, Argyrophilic Nucleolar Organizer Regions in Cells of Thymoma and Thymic Carcinoma “Correlation with DNA Ploidy and Clinicopathologic Characteristic “ ,Chest 115: 1115-1119 Pan, M. H., Chen, W. J., Shiau, S.Y.L., Ho, C.T., Lin, J.K., 2002, Tangeretin Induces Cell Cycle G1 Arrest through Inhibiting Cyclin Dependent Kinases 2 and 4 Activities as well as Elevating Cdk Inhibitor p21 and p27 in Human Colorectal Carcinoma Cell, Carcinogenesis, vol. 23: 1677-1684 Sudarto, B., dan Pramono, S., 1985, Skrining Fitokimia Daun Dewa (Gynura procumbens, Luor Merr yang diduga berkhasiat sebagai anti-kanker, PPPTUGM, Lembaga Penelitian UGM, Yogyakarta Sugiyanto, Sudarto, B., Meiyanto, E., Nugroho, A. E., Jenie, U. A., 2003, Aktivitas Antikarsinogenik Senyawa yang Berasal dari Tumbuhan, Majalah Farmasi Indonesia, 14 (4) : 216-225 Tjindarbumi, D., and Mangunkusumo, R., 2002, Cancer in Indonesia, Present and Future, Jpn J Clin Oncol : 32 (Supplement 1): S17-S21
