Potensi Sitotoksik Ekstrak Etanol..... (Anjar Mahardian K, dkk)
POTENSI SITOTOKSIK EKSTRAK ETANOL DAUN BERENUK (Crescentia cujete L.) TERHADAP SEL KANKER Cytotoxic Potential Ethanol Extract of Berunuk Leaves (Crescentia cujete L.) on Cancer Cells Anjar Mahardian Kusuma, Susanti, Gilang Akbariani Fakultas Farmasi Universitas Muhammadiyah Purwokerto Naskah diterima tanggal 8 Oktober 2014 ABSTRACT Berenuk (Crescentia cujete L.) is a plant that thrives in Indonesia. This plant has a great potential to be developed as a natural medicine, but has little scientific research conducted on it. Among recent study conducted at the faculty of pharmacy UMP showed that the ethanol extract of berunuk leaves with a concentration of 60% and 80 % can significantly accelerate the cessation of surface skin bleeding on mice (Kusuma & Sabikis, 2012), as well as having anti-inflammatory activity (anti-inflammatory) in mice in vivo by doses of 1680, 3360 and 6720 mg/kg (Kusuma and Susanti, 2013). This study was conducted to see the cytotoxic potential of ethanol extract of leaves berenuk ( EEDB ) in T47D breast cancer cells using MTT assay. The results showed that the percentage of cell viability at various concentrations, were 94.44 % at the concentration 500 μg/ml, 99.11 % at the concentration of 250 μg/ml, 102.86 % at the concentration 125 μg/ml, 102. 57 % at the concentration 62.5 μg/ml, 102.35 % at the concentration of 31.25 μg/ml. IC50 values based on extrapolation regretion is 1277.828 μg/ml. Based on these results it is known that EEDB has low potential as a cytotoxic agent against cancer cells T47D. Keywords : Crescentia cujete, EEDB, Cytotoxic, IC50. ABSTRAK Tanaman berenuk (Crescentia cujete L.) merupakan tanaman yang tumbuh subur di Indonesia.Tanaman ini memiliki potensi yang besar untuk dikembangkan sebagai obat bahan alam, namun baru sedikit penelitian ilmiah yang dilakukan terhadap tanaman berenuk. Diantaranya penelitian terbaru yang dilakukan di fakultas farmasi UMP menunjukkan bahwa ekstrak etanol daun berunuk dengan konsentrasi 60% dan 80 % secara signifikan mampu mempercepat penghentian pendarahan luar mencit tahun 2012 oleh Kusuma & Sabikis, serta mempunyai aktivitas antiradang (antiinflamasi) pada mencit secara in vivo dengan dosis 1680, 3360 dan 6720 mg/kg BB tahun 2013 oleh Kusuma dan Susanti. Penelitian ini dilakukan untuk melihat potensi sitotoksik ekstrak etanol daun berenuk (EEDB) pada sel kanker payudara T47D dengan menggunakan metode MTT assay.Hasil yang diperoleh dari penelitian ini adalah % viabilitas sel pada berbagai konsentrasi yaitu pada konsentrasi 500 μg/ml diperoleh % viabilitas sel 94,4369, konsentrasi 250μg/ml diperoleh % viabilitas sel 99,1066, konsentrasi 125 μg/ml % diperoleh viabilitas sel 102,8569, konsentrasi 62,5 μg/ml diperoleh % viabilitas sel 102,5728, konsentrasi 31,25 μg/ml diperoleh % viabilitas sel 102,3495, konsentrasi 15,625μg/ml diperoleh % viabilitas sel 100,5092, konsentrasi 7,8125 μg/ml diperoleh % viabilitas sel 83,5688. Serta hasil nilai IC50berdasarkan persamaan ekstrapolasi adalah 1277.828 µg/ml. Berdasarkan hasil tersebut diketahui bahwa EEDB memiliki potensi yang rendah sebagai agen sitotoksik terhadap sel kanker T47D. Kata Kunci: Crescentia cujete, Sitotoksik, IC50 PENDAHULUAN Crescentia cujete (dalam bahasa Inggris “Calabas”, Prancis “Calabassier”) adalah tanaman yang tumbuh pada daerah tropis, dan merupakan
Alamat korespondensi: Fakultas Farmasi Universitas Muhammadiyah Purwokerto. Jl. Raya Dukuhwaluh, Kembaran Jawa Tengah, 53182 email :
[email protected]
191
tanaman asli negara Amerika Tengah, Kamerun, serta beberapa negara bagian Afrika (Mahbub et al, 2011). Di beberapa tempat di Jawa Tengah dan Jawa Timur, tanaman ini dikenal juga sebagai berenuk dan majapahit. Secara tradisional tanaman ini banyak digunakan sebagai obat diare, anti-radang, dan obat luka (Mahbub et al, 2011).Tanaman ini memiliki beberapa kandungan kimia yang penting antara lain: flavonoid-quercetin (Marc, 2008),tannin, fenol, saponin, anthraquinon, dan cardenolides (Ejelonu et al, 2011).
FARMASAINS Vol 2 No. 4, Oktober 2014
Penelitian ilmiah mengenai berenuk masih sangat jarang, namun tanaman ini memiliki potensi yang cukup menjanjikan sebagai obat herbal.Salah satunya adalah penelitian yang dilakukan oleh (Mahbub et al 2011) menunjukan bahwa ekstrak etanol daun Berenuk (EEDB) memiliki daya antibakterial yang efektif menghambat pertumbuhan bakteri Shigella dysentriae. Hasil penelitian terbaru yang dilakukan di Fakultas Farmasi UMP juga menunjukkan bahwa EEDB dengan konsentrasi 60% dan 80 % secara signifikan mampu mem percepat penghentian pendarahan luar mencit (Kusuma & Sabikis, 2012) serta mempunyai aktivitas antiradang (antiinflamasi) pada mencit secara in vivo dengan dosis 1680, 3360 dan 6720 mg/kg BB (Kusuma dan Susanti, 2013). Quercetin sebagai salah satu kandungan berenuk dilaporkan memiliki efek antikanker baik secara in vitro maupun in vivo (Baghel, et al, 2012).Agron (2013) juga melaporkan adanya kandungan quercetin dan anthraquinon diduga sebagai senyawa yang bertanggungjawab dalam penghambatan angiogenesis. Penghambatan angiogenesis merupakan salah satu cara untuk menghambat penyebaran kanker (Agron 2013). Beberapa hasil penelitian telah mengungkapkan quersetin efektif terhadap perkembangan sel kanker pada banyak organ dan aktifitas anti-tumorigenik, hal tersebut telah dibuktikan dengan kemampuannya untuk menekan pertumbuhan dan metastasis sel melanoma (Gulati et al, 2006).Penelitian lainnya melaporkan bahwa quersetin sebagai kemopreventif potensial diasumsikan bisa meningkatkan keterlibatannya dalam menekan pertumbuhan tumor. Mekanisme penekanannya dengan carastressoxidative, apoptosis, proliferasi, dan metastasis (Gibellini, 2010). Para ilmuan dari Universitas Henan-China, menyimpulkan bahwa quercetin dapat meningkatkan indeks terapi doxorubisin, suatu obat yang digunakan pada kemoterapi kanker (Baghel, 2012). Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui potensi sitotoksik EEDB terhadap sel kanker payudara T47D. Pengujian aktifitas sitotoksik dilakukan dengan metode MTT assay terhadap sel kanker manusia. Menurut Lim (2012) Tanaman berenuk (Crescentia cujete L) tumbuh tegak dengan tinggi antara 6–10 m. Batang berkayu, bulat, percabangannya simpodial, beralur, kulitnya mudah pecah-pecah dan mengelupas terbuka dengan kepanjangan tidak normal, berwarna coklat pucat, daunnya majemuk, menyirip, lonjong, tepi rata, ujung meruncing pangkal membulat, tipis, panjang 10-15 cm, lebar 5-7 cm, warna hijau. Berenuk mempunyai Bunga tunggal di cabang dan ranting, kelopak berbentuk corong, ujung bercangap, berwarna hijau pucat atau putih, benang sari berjumlah 4 dengan panjang ± 2 cm, kepala putik bentuk corong, berwarna putih, mahkota bentuk bibir dan berwarna putih. Buah dari tanaman berenuk ini berupa buni, bulat, ketika masih muda berwarna hijau, setelah tua
berwarna coklat, Dibutuhkan sekitar enam sampai tujuh bulan untuk mematangkan dan akhirnya jatuh ke tanah. Buah ini merupakan buah musiman yang berkembang setelah.penyerbukan oleh kelelawar. Buah muncul pada akhir musim kemarau dengan diameter buah sebesar 12 sampai 14 cm (Gilman, 1993). Tanaman ini mengandung senyawa aktif antara lain: asam tartarat, sianohidrik, asam sitrat, asam kresentia, tanin, beta-sitosterol, stigmastrol, alpa dan beta amirina, asam esterat, asam palmitat, flavonoid-quersetin, apigenin, naftaquinon, glikosida iridoid, 3-hydroxyoktanol glicosida, (Marc, 2008) tannin, saponin, anthraquinon, kardenolida (Ejelonu et al, 2011). Flavonoid-quercetin yang ditemukan pada tanaman berenuk memiliki aktifitas sebagai antioksidan yang melindungi sel-sel tubuh dari kerusakan akibat radikal bebas yang berkontribusi terhadap kerusakan sel dan berbagai masalah yang berhubungan dengan kesehatan (Ejelonu et al, 2011). Beberapa penelitian ilmiah yang telah dilakukan terhadap tanaman ini melaporakan bahwa tanaman berenuk memiliki efek sebagai antibakteri.Penelitian yang sudah dilakukan di Fakultas Farmasi UMP sendiri membuktikan bahwa ekstrak etanol berenuk dapat menghambat pertumbuhan bakteri Bacillus substilis dan Escherichia coli (Susanti, 2006). Hasil penelitian terbaru yang juga dilakukan di Fakultas Farmasi UMP menunjukkan bahwa ekstrak etanol daun berunuk dengan konsentrasi 60% dan 80 % secara signifikan mampu mem percepat penghentian pendarahan luar mencit (Kusuma & Sabikis, 2012) serta mempunyai aktivitas antiradang (antiinflamasi) pada mencit secara in vivo dengan dosis 1680, 3360 dan 6720 mg/kg BB (Kusuma dan Susanti, 2013). Sitotoksik merupakan kemampuan suatu senyawa yang potensial menginduksi kematian sel, mekanisme yang diharapkan dari kematian sel tersebut adalah kematian terprogram atau apoptosis (Eisenbrand et al, 2002).Uji sitoksik diakukan untuk melihat potensi suatu obat antikanker atau keamanan suatu senyawa.Sistem tersebut merupakan uji kualitatif dengan menetapkan kematian sel (Anggraini, 2008). Parameter dari uji sitotoksik adalah nilai IC50, yaitu yang nilai menunjukan konsentrasi hambatan proliferasi sel sebesar 50% dan menunjukan potensi ketoksikan suatu senyawa terhadap sel. Semakin besar nilai IC50 maka senyawa tersebut semakin tidak toksik (Amalina, 2008). Salah satu uji sitotoksik yang sering digunakan adalah Uji MTT (3-[4,5-dimetilthiazol-2yl]2,5-difeniltetrazolium bromide). Uji ini didasarkan pada konversi MTT menjadi kristal formazan oleh sel hidup yang menentukan aktivitas mitokondria. Pengujian ini secara luas digunakan untuk mengukur efek sitotoksik obat secara in vitro pada cell line (Merloo et al, 2011). Reaksi MTT merupakan reaksi reduksi selular yang didasarkan pada pemecahan garam tetrazolium MTT berwarnakuning menjadi kristal formazan berwarna biru keunguan (Depamede et al, 2009). Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui bahwa EEDB memiliki
192
Potensi Sitotoksik Ekstrak Etanol..... (Anjar Mahardian K, dkk)
efek sitotoksik terhadap sel kanker dan untuk mengetahui konsentrasi penghambatan pertumbuhan 50% sel kanker dari EEDB. METODOLOGI Alat Botol, alat-alat gelas (Pyrex), rotary evaporator, kompor listrik, seperangkat alat soxhlet, mikropipet (Socorex), mikroskop cahaya (Olympus), obyek dan deck glass (Sail Brand). Bahan Sel kanker payudara T47D cell line (ATCC) (diperoleh dari Laboratorium Kedokteran Tropis, Bagian Parasitologi, Fakultas Kedokteran UGM), etanol 96% (Bratachem), akuades, Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) yang mengandung Fetal Bovine Serum (FBS) (Gibco), penicillin-streptomisin (Gibco), Phosphat Buffer Saline (PBS) (Merck), Dimethyl Sulfoxide (DMSO) (Merck), 3-[4,5-dimetilthiazol-2yl]2,5-difeniltetrazolium bromide (MTT) (Merck), Sodium Dedocyl Sulfate (SDS), Media RPMI, Natrium bikarbonat (Bratachem), HEPES, EDTA, HCl 0,1 N. Pembuatan Ekstrak Etanol Berenuk (EEDB) Sebanyak 50 gram serbuk simplisia kering diekstraksi dengan metode sokletasi menggunakan pelarut etanol 290 ml selama 8 jam atau sampai larutan di dalam tabung soklet tidak berwarna. Ekstrak cair etanol dari daun berenuk yang diperoleh selanjutnya dipekatkan dengan rotary evaporator dan dikeringkan pada suhu rendah (<40oC) sehingga diperoleh ekstrak etanol kental. Uji Aktivitas sitotoksik dengan MTT Assay Suspensi sel kanker payudara (T47D) sebanyak 100 µL dengan kepadatan 3 x 104 sel/100 µL media didistribusikan ke dalam sumuran- sumuran pada 96-well plate dan diinkubasikan selama 24 jam.Setelah diinkubasi, ke dalam sumuran dimasukkan 100 µL sampel uji pada berbagai seri konsentrasi. Konsentrasi EEDB yang digunakan adalah 500 µg/ml; 250 µg/ml; 125 µg/ml; 62.5 µg/ml; 31.25 µg/ml; 15,625 µg/ml; 7,8125 µg/ml. Sebagai kontrol sel hanya ditambahkan 100 µL medium kultur ke dalam sumuran yang berisi 100 µL suspensi sel dan 100 µL suspensi sel dengan delusi yang sesuai dengan delusi konsentrasi larutan uji, lalu diinkubasi selama 24 jam dalam inkubator dengan aliran 5% CO2 dan 95% O2. Pada akhir inkubasi, media kultur dibuang lalu ditambahkan 10 µL larutan MTT (5 mg/mL PBS), dan medium diganti dengan 190 µL medium RPMI 1640
komplit. Kemudian sel diinkubasi selama 3-4 jam. Reaksi MTT dihentikan dengan penambahan reagen stopper SDS (100 µL). Microplate kemudian dibungkus dengan tissue dan diinkubasi selama 1 malam pada suhu kamar dan ruangan gelap.Sel yang hidup bereaksi dengan MTT membentuk warna ungu.Hasil pengujian dibaca dengan ELISA reader pada panjang gelombang 595 nm. Pengolahan Data Uji Sitotoksisitas dengan Metode MTT assay Data yang diperoleh dari hasil pembacaan ELISA reader berupa absorbansi masing-masing sumuran dikonversikan dalam % kehidupan (viabilitas) sel dengan rumus: Nilai IC50 ditentukan dengan menggunakan analisis persen probit pada program SPSS Windows 16.0. HASIL DAN PEMBAHASAN Uji sitotoksik ekstrak etanol daun berenuk (EEDB) dilakukan terhadap sel kanker payudara T47D dengan variasi konsentrasi diantaranya yaitu500 µg/ ml, 250 µg/ml, 125 µg/ml, 62.5 µg/ml, 31.25 µg/ml, 15,625 µg/ml, 7,8125 µg/ml pada media kultur RPMI. Pengujian yang dilakukan bertujuan untuk mengetahui potensi sitotoksik pada daun berenuk (Crescentia cujete L.) yang diketahui memiliki kandungan senyawa flavonoid quersetin dan atraquinon.Quercetin sebagai salah satu kandungan berenuk dilaporkan memiliki efek antikanker baik secara in vitro maupun in vivo (Baghel, et al, 2012).Agron (2013) juga melaporkan adanya kandungan quercetin dan anthraquinon diduga sebagai senyawa yang bertanggungjawab dalam penghambatan angiogenesis. Pengujian ini dilakuk an dengan menggunakan metode MTT assay. Uji MTT didasarkan pada rekasi reduksi dengan terjadinya pemecahan garam tetrazolim yang berwarna kuning menjadi kristal formazan yang berwarna ungu (Eko, 2011). Metode perubahan warna tersebut digunakan untuk mendeteksi adanya sel yang mengalami proliferasi. Mitokondria pada sel yang mengalami proliferasi akan menyerap senyawa MTT sehingga akan terbentuk kristal formazan yang berwarna ungu (Depamede & Rosyidi, 2009). Pada penelitian ini parameter pengukuran sitotoksik ekstrak terhadap sel kanker ditunjukkan dengan % viabilitas sel kanker.Hasil % viabilitas sel kanker dapat dilihat pada Tabel I:
Tabel I. Hasil % Viabilitas Sel Kanker T47D Oleh EEDB Konsentrasi (μg/ml) 500 250 125 62,5 31,25 15,625 7,8125 193
Viabilitas Sel Kanker T47D (%) 94,4369 99,1066 102,8569 102,5728 102,3495 100,5092 83,5688
FARMASAINS Vol 2 No. 4, Oktober 2014
140
Viabilita s Se l (% )
) % (l e S s at il i b ai V
120 100 80 60 40
EE D B
20 0 0
200
400
600
Ko n se n tra s i (µ g /m l) G am b a r 1.G r af ik H u b u n g a n Pe r se n ta si V ia b ilitas se l T 47 D T er h a d a p ko n s en t r as i E k st ra k E ta n o l D au n B e r en u k (E E D B ).
1. Nilai % viabilitas sel atau kehidupan sel menunjukkan kurang potensial sebagai agen sitotoksik terhadap sel kanker payudara T47D. 2. Nilai IC50 yang diperoleh adalah 1277.828 µg/ml. DAFTAR PUSTAKA
/ s/ r t :3se n n 2 p i et c a i t5 t n d h 0n i a . r o t2 c g cn 1ne r I 0h o e 2sf vm/at p i l ] b t a h a 3 a c p i lt 1 Ae. a r 0 x cn2 nTe i er a rd8te n 4 t o e i n /1p b h ocp 6 m / Cn. se s savetp t o t n aCg a ee brt .di s ao spd l 9 u o a e f 2 d-r d C . [ -gt , ,nd r a n r / 3 n i 6 1ih3 e c 0sp em -v 2n. 6 ,ew 4it t a . t w-c e Bo Pw7 . 0ar t E , n o r g A
Berdasarkan Tabel I dapat diketahui bahwa % viabilitas sel pada berbagai konsentrasi yang digunakan menununjukkan nilai yang tinggi, yang menunjukkan persentasi jumlah sel kanker yang hidup.Hasil % viabilitas sel menunjukkan bahwa ekstrak etanol daun berenuk kurang potensial sebagai agen sitotoksik terhadap sel kanker payudara T47D karena masih banyaknya sel yang hidup setelah diberikan perlakuan dengan ekstrak uji EEDB. Selanjutnya dilakukan analisis probit dengan menggunakan spss versi 16untuk mengetahui nilai IC50 dari EEDB.IC50 merupakan parameter dari uji sitotoksik, dimana nilai tersebut akan m enunjukan nilai konsentrasi hambatan proliferasi sel sebesar 50% dan menunjukan potensi ketoksikan suatu senyawa terhadap sel. Semakin besar nilai IC50 maka senyawa tersebut semakin tidak toksik dan semakin kecil nilai IC50 maka senyawa tersebt semakin toksik.Nilai IC50dari EEDB dihitung berdasarkan persamaan ektrapolasi dan diperoleh adalah 1277.828 µg/ml. Batas IC50 suatu ekstrak untuk dikatakan berpotensi sebagai antikanker adalah 10.000 ppm (Eko, 2011).Berdasarkan hal tersebut makan EEDB dapat dikatakan memiliki potensi sitotoksik yang lemah terhadap sel kanker. Penelitian lebih lanjut perlu dilakukan untuk mengetahui potensi sitotoksik dari tanaman berenuk tersebut yang tidak hanya terbatas pada daunnya saja, karena tanaman berenuk ini memiliki banyak sekali potensi sebagai bahan obat alam dimasa yang akan datang dengan banyaknya kandungan zat aktif yang terdapat tidak hanya pada daunnya tapi juga buahnya UCAPAN TERIMAKASIH Terimakasih kami ucapkan kepada Lembaga Penelitian dan Pengabdian Masyarakat (LPPM) Universitas Muhammadiyah Purwokerto (UMP) atas pembiayaan dalam penelitian ini melalui program hibah prodi tahun 2013 KESIMPULAN Dari hasil penelitian yang telah dilakukan dapat diambil beberapa kesimpulan sebagai berikut:
Amalina, N., 2008, Uji Sitotoksik Ekstrak Etanol 70% Buah Merica Hitam (Piper nigrum L) Terhadap sel HeLa [Skripsi], Surakarta: Fakultas Farm asi, Universitas Muhammadiyah Surakarta Anggraini, P., 2008, Uji Sitotoksik Ekstrak Etanol 70% Buah Kemukus (Piper cubeba L) Terhadap Sel HeLa [Skripsi], Surakarta: Fakultas Farmasi, Universitas Muhammadiyah Surakarta Depamede, S.N., Rosyidi, A., 2009, Penghambatan Proliferasi Limfosit Mencit Balb/c oleh Ekstrak Testis Sapi Bali: Peran TGF-ß, Media Peternakan 32: 95-103 Eisenbranda, B., Pool Zobelb, V. Bakerc, M. Ballsd, B.J. Blaauboere, A. Boobisf, et al., 2002, Methods of In Vitro Toxicology, Food and Chemical Toxicology 40: 193–236 Ejelonu, BC., Lasisi., Olarenus., Ejelonu, OC, 2011, The Chemical Constituents of Calabash (Crescentia cujete), African Journal Biotechnology Vol.10: 84 Eko Winarno, 2011, Uji Sitotoksik Ekstrak Kapang Aspergillus sp Terhadap Sel Kanker Payudara T47D [Skripsi], Jakarta: FMIPA Universitas Indonesia Gilman, E.F., Watson, D.G, 1993, Crescentia cujete: Calabash Tree, Florida, University of Florida. Khandaker Rayhan Mahbub., Mojibul Hoq., Monzur Morshed Ahmed., Animesh Sharker, 2011, In 194
Potensi Sitotoksik Ekstrak Etanol..... (Anjar Mahardian K, dkk)
Vitro Antibacterial Activity of Crescentia cujete and Moringa oleifera, Bangladesh Research Publication Journal Vol.05:337-347. Kusuma, A.M., Sabikis, 2012, Aktivitas ekstrak daun berenuk (crescentia cujete L) Terhadap pendarahan luar mencit [Laporan Penelitian], Purwokerto: Fakultas Farmasi Universitas Muhammadiyah purwokerto Kusuma, A.M., Susanti, 2013, Aktvitas ekstrak daun berunuk (Crescentia cujete L.) terhadap penghambatan radang, [Laporan Penelitian], Purwokerto: Fakultas Farmasi Universitas Muhammadiyah Purwokerto Lara Gibellini, Marcello Pinti, Milena Nasi, Jonas, P., Montagna, Sara De Biasi, et al., 2011, Review Article Quercetin and Cancer
195
Chemoprevention, Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine Article ID 591356: 15 Lim, T.K., 2012, Edible Medicinal and Non-Medicinal Plants, Volume 1 Fruits, London, Springer Marc, N.O., 2008, The Nutritive and Anti-nutritive Compositions of Calabash (Crescentia cujete), Journal of Food Technology 6:267-270 Nicholas Gulati, Beatrice Laudet, Vahe Michael, Z., Raj Murali, Meena, J.M., 2006, The Antiproliferative Effect of Quercetin in Cancer Cells is Mediated via Inhibition of the PI3KAkt/PKB Pathway, Anticancer Research 26: 1177-1182 Van Meerloo, J., Kapers G.J., Cloos, J., 2011, Cell Sensitivity Assays: The MTT assay, Department of Paediatric Oncology 45: 731
