TESIS PERBEDAAN RERATA EKSPRESI PROTEIN Ki-67 PADA ADENOMA DAN KARSINOMA KOLOREKTAL PADA BIOPSI KOLONOSKOPI
Tesis untuk Memperoleh Gelar Magister Pada Program Magister Program Studi ilmu Kedokteran Biomedik Program Pasca sarjana Universitas Udayana
NI MADE MAHARINI RAHAYU NIM 0814098201
PROGRAM MAGISTER PROGRAM STUDI ILMU BIOMEDIK PROGRAM PASCASARJANA UNIVERSITAS UDAYANA DENPASAR 2013
Tesis Ini Telah Diuji pada Tanggal 19 September 2013
Panitia Penguji Tesis Berdasarkan SK Rektor Universitas Udayana, Nomor 1717/UN14.4/HK/2013 Tertanggal 16 September 2013
Ketua
: dr. I ketut Mulyadi, SpPA (K)
Sekretaris
: dr Moestikaningsih, SpPA(K)
Anggota : 1. Prof. dr. N Tigeh Suryadhi, MPH,Ph.D 2. Dr. dr. Ida Sri Iswari, SpMK., M.Kes 3. dr. AAA.N. Susraini, SpPA (K)
UCAPAN TERIMA KASIH Pertama tama perkenanlah penulis memanjatkan puji syukur ke hadapan Ida Sanghyang Widhi Wasa/Tuhan yang Maha Esa, karena hanya atas asung wara nugrahaNya/kurnia Nya, karya akhir ini dapat diselesaikan. Pada kesempatan ini perkenankanlah penulis mengucapkan terima kasih kepada dr. I Ketut Mulyadi, SpPA(K) selaku pembimbing I dan dr. Moestikaningsih, SpPA(K) sebagai pembimbing II, yang telah memberikan bimbingan dan saran saran dari awal sampai karya akhir ini terselesaikan. Penulis minta maaf karena dalam proses penyelesaian karya akhir ini penulis banyak membuat kesalahan sehingga membuat pembimbing merasa tidak nyaman. Ucapan yang sama juga kami sampaikan kepada Rektor Universitas Udayana Prof.DR. dr. I Made Bakta, SpPD-KHOM, Direktur Program Pascasarjana Prof.DR.dr. Raka Sudewi, SpS(K), serta Ketua Program Studi Ilmu Biomedik, Prof.DR.dr. Wimpie pangkahila, Sp.And.,FAACS., yang telah memberikan kesempatan kepada penulis menjadi mahasiswa pada program pascasarjana Universitas Udayana. Pada kesempatan ini pula kami sampaikan rasa terima kasih yang dalam kepada tim penguji, prof. dr. N. Tigeh Suryadi, MPH,Ph.D., DR. dr. Ida Iswari, Sp.MK.,M.Kes., dan dr. AAAN Susraini, SpPA(K), yang telah memberikan masukan, sanggahan, saran dan koreksi sehinngga karya akhir ini dapat terwujud seperti ini. Kepada dr. I Wayan Sutarga MPHM, Direktur Utama Rumah Sakit Sanglah Denpasar, penulis sampaikan ucapan terima kasih karena telah memberikan kesempatan dan fasilitas kepada penulis selama mengikuti
pendidikan di Rumah Sakit Sanglah. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada dr Luh Putu Iin Indrayani Maker,SpPA sebagai Kepala Instalasi laboratorium Patologi Anatomi Rumah Sakit Sanglah dan dr Ni Wayan Winarti SpPA sebagai Kepala Bagian lab Patologi Rumah Sakit Sanglah Denpasar, yang telah memberikan fasilitas dan kesempatan kepada penulis untuk melakukan penelitian. Pada kesempatan ini penulis juga mengucapkan rasa terima kasih yang tulus kepada dr Herman Saputra,SpPA(K) dan dr Ni Putu Sriwidyani, SpPA yang banyak memberikan masukan
dan saran
serta dorongan semangat kepada
penulis. Ucapan yang sama juga kami berikan kepada seluruh staf pengajar dan senior di Lab. Patologi Rumah Sakit Sanglah Denpasar, serta seluruh staf karyawan dan rekan rekan sejawat residen Patologi Anatomi atas kerjasamanya selama penulis menyelesaikan karya akhir ini. Ungkapan terima kasih yang sebesar besarnya penulis sampaikan kepada suami tercinta I Putu Saptajaya, SIP serta kedua anak tercinta Ni Putu Ayu Finansya Saptarini dan I Made Rezilienta Saptaputra, atas pengertian dan dukungannya selama penulis mengikuti pendidikan spesialisasi ini. Terimakasih yang besar juga penulis sampaikan kepada kedua orang tua dan mertua serta seluruh keluarga besar atas dukungannya dan dorongan semangatnya, serta semua pihak yang tidak dapat kami sebutkan satu persatu. Semoga Ida Sanghyang Widhi Wasa/Tuhan Yang Maha Esa selalu melimpahkan rahmatnya kepada kita semua.
ABSTRAK PERBEDAAN RERATA EKSPRESI PROTEIN Ki-67 PADA ADENOMA DAN KARSINOMA KOLOREKTAL PADA BIOPSI KOLONOSKOPI Lesi neoplastik pada kolorektal dapat berupa adenoma dan karsinoma kolorektal (KKR). Adanya invasi pada muskularis mukosa merupakan kriteria untuk KKR. Diagnosis ditegakkan dengan interpretasi histopatologik. Menentukan invasi pada interpretasi sediaan biopsi kolorektal yang terbatas kadang agak sulit sehingga memerlukan alat bantu diagnostik lainnya. Penelitian ini bertujuan untuk mengevaluasi perbedaan rerata ekspresi Ki-67 pada adenoma dan KKR. Penelitian ini menggunakan metode analitik potong lintang pada kasus biopsi kolonoskopi yang didiagnosis adenoma dan KKR pada tahun 2011 sampai 2012. Dilakukan reinterpretasi sediaan H-E untuk diagnosis adenoma atau KKR serta menentukan derajat diferensiasi dari adenoma dan KKR tersebut. Dilakukan pulasan imunohistokimia Ki-67, kemudian diinterpretasi dengan menggunakan mikroskop cahaya dihitung prosentase sel tumor yang terpulas. Perbedaan rerata Ki-67 adenoma dan KKR dianalisis dengan uji t dengan kemaknaan p<0,05. Rerata ekspresi Ki-67 pada KKR lebih tinggi dibandingkan dengan adenoma (p=0,000). Ekspresi Ki-67 juga berbeda bermakna pada KKR derajat rendah dan tinggi. Pada adenoma derajat rendah dan derajat tinggi tidak didapatkan perbedaan yang bermakna secara statistik. Perbedaan ekspresi Ki-67 yang bermakna pada adenoma dan KKR dapat dipergunakan sebagai dasar menggunakan Ki-67 untuk metode diagnostik molekuler untuk mengkonfirmasi diagnostik konvensional adenoma dan KKR. Kata kunci : Ki-67, adenoma, karsinoma kolorektal, biopsi kolonoskopi.
ABSTRACT THE DIFFERENCE OF EXPRESSION OF MEAN Ki-67 PROTEIN IN COLORECTAL ADENOMA AND CARCINOMA IN COLONOSCOPY BIOPSY
Neoplastic lesion in colorectal could be adenoma and colorectal carcinoma (CRC). An invasion in muscularis mucosa is a criteria for colorectal carcinoma. Diagnosis is formed with histopatologic interpretation. In colorectal - biopsy preparation interpretation, determining limited invasion is sometimes difficult so that it needs other diagnostic tools. The aim of this study was to evaluating the difference of Ki – 67 mean expression in colorectal adenoma and CRC. This study was cross-sectional study on colorectal adenoma and CRC. Cases were diagnosed by colonoscopy-biopsy between 2011 and 2012. It did reinterpretation of H-E preparation of adenoma or colorectal carcinoma diagnosis and determination of the degree of differentiation of those adenoma and colorectal carcinoma. Immunohistochemical Ki-67 staining was interpreted with light microscope. The percentage of the stained tumour cells was counted. The difference of mean in Ki-67 expression of colorectal adenoma and CRC was analyzed with t-test with significance level at p<0.05. The mean of Ki-67 expression in colorectal carcinoma was higher compared to adenoma (p= 0.000). Ki-67 expression was significantly difference in colorectal carcinomas with low and high grade. At low and high grade adenoma, the Ki-67 expression was no significantly difference. The significantly difference of Ki-67 expression in adenoma and colorectal carcinoma could be used as a basis of the usage of Ki-67 for molecular diagnostic method in order to confirm conventional diagnostic of adenoma and colorectal carcinoma. Keywords: Ki-67, adenoma, colorectal carcinoma, colonoscopy biopsy
DAFTAR ISI
SAMPUL DALAM .................................................................................
i
PRASYARAT GELAR ...........................................................................
ii
LEMBAR PERSETUJUAN ....................................................................
iii
PENETAPAN PANITIA PENGUJI ........................................................
iv
SURAT PERNYATAAN BEBAS PLAGIAT .........................................
v
UCAPAN TERIMA KASIH ....................................................................
vi
ABSTRAK .............................................................................................
viii
ABSTRACT ..............................................................................................
ix
DAFTAR ISI .........................................................................................
x
DAFTAR GAMBAR ..............................................................................
xiv
DAFTAR TABEL ...................................................................................
xv
DAFTAR SINGKATAN ........................................................................
xvi
DAFTAR LAMPIRAN ...........................................................................
xvii
BAB I
PENDAHULUAN .....................................................................
1
1.1 Latar Belakang ...................................................................
1
1.2 Rumusan Masalah ...............................................................
4
1.3 Tujuan Penelitian ................................................................
5
1.3.1 Tujuan Umum .........................................................
5
1.3.2 Tujuan Khusus ........................................................
5
1.4 Manfaat Penelitian ..............................................................
5
BAB II KAJIAN PUSTAKA ................................................................
6
2.1 Insidensi Adenoma dan Karsinoma Kolorektal ...................
6
2.2 Adenoma Kolorektal dan Karsinoma Kolorektal .................
7
2.2.1 Adenoma Kolorektal .....................................................
7
2.2.1.1 Gambaran Histopatologik Adenoma .......................
9
2.2.1.2 Derajat displasia .....................................................
11
2.2.1.3 Karsinoma Intramukosa .........................................
11
2.2.2 Karsinoma Kolorektal ...................................................
12
2.2.2.1 Gambaran Mikroskopik ..............................................
12
2.2.2.2 Diagnosis Banding .....................................................
14
2.2.2.3 Derajat Diferensiasi Karsinoma Kolorektal ...............
15
2.2.2.4 Stadium Patologik ........................................................... 16 2.3 Karsinogenesis Karsinoma Kolorektal .................................................
17
2.4 Struktur dan fungsi Ki-67 ......................................................................
21
2.5 Ki-67 pada Adenoma dan Karsinoma Kolorektal .................................
22
BAB III KERANGKA PIKIR, KONSEP DAN HIPOTESIS PENELITIAN
...................................................................................
25
3.1 Kerangka Pikir ....................................................................
25
3.2 Konsep Penelitian ...............................................................
26
3.3 Hipotesis Penelitian ............................................................
27
BAB IV METODE PENELITIAN ..........................................................
28
4.1 Rancangan Penelitian ..........................................................
28
4.2 Tempat dan Waktu Penelitian .............................................
28
4.3 Populasi dan Sampel Penelitian ..........................................
28
4.3.1 Populasi ..................................................................
28
4.3.2 Sampel ....................................................................
29
4.4 Kriteria Inklusi dan Eksklusi ...............................................
30
4.4.1 Kriteria Inklusi ........................................................
30
4.4.2 Kriteria Eksklusi .....................................................
30
4.5 Identifikasi Variabel Penelitian ...........................................
30
4.6 Definisi Operasional Variabel .............................................
30
4.7 Prosedur Penelitian .............................................................
33
4.8 Analisis Data ......................................................................
40
BAB V HASIL PENELITIAN ................................................................
41
5.1 Karakteristik Subyek Penelitian ..........................................
41
5.1.1 Karakteristik Subyek Penelitian Berdasarkan umur .....
41
5.1.1 Krakteristik Subyek Penelitian Berdasarkan Jenis Kelamin .........................................................................
42
5.2 Hubungan Overekspresi Ki-67 pada Adenoma dan KKR .....
44
BAB VI PEMBAHASAN .......................................................................
48
6.1 Karakteristik Subyek Penelitian ..........................................
48
6.2 Hubungan Overekspresi Ki-67 pada Adenoma dan KKR ....
49
BAB VII SIMPULAN DAN SARAN .....................................................
52
7.1 Simpulan ............................................................................
52
7.2 Saran ..................................................................................
52
DAFTAR PUSTAKA .............................................................................
53
LAMPIRAN
57
...................................................................................
DAFTAR GAMBAR
Gambar 2.1 Tipe histologik dari Adenoma kolorektal .................................
10
Gambar 2.2 Tipe deferensiasi KKR .............................................................
16
Gambar 2.3 Tahap Tahap Perubahan Molekuler pada Karsinogenesis Kolorektal yang Sporadik ......................................................
18
Gambar 2.4 Tahap Tahap perubahan Molekuler dari Neoplasia yang Berhubungan dengan Inlammatory Bowel Disease ..................
21
Gambar 2.5 Adenoma kolorektal yang menunjukkan ekspresi Ki-67 ..........
24
Gambar 3.1 Bagan Kerangka Konsep Penelitian ........................................
26
Gambar 4.1 Bagan Alur Penelitian ..............................................................
28
Gambar 4.2 Bagan Prosedur Penelitian ........................................................
39
Gambar 5.1 Derajat Diferensiasi Adenoma Kolorektal .................................
43
Gambar 5.2 Derajat Diferensiasi KKR ........................................................
44
Gambar 5.3 Ekspresi Ki-67 pada Karsinoma Payudara ..................................
45
Gambar 5.4 Ekspresi Ki-67 pada Derajat Diferensiasi Adenoma Kolorektal..
46
Gambar 5.5 Ekspresi Ki-67 pada Derajat Diferensiasi KKR ........................... 46
DAFTAR TABEL
Tabel 5.1 Jumlah Adenoma dan KKR Perkelompok Umur Satu Dekade ...
42
Tabel 5.2 Jumlah Adenoma dan KKR Berdasarkan Jenis Kelamin .............
42
Tabel 5.3 Frekuensi Adenoma kolorektal Berdasarkan Derajat Diferensiasi ...............................................................................
43
Tabel 5.4 Frekuensi KKR Berdasarkan Derajat Diferensiasi.........................
44
Tabel 5.5 Perbedaan Skor Ekspresi Ki-67 antara Kelompok Adenoma Kolorektal dan Karsinoma Kolorektal .......................... 45
DAFTAR SINGKATAN
ACF
=
Aberant Crypt Foci
APC
=
Adenomatous Polyposis Coli
CDK
=
Cyclin Dependent Kinase
CIMP
=
CpG Island Methylator Phenotype
CIN
=
Chromosomal Instability
DCC
=
Deleted in Colon Cancer
FAP
=
Familial Adenomatous Polyposis
IL-1
=
Interleukin- 1
Ki-67
=
Protein Kiev-67
KRAS
=
Kirsten Rat Sarcoma
MSI
=
=
Microsatellite Instability
NF-KB
=
Nuclear Factor Kappa
PCNA
=
Proliferating Cell Nuclear Antigen
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1 Surat Keterangan Kelaikan Etik ................................................ 57 Lampiran 2 Surat Ijin Penelitian ................................................................... 58 Lampiran 3 Data Sampel dan Hasil Pemeriksaan Imunohistokimia Ki-67 ........................................................................................ 59 Lampiran 4 Analisis Statistik ....................................................................... 61
BAB I PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang Karsinoma kolorektal adalah salah satu neoplasma yang kejadiannya cukup sering, terutama mengenai penduduk yang tinggal di negara industri. Pada saat ini karsinoma kolorektal sangat sering kita jumpai. Kanker ini insidennya lebih tinggi di negara maju dan dikaitkan dengan pola makan dan gaya hidup. Karsinoma kolorektal (KKR) menempati urutan keempat sebagai penyebab kematian terbanyak akibat kanker di seluruh dunia, merupakan keganasan utama urutan ketiga pada laki-laki (663 000 kasus, 10 % dari total kasus) dan keempat pada perempuan (570 000 kasus, 9.4 % dari total kasus) pada tahun 2008 (Ferlay et al., 2010). Di Indonesia kanker kolorektal relatif berdasarkan registrasi Patologi tahun 2008 pada laki-laki 1021 kasus, pada perempuan 839 kasus. Di Bali KKR menempati urutan ketiga setelah karsinoma payudara dan servik, dengan jumlah kasus 103 pada laki-laki, 81 pada perempuan (DitjenYanMed, 2008). Berdasarkan prevalensi KKR yang tinggi, telah dilakukan skrining KKR dengan metode invasif biopsi kolonoskopi untuk mendeteksi lesi prekanker dan KKR. Terdapat 2 modalitas pencegahan dari KKR, modalitas primer dan sekunder. Pencegahan primer adalah pencegahan penyakit sebelum penyakit terjadi. Pencegahan sekunder melibatkan deteksi penyakit sebelum menimbulkan gejala dan melakukan intervensi untuk mencegah manifestasi klinis pada penyakit
seperti
pengangkatan
adenoma
kolon
sebelum
berkembang
menjadi
adenokarsinoma. Skrining KKR sebaiknya dilakukan pada semua orang yang berumur diatas 50 tahun, menggunakan beberapa strategi seperti Fecal Occult Blood Testing (FOBT), Flexible sigmoidoscopy, kombinasi dari FOBT dan sigmoidoskopi, kolonoskopi dan double contrast barium enema (Fenoglio, 2009). Untuk orang yang berusia lebih dari 50 tahun dengan risiko rata-rata, skrining KKR dilakukan dengan metode noninvasif yaitu FOBT. Sedangkan untuk orang dengan risiko tinggi, metode skrining yang digunakan adalah metode invasif. Deteksi dengan menggunakan metode invasif seperti kolonoskopi masih tetap merupakan pilihan karena akurasinya yang tinggi mencapai 95%. Secara teori kolonoskopi adalah suatu pemeriksaan kolon (usus besar) mulai dari anus, rektum sigmoid, kolon desendens, tranversum, asenden atau sekum dan ilium terminale dengan menggunakan alat (scope). Tujuan dari pemeriksaan ini adalah untuk menilai jika hasil radiologi meragukan atau tidak ditemukannya kelainan sehingga perlu evaluasi lebih lanjut. Tujuan selanjutnya adalah meneliti suatu penyakit pada mukosa kolon yang disertai penurunan berat badan dan adanya anemia tanpa tahu penyebabnya, menegakkan diagnosis suatu keganasan/ kanker pada kolon dengan melakukan tindakan terapiutik dan biopsi mukosa kolon, selanjutnya sebagai follow up setelah pengangkatan/ operasi suatu kanker usus/evaluasi setelah polipektomy (pengambilan polip) ( Mesmann et al., 2006). Namun seringkali jaringan yang didapat dari kolonoskopi hanya mengandung mukosa tanpa lapisan submukosa. Hal ini menyulitkan patolog untuk membuat suatu diagnosis, apakah itu suatu adenoma murni, ataukah suatu
karsinoma kolorektal. Kriteria diagnostik suatu karsinoma kolorektal adalah adanya invasi ke muskularis mukosa dan atau submukosa. Kebanyakan karsinoma kolorektal berkembang dari adenoma. Adenoma merupakan lesi prekursor KKR. Adenoma ini dapat terjadi secara sporadik atau merupakan bagian dari sindrom polyposis. Adenoma secara definisi adalah jinak, walaupun bersifat neoplastik dan dapat menyebabkan karsinoma kolorektal invasif. Karsinoma kolorektal juga dapat berasal dari area displasia pada pasien dengan Idiopathic inflammatory bowel disease (IBD) (Fenoglio, 2009). Berdasarkan persentase komponen vilosum, adenoma dibedakan menjadi tiga tipe histologik, yaitu tubuler, tubulovilosum dan vilosum. Pada penelitian ini tipe adenoma tidak dibedakan. Sel neoplastik adalah sel-sel yang aktif berproliferasi, yang ditandai dengan siklus sel yang lebih cepat dibandingkan dengan sel normal. Proliferasi sel ini dipicu oleh beberapa faktor seperti protein Ki-67 atau MIB I dan beberapa Cyclin. Laju proliferasi sel tumor dapat ditentukan melalui beberapa petanda proliferasi sel seperti : Mitotic activity Index /MAI, S-Phase Fraction/SPF dan DNA ploidy melalui flow cytometri, Thymidin Labeling Index (TLI), Thymidin Kinase (TK), protein Ki-67, atau MIB I, PCNA, Cyclin E, Cyclin D dan lain lain. Dengan menggunakan marker index proliferatif seperti Ki-67 pada adenoma dapat dibuat prediksi progresifitasnya dan pada KKR dapat dibuat suatu prediktif terapi. Penelitian oleh Nabi et al. (2008) menunjukkan bahwa kanker yang lanjut menunjukkan proliferasi sel yang lebih tinggi dibandingkan dengan lesi yang lebih awal. Ki-67 merupakan pemeriksaan molekuler yang dapat dipergunakan untuk menilai laju proliferasi tumor. Penelitian lain tentang Ki-67 pada karsinoma
kolorektal dengan menghubungkan marker ini dengan beberapa faktor prognosis. Aktivitas proliferasi berhubungan dengan derajat diferensiasi, tipe histologik, dan stadium dari karsinoma kolorektal (Nabi et al., 2008). Sementara pada adenoma kolorektal, penelitian oleh Nussrat et al. (2011) menunjukkan bahwa ekspresi Ki67 berhubungan dengan ukuran dan derajat lesi. Bila dibandingkan dengan pengecatan untuk biomarker yang lain, maka teknik pengecatan Ki-67 ini adalah mudah dikerjakan, ekonomis dan lebih reproducible (Urruticoechea et al., 2005). Beberapa penelitian memperlihatkan Ki-67 merupakan marker proliferatif yang lebih baik pada kolon dibandingkan Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA). Berdasarkan data inilah dipilih Ki67. Mengingat adanya ketidaksamaan dalam hal menentukan definisi dari cut-off point, maka sebaiknya Ki-67 ditetapkan sebagai variabel kontinyu (Urruticoechea et al., 2005). Sejauh pengetahuan penulis, di Bali selama ini hanya ada penelitian ekspresi Ki-67 yang dikaitkan dengan karsinoma dan belum ada penelitian yang membandingkan ekspresi Ki-67 pada adenoma dan adenokarsinoma kolorektal yang bernilai untuk surveilen deteksi KKR.
1.2 Rumusan Masalah Adakah perbedaan rerata ekspresi antara indek proliferasi Ki-67 pada adenoma kolorektal dengan rerata ekspresi indek proliferasi Ki-67 pada karsinoma kolorektal?
1.3 Tujuan Penelitian 1.3.1
Tujuan umum Menilai perbedaan indeks proliferasi sel pada adenoma dan karsinoma kolorektal.
1.3.2
Tujuan Khusus Penelitian ini bertujuan umtuk mengetahui perbedaan rerata ekspresi Ki-67 pada adenoma dan karsinoma kolorektal.
1.4 Manfaat Penelitian a. Sebagai alternatif faktor prognostik kemungkinan suatu karsinoma invasif pada kasus adenoma dari sediaan biopsi kolonoskopi kolorektal di Bali. b. Sebagai faktor prediktif pertimbangan terapi suatu karsinoma invasif dan sebagai deteksi dini pada kasus adenoma dari sediaan biopsi kolonoskopi kolorektal. c. Sebagai salah satu acuan untuk penelitian prospektif selanjutnya.
BAB II KAJIAN PUSTAKA
2.1 Insidensi Adenoma dan Karsinoma Kolorektal Area geografik untuk adenoma dan karsinoma kolorektal adalah sama, terjadi lebih umum di negara maju dibandingkan dengan negara berkembang. Perbedaan geografik yang tinggi dapat disebabkan karena pola makan dan gaya hidup. Insiden adenoma kolon ditemukan meningkat pada pasien dengan FAP (Familial Adenomatous Polyposis) (Fenoglio,2009). Dengan pemeriksaan endoskopik sekitar 60-70% adenoma dapat ditemukan pada polip kolorektal. Di negara barat, prevalensi seumur hidup untuk menderita adenoma adalah 30-50% dan 6% diantaranya akan berlanjut menjadi KKR (Riddel et al., 2002). Pada tahun 2008 Karsinoma kolorektal (KKR) merupakan keganasan utama urutan ketiga pada laki-laki (663.000 kasus, 10 % dari total kasus) dan keempat pada perempuan (570.000 kasus, 9.4 % dari total kasus) di seluruh dunia. Angka kematian sebanyak 608.000 di seluruh dunia menempatkan KKR sebagai penyebab kematian urutan keempat terbanyak akibat kanker (Ferlay et al., 2010). Diperkirakan kasus baru KKR di Amerika Serikat pada tahun 2010 sebanyak 142.570 (9%) pada laki-laki dan perempuan dengan perkiraan angka kematian 52.470 (9 %) (Jemal et al., 2010). Di Indonesia kanker kolorektal relatif berdasarkan registrasi Patologi tahun 2008 pada laki-laki 1021 kasus, pada perempuan 839 kasus. Di Bali KKR
menempati urutan ketiga setelah karsinoma payudara dan servik, dengan jumlah kasus 103 pada laki-laki, 81 pada perempuan (DitjenYanMed,. 2008). Sampai saat ini, penanganan kuratif adalah reseksi operatif, yang pada kasus KKR lanjut seringkali tidak memungkinkan untuk mengangkat seluruh sel kanker. Walaupun pengobatan adjuvan berkembang cepat dan maju, namun hanya sedikit yang meningkatkan survival pasien KKR dalam keadaan lanjut (Wolpin et al., 2007). Atas dasar itu, menemukan kasus baru dalam stadium dini, harus dikembangkan sebagai tindakan preventif sehingga dapat menekan morbiditas dan mortalitas pasien KKR (American Cancer Society, 2008).
2.2 Adenoma Kolorektal dan Karsinoma kolorektal 2.2.1 Adenoma kolorektal Adenoma kolorektal adalah lesi neoplasma glandular jinak yang mengawali perkembangan KKR. Adenoma bisa terjadi tunggal ataupun multipel. Bila multipel pasien mungkin mempunyai sindrom genetik. Adenoma telah ditetapkan sebagai lesi prekursor KKR karena (1) adenoma dan KKR memiliki distribusi lokasi anatomik yang sama dan sering terjadi bersamaan, (2) terdapat korelasi epidemiologik faktor risiko antara adenoma dan KKR, (3) dapat ditemukan area transisi adenoma-karsinoma, dan (4) dapat ditemukan defek molekuler yang sama (Homick, 2011 ). Adenoma dapat mengalami pertambahan ukuran sebanyak 50% sejalan dengan waktu, namun hanya 5 – 10% adenoma yang berlanjut menjadi KKR. Kebanyakan adenoma tubuler berukuran kecil bersifat statis bahkan mengalami
regresi (Homick,2011). Waktu yang dibutuhkan adenoma untuk transformasi menjadi KKR diperkirakan selama 10 tahun. Sebesar 0,25 % adenoma dan 1 % dari adenoma lanjut akan berkembang menjadi KKR tiap tahunnya. Dengan skrining
endoskopik
dapat
dilakukan
pengangkatan
adenoma
sehingga
menurunkan insidens KKR sebesar 70 – 90 % (Gschwantler et al., 2001). Pada 3 – 5% adenoma mengandung KKR pada saat diagnosis. Ukuran adenoma merupakan prediktor paling baik untuk risiko karsinoma, yaitu 10 – 20% pada adenoma ukuran lebih dari 2 cm, 5 % pada ukuran 1 – 2 cm, dan kurang dari 1 % pada adenoma yang berukuran kurang dari 1 cm. Komponen vilosum dan derajat displasia meningkat sesuai dengan peningkatan ukuran adenoma. Adenoma yang berukuran kurang dari 1 mm umumnya menunjukkan displasia ringan dan memiliki resiko keganasan 5 % dalam 15 tahun. Pada adenoma dengan displasia berat, resiko keganasan meningkat menjadi 27%. Sebanyak 30% adenoma vilosum yang berukuran lebih dari 5 mm mengandung KKR pada saat diagnosis (Euscher et al., 2001; Riddell et al., 2002). Pada 10 – 30 % pasien adenoma memiliki lesi multipel (lebih dari atau sama dengan 3). Prevalensi adenoma multipel meningkat sesuai dengan pertambahan usia, yaitu 9 % pada usia kurang dari 60 tahun, 17 % pada usia 60 - 73 tahun dan 28 % pada usia diatas 75 tahun memiliki tiga atau lebih adenoma. Lesi multipel juga meningkatkan resiko memiliki komponen vilosum (60 % dibandingkan dengan 38 %) dan displasia keras (14 % dibandingkan dengan 7 %) (Homick, 2011).
2.2.1.1 Gambaran histopatologik adenoma Adenoma secara mikroskopik didiagnosis dengan mengamati perubahan sitologik dan arsitektur. Yang termasuk dalam perubahan sitologik adalah peningkatan rasio inti terhadap sitoplasma (pembesaran relatif inti terhadap sitoplasma), hiperkromasia (warna gelap pada inti oleh karena peningkatan aktivitas DNA), pleomorfisme inti (variasi bentuk dan ukuran inti), peningkatan jumlah mitosis, dan adanya mitosis atipik (Homick,2011). Pada adenoma, umumnya terjadi kegagalan maturitas sitoplasma berupa berkurang/hilangnya musin. Perubahan arsitektur kelenjar meliputi inti yang bertumpuk, bentuk kelenjar yang kompleks disertai kontur permukaan abnormal, yaitu lebih viliform (Riddell et al., 2002). Pola arsitektur yang dijumpai dapat berupa bentukan vilosum, tubulus atau campuran. Komponen vilosum ditandai oleh adanya epitel displastik yang memanjang seperti jari-jari, panjangnya lebih dari dua kali ketebalan mukosa normal kolon. Definisi ini adalah subjektif dan sulit dibedakan dengan tubulus yang panjang dan terpisah. Pada 35-75 % adenoma berukuran lebih dari 1 cm diketahui memiliki komponen vilosum (Euscher, 2001). Berdasarkan persentase komponen vilosum, adenoma dibedakan menjadi tiga tipe histologik, yaitu tubuler, tubulovilosum dan vilosum. Adenoma tubuler (70 – 90% kasus) memiliki komponen vilosum kurang dari 20%. Arsitektur tubuler pada lapisan mukosa tetap dipertahankan. Gambaran mikroskopik umumnya bertangkai. Memiliki resiko keganasan sebesar 2 – 3 % (Gambar 2.1A) (Ferlay et al., 2010).
Adenoma tubulovilosum (10 – 25% kasus) memiliki komponen vilosum antara 20 – 80%. Memiliki resiko degenerasi keganasan menengah. (Gambar 2.1B). Adenoma vilosum (5% kasus) memiliki lebih dari 80 % komponen vilosum. Makroskopik umumnya sessile dengan permukaan viliform. Pada 30 % adenoma vilosum dengan displasia keras mengandung KKR pada saat diagnosis (Ferlay et al., 2010).
Gambar 2.1. Tipe histologik dari adenoma kolorektal. A. Adenoma tubuler, B. Adenoma Tubulovilosum, C. Adenoma vilosum, D. Displasia ringan, E. Displasia keras, F. Karsinoma intramukosa (Dikutip dari Ferlay et al., 2010)
2.2.1.2. Derajat displasia Displasia pada adenoma dibedakan menjadi displasia ringan (mencakup displasia ringan dan sedang) dan displasia berat (mencakup displasia berat dan
karsinoma intramukosa). Penentuan derajat displasia ini berdasarkan kombinasi gambaran sitologik dan arsitektural. Pada displasia ringan ditemukan kripta yang penuh, tersusun paralel, tanpa gambaran kelenjar back-to-back, cribriform atau budding. Inti sel bertumpuk mencapai setengah ketebalan epitel dan tetap berorientasi pada basal. Mitosis atipik, kehilangan polaritas sel dan pleomorfisme ditemukan minimal (Riddell et al., 2002; Hamilton et al., 2009; Homick, 2011) (Gambar 1D). Pada displasia berat ditemukan pleomorfisme inti yang jelas, yaitu bentuk inti lebih bulat dengan peningkatan rasio inti terhadap sitoplasma, kromatin inti kasar dan nukleoli yang nyata. Terdapat kehilangan orientasi inti pada basal dan inti bertumpuk melebihi setengah ketebalan epitel. Mitosis dan mitosis atipik mudah ditemukan. Perubahan arsitektur kelenjar yang ditemukan dapat berupa pola back-to-back dan cribriform serta sarang-sarang solid. Tidak ditemukan invasi pada membran basal (Riddell et al., 2002; Hamilton et al., 2009; Homick, 2011) (Gambar 1E).
2.2.1.3 Karsinoma Intramukosa Beberapa literatur baru membedakan gambaran adenoma yang menunjukkan invasi pada lapisan mukosa atau muskularis mukosa namun tidak mencapai lapisan submukosa disebut sebagai adenokarsinoma intramukosal (Gambar 1F). Ditemukan arsitektur kelenjar cribriform dan back-to-back, infiltrasi sel individual, proliferasi kelenjar berukuran kecil yang ireguler, inti sel menjadi lebih bulat (Fenoglio et al., 2009; Homick, 2011).
Adenokarsinoma intramukosal tidak memiliki resiko metastasis. Hal ini disebabkan oleh tidak adanya pembuluh limfatik pada mukosa kolorektal. Penanganan yang adekuat hanya dengan polipektomi dengan catatan batas sayatan yang bebas invasi tumor. Terminologi ini jarang digunakan oleh ahli patologi karena sering menimbulkan kesalahan interpretasi dalam hal penanganan klinik yang disebabkan penggunaan kata ”karsinoma” (Riddell et al., 2002; Homick, 2011).
2.2.2 Karsinoma Kolorektal Karsinoma kolorektal adalah adenokarsinoma pada kolon atau rektum. Pada lokasi ini dikatakan tumor ganas apabila sel tumor telah menembus lapisan muskularis mukosa dan mencapai lapisan submukosa (Hamilton et al., 2009).
2.2.2.1. Gambaran mikroskopik Sebanyak 85 – 90 % KKR merupakan adenokarsinoma (Hamilton et al., 2009) Terdapat juga tipe lainnya yaitu karsinoma musinosum (8 – 10 %) dan karsinoma sel cincin (0.5 – 1 %). Karsinoma kolorektal mempunyai gambaran glanduler yang dominan dengan sedikit stroma (Gambar 2A). Sel tumor berbentuk kolumnar tinggi dan berubah menjadi kuboid pada diferensiasi yang lebih buruk. Mitosis mudah ditemukan. Lumen kelenjar berisi mukus eosinofilik dan debris inti dari sel yang disebut sebagai nekrosis kotor. Bila nekrosis kotor ini ditemukan pada karsinoma metastasis yang primernya belum diketahui, gambaran nekrosis kotor ini dapat menjadi petunjuk untuk primer kolorektal. Dapat ditemukan
gambaran desmoplasia, yang disebabkan oleh hialinisasi stroma disekitar sel tumor yang invasif. Selain sel-sel glanduler, sejumlah sel Paneth, sel neuroendokrin dan sel skuamosa dapat ditemukan pada KKR. Adanya sel-sel tersebut tidak memberikan kemaknaan prognostik. (Montogomery et al., 2006; Fenoglio, 2009; Hamilton et al., 2009; Homick, 2011). Adenokarsinoma musinosum dapat terjadi pada kolon sisi kiri maupun kanan dengan proporsi lebih banyak pada sisi kanan. Pada pemotongan jaringan tumor, tumor lunak seperti gelatin dan mengandung jaringan ikat yang sebagian umenyerupai koloid. Jenis ini didiagnosis secara histopatologik bila ditemukan komponen musin ekstraselular lebih dari 50 %. Pada pemeriksaan mikroskopik menunjukkan gambaran banyak struktur kelenjar berukuran besar di antara genangan musin (Hamilton et al., 2009). Terminologi adenokarsinoma dengan komponen musinosum digunakan untuk menggambarkan tumor yang memiliki komponen musin signifikan (lebih dari 10% namun kurang dari 50%) (Gambar 2C). Dapat pula ditemukan sejumlah sel cincin (Hamilton et al, 2009). Batas tumor yang infiltratif ke jaringan sekitarnya menyebabkan prognosis tumor ini secara keseluruhan menjadi buruk. Bila dibandingkan dengan KKR, subtipe musinosum, tipe ini cenderung menunjukkan keterlibatan kelenjar getah bening di luar regio perikolika, menimbulkan implan peritoneal dan menginvasi organ viseral sekitarnya, sehingga memerlukan penanganan operatif yang lebih agresif (Homick, 2011). Adenokarsinoma sel cincin didefinisikan sebagai tumor yang terdiri atas sel tumor yang lebih dari 50 % berupa sel cincin. Tumor jenis ini lebih sering
ditemukan pada laki-laki dan 50% terjadi pada usia muda (kurang dari 40 tahun) dan sebanyak 30% lebih sering terjadi pada kolitis ulseratif. Secara histologik tumor ini menunjukkan vakuole musin pada sitoplasma sehingga mendorong inti ke perifer (sel cincin). Sekitar 80 % pasien tumor jenis ini berada pada stadium III atau IV pada saat diagnosis. Penetrasi pada seluruh lapisan muskularis propria dan peritoneal seeding lebih sering terjadi dibandingkan KKR tipe lainnya (36 % dibandingkan dengan 12 %). Akibatnya, subtipe ini cenderung sulit disembuhkan dengan reseksi operatif dan berhubungan dengan prognosis buruk. Angka kesembuhan 5 tahun dilaporkan kurang dari 5% (Homick, 2011). Sistem klasifikasi ini yang paling banyak digunakan dan dianut pula dalam sistem klasifikasi tumor gastrointestinal oleh WHO karena: (1) mengurangi variasi antar pengamat dalam interpretasi displasia oleh ahli patologi, (2) meningkatkan relevansi klinik dalam pilihan terapi, dan (3) menghindari interpretasi berlebihan secara klinik (Homick, 2011). 2.2.2.2. Diagnosis banding Adenokarsinoma kolorektal harus dibedakan dengan adenoma yang menunjukkan gambaran pseudoinvasi serta adenokarsinoma metastasis dari tumor primer di tempat lain. Adenoma dengan pseudoinvasi ditandai oleh adanya inflamasi pada lamina propria yang mengelilingi kelenjar displastik pada tangkai polip tanpa gambaran desmoplasia. Sering pula ditemukan adanya hemosiderofag. Diagnosis banding lainnya yaitu adenokarsinoma metastasis. Adenokarsinoma metastasis tidak memiliki gambaran lesi adenoma pada tepi tumor (Homick,2011).
2.2.2.3. Derajat diferensiasi karsinoma kolorektal Derajat diferensiasi (grading) terutama berdasarkan perbandingan area gambaran glanduler dengan area solid atau kelompok sel-sel tanpa lumen. Derajat keganasan dibedakan menjadi diferensiasi baik, sedang dan buruk. Menggunakan sistem ini, kira-kira 10% adenokarsinoma adalah berdiferensiasi baik, 70% diferensiasi sedang dan 20% diferensiasi buruk. Diferensiasi baik jika menunjukkan struktur glanduler pada lebih dari 95 % tumor berbentuk simpel atau kompleks dengan polaritas sel baik dan inti sel yang relatif uniform (Gambar 2A); diferensiasi sedang jika memiliki 50 – 95 % struktur glanduler dengan bentuk yang lebih ireguler dan polaritas inti yang berkurang (gambar 2B); diferensiasi buruk jika memiliki 5 – 50% struktur glanduler yang ireguler dan kehilangan polaritas inti sel; dan sel tumor yang tidak berdiferensiasi memiliki lebih dari 5% struktur glanduler (Hamilton et al., 2009) (Gambar 2C).
Gambar 2.2 Tipe diferensiasi karsinoma kolorektal. A. Diferensiasi baik. B diferensiasi sedang. C. Diferensiasi buruk (dikutip dari Fenoglio, 2009)
Derajat keganasan ini hanya diaplikasikan pada KKR NOS (no otherwise specify). Adenokarsinoma musinosum dan sel cincin dianggap memiliki diferensiasi buruk dan adenokarsinoma meduler termasuk dalam derajat 4 (tidak
berdiferensiasi) (Fenoglio, 2009). Bila terdapat berbagai diferensiasi pada KKR, derajat keganasan ditentukan berdasarkan komponen diferensiasi yang paling buruk (Hamilton et al., 2009; Fenoglio, 2009).
2.2.2.4. Stadium patologik Stadium patologik (pathologic staging) merupakan prediktor yang paling penting untuk menentukan perangai tumor dan outcome pasien dengan KKR. Sistem staging yang digunakan dalam penelitian ini adalah sistem TNM dari American Joint Committee on Cancer (AJCC) berdasarkan evaluasi terhadap tumor (T), keterlibatan kelenjar getah bening (N) dan metastasis jauh (M) (Sobin, 2002). Ukuran dan kedalaman invasi tumor primer ditunjukkan oleh komponen T. Perluasan invasi tumor melewati muskularis propria berpengaruh kuat terhadap prognosis. Tumor yang melewati muskularis propria dapat menyebabkan perforasi peritoneum atau menginfiltrasi struktur viseral sekitarnya (Fenoglio, 2009). Komponen
N
menunjukkan keterlibatan tumor pada kelenjar getah
bening regional. Jumlah total kelenjar getah bening merupakan penentu penting untuk adekuasi pemeriksaan histopatologik. Jumlah kelenjar getah bening positif bergantung pada jumlah yang diperiksa. Disarankan untuk mencari dan memeriksa kelenjar getah bening sebanyak-banyaknya (Cserni, 2003). Komponen M menggambarkan metastase. M0 menunjukkan tumor tidak meluas ke organ lain, dan M1 menunjukkan tumor telah meluas ke organ lain di dalam tubuh (Hamilton et al., 2009)
Prognosis KKR pada umumnya ditentukan berdasarkan sistem TNM yang tergantung dari kedalaman invasi tumor, ada tidaknya keterlibatan kelenjar limfe dan metastasis jauh. Sistem ini dipergunakan untuk memperkirakan prognosis, rencana terapi dan memperkirakan outcome (Pages et al., 2008).
2.3. Karsinogenesis Karsinoma Kolorektal Sebagian besar KKR berkembang dari adenoma sebagai lesi prekursornya. Adenoma ini dapat terjadi secara sporadik atau sebagai bagian dari sindroma poliposis. Karsinoma kolorektal juga dapat berkembang dari area displastik dari pasien dengan idiopathic inflammatory bowel disease/IBD (Antonia,2010). Karsinogenesis KKR merupakan salah satu jenis kanker yang paling banyak diteliti secara mendalam. Setidaknya terdapat 3 jalur karsinogenesis yang telah
dikenal
luas,
yaitu
jalur
instabilitas
kromosom
(chromosomal
instability=CIN), jalur instabilitas mikrosatelit (microsatellitte instability=MSI), dan jalur metilasi (CIMP= CpG island methylator phenotype) (Gschwantler et al., 2001; Antonia, 2010). Jalur CIN terjadi pada karsinoma kolorektal sporadik (85%) dan herediter (10%) yang dikenal sebagai urutan adenoma-karsinoma yang diperkenalkan oleh Fearon dan Volgenstein pada tahun 1990 dengan mengemukakan mekanisme transisi epitel normal kolorektal menjadi karsinoma (Aoki, 2007). Lesi awal yang dapat diidentifikasi disebut sebagai fokus kripta aberant (aberrant cypt focus), yaitu suatu lesi mukosal mikroskopik yang mendahului perkembangan polip (Riddell et al., 2002).
Pada model ini, terjadinya karsinoma kolorektal melalui proses perubahan molekuler yang bertahap, sekurang-kurangnya melewati 4 kali mutasi gen dalam urutan tertentu. Tahap pertama adalah mutasi pada gen APC (kromosom 5q) yang menyebabkan sel kehilangan kontrol pertumbuhan. Tahap kedua adalah aktivasi onkogen KRAS yang menyebabkan sel kehilangan fungsi kontrol proliferasi, dan diikuti oleh tahap ketiga, yaitu inaktivasi gen DCC/SMAD4 (kromosom 18q), mutasi gen p53 (kromosom 17p) dan TGFBR2 serta aberant E-cadherin yang pada akhirnya terjadi kanker (Antonia, 2010).
Gambar 2.3. Tahap-tahap perubahan molekuler pada karsinogenesis kolorektal yang sporadik. (Dikutip dari Antonia, 2010)
APC merupakan tumor supressor gen yang terlibat pada jalur CIN. Umumnya pada mutasi gen APC terjadi trunkasi protein APC pada gugus karboksil sehingga APC tidak dapat berikatan dengan protein beta catenin (Qian et al., 2008) Dalam keadaan normal, ikatan APC dengan beta catenin akan menekan jalur sinyal WNT. Jalur sinyal WNT berfungsi untuk mengatur pertumbuhan, apoptosis dan
diferensiasi. Mutasi APC ditemukan pada 60 % kanker kolon dan 82 % kanker rektal serta 80 % adenoma (Aoki, 2007). KRAS (12p12) merupakan gen yang terlibat pada jalur CIN namun berperan pula pada jalur CIMP. Aktivasi mutasi KRAS terjadi pada 35 – 42 % karsinoma kolorektal dan adenoma. Kehilangan alel pada DCC, SMAD2 dan SMAD4 yang berlokasi pada kromosom 18q21.1 ditemukan pada 60 % karsinoma kolorektal. SMAD2 dan SMAD4 terlibat pada jalur sinyal TGF-β yang mengatur pertumbuhan dan apoptosis. Kehilangan fungsi TP53 umumnya merupakan peristiwa terakhir pada transisi adenoma – karsinoma melalui jalur CIN. Abnormalitas TP53 ditemukan pada 4 – 26 % adenoma, 50 % adenoma dengan fokus invasif, dan 50 – 75% karsinoma kolorektal. Protein p53 berperan dalam mengatur siklus sel dan apoptosis. Mutasi pada E-Cadherin lebih berhubungan dengan kemampuan metastase tumor kolorektal (Antonia, 2010). Jalur karsinogenesis yang lain adalah progresi IBD menjadi neoplasma. Pasien dengan IBD mempunyai risiko peningkatan displasia dan karsinoma kolorektal sebesar 0,5-1.0% dalam waktu 8-10 tahun. Diduga hal ini mempunyai kaitan yang kuat dengan kolitis kronis yang berkepanjangan. Mekanisme karsinogenesis pada IBD sebenarnya menyerupai yang terjadi pada karsinoma kolorektal yang sporadik tapi berbeda pada waktu terjadinya perubahan molekuler. Selama periode kolitis kronis terjadi aktifasi NF-ĸB pada epitel. NFĸB ini akan mengaktivasi COX2, beberapa sitokin proinflamasi (termasuk IL-1, TNFα, IL-12p40 dan IL-23p19), faktor antiapoptosis (inhibitor of apoptotic protein (IAP), dan B-cell leukemia/lymphoma (Bcl-xL)). Prostaglandin dan
beberapa sitokin termasuk IL-6 dilepaskan kelingkungan inflamasi dan mengaktifkan jalur signaling intraselular serinine threonine AKT kinase yang menghambat faktor
proapoptotik termasuk p53 dan BAD yang akhirnya
meningkatkan masa hidup sel. Instabilitas genetik seperti CIN dan MSI juga terjadi pada karsinogenesis yang berkaitan dengan inflamasi. Mutasi APC terjadi 14-33% pada karsinogenesis inflamasi tapi pada karsinogenesis sporadik mencapai 80% dan terjadi pada awal proses karsinogenesis. Mutasi p53 terjadi pada fase displasia hal ini disebabkan terjadinya kerusakan inflamasi yang berhubungan dengan reaksi oksidasi dari radikal bebas (Antonia, 2010).
Gambar 2.4. Tahap-tahap perubahan molekuler dari neoplasia yang berhubungan dengan inflammatory bowel disease. (Dikutip dari Antonia, 2010)
Semua jalur karsinogenesis diatas akan menghasilkan replikasi yang tak terkendali dari sel tumor.
2.4. Struktur dan Fungsi Ki-67 Antigen Ki-67 merupakan protein non-histon yang ditemukan oleh Gerdes dan kawan-kawan pada 1980 an, di Universitas Kiel, Jerman. Angka 67 adalah urutan nomor cloning dari sebanyak 96 piringan yang telah diberi label dalam penelitian pada Universitas tersebut. Antigen ini diambil dari tubuh tikus yang telah disuntik dengan antigen inti yang berasal dari cell line yang diturunkan dari limfoma Hodgkin manusia (Yerushalmi et al., 2010). Ki-67 merupakan protein inti non histon yang mempunyai dua isoform dengan berat molekul 359kD dan 320kD, sedangkan gen ini terletak pada kromosom 110q25, Protein ini ditemukan terutama pada korteks nukleolus dan pada komponen fibrin yang padat di nukleolus selama fase interfase. Selama proses mitosis kromosom - kromosom tersebut mengumpul ke arah tepi (Urruticoechea et al., 2005; Yerushalmi et al., 2010). Waktu paruh dari Ki-67 diperkirakan berkisar antara 1-1,5 jam. Ekspresi Ki67 bervariasi sesuai dengan fase siklus sel. Sel mengekspresi antigen ini selama fase G1, S, G2 dan M; tetapi tidak diekspresi selama fase istirahat (G0). Kadar Ki67 rendah pada fase G1 dan S, serta mulai meningkat sampai mencapai titik tertinggi pada fase mitosis. Kemudian pada fase anaphase dan telophase terjadi penurunan ekspresi secara tajam (Urruticoechea et al., 2005; Colozza et al., 2005). Perbedaan ekspresi
Ki-67 selama cell cycle, bukan disebabkan oleh
akumulasi dari protein yang non-degraded, tetapi akibat dari variable de-novo synthesis (Urruticoechea et al., 2005). .
Walaupun diduga bahwa protein ini mempunyai peran penting dalam proses pembelahan sel, namun sampai saat ini fungsi yang pasti dari antigen ini belum diketahui (Urruticoechea et al., 2005).
2.5 Ki-67 pada Adenoma dan Karsinoma Kolorektal Sel kanker sangat aktif berproliferasi yang ditandai dengan siklus sel yang lebih cepat dibandingkan dengan sel normal. Proliferasi sel kanker ini dipicu oleh beberapa faktor seperti protein Ki-67 atau MIB I, dan beberapa Cyclin. Laju proliferasi sel dapat ditentukan melalui beberapa penanda sel seperti grading histologi, Mitotic Activity Index/MAI, S-Phase Fraction/SPF dan DNA Ploidy melalui flowcytometry, Thymidine Labeling Index/TLI, Thymidine Kinase/TK, protein Ki-67 atau MIB I, Cyclin E, Cyclin D dan lain-lain.(Colozza et al., 2005). Penelitian oleh Nussrat et al. (2011) pada adenoma kolorektal menunjukkan bahwa ekspresi ki-67 berkorelasi signifikan dengan ukuran lesi dan derajat displasia. Penelitian ini menunjukkan hasil yang berbeda dengan penelitian sebelumnya, dimana penelitian Vernillo et al. (2008) menunjukkan bahwa ekspresi ki-67 tidak berhubungan dengan derajat atipia dari adenoma. Penelitian oleh Nabi et al. (2008) menunjukkan bahwa aktivitas proliferasi pada KKR yang dievaluasi dengan ekspresi Ki-67 berkorelasi dengan tipe histologik, derajat diferensiasi, dan stadium tumor. Kasus KKR yang berdiferensiasi baik dan sedang menunjukkan ekspresi Ki-67 yang lebih tinggi dibandingkan dengan kasus yang berdiferensiasi jelek. Kasus KKR dengan tipe non musinus menunjukkan ekspresi Ki-67 yang lebih tinggi dibandingkan dengan
tipe musinus atau karsinoma sel cincin. Kasus KKR Dukes’ B menunjukkan ekspresi Ki-67 yang lebih tinggi dibandingkan dengan kasus Dukes’C. Sebaliknya penelitian lain oleh Salminem (2005) yang menilai hubungan aktivitas proliferasi sel dengan survival pasien KKR menemukan bahwa dengan ekspresi Ki-67 yang tinggi (>40%) memilki survival yang lebih baik. Penelitian ini memakai cutt off point 40% untuk menilai faktor prognostik KKR. Bila dibandingkan dengan tehnik pengecatan untuk biomarker yang lain, maka tehnik pengecatan Ki-67 ini adalah mudah dikerjakan, ekonomis dan lebih reproducible. Mengingat adanya ketidaksamaan dalam hal menentukan definisi dari cut-off point, maka interpretasi Ki-67 dapat ditetapkan sebagai variabel kontinyu (Urruticoechea et al., 2005). Beberapa penelitian sebelumnya telah meneliti ekspresi Ki-67 baik pada adenoma maupun KKR, namun sepengetahuan kami di Bali belum ada penelitian yang membandingkan ekspresi Ki-67 pada adenoma dan KKR.
Gambar 2.5. Adenoma yang menunjukkan ekspresi Ki-67 (x40). Pulasan positip menunjukkan inti yang terpulas berwarna coklat (Dikutip dari Wang et al., 2011)
BAB III KERANGKA PIKIR, KONSEP, DAN HIPOTESIS PENELITIAN
3.1 Kerangka Pikir Skrining KKR untuk orang dengan risiko tinggi adalah menggunakan metode invasif. Deteksi dini yang masih merupakan pilihan saat ini adalah metode biopsi kolonoskopi karena akurasinya yang tinggi mencapai 95%. Dari biopsi kolonoskopi dapat ditentukan diagnosis adenoma maupun KKR. Tetapi dalam praktek sehari-hari seringkali kita jumpai kesulitan oleh karena biopsi yang ditemukan hanya mengandung lapisan mukosa tanpa komponen submukosa. Invasi ke lamina propria dan atau submukosa merupakan kriteria diagnosis untuk KKR. Pada jaringan biopsi mukosa kolorektal tanpa komponen submukosa, adanya gambaran displasia epitel yang ditunjang oleh proliferasi sel yang tinggi tampaknya dapat mengarahkan ke suatu diagnosa KKR. Salah satu marker proliferasi sel yang digunakan untuk menilai laju proliferasi sel tumor adalah ekspresi protein Ki-67. Ki-67 merupakan salah satu marker proliferasi sel yang digunakan untuk menilai laju proliferasi sel tumor. Banyak penelitian menunjukkan aktivitas proliferasi berhubungan dengan derajat diferensiasi, tipe histologi, dan stadium dari karsinoma kolorektal, sementara pada adenoma kolorektal menunjukkan bahwa ekspresi Ki-67 berhubungan dengan ukuran dan derajat lesi.
Proliferasi sel mulai meningkat pada adenoma, dan
menjadi lebih tinggi pada kasus KKR. .
3.2 Konsep Penelitian Biopsi kolonoskopi
Adenoma kolorektal
Karsinoma kolorektal
Proliferasi sel, ekspresi Ki-67
Rerata ekspresi Ki-67 pada adenoma
Gambar 3. Bagan Konsep Penelitian
Rerata ekspresi Ki67 pada KKR
3.3. Hipotesis Penelitian Hipotesis penelitian ini adalah terdapat perbedaan bermakna antara rerata ekspresi Ki-67 pada adenoma dengan rerata ekspresi Ki-67 pada KKR.
BAB IV METODE PENELITIAN
4.1. Rancangan Penelitian Penelitian ini merupakan penelitian korelasi dengan menggunakan metode analitik potong lintang.
Adenoma
KKR
Gambar 4. Bagan rancangan penelitian 4.2. Tempat dan Waktu penelitian Penelitian dilakukan dibagian /SMF Patologi Anatomi FK Unud / RSUP Sanglah Denpasar. Waktu penelitian ditetapkan dari 15 April 2013 sampai dengan 20 Mei 2013.
4.3. Populasi dan Sampel Penelitian 4.3.1. Populasi Penelitian Populasi penelitian ini adalah semua sediaan blok parafin dari penderita adenoma dan KKR yang telah melakukan pemeriksaan histopatologi dari hasil biopsi kolonoskopi di Laboratorium Patologi Anatomi FK Unud / RSUP Sanglah Denpasar dan laboratorium swasta yang ada di Denpasar.
4.3.2. Sampel Penelitian Sampel penelitian ini adalah semua sediaan blok parafin dari hasil biopsi kolonoskopi penderita adenoma dan karsinoma kolorektal dari tanggal 1 Januari 2011 sampai 31 desember 2012 yang memenuhi kriteria inklusi dan eksklusi yang ditetapkan peneliti. Untuk memenuhi jumlah kasus yang memenuhi kriteria inklusi dan eksklusi maka sampel ditentukan dengan cara random.
4.3.3.Jumlah Sampel Besar sampel minimal yang dibutuhkan dalam penelitian ini menggunakan rumus uji hipotesis terhadap rerata dua populasi independen dari Maldiyono dkk :
[(Zα + Zβ)xS]2 n1 = n2 = 2 d
Keterangan : Zα =
derivat baku normal untuk α (1,96 untuk α sebesar 5%)
Zβ =
0,842 untuk power 80%
S=
simpang baku untuk dua kelompok
d=
perbedaan klinis yang diinginkan
N = 31, sehingga jumlah sampel yang dibutuhkan sebanyak 31 orang masingmasing kelompok. n total = 62
4.4. Kriteria Inklusi dan Eksklusi 4.4.1. Kriteria Inklusi 1. Sediaan berasal dari bahan biopsi kolonoskopi yang mengandung lapisan mukosa dan submukosa. 2. Sampel memenuhi syarat untuk diinterpretasi sebagai adenoma dan Karsinoma kolorektal (KKR). 4.4.2. Kriteria Eksklusi 1. Terdapat riwayat karsinoma, post reseksi, dan penyakit radang usus pada kasus adenoma. 2. Kasus dengan diagnosis histopatologi yang belum pasti ( masih ada diagnosis banding). 3. Blok parafin rusak. 4.5. Variabel Penelitian 1. Variabel Dependent
: Adenoma dan KKR
2. Variabel Independent
: Ekspresi Ki-67
4.6. Definisi Operasional Variabel 1. Adenoma: adalah lesi neoplasma jinak intraepithelial yang terdiri dari sel-sel epitel dengan tanda displastik yang tidak menembus membran basal. Adenoma derajat rendah dengan derajat displasia ringan menunjukkan karakteristik : kripta penuh, tersusun pararel, tanpa gambaran kelenjar back to back, cribriform, atau budding.
inti sel bertumpuk mencapai setengah ketebalan epitel dan tetap berorientasi pada basal. mitosis
atipik,
kehilangan
polaritas
dan
pleomorfisme
ditemukan minimal. Adenoma derajat tinggi dengan derajat displasia sedang dan berat dengan karakteristik : pleomorfisme inti yang jelas, dengan bentuk inti lebih bulat, peningkatan rasio inti terhadap sitoplasma, kromatin inti kasar dan nukleoli yang nyata. gambaran kelenjar dengan pola back to back, cribriform serta sarang- sarang solid. tidak ditemukan invasi pada membran basal. Diagnosis adenoma dibuat dengan pulasan Hematoksilin dan Eosin (H&E) dan pemeriksaan mikroskopik menggunakan mikroskop cahaya merk Olympus CX21. 2. Karsinoma kolorektal : adalah keganasan epitel kelenjar kolorektal yang menunjukkan invasi ke dalam muskularis mukosa dan atau submukosa. Kriteria diagnostik dari karsinoma kolorektal: gambaran kelenjar yang dominan dengan sedikit stroma. arsitektur kelenjar dengan pola back to back, cribriform, proliferasi kelenjar berukuran kecil yang ireguler. sel tumor berbentuk kolumner tinggi dan berubah menjadi lebih kuboid pada diferensiasi buruk.
infiltrasi sel individual dan kelenjar kedalam lamina propria dan atau muskularis mukosa. Karsinoma kolorektal dibagi berdasarkan derajat rendah dan derajat tinggi berdasarkan komponen glandular yang masih tersisa. KKR derajat rendah memiliki komponen glandular 50-95%. KKR derajat tinggi memiliki komponen glandular kurang dari 50%. Diagnosis Karsinoma kolorektal dibuat dengan pulasan hematosilin dan Eosin (H&E) dan pemeriksaan mikroskopik menggunakan mikroskop cahaya merk Olympus CX21. 3. Ekspresi protein Ki-67 adalah penilaian protein Ki-67 yang terpulas berwarna coklat dari hasil pemeriksaan patologi dengan pengecatan Immuno Histo Chemistry Staining (IHC) dari blok parafin spesimen biopsi tumor primer. Dilakukan perhitungan kuantitatif dari protein Ki-67 yang tercat oleh IHC (Monoclonal Mouse Anti-Human Ki-67 Antigen, DAKO, Denmark) dan terlihat pada inti sel dalam satu lapangan pandang mikroskopis. Interpretasi pengecatan IHC dinyatakan sebagai persentase inti sel yang terpulas dengan berbagai intensitas. Interpretasi dilakukan dengan menghitung sel yang terpulas pada inti sel dari 100 sel tumor pada pembesaran 400 x (Urruticoechea et al., 2005). Pemeriksaan ini dilakukan oleh peneliti dan satu Ahli Patologi yang berpengalaman dari Bagian/SMF Patologi Anatomi FK UNUD/RSUP Sanglah Denpasar. 4. Biopsi kolonoskopi : jaringan biopsi yang berasal dari kolon dan rektum yang dilakukan melalui anus dengan menggunakan alat kolonoskopi.
5. Blok parafin : jaringan yg mengandung sel sel tumor kolorektal yang ditanam dalam parafin dalam bentuk blok untuk memudahkan pemotongan dengan mikrotom. 4.7 Prosedur Penelitian 1. Pengumpulan data pasien dan sediaan preparat yang dibiopsi kolonoskopi kolorektal dan melakukan pemeriksaan patologi dari 1 Januari 2011 sampai 31 Desember 2012 di l;aboratorium swasta, Denpasar dan di laboratorium Patologi Anatomi FK UNUD/RSUP Sanglah, Denpasar. 2. Preparat hasil pulasan Hematoksilin dan Eosin (H&E) sesuai nomornomor diatas dikumpulkan dan dievaluasi ulang supaya memenuhi kriteria inklusi dan eksklusi sehingga didapat dua kelompok data yaitu adenoma dan KKR. Preparat yang sulit dievaluasi dilakukan potong ulang blok dan dipulas dengan pulasan rutin menggunakan Harris’s Hematoksilin dan Eosin. Prosedur pulasan H&E sesuai dengan prosedur pulasan yang rutin dikerjakan di Bagian/SMF Patologi Anatomi FK UNUD/RSUP Sanglah, Denpasar: a. Potong ulang blok parafin menggunakan mikrotom Leica 2125 RM dengan ketebalan 4μm, kemudian ditempelkan pada gelas obyek merk Sail Brand dengan ukuran lebar 1 inchi, panjang 3 inchi dan tebal 1,2 mm. b. Deparafinisasi dengan dicelupkan pada xilol sebanyak 4 kali masing masing celupan sebanyak 5 menit.
c. Hidrasi dengan alkohol bertingkat dengan kosentrasi menurun menggunakan alkohol 95%, alkohol 80%, alkohol 75%, dan alkohol 50%, masing masing celupan selama 2 menit. d. Masukkan ke air selama 10 menit. e. Celupkan ke cat utama yaitu Harris’s hematoksilin selama 10 menit. f. Cuci dengan air selama 10 menit. g. Lihat dibawah mikroskop, inti sel akan terlihat biru terang sedangkan sitoplasma tidak berwarna. h. Celupkan pada cat pembanding eosin 1% selama 0,5-1 menit. i. Dehidrasi dengan alkohol bertingkat dengan konsentrasi meningkat mengunakan alkohol 70%, alkohol 80%, alkohol 95% dan alkohol absolute, masing-masing celupan selama 2 menit. j. Penjernihan dengan xilol sebanyak 4 kali celupan, lama masingmasing celupan selama 5 menit. k. Tutup dengan cover glass. 3. Mengumpulkan blok parafin dari sediaan H&E terpilih. 4. Blok parafin dipotong setebal 4 mikrometer dengan mikrotom untuk pulasan imunohistokimia. 5. Melakukan pulasan imunohistokimia Ki-67 dengan prosedur : a. Potong blok parafin menggunakan mikrotom Leica 2125 RM dengan ketebalam 3 μm, kemudian direkatkan pada gelas obyek yang telah dilapisi dengan poly-L-lysine, merk Sigma, dengan ukuran lebar 1 inchi, panjang 3 inchi dan tebal 1,2 mm. Disamping pemeriksaan
untuk sampel, pemeriksaan juga dilakukan pada kasus karsinoma payudara sebagai kontrol positif. b. Inkubasi dalam inkubator dengan suhu 37 o C selama 1 malam. c. Deparafinisasi dengan xilol, preparat dicelupkan ke dalam xilol sebanyak 3 kali, masing-masing celupan selama 3 menit. d. Rehidrasi dengan alkohol bertingkat terdiri dari alkohol absolute 2 kali, alkohol 95%, alkohol 80%, dan alkohol 70%, masing-masing selama 3 menit. e. Cuci dengan aquadest selama 10 menit. f. Teteskan H2O2 dalam methanol 3% sampai menutupi seluruh permukaan jaringan selama 15 menit. g. Cuci dengan aquadest selama 10 menit. h. Cuci dengan PBS (phosphate buffer saline) sebanyak 2 kali, masingmasing selama 10 menit. i. Rendam dengan buffer sitrat 0,01 M, pH 6,0. Kemudian panaskan di dalam oven microwave selama 15 menit, mula-mula dengan pemanasan tinggi (80oC) sampai tepat mendidih kemudian dengan pemanasan sedang (50 oC) selama 5 menit. j. Dinginkan pada suhu kamar. k. Cuci dengan PBS sebanyak 2 kali, masing-masing selama 10 menit. l. Teteskan 100μl (blocking) dengan ultra V block atau sniper block selama 10 menit.
m. Teteskan 100 μl antibody primer menggunakan antibody monoklonal Ki-67 dari Dako yang telah diencerkan (pengenceran 1:100) selama 30 menit pada suhu kamar atau semalam pada suhu 40C. n. Cuci dengan PBS sebanyak 2 kali, masing-masing selama 10 menit. o. Teteskan Biotinylated Anti Polyvalent selama 10 menit. p. Cuci dengan PBS sebanyak 2 kali, masing-masing 10 menit. q. Teteskan Streptavidin Peroxidase selama 10 menit. r. Cuci dengan PBS sebanyak 2 kali, masing-masing selama 10 menit. s. Teteskan dengan reagen DAB selama 10 menit. t. Cuci dengan air mengalir. u. Counterstain dengan Mayer Hematoksilin selama 2 menit. v. Cuci dengan air mengalir. w. Dehidrasi dengan alkohol bertingkat terdiri dari alkohol 70%, alkohol 80%, alkohol 95%, dan alkohol absolut 2 kali, masingmasing selama 3 menit. x. Celupkan ke dalam xilol sebanyak 3 kali, masing-masing selama 3 menit. y. Tutup dengan cover glass. 6. Interpretasi dan penghitungan persentase pulasan Ki-67 dilakukan oleh peneliti dan seorang ahli Patologi Anatomi di laboratorium PA RSUP Sanglah, Denpasar, dengan menggunakan mikroskop olympus CX 21. Penghitungan dilakukan dengan pembesaran lensa okuler 10x dan lensa obyektif 10x. Kemudian dihitung 100 sel pada area yang terpulas paling
padat. Setelah itu dihitung persentase sel yang terpulas berwarna coklat dari 100 sel yang dievaluasi. 7. Pencatatan dan pengumpulan data. 8. Analisis data.
Mencari nomor-nomor sediaan adenoma dan karsinoma kolorektal dari 1 Januari 2011 sampai 31 Desember 2012
Pengumpulan sediaan pulasan HE
Seleksi, rediagnosis dan regrading sediaan mikroskopik yang memenuhi kriteria inklusi dan eksklusi untuk pengelompokan data
Adenoma kolorektal
Karsinoma kolorektal
Randomisasi
Pengumpulan dan pemotongan blok parafin Pulasan imunohistokimia ekspresi Ki-67
Interpretasi dan penghitungan rerata ekspresi Ki67 pada adenoma dan KKR
Analisis data
Gambar 5 Bagan Prosedur Penelitian
4.9 Analisis Data Data yang diperoleh dianalisis dengan menggunakan SPSS. Dari data yang terkumpul diolah secara deskriptif untuk mengetahui karakteristik sampel. Analisis yang dilakukan adalah deskriptif dan komparatif. Analisis deskriptif dilakukan untuk mengetahui perbedaan rerata Ki-67 pada adenoma dan karsinoma kolorektal. Analisa komparatif dilakukan untuk mengetahui perbedaan rerata Ki67 pada adenoma dengan KKR.
BAB V HASIL PENELITIAN
5.1 Karakteristik Subyek Penelitian Selama periode Januari 2011 sampai Desember 2012, berdasarkan data pasien yang diperiksa di Laboratorium Patologi Anatomi Rumah Sakit Sanglah dan beberapa laboratorium swasta di Denpasar, didapatkan sebanyak 62 sampel pasien dengan diagnosis adenoma kolorektal dan sebanyak 159 sampel pasien dengan diagnosa adenokarsinoma kolorektal yang diambil dengan biopsi kolonoskopi. Berdasarkan perhitungan sampel menurut rumus Maldiyono, dibutuhkan jumlah sampel 31 kasus adenoma kolorektal dan 31 kasus adenokarsinoma kolorektal. Semua kasus Adenoma dan KKR diberi nomor urut. Sampel Adenoma dipilih berdasarkan nomor urut ganjil (1,3,5...dst). Sampel KKR dipilih berdasarkan nomor urut kelipatan 5 (1,5,10,..dst). Dari kasus yang ada selama tahun 2011 sampai 2012, sampel dipilih yang memenuhi kriteria inklusi dan eksklusi yang telah ditetapkan, kemudian dilakukan pengecatan imunohistokimia pemeriksaan protein Ki-67. 5.1.1. Karakteristik subyek penelitian berdasarkan umur Umur rata-rata pasien dalam penelitian ini adalah 56,9 tahun dengan rentang umur 19 sampai 87 tahun. Kasus adenoma dan KKR tertinggi ditemukan pada dekade keenam. (Tabel 1).
Tabel 5.1. Jumlah adenoma dan KKR perkelompok umur satu dekade.
10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0
Adenoma KKR
5.1.2 Karakteristik subyek penelitian berdasarkan jenis kelamin Kasus adenoma dan KKR lebih sering dijumpai pada laki laki dibandingkan wanita baik pada kasus adenoma ataupun KKR. Kasus adenoma pada laki laki sebanyak 18 orang, wanita sebanyak 13 orang, dan kasus KKR pada laki - laki sebanyak 17 orang, pada wanita sebanyak 14 orang (Tabel 2). Tabel 5. 2. Jumlah adenoma dan KKR berdasarkan jenis kelamin
20 15
Laki-laki
10
Wanita
5 0
Adenoma
KKR -
5.1.3 Karakteristik subyek penelitian berdasarkan tipe histologik Penelitian ini menggunakan subyek penelitian berupa 31 kasus adenoma dan 31 kasus KKR. Pada kasus adenoma secara spesifik ditentukan pula derajat diferensiasinya menjadi derajat rendah dan derajat tinggi. Klarifikasi dari 31 kasus adenoma, 17 kasus merupakan adenoma derajat rendah dan 14 kasus adenoma derajat tinggi (Gambar 5.1) (Tabel 3).
B
A AA
Gambar 5.1. Derajat diferensiasi Adenoma kolorektal. A. Adenoma derajat rendah (kasus no M. 2742.11), B. Adenoma derajat tinggi (kasus no M. 649.11) Pulasan H-E.
Tabel 5. 3. Frekuensi adenoma kolorektal berdasarkan derajat diferensiasi
Adenoma Derajat rendah Derajat tinggi Total
Frekuensi 17 14 31
Persen 54.8 45.2 100.0
Sementara pada kasus KKR secara spesifik derajat diferensiasinya dikelompokkan menjadi derajat rendah, dan derajat tinggi (Gambar 2) (Tabel 4).
Tabel 5.4. Frekuensi KKR berdasarkan derajat diferensiasi
KKR derajat rendah derajat tinggi Total
A
Frekuensi 5 26 31
Persen 16.1 83.9 100.0
B
Gambar 5.2. Derajat diferensiasi KKR. A. KKR derajat rendah (kasus no M.2588.11), B. KKR derajat tinggi (kasus no M.2418.11), Pulasan H-E
5.2 Hubungan Overekspresi Ki-67 pada Adenoma dan KKR Pemeriksaan Ki-67 pada penelitian ini menggunakan kontrol positif yang diperoleh dari kasus karsinoma payudara yang menunjukkan ekspresi Ki-67 yang tinggi ( 80%) (Gambar 5.3).
Gambar 5.3. Ekspresi Ki-67 pada karsinoma payudara. Tampak inti sel terpulas berwarna coklat 80 % dari keseluruhan tumor . Pemeriksaan imunohistokimia terhadap Ki-67 pada kasus adenoma derajat rendah kolorektal menunjukkan rentang ekspresi yang bervariasi, mulai 5% sampai 25% (rerata 11,47 dengan SD 5,77). Pada adenoma derajat tinggi menunjukkan ekspresi yang lebih tinggi dibandingkan adenoma derajat rendah dengan rentang 8% sampai 24% (rerata 14,57% dengan SD 4,43%) (Gambar 5.4).
A
B
Gambar 5.4. Ekspresi Ki-67 pada derajat diferensiasi adenoma kolorektal. A. Ekspresi Ki-67 pada kasus no M.1063.12 dengan Adenoma derajat rendah. B. Ekspresi Ki-67 pada kasus no M.2437.12 dengan Adenoma derajat tinggi
Pemeriksaan terhadap Ki-67 pada KKR derajat rendah menunjukkan rentang ekspresi yang bervariasi, mulai 25% sampai 37% (rerata 30,4% dengan SD 4,67%). Pada KKR derajat tinggi menunjukkan ekspresi yang lebih tinggi dibandingkan KKR derajat rendah dengan rentang 30% sampai 60% (rerata 38,9% dengan SD 7,26%) (Gambar 5.5).
A
B
B
Gambar 5.4. Ekspresi Ki-67 pada derajat diferensiasi KKR. A Ekspresi Ki-67 pada kasus no M.2271.11 dengan Derajat rendah KKR. B Ekspresi Ki-67 pada kasus no 731 PM 12 dengan derajat tinggi KKR.
Uji beda rerata antara ekspresi Ki-67 pada adenoma dan KKR dengan menggunakan uji t menunjukkan hasil yang bermakna dengan p=0,000 (beda mean -24,67742; 95% CI = -28,0039 s/d -21,35145). (Tabel 5)
Tabel 5.5. Perbedaan skor ekspresi Ki-67 antara kelompok adenoma kolorektal dan Karsinoma kolorektal (KKR) Kelompok
Rerata SD
t
Adenoma
12,87 5,36
14,841
KKR
37,55 7,55
14,481
Beda rerata
CI beda rerata
Nilai p
-24,68
-28,0 sd -21,35
0,000
BAB VI PEMBAHASAN
6.1 Karakteristik subyek penelitian Pada penelitian ini penulis mendapatkan bahwa dari temuan biopsi kolonoskopi pada kasus adenoma dan karsinoma kolorektal usia terbanyak adalah pada dekade keenam dengan rentang usia termuda 19 tahun dan tertinggi pada usia 87 tahun. Di negara negara barat insiden karsinomanya jarang sebelum usia 40 tahun kecuali pada orang orang yang dengan predisposisi genetik atau dengan inflamatory bowel disease (Hamilton et al., 2009). Di Amerika rerata usia penderita KKR adalah 62 tahun (Rosai, 2011). Di Bali pada penelitian kami insiden KKR tersering dijumpai pada dekade keenam. Kasus adenoma dan KKR lebih sering ditemukan pada laki laki daripada wanita, yang pada penelitian ini didapatkan adenoma sebanyak 18 kasus pada laki laki dan 13 kasus pada wanita. Kasus KKR pada laki laki sebanyak 17 kasus dan wanita 14 kasus. Hal ini sesuai dengan data epidemiologi di dunia tahun 2008 yang menemukan kanker kolon lebih tinggi 20% pada laki laki. (Hamilton et al., 2009) Berdasarkan data sampel yang didapat, kasus adenoma derajat rendah dan derajat tinggi tidak jauh berbeda, sementara pada kasus KKR didapatkan kasus KKR derajat rendah yang jauh lebih rendah dibandingkan dengan kasus KKR
derajat tinggi. Hal ini disebabkan karena pemilihan sampel yang menggunakan cara random. 6.2 Hubungan Overekspresi Ki-67 pada Adenoma dan KKR Populasi sel di dalam suatu jaringan ditentukan oleh laju proliferasi dan apoptosis dari sel penyusun jaringan tersebut. Proliferasi sel yang berlebih merupakan perubahan yang selalu terjadi pada proses karsinogenesis.
Indeks
proliferasi sel penyusun tumor dapat dievaluasi dengan beberapa metode, mulai evaluasi indeks mitosis dari sediaan histopatologik konvensional, pemeriksaan marka proliferasi sel seperti ekspresi Ki-67 dengan pemeriksaan imunohistokimia atau pemeriksaan molekuler lainnya. Pada penelitian ini ditemukan ekspresi Ki-67 pada kasus adenoma kolorektal dengan rentang yang bervariasi mulai 5% sampai 25%. Ekspresi Ki-67 pada adenoma derajat tinggi lebih tinggi dibandingkan dengan adenoma derajat rendah. Hasil penelitian ini sesuai dengan yang ditemukan oleh Nussrat et al. (2011) dalam penelitiannya yang mengevaluasi ekspresi Ki-67 pada adenoma kolorektal dan menilai hubungannya dengan beberapa parameter klinikopatologi seperti usia dan jenis kelamin pasien, tipe dan lokasi tumor, serta ukuran dan derajat diferensiasi tumor. Nussrat et al. (2011) pada penelitiannya menemukan bahwa ekspresi Ki-67 berkorelasi secara bermakna dengan ukuran dan derajat diferensiasi tumor, tetapi tidak berkorelasi bermakna dengan
usia dan jenis
kelamin pasien serta tipe dan lokasi tumor. Penelitian lain yang menunjukkan hasil serupa yaitu penelitian oleh Yinghao et al. (2006), Abdulamir et al., (2008)
dan Radovanick et al.,(2009). Pulasan imunohistokimia Ki-67 dapat dipergunakan sebagai metode tambahan untuk evaluasi histopatologi konvensional pada penderita adenoma kolorektal terutama dalam mengkonfirmasi derajat diferensiasi tumor serta kemungkinan progresifitasnya. Pada kasus KKR ekspresi Ki-67 ditemukan dalam rentang 25% sampai 60%. Ekspresi Ki-67 pada KKR dengan derajat diferensiasi jelek lebih tinggi dibandingkan dengan KKR dengan derajat diferensiasi baik. Hasil penelitian ini sejalan dengan penelitian oleh Ahmed et al. (2012). Ahmed dalam penelitian ini menemukann bahwa terdapat korelasi yang signifikan antara indeks proliferasi Ki67 dengan tipe histologik dan derajat diferensiasi dari KKR tetapi tidak berkorelasi dengan parameter klinikopatologik lain seperti usia dan jenis kelamin penderita, ukuran tumor, lokasi, kedalaman invasi, stadium, status nodal, dan invasi vaskuler. Hasil serupa ditemukan pada penelitian lain oleh Valentina et al. (2005). Hasil sebaliknya ditemukan pada penelitian dari Saleh et al. (2008) dan Nabi et al. (2008). Penelitian Saleh dan Nabi menemukan bahwa semakin jelek derajat diferensiasi tumor pada KKR semakin berkurang laju proliferasi sel yang dievaluasi dengan menilai ekspresi Ki-67 yang semakin rendah. Beberapa kemungkinan yang mendasari perbedaan hasil penelitian ini adalah berbedanya jenis jaringan yang dipergunakan, perbedaan prosedur pulasan, perbedaan cara interpretasi Ki-67, serta perbedaan karakteristik subjek penelitian. Perbedaan ekspresi Ki-67 pada adenoma dan KKR terbukti signifikan pada penelitian ini (p=0,000). Ekspresi Ki-67 pada KKR (rerata 37,5%; SD 7,55) lebih tinggi dibandingkan pada adenoma (rerata 12,87; SD 5,36). Hasil penelitian ini
serupa dengan penelitian oleh Lin et al. (2008) yang menemukan bahwa ekspresi Ki-67 secara signifikan lebih tinggi pada KKR dibandingkan pada adenoma serta mukosa normal kolon. Pada penelitian ini juga Lin et al. (2008) menemukan bahwa ekspresi Ki-67 berhubungan dengan usia pasien, adanya metastasis jauh, serta stadium TNM tumor. Penelitian lain oleh Wang et al. (2013) yang menilai ekspresi Ki-67 pada adenoma dan KKR tipe familial dan sporadik juga menunjukkan hasil yang serupa baik pada kasus KKR familial maupun sporadik. Perbedaan ekspresi Ki-67 yang signifikan antara kasus adenoma kolorektal dan KKR yang dijumpai pada penelitian ini maupun pada penelitian oleh penelitipeneliti lain juga dijumpai pada beberapa keganasan di tempat lain seperti pada rongga mulut dan prostat. Pada penelitian oleh Zhong et al. (2008) yang meneliti ekspresi Ki-67 pada cell line karsinoma prostat dan cell line benign prostate hyperplasia serta menilai potensinya menjadi keganasan. Pada penelitian ini dijumpai bahwa pada sel kanker menunjukkan ekspresi Ki-67 yang lebih tinggi dibandingkan dengan sel benigna. Dari penelitiannya ini Zhong menyimpulkan bahwa ekspresi Ki-67 dapat meningkatkan akurasi diagnosis terutama pada kasus karsinoma prostat awal. Penelitian serupa pada kasus di rongga mulut oleh Angiero et al. (2008) juga menemukan bahwa ekspresi Ki-67 pada karsinoma invasive di rongga mulut lebih tinggi dibandingkan lesi prekursornya, serta lesi dengan displasia derajat tinggi menunjukkan ekspresi Ki-67 yang lebih tinggi dibandingkan dengan displasia derajat rendah. Dari penelitiannya ini Angiero et al. menyimpulkan bahwa Ki-67 dapat dipergunakan sebagai marka untuk
mengenali evolusi menjadi karsinoma invasif lesi prekanker pada rongga mulut serta mengidentifikasi derajat displasianya. Dari hasil penelitian ini yang sesuai dengan penelitian-penelitian lain baik pada lesi di kolorektal maupun pada keganasan di tempat lain, tampaknya Ki-67 dapat merupakan marka yang dapat membantu dalam menegakkan diagnosis suatu lesi displastik atau karsinoma invasif, termasuk pada lesi kolorektal, dimana diagnosis ini sering menimbulkan kesulitan pada diagnosis histopatologik konvensional dari jaringan biopsi kolonoskopi dimana spesimen hanya mengandung bagian mukosa sehingga adanya invasi sulit dievaluasi.
BAB VII SIMPULAN DAN SARAN
7.1 Simpulan
7.1.1. Terdapat perbedaan ekspresi Ki-67 yang lebih tinggi pada KKR daripada Adenoma kolorektal.
7.2 Saran 7.2.1. Ki-67 dapat dipergunakan sebagai marka untuk membantu menegakkan diagnosa adenoma dan karsinoma kolorektal dengan sediaan konvensional pada jaringan biopsi kolonoskopi.
DAFTAR PUSTAKA
Abdulamir, A.S., Hafidh, R., Mahdi, L., Al-Jaboori, L., Abubakar, F., Abbas, K.A. 2008. The Interplay between P53 and P21 Tumor Suppressor Proteins in The Transformation of Colorectal Adenoma to Carcinoma. American Journal of Immunology.4(2);14-22. Ahmed, N.Y., Ismail, A.T., Kareem, T.S. 2012. A clinicopathologic study of Ki67 proliferation index in colorectal carcinoma. Saudi Med J, Vol 33(8):841-5. American Cancer Society. Colorectal cancer facts & figures 2008 – 2010. Atlanta: American Cancer Society. Angiero, F., Berenzi, A., Benetti, A., Rossi, E., Sordo, R.D., Sidoni, A. 2008. Expression of P16,P53 and Ki-67 Proteins in the Progression of Epithelial Dysplasia of The Oral Cavity. Anticancer Research, 28:2535-40. Antonia, R.S., Dara, L., Aisner. 2010. Molecular basis of Disease of the Gastrointestinal Tract. In: William B. Coleman, Gregory J. Tsongalis, Essential Concepts in Molecular Pathology, Elsevier: 243-61. Aoki, K., Taketo, M.M. 2007. Adenomatous polyposis coli (APC): a multifunctional tumor suppressor gene. J Cell Sci.120:3327-35 Badan Registrasi Kanker Perhimpunan Dokter Spesialis Patologi Anatomi. Kanker di Indonesia tahun 2008: data histopatologik. Jakarta:Direktorat Jenderal Pelayanan Medik Departemen Kesehatan R.I. Colozza, M., Azambuja, E., Cardoso, F., Sotiriou, C., Larsimont, D., Piccart, M.P. 2005. Proliferative Markers as Prognostic and Predictive Tools in Early Breast Cancer; Where are we now? Annals of Oncology, 16;17223-39. Cserni G. 2003. Nodal staging of colorectal carcinomas and sentinel nodes. J Clin Pathol. 56:327–35. Euscher, E.D., Niemann, T.H., Lucas, J.G., Kurokawa, A.M,, Frankel, W.L. 2001. Large colorectal adenomas an approach to pathologic evaluation. Am J Clin Pathol.16:336-40.
Fenoglio_Preiser C.M. 2009. editor. Gastrointestinal pathology: an atlas and text. Philadelphia: Lippincott Williams &Wilkins.
Ferlay, J., Shin, H.R., Bray, F., Forman, D., Mathers, C., Parkin, D.M,. GLOBOCAN 2008, cancer incidence and mortality worldwide: IARC CancerBase No. 10 [Internet]. 2010. Diunduh dari: http://globocan.iarc.fr. Lyon, France: International Agency for Research on Cancer; 2010. Gschwantler, M., Kriwanek, S., Langner, E,, Goritzer, B, Schrutka-Kolbl C, Brownstone E. 2004. High grade dysplasia and invasive carcinoma in colorectal adenomas: a multivariate analysis of the impact of adenoma and patient characteristics. Eur J Gastroenterol Hepatol.14:183-8 Hamilton, S.R., Vogelstein, B., Kudo, S., Riboli, E., Nakamura, S., Hainaut, P. 2009 Tumours of the colon and rectum. In: Hamilton SR, Aaltonen A, editors. World Health Organization: classification of tumours, pathology and genetics of tumours of the digestive system. Third ed. Lyon: IARC Press. p. 104-19. Homick, J.L,. Odze, R.D. 2011. polyps of the large intestine. In: Odze RD, Goldblum JR, editors. Surgical Pathology of the GI tract, liver, biliary tract, and pancreas. 2nd ed. Philadelphia: Elsevier, 507-20. Jemal, A., Siegel, R., Xu J, Ward E. 2010. Cancer statistics. CA Cancer J Clin 60 (5):1-24. Kelompok Kerja Adenokarsinoma Kolorektal. 2006. Pengelolaan karsinoma kolorektal: suatu panduan klinis nasional. Jakarta. Lin, M., Wen Z., Feng Z., He D. 2008. Expression and significance of Bmi-1 and Ki67 in Colorectal carcinoma tissues. Chinese Journal of Cancer. vol.27:12,568-73.
Montogomery, E. 2006. editor. Biopsy interpretation of the gastrointestinal tract mucosa. Philadelphia: Lippincott, William&Wilkins. Nabi, U., Nagi, A.H., Sami, W., 2008. Ki-67 Proliferatif Index and Histological Grade, Type and Stage of Colorectal Carcinoma, J. Ayub Med Coll Abbotabad. 20(4) Nussrat, L.F., Ali, H.H., Husein, G.H., Al-Ukashi, J.R. 2011. Immunohistochemical Expression of Ki-67 and p53 in Colorectal Adenomas: A Clinicopathological Study. Oman Medical Jurnal, Vol. 26, No. 4: 229-34. Pages, F., Galon, J,, Fridman, W.H. 2008. The essential role of the in situ immune reaction in human colorectal cancer. Journal of Leukocyte Biologi,84:9817.
Qian, J., Sarnaik, A.A., Bonney, T.M., Keirsey, J., Combs, K.A., Steigerwald, K, 2008. The APC tumor suppressor inhibits DNA replication by directly binding to DNA via its carboxyl – terminus Gastroenterology. 135 (1):152–162. Radovanick-Dinic, B., Nagorni, A., Katic, V., Starnenkovic, I., Zlatic, A. 2009. An immunohistochemichal study of Ki-67 in colorectal adenoma. National center for biotechnology information, 63(I);16-18. Riddell, R.H., Petras, R.E., Williams, G.T., Sobin, L.H. 2002. editors. Atlas of tumor pathology: tumors of the intestines. Washington: IARC. Rosai, J. 2011. Rosai and Ackerman’s Surgical Pathology. Tenth Edition, Mosbey. p 731-75. Saleh, H.A., Jackson, H., Khatib, G., Banerjee, M. 2008. Correlation of Bcl-2 Oncoprotein Immunohistochemical Expression with Proliferation Index and Histopathologic parameters in Colorectal Neoplasia. Appl Immunohistochem Mol Morphol.175-182. Sobin, L.H., Wittekind, C. 2002. editors. International Union Against Cancer: TNM classification of malignant tumours. 6ed. Geneva:Wiley-Liss. p.72-6. Urruticoechea, U., Smith, I.E., Dowsett, M. 2005. Proliferation Marker Ki-67 in Early Breast Cancer. J Clin Oncol, 23 : 7212 –7220. Valentina, V., Yokoyama, N., Walter, B., Okamoto, H., Suda, T., Hatakeyama, K. 2005. Clinical Significance of Ki-67 Proliferation Index in disease progression and prognosis of patients with resected colorectal carcinoma. Br J Surg. 92:1002-7 Vernillo, R., Lorenzi, B., Banducci, T., Minacci, C. 2008. Immunohistochemical Expression of p53 and Ki-67 in Colorectal Adenomas and prediction of Malignancy and Development of New Polyp. Int J Biol Markers. Apr-Jun: 23(2): 89-95. Wang J, El-Masry N, Talbot J,Tomlinson I, Alison MR, and El-Bahrawy M. 2013. Expression Profilingof Proliferation and Apoptotic Markers Along The Adenoma-Carcinoma Sequence in Familial Adenomatous Polyposis Patient. Hindawi Publishing Corporation Gastroenteropathology Research,;p.1-8. Wolpin, B.M., Meyerhadt, J.A., Mamon, H.J, Mayer, R.J. 2007. Adjuvant treatment of colorectal cancer. CA Cancer J Clin, 57;168-85.
Worthley, D.L., Leggett, B.A. 2010. Colorectal cancer: molecular features and clinical opportunities. Clin Biochem Rev.31:31-8. Yerushalmi, R., Woods, R., Ravdin, P.M. 2010. Ki-67 in Breast Cancer : Prognostic and Predictive Potential. Lancet Oncol.11 : 174 – 83. Yinghao, S., Martha, S., Reid, N., Qiuyin, C., Nobuhiko, K., Kay, W. 2006. Immunohistochemical expression of Ki-67, Cyclin D1, B Catenin, Cyclooxygenase-2, and Epidermal Growth Factor Receptor in Human Colorectal Carcinoma. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev.15(9). Zhong W, Peng J, He H, Wu D, Han Z, Xuecheng,B.I, QiShan,D.A.I. 2008. Ki-67 and PCNA Expression in Prostate Cancer and Benign Prostatic Hyperplasia. Clin Invest Med;31(1):E8-E15.
Lampiran 3 Data Sampel dan Hasil Pemeriksaan Imunohistokimia Ki-67 NO
NO SEDIAAN
JENIS KELAMIN
UMUR
LOKASI
DIAGNOSIS
Ki67
1
M.2742.11
P
44
Rektum
Adenoma
16
2
M.2749.11
L
68
Rektum
Adenoma
25
3
M.649.11
P
55
Colon
Adenoma
20
4
M.1454.12
P
58
Rektum
Adenoma
10
5
M.2437.12
P
72
Rektum
Adenoma
24
6
M.2101.12
L
56
Rektum
Adenoma
20
7
M.2562.12
L
54
Colon
Adenoma
10
8
M.1755.12
L
72
Rektum
Adenoma
8
9
M.1063.12
P
60
Rektum
Adenoma
6
10
M.1873.12
P
65
Colon
Adenoma
11
11
M.836.12
L
44
Colon
Adenoma
8
12
M.2077.12
P
70
Rektum
Adenoma
8
13
M.2630.12
P
19
Colon
Adenoma
21
14
M.3016.12
P
71
Colon
Adenoma
14
15
M.2221.12
L
48
Colon
Adenoma
11
16
M.2318.12
L
42
Rektum
Adenoma
9
17
M.761.12
L
50
Rektum
Adenoma
13
18
M.619.12
L
51
Colon
Adenoma
7
19
M.564.12
P
78
Rektum
Adenoma
5
20
M.299.12
L
60
Rektum
Adenoma
15
21
M.284.12
L
76
Rektum
Adenoma
13
22
M.018.12
L
42
Rektum
Adenoma
9
Low grade
23
353.PM.12
L
70
Rektum
Adenoma
12
High grade
Grade Low grade Low grade High grade Low grade High grade Low grade High grade High grade Low grade High grade Low grade Low grade Low grade Low grade Low grade Low grade High grade Low grade Low grade High grade High grade
24
25.PH.11
L
42
Colon
Adenoma
10
25
04.PM.11
P
52
Rektum
Adenoma
15
26
283.PM.12
P
58
Rektum
Adenoma
7
27
113.PH.12
P
58
Colon
Adenoma
9
28
393.PH.12
L
56
Rektum
Adenoma
15
29
3114.PP.12
L
45
Rektum
Adenoma
12
30
2911.PP.12
L
37
Rektum
Adenoma
21
31
77.PP.12
L
71
Rektum
Adenoma
15
32
M.2588.11
L
72
Rektum
Adeno Ca
25
33
M.2418.11
L
61
Rektum
Adeno Ca
42
34
M.1258.11
P
56
Rektum
Adeno Ca
47
35
M.2730.11
P
54
Rektum
Adeno Ca
35
36
M.2804.11
P
65
Colon
Adeno Ca
38
37
M.2365.11
L
50
Rektum
Adeno Ca
30
38
M.3112.11
P
70
Rektum
Adeno Ca
33
39
M.3111.11
P
60
Rektum
Adeno Ca
35
40
M.1820.12
L
39
Rektum
Adeno Ca
30
41
M.2527.11
P
59
Colon
Adeno Ca
42
42
M.2575.11
P
49
Rektum
Adeno Ca
44
43
M.2650.11
P
46
Rektum
Adeno Ca
32
44
M.2771.11
P
57
Rektum
Adeno Ca
40
45
M.2321.11
L
50
Rektum
Adeno Ca
37
46
M.2173.11
L
72
Rektum
Adeno Ca
41
47
M.2271.11
L
65
Rektum
Adeno Ca
33
48
M.2815.11
P
45
Colon
Adeno Ca
35
49
M.2365.11
L
50
Rektum
Adeno Ca
33
50
M.2270.11
P
45
Rektum
Adeno Ca
37
Low grade High grade Low grade Low grade High grade High grade High grade High grade Low grade High grade High grade High grade High grade High grade High grade High grade High grade High grade High grade High grade High grade High grade High grade Low grade High grade High grade High grade
51
M.402.12
P
81
Rektum
Adeno Ca
42
52
M.331.12
P
59
Rektum
Adeno Ca
29
53
M.321.12
P
45
Rektum
Adeno Ca
32
54
731.PM.12
L
87
Rektum
Adeno Ca
54
55
333.PM.11
P
76
Rektum
Adeno Ca
45
56
50.PM.12
L
28
Colon
Adeno Ca
37
57
520.PM.11
L
39
Rektum
Adeno Ca
39
58
385.PH.12
P
68
Colon
Adeno Ca
28
59
3778.PP.12
L
59
Rektum
Adeno Ca
30
60
3846.PP.12
L
60
Rektum
Adeno Ca
60
61
4046.PP.12
L
59
Colon
Adeno Ca
43
62
1335.PP.12
P
61
Rektum
Adeno Ca
36
High grade Low grade High grade High grade High grade Low grade High grade Low grade High grade High grade High grade High grade
Lampiran 4 Analisis Statistik T-Test
Group Statistics tipe tumor nilai adenoma adenokarsinoma
N
Mean
Std. Deviation
Std. Error Mean
31
12.8710
5.35874
.96246
31
37.5484
7.54912
1.35586
Independent Samples Test Levene's Test for Equality of Variances
F
Sig.
t-test for Equality of Means
t
nilai Equal 1.931 .170 variances 14.841 assumed Equal variances not assumed
df
Sig. (2Mean Std. Error tailed) Difference Difference
95% Confidence Interval of the Difference Lower
Upper
60
.000 -24.67742
1.66274
28.00339 21.35145
- 54.111 14.841
.000 -24.67742
1.66274
28.01085 21.34399
