Tagetes patula L. géntranszformált hairy root kultúrák tiofén anyagcseréjének vizsgálata

Tagetes patula L. géntranszformált hairy root kultúrák tiofén anyagcseréjének vizsgálata Doktori értekezés

Szarka Szabolcs Semmelweis Egyetem Gyógyszertudományi Doktori Iskola

Témavezető: Dr. Szőke Éva egyetemi tanár, D.Sc. Hivatalos bírálók: Dr. Kalász Huba tudományos szaktanácsadó, D.Sc. Dr. Mészáros Annamária tudományos főmunkatárs, Ph.D. Szigorlati bizottság elnöke: Dr. Tekes Kornélia egyetemi tanár, Ph.D. Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Varga Erzsébet egyetemi docens, Ph.D. Dr. László Miklós tudományos főmunkatárs, Ph.D.

Budapest 2010

_________________________________________________________Tartalomjegyzék

Tartalomjegyzék Tartalomjegyzék.......................................................................................... 1 Rövidítések jegyzéke ................................................................................... 4 1. Bevezetés és célkitűzések ........................................................................ 5 2. Irodalmi áttekintés .................................................................................. 7 2.1. A Tagetes patula L. rendszertani besorolása és elnevezése .............................. 7 2.2. A Tagetes patula botanikai leírása...................................................................... 8 2.3. A Tagetes patula etnofarmakológiai jelentősége ............................................... 9 2.4. A Tagetes patula speciális anyagcseretermékei ............................................... 10 2.4.1. Az illóolaj terpenoid komponensei............................................................... 10 2.4.2. Karotinoid származékok............................................................................... 12 2.4.3. Flavonoidok ................................................................................................. 14 2.4.4. Alkaloidok .................................................................................................... 15 2.4.5. Benzofuránok ............................................................................................... 15 2.4.6. Tiofénvázas poliacetilén származékok ......................................................... 16 2.5. A tiofénvegyületek megoszlása a növény szöveteiben .................................... 19 2.6. A tiofénszármazékok bioszintézise................................................................... 22 2.7. A tiofének biológiai aktivitása, hatásmechanizmusa...................................... 27 2.7.1. Fototoxikus hatás ......................................................................................... 27 2.7.2. Antivirális hatás ........................................................................................... 29 2.7.3. Baktériumok és gombák elleni hatás............................................................ 29 2.7.4. Élősködő fonálférgek ellen kifejtett hatás .................................................... 30 2.7.5. Emlős sejtekre kifejtett citotoxikus hatás ..................................................... 30 2.8. A tiofének kémiai analízise ............................................................................... 32 2.8.1. A növényi minták szárítása, kezelése ........................................................... 32 2.8.2. Tiofén-extrakciós módszerek........................................................................ 32 2.8.3. Tiofének nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiás (HPLC) vizsgálata... 33 2.8.4. Tiofének gázkromatográfiás vizsgálata ....................................................... 35 2.9. Tagetes patula in vitro szövettenyésztése és tiofének termelése...................... 37 2.9.1. Tagetes patula kallusz-, sejtszuszpenziós kultúrák és izolált gyökértenyészetek ......................................................................................... 37 2.9.2. Tiofének termeltetése Tagetes patula géntranszformált hairy root kultúrákkal.................................................................................................... 39

1


3. Anyag és módszer .................................................................................. 44 3.1. Növényi anyag .................................................................................................... 44 3.1.1. Az intakt növények........................................................................................ 44 3.1.2. In vitro, géntranszformált hairy root kultúrák ............................................. 44 3.1.2.1. Géntranszformáció ........................................................................... 44 3.1.2.2. A Tagetes patula hairy root kultúrák tenyésztésének kísérleti körülményei...................................................................................... 46 3.1.2.3. A kultúrák növekedési aktivitásának jellemzése.............................. 48 3.1.2.4. A géntranszformáció igazolása hairy root kultúrákban PCR technikával ....................................................................................... 49 3.2. Kémiai reagensek............................................................................................... 52 3.3. Tagetes patula speciális anyagcseretermékeinek vizsgálati módszerei ......... 52 3.3.1. Mintaelőkészítési és extrakciós módszerek .................................................. 52 3.3.1.1. Vízgőzdesztilláció ............................................................................ 52 3.3.1.2. Statikus gőztéranalízis (sHS)............................................................ 53 3.3.1.3. Szilárdfázisú mikroextrakció (SPME).............................................. 53 3.3.1.4. Szuperkritikus fluid fázisú széndioxid extrakció (SFE)................... 53 3.3.1.5. Oldószeres extrakció ........................................................................ 54 3.3.2. Gázkromatográfiás-tömegspektrometriás (GC-MS) módszerek a Tagetes patula illékony alkotóinak vizsgálatára .......................................... 55 3.3.2.1. A vízgőzdesztillációval előállított illóolaj GC-MS vizsgálata ......... 55 3.3.2.2. Az illékony komponensek SPME-GC-MS és sHS-GC-MS vizsgálata.......................................................................................... 55 3.3.3. Kromatográfiás módszerek a Tagetes patula tiofénjeinek vizsgálatára ...... 56 3.3.3.1. Vékonyréteg-kromatográfiás (VRK) vizsgálatok............................. 56 3.3.3.2. Flash kromatográfia oldószeres kivonatok frakcionálására ............. 56 3.3.3.3. Tiofének GC-MS vizsgálatai............................................................ 57 3.3.4. A gázkromatográfiás-tömegspektrometriás minőségi azonosítás és mennyiségi elemzés módszerei ..................................................................... 59 3.3.4.1. Minőségi azonosítás ......................................................................... 59 3.3.4.2. Mennyiségi elemzés ......................................................................... 59 3.4. Az eredmények értékelésének statisztikai módszerei..................................... 60

4. Eredmények és megbeszélés ................................................................. 61 4.1. Kémiai analízis, módszertani fejlesztések ....................................................... 61 4.1.1. Az illékony komponensek GC-MS vizsgálata ............................................... 61 4.1.1.1. A vízgőzdesztillációval előállított illóolaj GC-MS vizsgálata ......... 61 4.1.1.2. Illékony összetevők sHS-GC-MS vizsgálata.................................... 63 4.1.2. Tiofének vizsgálata GC-MS módszerekkel................................................... 67 4.1.2.1. Tiofének tömegspektrometriás azonosítása...................................... 67 4.1.2.2. Az optimális GC mintabeviteli technika kiválasztása ...................... 71 4.1.2.3. Tiofének GC-MS vizsgálata szerves oldószeres kivonatokban........ 74 4.1.2.3.1. Tiofének optimális szerves oldószeres extrakciója ................. 74 4.1.2.3.2. Az elemzési eredmények hihetőségének bizonyítása (validálás) és a módszer analitikai teljesítményjelző paraméterei ........... 76 4.1.2.4. Tiofének GC-MS vizsgálata SFE kivonatokban .............................. 84

2


4.1.2.5. Flash kromatográfiás vizsgálatok tiofénvegyületek izolálására....... 89 4.2. Tagetes patula intakt növények tiofénvegyületei............................................. 92 4.3. Tagetes patula géntranszformált hairy root kultúrák ..................................... 94 4.3.1. Géntranszformáció, klónszelekció ............................................................... 94 4.3.2. A géntranszformáció igazolása.................................................................... 98 4.3.3. A hairy root kultúra növekedési jellemzőinek és tiofén produkciójának vizsgálata ...................................................................................................... 99 4.3.4. A T. patula géntranszformált hairy root klón növekedési sajátságainak és tiofén produkciójának retrospektív összehasonlítása................................. 103 4.3.5. A hairy root klón és az intakt gyökerek tiofén metabolitjainak összehasonlítása ......................................................................................... 106 4.4. A T. patula hairy root klón (#TpA6) biomassza képzésének és tiofén produkciójának befolyásolása......................................................................... 107 4.4.1. Az optimális alaptáptalaj kiválasztása....................................................... 107 4.4.2. A MgSO4 hatásának vizsgálata .................................................................. 109 4.4.3. Kéntartalmú prekurzor aminosavak hatásának vizsgálata........................ 112

5. Következtetések ................................................................................... 115 6. Összefoglalás ........................................................................................ 122 7. Summary .............................................................................................. 123 8. Irodalomjegyzék .................................................................................. 124 Saját publikációk jegyzéke ..................................................................... 137 Köszönetnyilvánítás ................................................................................ 139

3

______________________________________________________Rövidítések jegyzéke

Rövidítések jegyzéke 1/2 NMS táptalaj: felére csökkentett nitrogén tartalmú MS táptalaj AcOCH2BBT: 5-metilaceto-5’-(3-butén-1-inil)-2,2’-bitiofén AES: atomemissziós spektroszkópia B5 táptalaj: Gamborg és mtsai által leírt táptalaj (1968) BBT: 5-(3-butén-1-inil)-2,2’-bitiofén BBTOAc: 5-(4-acetoxi-1-butinil)-2,2’-bitiofén BBT(OAc)2: 5-(3,4-diacetoxi-1-butinil)-2,2’-bitiofén BBTOH: 5-(4-hidroxi-1-butinil)-2,2’-bitiofén BPT: 2-(3-butén-1-inil)-5-(penta-1,3-diinil)-tiofén FID: lángionizációs detektor FTIR: Fourier-transzformációs infravörös spektroszkópia GC: gázkromatográfia GC-MS: gázkromatográfiával kapcsolt tömegspektrometria HPLC: nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia IPTGC: programozott hőmérsékletű gázkromatográfiás retenciós index MeBBT: 5’-metil-5-(3-butén-1-inil)-2,2’-bitiofén MS táptalaj: Murashige-Skoog (1962) táptalaj NMR: magmágneses rezonancia spektroszkópia PBT: 5-(3-pentén-1-inil)-2,2’-bitiofén PCR: polimeráz láncreakció PYE: trideka-3,5,7,9,11-pentain-1-én R2: korrelációs együttható SD: standard deviáció, szórás SFE: szuperkritikus fluid fázisú extrakció sHS: statikus gőztéranalízis SIM: szelektív ionkövetéses üzemmód SPME: szilárdfázisú mikroextrakció SSDE: szimultán vízgőzdesztilláció és extrakció TIC: teljes ionáram kromatogram VRK: vékonyréteg-kromatográfia α-T: 2,2’:5’,2”-tertiofén, α-tertiofén, α-tertienil

4

__________________________________________________Bevezetés és célkitűzések

1. Bevezetés és célkitűzések A növények által szintetizált speciális anyagcseretermékek értékes vegyületeket szolgáltatnak a gyógyszer-, kozmetikai-, élelmiszeripar és a mezőgazdaság számára. A természetes eredetű hatóanyagok iránti igény napról napra nő. A műszeres analitikai módszerek nagymértékű fejlődése újabb és újabb gyógyászatilag fontos hatóanyagok, vagy potenciális hatóanyagok feltárását teszi lehetővé. Növényi hatóanyagok előállításának céljára a hagyományos növénytermesztési eljárások mellett előnyös lehetőséget kínál a biotechnológiai módszerek alkalmazása. A totipotens növényi sejtek kontrollált laboratóriumi körülmények között fenntartott in vitro tenyészetei felhasználhatók arra, hogy „kis biokémiai üzemek” módjára, speciális anyagcseréjük révén értékes vegyületek széles körét állítsák elő. Az utóbbi évtizedekben jelentős eredményeket értek el a géntranszformációs módszerekkel előállított járulékos gyökértenyészetekkel, az úgynevezett hairy root kultúrákkal. A nem transzformált

(korábbi

időszakokban

vizsgált)

kallusz

vagy

sejtszuszpenziós

tenyészetekhez képest számos előnyös tulajdonsággal rendelkeznek. Kifejezett endogén növekedési hormon termelésük következtében hormonmentes táptalajokon intenzíven növekednek. A sejtek nagy része specializálódott, magasabb differenciáltsági szinten van, ami nagyon gyakran elengedhetetlen feltétele a speciális anyagcseretermékek magas szintű képzésének. A hairy root kultúrák speciális metabolit szintézise általában meghaladja a kallusz és sejtszuszpenziós kultúrák képességeit. Mi több, az anyagcseretermékek összetétele az intakt anyanövényhez hasonló, mennyisége sok esetben magasabb. Biokémiai potenciáljuk hosszútávon is egyenletes, kiszámítható. Miután a differenciáció következtében egyfajta szöveti strukturáltság alakul ki, a sejtek nem korlátlanul osztódnak, így a hairy root kultúrák nagyobb mértékű genetikai stabilitással rendelkeznek. A genetikailag módosított szövettenyészetekből pedig genetikailag stabil transzgén növények is regenerálhatóak. A biológiailag aktív speciális növényi anyagcseretermékek egy része bizonyítottan a külvilág káros hatásainak kivédésére szolgáló mechanizmusok fontos részét képezik. Az Asteraceae növénycsalád jellegzetes fototoxikus hatású vegyületei a poliacetilén eredetű tiofének, melyeknek mind gyógyászati, mind mezőgazdasági alkalmazása igen perspektivikusnak ígérkezik erőteljes biocid hatásuk és az ehhez

5

__________________________________________________Bevezetés és célkitűzések

kapcsolódó kedvező hatásmechanizmusok következtében. A biológiailag aktív bi- és tertiofének szintézisében a fajok közül a Tagetes patula L. (törpe bársonyvirág) magasan kiemelkedik. Ezáltal szilárd alapul szolgálhat hatékony, magas szintű tiofén termelésre képes in vitro szövettenyészetek létrehozásához. Doktori értekezésem tárgya a T. patula tiofén vegyületeinek vizsgálata az intakt növényekben és géntranszformált in vitro szövettenyészetekben. A kutatómunkám a tiofének összehasonlító analízisétől – egy produktív és stabil in vitro rendszer létrehozásán keresztül – a tioféntermelés befolyásolására, fokozására irányult. Munkánk során fontosnak tartottuk, hogy a tiofének monitorozására korunk egyik leghatékonyabb analitikai és szerkezetvizsgáló módszerét, a tömegspektrometriát alkalmazzuk. Ennek érdekében gázkromatográfiával kapcsolt tömegspektrometriás analitikai módszert kívántunk kidolgozni a tiofénvegyületek növényi mátrixból történő minőségi és mennyiségi elemzésére. Magas szintű, stabil tiofén produkciós képességgel rendelkező, jól növekedő T. patula géntranszformált hairy root kultúrák létrehozását tűztük ki célul. A legjobb növekedési és tiofén bioszintetikus potenciállal rendelkező klónok szelektálása során elengedhetetlen a speciális anyagcsere műszeres analitikai vizsgálata. A

szelektált

klónok

növekedési

sajátságainak

és

tiofén

produkciós

képességeinek részletes vizsgálata mellett a szövettenyészet bioszintetikus potenciálját az indításhoz használt intakt anyanövény tulajdonságaival kívántuk összehasonlítani. A kultúrák speciális anyagcseréjének fokozása érdekében célul tűztük ki a tenyésztési körülmények optimalizálását. A táptalaj összetételének változása a génműködés befolyásolásán keresztül hatást gyakorol a kultúrák biomassza képzésére és speciális metabolizmusára. A megfelelő alaptáptalaj kiválasztását követően fontosnak tartottuk a tiofének bioszintézisében kiemelkedő jelentőségű kénforrások, a magnéziumszulfát és szerves kénvegyületek (kéntartalmú aminosavak) hatásának vizsgálatát. A jelen értekezésben a témában közel három évtizede összegyűlt kutatási eredmények összefoglalásán túl, saját eredményeinkkel szeretnénk hozzájárulni T. patula szövettenyészetek növekedési és bioszintetikus tulajdonságainak alaposabb megismeréséhez.

6

_______________________________________________________Irodalmi áttekintés

2. Irodalmi áttekintés 2.1. A Tagetes patula L. rendszertani besorolása és elnevezése A Tagetes patula L. (törpe bársonyvirág) rendszertanilag a magvas növények törzsének zárvatermők altörzsébe, a kétszikűek osztályába, az Asteridae alosztály Asterales

(fészekvirágzatúak)

rendjének

Asteraceae

(csövesvirágú

fészkesek)

családjának Tageteae nemzetségébe tartozik. E nemzetség mintegy 50 fajt számlál, melyek az USA délnyugati részétől Argentínáig vadon előfordulnak. A legtöbb faj azonban Dél- és Közép-Mexikó területén található. Európában a XVI. századtól ismert és termesztett növények, melyek közül a T. patula mellett a T. erecta és a T. tenuifolia napjainkra már az egész világon elterjedt, kedvelt dísznövény. A ma is használatos Tagetes tudományos nevet Fuchs (1542) adta, amely Tages etruszk isten nevéből ered. A mitológia szerint Tages Jupiter unokája, abból a barázdából kelt ki, melyet egy Tarquinii határában szántó-vető ember ekéje hasított. Tőle származtatták az ősrómaiak mindazon rituális szokásokat, szertartásokat és jós jelmagyarázatokat, amelyeket az etruszkoktól vettek át. Fuchs azzal is tisztában volt, hogy a növény Amerikából származik, ezért füveskönyvében T. indica a növény neve. A magyar nyelvű munkák közül a T. patula először Melius Herbáriumában (1578) bukkant fel, mint koszorúnövény, sárga rózsa néven. Péchy (1591) borsoló vagy indiai szegfűnek fordította a nevét német forrásból. Lippay (1664) a mérgező növények közé sorolta, míg Csapó (1775) és Benkő (1783) már leírták a Tagetes és a büdöske neveket is (Szabó és Papp 1975, Margl 2002, Dános 2006). Jelenleg hivatalos magyar elnevezése Szabó és Papp (1975) illetve Dános (2006) szerint törpe bársonyvirág, azonban Priszter (1986, 1988) megemlíti az alacsony, kis, kisvirágú vagy közönséges bársonyvirág elnevezéseket is, miközben a törpe vagy apró bársonyvirág névvel a T. tenuifolia fajt illeti. A helyzetet tovább árnyalja, hogy Szabó és Papp (1975) ez utóbbi speciest nevezi kis bársonyvirágnak.

7


A

B

C

D 1. ábra. Tagetes patula L. (Asteraceae) teljes virágzási periódusban (A), virágzata (B), leveles hajtásrészlete (C) és gyökérzete (D)

2.2. A Tagetes patula botanikai leírása A faj a T. erecta és a T. tenuifolia alloploid hibridje (Margl 2002). A virágzó herba és az elkülönített növényi részek az 1. ábrán láthatóak. Az egyéves lágyszárú növénynek a kétszikűekre jellemzően főgyökérrendszere van, továbbá hajtáseredetű gyökerei is fejlődnek. Földfeletti hajtása a talajszint közelében bokrosan elágazik, kb. 20-40 cm magas. Az egész növény megdörzsölve erősen aromás szagú. A szár kissé bordás és gyakran antociános futtatású. Levelei alul keresztben átellenesek, feljebb szórtak, szárnyasan szeldeltek. A szeletek lándzsásak, fűrészes-fogas szélűek. A fonáki oldalon kiemelkedő félgömbös duzzanatok találhatók, melyek az epidermisz alatti skizogén eredetű váladéktartókat jelzik. A főtengely és az oldalágak jellegzetes fészekvirágzatban zárulnak. A virágzás a termesztett fajtáktól függően májustól az első fagyos napok beálltáig tart. A fészekörv általában hengeres, a fészekpikkelyek összenőttek (ún. involukrumot alkotnak), csak a hegyes cimpák jelzik levéleredetüket. Itt is jelentős számú váladéktartó található. A vacok lapos, ezen erednek szélen a

8


nyelves virágok (5-8), középen pedig a csövesek (10-50). Nemesített fajtáknál ezek igen változatosak, hol a nyelves virágok, hol a csöves virágok sokszorozódnak és alkotnak telt virágzatú típusokat. A virágok színében uralkodó a sárga-sárgásbarna. A nyelves virágok csak női ivarjelleget képviselnek, míg a csöves virágok hímnősek. Utóbbiak porzótája 5 tagú és a portokok – a családra jellemzően – összenőttek. E portokcsőben emelkedik ki a termő bibeszála, illetve kétágú bibéje. A termő két termőlevelű és alsóállású. Ebből 8-11 mm-es, vékony pálcika vagy orsó alakú és töve felé elvékonyodó, barnásfekete árnyalatú kaszattermés lesz. Csúcsán keskeny hengeres gallér díszíti (Dános 2006).

2.3. A Tagetes patula etnofarmakológiai jelentősége

A Tagetes fajok gyógynövényként történő használata a fajok őshazájában, Közép- illetve Dél-Amerikában, az indián lakosság körében a legsokrétűbb. Annál is inkább, mivel a modern világtól elszigetelt, zárt közösségekben a hagyományos orvoslás kiemelkedő jelentőséggel bír. A nemzetség legnépszerűbb tagjai a T. lucida, T. filifolia és a T. erecta fajok. A T. patula esetében csupán szórványos adatok állnak rendelkezésünkre. A felmérések alapján e növényeket általában enyhe felső légúti megbetegedések, így köhögés, megfázás, torokfájás, továbbá parazitafertőzések, szélgörcs és étvágytalanság esetén használják. A fajok hatása laboratóriumi körülmények között bizonyítást nyert számos légúti és emésztőrendszeri, továbbá bőrbetegség okozója, paraziták ellen és inszekticidként (Linares és Bye 1987, Cáceres és mtsai 1990, 1991, 1993a, 1993b, Girón és mtsai 1991). Magyar nyelven sajnos meglepően kevés forrásmunka áll rendelkezésünkre. E dolgozatok a T. patula vizelet- és szélhajtó, étvágygerjesztő, reumás fájdalom csillapító és antibakteriális hatásait emelik ki (Szabó és Papp 1975, Margl 2002, Dános 2006).

9


2.4. A Tagetes patula speciális anyagcseretermékei

A kártevőkkel szemben tanúsított jelentős mértékű rezisztencia és a népgyógyászati alkalmazás a növény speciális anyagcseretermékeire vezethető vissza. A növény számos vegyületet szintetizál, melyek potenciális gyógyászati és ipari felhasználását napjainkban széles körben vizsgálják. Ezek közé tartoznak a föld feletti részekben felhalmozódó illóolaj, a karotinoid származékok, flavonoidok, valamint a főként gyökérzetben akkumulálódó különböző szerkezetű kéntartalmú poliacetilén származékok. A következőkben e speciális anyagcseretermékeket kémiai szerkezetük szerint csoportosítva tárgyalom. 2.4.1. Az illóolaj terpenoid komponensei A növény föld feletti része jelentős mennyiségű illóolajat szintetizál és raktároz. A fajra jellemzőek a levéllemezek fonákján kidomborodó skizogén eredetű kiválasztó üregek,

váladéktartók,

melyek

a

fészekpikkelyek

összeolvadásából

származó

involukrumon, sőt már a fiatal csíranövény sziklevelein is megjelennek (Dános és mtsai 1988, Poli és mtsai 1995, Sacchetti és mtsai 2001). A levelek 0,2-0,6 %, a virágzat 0,04-0,1 % vízgőzdesztillációval kivonható illóolajat tartalmaz, mely főleg alifás [pl. (Z)-β-ocimén] és ciklikus (pl. limonén, terpinolén) monoterpén szénhidrogén származékok elegye. Az oxidált alkotók közül a fajra jellemzően ketonok [pl. (Z/E)-ocimenon vagy (Z/E)-tageton] fordulnak elő (2. ábra). A komponensek tekintetében az egyes források adatai gyakran ellentmondásosak. Úgy tűnik, hogy az illóolaj tartalom, illetve az összetevők aránya a termőhely földrajzi helyzete és a növény egyedfejlődése során is változik (Bicchi és mtsai 1992, Garg és mtsai 1999b, Stojanova és mtsai 2000, Krishna és mtsai 2002, Margl és mtsai 2002, Marotti és mtsai 2004, Dharmagadda és mtsai 2005, Sagar és mtsai 2005, Restello és mtsai 2009). A bársonyvirágok jellegzetes illatát, vagy szagát ezek a tartalmi anyagok okozzák.

10


H

H

limonén

terpinolén

O

O

O

(Z)-tageton

(Z)-β-ocimén

(E)-tageton

(Z)-ocimenon

β-kariofillén

O

(E)-ocimenon

2. ábra. A T. patula illóolajának fontosabb összetevői

Magyarországon elsőként Héthelyi és mtsai végezték el a hazai állományok illóolajának fitokémiai és farmakológiai vizsgálatát. A T. patula mellett a nemzetség számos

faját

vizsgálták.

Gázkromatográfiás-tömegspektrometriás

(GC-MS)

módszerekkel azonosították az illóolajok komponenseit, továbbá megállapították, hogy az illóolajok széles spektrumú, jelentős baktericid és gombaellenes hatással rendelkeztek (Héthelyi és mtsai 1986a, 1986b, 1987a, 1987b, 1987c, 1988, 1989). Dharmagadda és mtsai (2005) az illóolaj szúnyoglárvák elleni hatásosságáról számol be, mely felfedezés különösen India malária által sújtott területein igen nagy jelentőséggel bír. Garg és mtsai (1999a) a T. patula virágzatából elsőként izoláltak egy korábban ismeretlen nyíltláncú monoterpén glikozidot, melynek mennyisége a vizsgált mintákban 7,2 mg/100 g

volt.

A

2-metil-6-metilén-2,7-oktadién-1-O-β-D-glükopiranozid

szerkezetét magmágneses rezonancia spektroszkópiás (NMR) módszerekkel határozták meg (3. ábra).

11


9

5

6

7

OH 4

8 3

O OH

2 10

O

OH HO

1

2-metil-6-metilén-2,7-oktadién-1-O-β-D-glükopiranozid

3. ábra. Az újonnan izolált monoterpén glikozid szerkezeti képlete és kémiai elnevezése

Továbbá érdemes megjegyezni, hogy Héthelyi és mtsai (1988), Bicchi és mtsai (1992), illetve Margl és mtsai (2002) vizsgálatai alapján a vízgőzdesztillációval kivonható illóolaj kéntartalmú tiofénvázas komponenseket is tartalmazott. Annak oka, hogy más, e témával foglalkozó szerzők nem írták le e vegyületek jelenlétét, az lehet, hogy az általuk használt extrakciós, illetve gázkromatográfiás (GC) analitikai módszerek nem voltak alkalmasak ezeknek a relatív magas forráspontú, nem klasszikus illóolaj összetevők megbízható kimutatására. Ez a példa felhívja a figyelmet arra, hogy az általánosan használt illóolaj-analitikai módszereket megfelelő kritikai szemlélettel alkalmazzuk.

2.4.2. Karotinoid származékok A virágzat sziromlevelei jelentős mennyiségű karotinoidot tartalmaznak. A Tagetes fajokban e nyolc izoprén egységből álló tetraterpén pigmentanyagok több mint 90 %-át a 4. ábrán bemutatott lutein és a lutein-zsírsavészterek alkotják, mellettük likopin, α-, β- és γ-karotin is megtalálható (Quackenbush és Miller 1972, Vasudevan és mtsai 1997a).

12


R2

R1

R2

R1

Komponens

HO-

HO-

H3C(CH2)14COO-

H3C(CH2)14COO-

lutein helenien (lutein dipalmitát)

H3C(CH2)12COO-

H3C(CH2)12COO-

lutein dimirisztát

H3C(CH2)16COO-

H3C(CH2)16COO-

lutein disztearát

H3C(CH2)14COO-

H3C(CH2)14COO-

lutein mirisztát-palmitát

H3C(CH2)14COO-

H3C(CH2)16COO-

lutein palmitát-sztearát

4. ábra. A T. patula virágzatára jellemző karotinoid származékok

A teljes pigmenttartalom kultúrváltozatonként eltérő, és a virágzatok színével áll szoros korrelácóban. Piccaglia és mtsai (1998) megállapították, hogy a legmagasabb karotinoid tartalommal a narancs, és a sötét narancsszínű virágok rendelkeztek. Az összes pigmenttartalom a sziromlevelekben 100-500 mg/100 g értékek között mozgott, míg a csészelevelekben 132 mg/100 g volt. A komponensek közül a helenien (lutein dipalmitát) kiemelkedően magas arányban, míg szabad lutein csupán nyomokban volt jelen. A lutein a szemben, a retinán található sárgafoltban nagy koncentrációban található. A táplálékkal elfogyasztott lutein és a sárgafoltban lokalizált lutein mennyisége szorosan korrelálnak, továbbá a sárgafolt pigmentálásának növelése csökkenti az időskori látásromlás esélyeit (Berendschot és mtsai 2000, Johnson és mtsai 2000, Johnson és mtsai 2005). Magyarországon is számos étrend-kiegészítő termék és multivitamin készítmény (pl. Ocuvite Lutein®, Béres Actival Max®, Centrum A-tól Z-ig Luteinnel®) hatóanyagai között szerepel. Az intenzív sárga színe miatt széles körben használják élelmiszer színezékként. Az Európai Unióban E161b jelzéssel került forgalomba (Piccaglia és mtsai 1998). A helenien a luteinhez hasonlóan a szem sötéttel szembeni, illetve a változó fényerősséghez való alkalmazkodóképességét növeli. Így felhasználást nyerhet farkasvakságban, az időskorúak gyenge látásának javításában, illetve gépjárművezetők

13


körében (Dános 2006). Az Adaptinol® (Bayer) néven külföldön forgalmazott helenient tartalmazó készítményt öregkori gyengénlátás és farkasvakság esetén alkalmazták a szemészetben (Margl 2002). 2.4.3. Flavonoidok A virágzatban felhalmozódó másik jelentős színanyagot a sárga flavonoidok képezik. A jellemző aglikonok a kvercetagetin és a patuletin (6-metil-kvercetagetin), illetve glikozidált formájukban kvercetagitrin (kvercetagetin-7-glükozid) és patuletrin (patuletin-7-glükozid) az 5. ábrán láthatók (Vasudevan és mtsai 1997a, Dános 2006). Garg és mtsai (1999) illetve Guinot és mtsai (2008) a virágzatból 10-14 mg/100 g patuletint és 9-10 mg/100 g patuletrint izoláltak.

OH OH

R1

O

R2

OH OH

O

R1

R2

Komponens

-OH

-OH

kvercetagetin

-OH

-OCH3

patuletin

-OGlü

-OCH3

patuletrin

-OGlü

-OH

kvercetagitrin

5. ábra. A T. patula virágzatára jellemző flavonoid származékok

14


2.4.4. Alkaloidok Faizi és Naz (2002) egy különleges szerkezetű, a növényvilágban igencsak ritkán előforduló tetrahidro β-karbolin alkaloidot, a jafrint elsőként izolálta a T. patula virágzatának petroléteres kivonatából. Tömegspektrometriás, infravörös és NMR spektroszkópiás

módszerekkel

igazolták

a

molekula

szerkezetét,

melynek

különlegessége, hogy az A-gyűrűjéhez egy rövid szénhidrogénlánc szubsztituens kapcsolódik (6. ábra). Vizsgálataik során a vegyület igen instabilnak bizonyult, autooxidációt követően a C-gyűrű felnyílása 2-acetil-triptamin bomlástermékek kialakulásához vezetett.

O

H 3C

H3CO

A

C N H

H

N

CH3

CH3 O

6. ábra. Jafrin, a T. patula virágzatából izolált alkaloid szerkezeti képlete

2.4.5. Benzofuránok Egy újabb vegyületcsoport, a benzofuránok előfordulásának és jelentőségének felismerése a legutóbbi néhány évtized kutatásainak eredménye. Első izolálásukról a T. patula növényből Bohlmann és Zdero (1979) beszámolójában találkozhatunk, akik a terpénketonok mellett egy benzofurán származékot, a 6-hidroxitremetont azonosították. A faj csíranövényeiben, föld feletti és földalatti szerveiben, valamint a gyökerek

15


rizoszférájában számos származékukat (7. ábra) írták le (Sütfeld és mtsai 1985, Parodi és mtsai 1988, Margl és mtsai 2005).

O

O O

O

HO

6-hidroxitremeton

dehidrotremeton

OH

O

O

HO

O

O

euparin

izoeuparin

7. ábra. A T. patula jelentősebb benzofurán származékai A benzofuránok többsége fototoxikus tulajdonságú (Proksch és mtsai 1983). A 6-hidroxitremeton jelentős antimikróbás (Cagniant és Cagniant 1975) és HIV vírusellenes hatással rendelkezik (Piacente és mtsai 1994), a növények növekedését gátolja (Cespedes és mtsai 2002), továbbá allergizáló tulajdonságát is leírták (Hausen és Helmke 1995). 2.4.6. Tiofénvázas poliacetilén származékok A poliacetilén eredetű kéntartalmú tiofénvázas vegyületek (1. táblázat) az Asteraceae család számos, illetve a Tageteae nemzetség összes eddig vizsgált fajában előfordulnak (Bohlmann és mtsai 1973, Chan és mtsai 1975, Chan és mtsai 1979, Downum és Towers 1983, Bohlmann és Zdero 1985, Menelaou és mtsai 1991a, Dános 2006, Margl 2002). Az első természetes eredetű tiofénszármazékot, a háromgyűrűs α-tertiofént (α-T) 1947-ben a T. erecta virágzatából izolálta Zechmeister és Sease (1947). Nem sokkal ezt követően, 1959-ben, szintén a T. erecta növényből, immár azonban a gyökérzetéből izolálta a kétgyűrűs 5-(3-butén-1-inil)-2,2’-bitiofén (BBT) kémiai nevű vegyületet Uhlenbroek és Bijloo (1959).

16


1. táblázat. A Tagetes patula növényben előforduló tiofének szerkezeti képlete, relatív molekulatömege, kémiai elnevezése és a szakirodalomban használt rövidítése Szerkezeti képlet

S

Mr

Kémiai elnevezés

Rövidítés

248

2,2’:5’,2”-tertiofén, α-tertiofén

α-T

216

5-(3-butén-1-inil)2,2’-bitiofén

BBT

234

5-(4-hidroxi-1butinil)-2,2’bitiofén

BBTOH

276

5-(4-acetoxi-1butinil)-2,2’bitiofén

BBTOAc

334

5-(3,4-diacetoxi-1butinil)-2,2’bitiofén

BBT(OAc)2

230

5’-metil-5-(3butén-1-inil)-2,2’bitiofén

MeBBT

288

5-metilaceto-5’-(3butén-1-inil)-2,2’bitiofén

AcOCH2BBT PBT

S

S

C

C

CH

CH2

C

C

CH2 CH2

S

S

S

OH

S

O CH3 C S

C

CH2 CH2

O

S O CH3 CH2 C

S

C

O

CH

S

CH3 O O

H3 C

C S

C

CH

CH2

S

H3C O O

H2C

C S

CH

CH2

S

S

S

S

S

S

C

C

C

CH

C

C

C

C

C

CH2

CH

CH3

230

5-(3-pentén-1-inil)2,2’-bitiofén

C

CH3

228

5-(1,3-pentadiinil)2,2’-bitiofén

232

5-(1-pentinil)-2,2’bitiofén

CH2 CH3

S

17


Elsőként Bohlmann és mtsai igazolták a különböző szerkezetű tiofének jelenlétét T. patula szöveteiben. Munkásságuk alapozta meg e vegyületcsoport kiterjedt vizsgálatát. A négy fő tiofénkomponens, a BBT, az α-T, az 5-(4-hidroxi-1-butinil)-2,2’bitiofén (BBTOH) és az 5-(4-acetoxi-1-butinil)-2,2’-bitiofén (BBTOAc) szerkezete már 1979-ben ismert volt (Bohlmann és mtsai 1973, Bohlmann és 1979). Jelenleg a növényben előforduló ismert tiofén vegyületek száma több mint tíz. A folyamatosan fejlődő analitikai módszereknek köszönhetően már a minor komponensek, az 5-(3,4diacetoxi-1-butinil)-2,2’-bitiofén [BBT(OAc)2], az 5’-metil-5-(3-butén-1-inil)-2,2’bitiofén (MeBBT), az 5-metilaceto-5’-(3-butén-1-inil)-2,2’-bitiofén (AcOCH2BBT), és az 5-(3-pentén-1-inil)-2,2’-bitiofén (PBT), szerkezetét is sikerült felderíteni (Sütfeld és Towers 1982, Downum és Towers 1983, Héthelyi és mtsai 1988, Sütfeld 1988, Sütfeld és Breteler 1988, Tosi és mtsai 1988, Bicchi és mtsai 1992, Croes és mtsai 1994, Margl 2002, Margl és mtsai 2002). A Bicchi és mtsai (1992) által azonosított 5-(1,3pentadiinil)-2,2’-bitiofén komponenst ez idáig csupán a virágzat illóolajából sikerült kimutatni. A tiofének jelentős fototoxikus hatásuk következtében kiemelkedő vírusellenes (Hudson és Towers 1988, 1991, Towers és Champagne 1988, Hudson és mtsai 1993), antibakteriális (Chan és mtsai 1975, Towers és mtsai 1977, Hudson és Towers 1991, Hudson és mtsai 1993), antifungális tulajdonsággal rendelkeznek (Chan és mtsai 1975, Towers és mtsai 1977, Towers és Champagne 1988, Romagnoli és mtsai 1994, Mares és mtsai 2002, Mares és mtsai 2004), továbbá elpusztítják az élősködő fonálférgeket (Gommers és Bakker 1988, Kyo és mtsai 1990, Vasudevan és mtsai 1997a, Ploeg és Maris 1999, Buena és mtsai 2008). Ezen vegyületek jelentőségére való tekintettel a dolgozat

további

fejezeteiben

kiemelten

eredményeket kívánom részletesen ismertetni.

18

a

tiofénekkel

kapcsolatos

kutatási


2.5. A tiofénvegyületek megoszlása a növény szöveteiben Bőségesen állnak rendelkezésünkre kutatási eredmények a Tageteae nemzetség fajaiban

előforduló

tiofénszármazékok

jelenlétéről.

Irodalmi

adatok

alapján

megállapítható, hogy a vizsgált fajok közül tioféntartalom tekintetében a T. patula egyértelműen kiemelkedik (Bohlmann és Zdero 1979, Downum és Towers 1983, Ketel 1987, Jacobs és mtsai 1994, Talou és mtsai 1994, Massera és mtsai 1998, Gil és mtsai 2002, Margl 2002). A megfelelő minőségű és mennyiségű aktív hatóanyagot tartalmazó, feldolgozásra szánt növényi rész begyűjtéséhez elengedhetetlen az ideális gyűjtési időpont és a hatóanyagokat akkumuláló növényi szerv ismerete. Így nagy jelentőségű a növényi ontogenezis, azaz egyedfejlődés, és a speciális anyagcsere közötti összefüggések felderítése. Downum és Towers (1983) szerint a növényi szövetekben a csírázást követően kb. 80 napig

(kb. 12 hétig),

a virágzási periódusig nőtt a tiofénszármazékok

mennyisége, majd ezt követően már nem változott jelentős mértékben. A gyökérzet tioféntartalma az egész kísérlet során meghaladta a föld feletti hajtásban mért értékeket. Ketel (1987) vizsgálatai során azt találta, hogy a növény leveleiben és gyökérzetében a vizsgálati időtartam (14 hét) alatt folyamatosan nőtt a tiofének mennyisége. Tosi és mtsai (1988) a mérési adatokat nem csupán az idő, hanem a fejlődési állapot függvényében is megadták. Szerintük a virágzást megelőzően és a korai virágzási periódusban a legmagasabb a tiofénszint. Nem csupán a vegetatív szervek, hanem a virágzatok és az éretlen kaszattermések tiofén összetételét is elemezték, melyek kitűntek relatív magas tiofén akkumulációjukkal. A teljes virágzást követően a 75. naptól (11. héttől) a tioféntermelés hanyatlását írták le minden szervben. A növény ontogenezise során a BBT és BBTOAc mennyisége változott jelentős mértékben, míg az α-T és BBTOH szöveti koncentrációja nem mutatott egyértelmű összefüggést az egyedfejlődés egyes szakaszaival. Érdekes módon, a szabadföldön termesztett intakt növény tiofén profiljáról csupán szórványos adatok állnak rendelkezésünkre, a legtöbb eredményt in vitro nevelt növények vizsgálata szolgáltatja. Az említett beszámolók megegyeztek abban, hogy a

19


T. patula esetében a tiofének legnagyobb részben a gyökérzetben halmozódtak fel, azonban az egész növényben megtalálhatóak voltak. Az eredmények értékelését nehezíti, hogy a szerzők néhol friss (szárítás nélküli), másutt pedig száraz súlyra vonatkoztatva adták meg a mérési adatokat. Mennyiségük egyes szerzők szerint néhány tíz µg/g, másutt eléri a mg/g száraz tömegre vonatkoztatott értékeket is. A tiofének minőségét tekintve a gyökérzetben a BBT (80 µg/g-1,6 mg/g száraz súly), a földfeletti hajtásban a BBTOAc (20 µg/g-1.4 mg/g száraz súly) volt a domináns komponens, az α-T (5 µg/g-310 µg/g száraz súly) bár kisebb mennyiségben, ugyanakkor minden szervben jelen volt. A minor komponensek közül a BBT(OAc)2 67-94 µg/g, a BBTOH 23-29 µg/g száraz súlyra vonatkoztatott mennyiségben található meg a növényben. A jelentős mennyiségi eltéréseket számos faktor, így a vizsgált növény eltérő kultúrváltozatai, a begyűjtés időpontja, a termesztés földrajzi helye, éghajlata, a mintaelőkészítés és az analitikai mérési módszer pontossága, egyaránt okozhatja (Ketel és Breteler 1988, Sütfeld és Breteler 1988, Margl 2002). A tiofének szintézisével és akkumulációjával kapcsolatos kiválasztó rendszerek tanulmányozása során a szövettani vizsgálatok az Asteraceae családra jellemző poliacetilén-rezervoárokra hívták fel a figyelmet. Ezen struktúrák a kutatások szerint mind poliacetiléneket, jelen esetben tioféneket, mind pedig illóolajat tartalmaznak. Ezek elhelyezkedését és fejlődését az ontogenezis során Poli és mtsai (1995) igen nagy alapossággal tanulmányozták. A tiofén származékok a gyökerekben az endodermisz mellett, a földfeletti részekben pedig szabad szemmel is jól látható, egymástól elszigetelt skizogén kiválasztó üregekben helyezkednek el. A szerveken belüli szöveti lokalizációra vonatkozóan többféle vizsgálati módszerrel találkozhatunk. A tiofének eloszlásának felderítésére alkalmas vizsgálati módszer a röntgen mikroanalízis, melynek segítségével kimutatható a kén jelenléte a növényi szövetekben. Sacchetti és mtsai (2001) kén jelenlétét mutatták ki az illóolajat szintetizáló és tároló skizogén eredetű kiválasztó rendszerekben, és legfőképp magában a szekrétumban. Hasonló módszerrel mért eredmények alapján a gyökérzetben a tiofének az endodermisz és a szállítószövetek környékére koncentrálódtak (Makjanič és mtsai 1988). A levelek kiválasztó

járataiból

közvetlenül,

mikrofecskendővel

vett

minta

tandem

tömegspektrometriás vizsgálata alapján négy kéntartalmú vegyületet tartalmazott (Caniato és mtsai 1990). Érdekes módon a legjellemzőbbnek ismert tiofének, a BBT,

20


α-T és BBTOAc nem voltak kimutathatóak e mérések során. Hazánkban Dános és mtsai (1988) végezték el a T. patula leveleiben fellelhető skizogén járatok ultrastruktúrális vizsgálatát fény- és elektronmikroszkópiás technikákkal. Az üregek epitél sejtjeiben található kloroplasztiszok a bioszintézisben betöltött jelentős szerepére hívták fel a figyelmet. A fent említett vizsgálatok eredményei egyöntetűleg alátámasztják azt a feltételezést, amely szerint a T. patula kiválasztó mirigyszövetei közvetlen kapcsolatba hozhatóak a tiofénszármazékok termelésével. A tiofének növényi szövetek közötti transzportjával kapcsolatban megoszlanak a vélemények.

Jacobs

és

mtsai

(1994)

megfigyelései

szerint

ezen

apoláris

anyagcseretermékek gyökértől a földfeletti hajtásig vezető transzportja észlelhető ugyan, azonban olyan elhanyagolható mértékű, ami nem adhat magyarázatot a hipokotil szárban talált jelentős tioféntartalomra. Arra a következtetésre jutott, hogy a tiofének a szintézisük helyén halmozódnak fel, így az adott szövetre jellemzőek. Érdekes azonban, hogy Tang és mtsai (1987) vizsgálatai igazolták, hogy a növények tioféneket juttatnak ki a környezetükbe. A növények rizoszférájából GC-MS módszerekkel BBTOH-t, BBTOAc-t, sőt vízben igen rosszul oldódó BBT-t illetve α-T-t mutattak ki. Ez a felfedezés már a mezőgazdaságban történő alkalmazás lehetőségét nyitotta meg.

21


2.6. A tiofénszármazékok bioszintézise A növényi hatóanyagok produkciójának fokozására törekvő kísérletek során elengedhetetlen a hatóanyagok bioszintézisének ismerete. Az átalakítási lépéseket, a kémiai folyamatokat enzimek katalizálják, és akár ezen a szinten beavatkozva, az enzimatikus aktivitás megváltoztatásával befolyásolható a metabolit termelése, ezáltal annak mennyisége. Ennek érdekében szükséges a szintetikus utak feltérképezése, és a meghatározó lépések és enzimek megismerése. A tiofének kialakulásának fontos állomásai a szénváz bioszintézise, a kénatomok beépülését követő tioféngyűrűk kialakulása, végül az oldallánc módosítások. A kutatók már kezdettől fogva feltételezték, hogy a tiofének bioszintézise kapcsolatban állhat az Asteraceae családban igen gyakori poliacetilének képződésével. A T. patula tiofénbioszintézisének tisztázásához jelentős segítséget nyújtott a rokon fajok tanulmányozása során nyert eredmények felhasználása. A szénlánc kialakulását radioaktívan jelölt acetáttal, zsírsavakkal (olajsav) illetve glükózzal végzett kísérletek során követték nyomon. A bioszintézis kulcsprekurzora az olajsav, mely először két kettős kötéssel rendelkező linolsavvá, majd az egy kettős és egy hármas kötést tartalmazó krepénsavvá alakul. Több lépéses deszaturációs reakciók mellett a 18 szénatomos telítetlen karbonsav a karboxil végről szénatomokat veszít, és létrejön az Asteraceae családban előforduló, a természetben megtalálható legtelítetlenebb vegyületek egyike, az 5 hármas és 1 kettős kötést tartalmazó

trideka-3,5,7,9,11-pentain-1-én

(PYE)

(Bohlmann

és

Zdero

1985,

Bohlmann 1988, Flores és mtsai 1988, Jente és mtsai 1981, 1988, Menelaou és mtsai 1991b, Margl és mtsai 2001, Margl 2002). A deszaturációs lépéseket szójalipoxigenázhoz hasonló aktivitású enzim katalizálja. Egy poliacetilént előállító növényből, a Grindelia robusta fajból próbálták ezt az enzimet izolálni, azonban instabil volta miatt a kinetikai vizsgálatok elvégzésére már nem kerülhetett sor (Jente és mtsai 1988). Lee és mtsai (1998) Crepis fajokon végzett vizsgálatok során azonosították azt az enzimet, mely a linolsav krepénsavvá történő átalakítását katalizálja. A ∆12deszaturáz egy nem hem-vas típusú protein, mely nagyfokú szerkezeti homológiát mutatott a ricinusmagban található, ricinolsav szintézisében kulcsfontosságú ∆12hidroxiláz enzimmel.

22


A hazai kutatások úttörőjeként Margl és mtsai (2001) vizsgálták a BBT bioszintézisét. Kísérleti objektumként folyamatosan fenntartható T. patula in vitro gyökérkultúrákat használtak. Vizsgálataik során a növénykultúrákhoz szénizotóppal jelölt acetátot vagy glükózt adtak, majd NMR technikákkal kísérték figyelemmel az izotópok BBT-be történő beépülését. A bioszintézis során az intermedier vegyületek koncentrációja gyakran olyan alacsony, ami meggátolja közvetlen vizsgálatukat. Ebben az esetben, a feltételezett bioszintézisút igazolására a retro-bioszintetikus módszert alkalmazták, mely során az anyagcseretermék izotópmintázatát a vélt prekurzorok izotópmintázatával hasonlították össze. A prekurzorok izotópmintázatát pedig indirekt módon, a megfelelő prekurzorokhoz köthető, azonban már kellő mennyiségben izolálható aminosavak kísérletesen megállapított izotópmintázatából kapták meg (Eisenreich és Bacher 2000). Megállapították, hogy a BBT két szénatomos acetát egységekből épül fel, mi több, meghatározták azok elhelyezkedését a molekulán belül. Így bizonyítást nyert, hogy a kétgyűrűs tiofének bioszintézise szorosan kapcsolódik a zsírsavanyagcseréhez. Ezek a kísérletek sem tudtak azonban választ adni arra a kérdésre, hogy a tiofén anyagcsere poliacetilén vagy ciklikus poliketid intermediereken keresztül játszódik-e le. A kénatom beépülésének folyamata sajnos nem ismert teljes részletességében. A vizsgálatok során

35

S izotóppal jelölt szervetlen és szerves (pl. metionin, cisztein)

kénvegyületek kénatomjainak tiofénekbe történő beépülését figyelték meg. A reakciót enzimek katalizálhatják, azonban meghatározott feltételek mellett spontán is végbemehet (Schulte és mtsai 1962, Schuetz és mtsai 1965, Minto és Blacklock 2008). A feltételezett reakciómechanizmus modellezéséül alkin szénhidrogének (Schulte és mtsai 1962) valamint a PYE és a kénhidrogén reakciója szolgált (Bohlmann és Zdero 1985). A lehetséges kétlépéses folyamatot a 8. ábra szemlélteti. Ekvivalens mennyiségű PYE és H2S reakciójának eredményeképp monotiofének jönnek létre. HC R1

C

C

C

C

R2

+ H2S

R1

C

C

C

R2 R2

R1

S

S

H

8. ábra. A kén beépülése a poliacetilén alapvázba (Bohlmann és mtsai 1973)

23


Az addíció helyzete alapján elméletileg négyféle lehetséges termék képződhet, azonban az Asteraceae család fajaiból ez idáig csupán két komponens létezését igazolták. Egy további H2S addíciója a kétgyűrűs bitiofének, egy harmadiké pedig a háromgyűrűs tertiofének kialakulásához vezet (Bohlmann és mtsai 1973). A két és háromgyűrűs tiofének bioszintézise már igen korán, a PYE kialakulása után elválik egymástól (9. ábra). A kétgyűrűs származékok kialakulásának lépései jól ismertek, azonban a háromgyűrűs α-T létrejöttének pontos folyamata egyelőre nem tisztázott. A PYE kénaddíciója során létrejövő korábban már említett két potenciális termék előfordulását a Tagetes fajokban azonban még nem bizonyították mindaddig, amíg Jacobs és mtsai (1995) létrehoztak egy olyan mutáns T. erecta vonalat, melynek tiofén anyagcseréje lényegesen eltért a vad típusú fajokétól. A mutáns vonalban a feltételezések szerint a PYE demetiláz enzim inaktiválódásának következtében a 12 szénatomos tiofének teljes hiánya és a 13 szénatomos termékek felhalmozódása volt jellemző.

Továbbá

megjelent

egy

korábban

nem

ismert

származék.

A

szerkezetvizsgálatok eredményei alapján ez a molekula a bioszintézisút egyik hiányzó láncszeme, a monotiofén, 2-(3-butén-1-inil)-5-(penta-1,3-diinil)-tiofén (BPT) volt. A közeli rokonság miatt az eredmények nagy biztonsággal extrapolálhatóak a T. patula fajra. Munkájuk egyrészt, a BPT bitiofén anyagcserében betöltött, kulcsszerepére világított rá, másrészt felvetette annak lehetőségét, hogy a 12 és 13 szénatomos tiofének szintézise két egymástól független, párhuzamos anyagcsereúton megy végbe. A kétgyűrűs származékok bioszintézisútjainak további igazolása céljából az in vitro tenyésztett T. patula géntranszformált hairy root kultúrák táptalajához radioaktív

35

S

izotópjelzett tiofén prekurzorokat adagoltak, majd az izotópok termékvegyületekben történő megjelenését követték nyomon (Jente és mtsai 1981, Croes és mtsai 1994, Arroo és mtsai 1995c, Minto és Blacklock 2008). Egy további kénatom BPT-be történő beépülése két bitiofén, a 13 szénatomos MeBBT, illetve demetilációt követően a 12 szénatomos BBT kialakulásához vezet. Ezután következnek az oldallánc szubsztitúciós lépések. A MeBBT tioféngyűrűjéhez kapcsolódó metilcsoport oxidációja során jön létre a HOCH2BBT, amiből az AcOCH2BBT képződik. A másik úton a BBT 3-butén-1-inil oldalláncának modifikációja történik, mely során első lépésben a BBTOH és BBT(OH)2 keletkezik, valószínűleg epoxid köztitermékeken keresztül. Az epoxid részleges redukciója a monohidroxid, míg hidrolízise a dihidroxid változatot

24


CH H3 C

CH

(CH2)7

(H2C)7

COOH

Olajsav

CH H3 C

CH

CH

(H2C)4

CH

CH2

(H2C)7

COOH

Linolsav

CH H3 C

(H2C)4

C

C

CH

CH2

(H2C)7

COOH

Krepénsav

H3C

C

C

C

C

C

C

C

C

C

C

CH

CH2

PYE

H3 C

C

C

C

C

C

C

CH

CH2

S

H3 C

C S

C

CH

S

S

S

BPT

α-T

CH2

C

S

S

C

CH

CH2

S

MeBBT

BBT

CH2 HO

CH2

C S

C

CH

C

CH2 S

S

C

CH2 CH2

OH

C

S

HOCH2BBT

S

BBTOH

C

OH

CH

S

OH

BBT(OH)2 O O

H3 C

O

CH3 CH3

O H2 C

C S

S

AcOCH2BBT

C

CH

C

CH2 S

S

C

CH2 CH2

CH2

O

C S

BBTOAc

S

C

CH

CH3 O

BBT(OAc)2

9. ábra. A tiofének bioszintézisének hálózata; a folytonos vonallal ábrázolt nyilak az anyagcsere fő irányát jelzik (Jente és mtsai 1981, Bohlmann 1988, Croes és mtsai 1994, Arroo és mtsai 1995c, Margl és mtsai 2001, Minto és Blacklock 2008 után)

25

O

O


eredményezi. A második, konjugációs lépésben a megfelelő acetilált termékek, a BBTOAc és BBT(OAc)2 alakulnak ki. Ezek a bitiofén-acetátészterek in vivo tovább már nem metabolizálódnak, így e komponensek a bitiofének bioszintézisének inaktív végtermékei. A reakciólépéseket katalizáló számos enzim (2,2’-bitiofén specifikus észterázok és O-acetiltranszferázok) ismert. A kísérletek tanúsága szerint, a bitiofének bioszintézise során, a tioféngyűrűk kiépítésében és az oldallánc módosításokban résztvevő enzimek szubsztrátspecificitása nem túl jelentős. Irreguláris mono- és bitioféneket is elfogadnak, az acetiltranszferázok pedig, akár propionil vagy metilmalonil csoportokkal is észterezik a vizsgált bitiofén-hidroxidokat (Sütfeld és Towers 1982, Sütfeld 1988). Sütfeld (1988) feltételezi, hogy ezeknek az enzimeknek szerepük lehet egy gyorsan mozgósítható tiofén raktár kialakításában a sejtekben. Elképzelése szerint az acetilált komponensek jelentik az inaktív, raktározott formát, amiből az aktívnak tartott BBT és α-T képződhet. Ennek a megállapításnak azonban ellentmondanak Arroo és mtsai (1995c) vizsgálatának eredményei, melyek szerint a BBT-ből α-T nem szintetizálódik, illetve a bitiofén észterázok létezése ellenére, a szövettenyészetek táptalajához adagolt és a sejtek által felvett BBTOAc vagy BBT(OAc)2 vegyületek in vivo nem alakulnak át a megfelelő hidroxi vegyületekké. A tiofének bioszintézisében szerepet játszó szabályozó mechanizmusok nagy része, valamint a tiofének növényi sejtekben lejátszódó lebomlási folyamatai ez idáig feltáratlanok. A T. patula életciklusa során tapasztalt tiofén-akkumulációs változások okai is ismeretlenek.

26


2.7. A tiofének biológiai aktivitása, hatásmechanizmusa 2.7.1. Fototoxikus hatás • Fototoxicitás A furanokumarinok fotoszenzibilizáló tulajdonságainak tesztelésére Daniels 1965-ben egy új, egyszerű bioassay-t dolgozott ki, melyet növények fototoxikus tulajdonságainak kimutatására is adaptálni lehetett. Definíció szerint, akkor fototoxikus az adott vizsgálati objektum, ha hosszúhullámú UV fény (320-400 nm) besugárzás hatására nagyobb mértékben pusztítja el az adott mikroorganizmust (Daniels módszer esetén Candida albicans), mint fénybesugárzás nélkül. A sötétben mutatott toxikus hatást antibiotikus hatásnak tekintették. A furanokumarinokhoz hasonló, telítetlen kötésekben gazdag szerkezettel rendelkező, poliacetiléneket akkumuláló Asteraceae család fajai gyorsan a kutatások előterébe kerültek (Camm és mtsai 1975, Towers és mtsai 1977, Hudson és mtsai 1993). A tesztek során, a Tageteae nemzetség számos faja, köztük a T. patula is fototoxikus tulajdonságokat mutatott. A kísérleteket kezdetben a friss növényi anyaggal, majd különböző kivonatokkal, valamint izolált, tisztított növényi komponensekkel is elvégezték. A kutatók izolálták a hatékony növényi kivonatok tartalmi anyagait, és megállapították, hogy a fototoxikus biocid hatást két tiofén, az α-T és BBT váltja ki (Chan és mtsai 1975, Towers és mtsai 1977, MeckesLozoya és Gaspar 1993). Több hatásos szintetikus vagy félszintetikus tiofénanalógot állítottak elő, azonban számos növényi eredetű vegyület vizsgálata várat még magára (Hudson és Towers 1988, Hudson és Towers 1991). Ez a hatás ugyanakkor nem szelektív, bizonyos vírusokon, a Gram-pozitív és Gram-negatív baktériumokon, számos antropofil, zoofil dermatofita, fitopatogén és egyéb fonalas gombákon, valamint férgeken, rovarokon és emlős sejteken is jelentkezik. • A tiofének fototoxikus hatásának mechanizmusa A fotoszenzibilizáló vegyületek, foton adszorpciójuk során, gerjesztett állapotba kerülnek, majd más molekulával reagálva megváltoztathatják annak energiaállapotát.

27


Biológiai rendszerekben a leggyakoribb kioltó molekula az oxigén, ezért a fotoszenzibilizált folyamatokban az oxigén szerepe kiemelt jelentőségű. Abban az esetben, amikor az oxigén molekula π-lazító pályáin két párosítatlan, azonos spinnel rendelkező elektron található, triplet oxigénről, amennyiben a párosítatlan elektronok spinje egyforma, szinglet állapotról (1O2) beszélünk. Oxigénmolekula esetében a triplet állapot felel meg a stabil alapállapotnak. A fotoszenzibilizáló reakciók két típusba sorolhatóak: Az I. típusú reakciók oxigén jelenléte nélkül is végbemennek, hatásukat különböző szerkezetű, reaktív szabadgyökök közvetítik. A II. típusú reakciókat fotodinámiás reakcióknak nevezzük, melyek oxigén jelenlétében játszódnak le. Ebben az esetben a fény által gerjesztett fotoszenzibilizáló molekula energiafeleslegét az oxigénnek adja át, amely így aktív, szinglet állapotba kerül. Az ezt követő hatásokat a 1O2 és az adott biomolekula reakciója hozza létre. A 1O2, elektrofil sajátságánál fogva, főleg a kettős kötésekkel vagy elektronban gazdag funkciós csoportokkal rendelkező molekulákkal lép reakcióba. Legfontosabb feltételezett célpontjai, a sejtekben található biomolekulák közül, az aminosavak (hisztidin, metionin, triptofán), a nukleinsav bázisok (guanin) és a biológiai membránokban található telítetlen zsírsavak (α-linolénsav). Biológiai rendszerekben a szinglet oxigén enzimatikus kioltása nem ismeretes, leghatásosabb kioltói a karotinoidok, a tokoferolok és az aszkorbinsav. A

tiofének

számos

élőlénnyel

szembeni

biocid

fototoxikus

hatása

fotoszenzibilizáló tulajdonságukból ered. A vizsgálatok alapján oxigénfüggő II. típusú fotodinámiás reakciókban vesznek részt. Sajnos csupán, a hatástani eredmények alapján kiemelt, α-T esetében rendelkezünk, a gerjesztett molekulákat és azok in vitro reakciókészségét illetően, részletes információkkal. Más tiofénekre vonatkozó adataink meglehetősen szórványosak. Hosszúhullámú UV (320-400 nm) fénnyel történő gerjesztés hatására kialakuló szinglet oxigén a sejtek biológiai membránrendszerét teszi tönkre, különösképp, miután a relatíve apoláris α-T ott akkumulálódik jelentős mértékben. Alternatív célmolekuláknak tekinthetőek még a membránfehérjék, a nukleinsavak. A fotoindukált α-T által okozott DNS-szál törését is megfigyelték (Knox és Dodge 1985, Hudson és Towers 1991, Wang és mtsai 1991).

28


2.7.2. Antivirális hatás Az α-T az egyik leghatásosabb antivirális növényi anyagcseretermékek egyike. A biológiai membránnal rendelkező Sindbis vírus és a herpeszvírusok családjába tartozó egér citomegalovírus elleni aktivitása csak az UV besugárzást követően volt megfigyelhető. A hatás mértéke nagyban vírusfüggőnek bizonyult, a hatékonyságbeli különbségeket a szerzők a membránok eltérő felépítésével, illetve hiányával magyarázták. A membránnal nem rendelkező bakteriofágokra csupán nagyobb koncentrációkban fejtette ki hatását. A molekula támadáspontja mindezidáig nem pontosan ismert. Ez lehet maga a membrán, vírus RNS vagy DNS, de leginkább vírus membránfehérjék jöhetnek számításba (Hudson és Towers 1988, 1991, Towers és Champagne 1988, Hudson és mtsai 1993). 2.7.3. Baktériumok és gombák elleni hatás A BBT, az α-T és számos szintetikus tiofénanalóg kiemelkedő fototoxikus hatással rendelkezik a Gram-pozitív baktériumok esetén. A Gram-negatív törzseknél általában csökkent hatás mutatkozott, a Pseudomonas fajok pedig teljes mértékben rezisztensnek bizonyultak (Chan és mtsai 1975, Towers és mtsai 1977, Hudson és Towers 1991, Hudson és mtsai 1993). A gombaellenes hatás szisztematikus feltárása során kezdetben a BBT, az α-T és a T. patula metanolos nyers kivonatának hatását tanulmányozták. Mindegyik vizsgálati objektum a számos humán dermatofiton és fitopatogén gombafaj növekedését gátolta (Chan és mtsai 1975, Towers és mtsai 1977, Towers és Champagne 1988, Romagnoli és mtsai 1994, Mares és mtsai 2002). Mares és mtsai (2004) már, az előzőekben említett növényi termékek mellett, az izolált BBTOH hatását is vizsgálták. A mérési adatok mellett látványos transzmissziós és pásztázó elektronmikroszkópos felvételekkel dokumentálták a gombasejteken létrejövő patológiás elváltozásokat. Kísérleteik során a BBTOH több esetben az α-T-vel megegyező hatékonyságúnak bizonyult, sőt aktivitása fénybesugárzás hiányában sem csökkent. Az α-T, a BBTOH és a nyers metanolos kivonat is igen jól korreláló dózis-hatás összefüggéseket mutatott, azonban a kivonat nem haladta meg jelentősen az egyes izolált komponensek hatékonyságának mértékét.

29


Az elektronmikroszkópos felvételeken pedig nagyon jól látszott, ahogyan a gombasejtek membránrendszerei

(külső

sejtmembrán,

endoplazmatikus

membránrendszer,

sejtmagmembrán) dezorganizálódtak a kezelések hatására. 2.7.4. Élősködő fonálférgek ellen kifejtett hatás Az élősködő gyökérgubacs-fonálférgek (Meloidogyne fajok) sok kárt okoznak a melegebb éghajlatú országok mezőgazdasági haszonnövényeinek. Uhlenbroek és Bijloo (1959) szerint a T. patula aktív nematicid hatóanyaga az α-T és a BBT. A későbbi vizsgálatok során kiderült, hogy a növényi kivonat in vitro számos kórokozót elpusztít, sőt a haszonnövényekkel együtt történő szabadföldi kokultiváció is hatásosnak bizonyult. Azonban sajnos nem minden szaprofita és endoparazita fonálféreggel szemben nyilvánult meg a toxikus hatás, ami felveti annak a kockázatát, mely szerint a kezelt területen az ellenálló fajok kiszelektálódnak (Gommers és Bakker 1988, Kyo és mtsai 1990, Vasudevan és mtsai 1997a, Ploeg és Maris 1999, Buena és mtsai 2008). A hatásmechanizmussal kapcsolatos kérdések számát növelte az a megfigyelés, hogy UV fény besugárzása jelentősen megemelte az α-T in vitro nematicid aktivitását, ami azonban, talajjal keverve, a fény hiányában megszűnt. Gommers és Bakker (1988) magyarázata szerint földalatti környezetben, fény hiányában a féregfertőzést követő emelkedett peroxidáz enzimaktivitás közvetítésével alakulhatnak ki a hatásos gerjesztett állapotú tiofének. A növénytermesztői tapasztalat mindenképpen a Tagetes fajok alkalmazása mellett szól. A holland mezőgazdaságban, speciálisan e célra nemesített, T. patula fajtát (Nemanon) is alkalmaztak (Margl 2002). 2.7.5. Emlős sejtekre kifejtett citotoxikus hatás A tiofének emlős sejtekre kifejtett citotoxikus hatásának mértékéről azonban megoszlanak a vélemények. Towers és Champagne (1988) szerint a tiofének igen alacsony toxicitást mutattak egér és patkány kísérleti állatokon. Az α-T esetében mutagén vagy karcinogén sajátságot nem tapasztaltak. Tengerimalacok bőrén akut és

30


krónikus elváltozásokat okoztak, eritéma, ödéma alakult ki, és csökkent a szőrnövekedés mértéke. Más vizsgálatok során azonban az α-T UV fény hatására jelentős citotoxicitást mutatott, míg sötétben lényegesen alacsonyabb mértékű, de szignifikáns hatással bírt. A kisszámú vizsgálatok miatt azonban messzemenő következtetések nem vonhatóak le, ugyanis az in vitro teszteknél használt eltérő sejtvonalak érzékenysége jelentős különbségeket mutatott. A szerzők szerint a rágcsálók in vivo a viszonylag magas tiofén dózisokat is jól tolerálták (Hudson és Towers 1991, Hudson és mtsai 1993). Egy másik tanulmány azonban egy rokon növényből, az Echinops grijissi Hance fajból, izolált BBT, α-T és BBT(OAc)2 számottevő citotoxikus tulajdonságát állapította meg. Mi több, a vizsgált anyagok közül a BBT(OAc)2 tiofénszármazékot igen ígéretes, antitumor

hatású,

lehetséges

gyógyszermolekula-jelöltnek

választotta

(Jin

és

mtsai 2008). Hausen és Helmke (1995) eredményei a BBT és az α-T kontakt allergén hatására mutattak rá. Kasahara és mtsai (2002) ugyanakkor a T. patula virágzatából nyert metanolos kivonat gyulladáscsökkentő hatásáról számoltak be. Az extraktum egereken és patkányokon is hatásosnak bizonyult, és bár az összetétel analitikai vizsgálata hiányzott, nagy valószínűséggel tartalmazott tiofén származékokat is. Összegzésképpen elmondható, hogy a T. patula-ban megtalálható tiofének közül az α-T, a BBT, a BBTOH és a BBT(OAc)2 bizonyítottan aktív biocid hatóanyagoknak tekinthetőek, melyek a növény, kórokozó ágensekkel szembeni, kémiai védekezésének alapvető részét képezik. Esetleges humán gyógyászatban történő felhasználásukat azonban a komponensek szelektivitásának hiánya, az emlős, így vélhetően a humán sejtekkel szemben is kifejtett biocid hatásuk, továbbá az ellentmondásos toxikológiai eredmények akadályozzák meg. A növényben megtalálható számos egyéb tiofénszármazék terápiás értéke azonban egyelőre ismeretlen, így megfelelő perspektívát jelenthet a jövőbeni kutatások számára.

31


2.8. A tiofének kémiai analízise 2.8.1. A növényi minták szárítása, kezelése A

természetben

előforduló

telítetlen

poliacetilén

vegyületek

általában

meglehetősen instabil molekulák, így a kémiai analízis sikerének egyik meghatározója a minták körültekintő kezelése. A mintaelőkészítési lépések kritikus pontja a friss növényi szövetek

tartósítása

és

kezelése,

tárolása.

Az

eltérő

szárítási

körülmények

nagymértékben befolyásolják a kémiai összetevők minőségét és mennyiségét. A vizsgálatok rámutattak arra, hogy kerülni kell a magasabb hőmérsékletet és a direkt fénysugárzást, ugyanis ezek a tényezők a tiofének lebomlását okozzák. A legbiztonságosabb

a

friss

növényi

anyaggal,

vagy

mélyfagyasztott

(-80 ºC)

készítményekkel történő kíméletes extrakció, továbbá a fagyasztva szárítás. A magasabb hőmérséklet és a direkt napfény vagy UV fény hatására a BBT, BBTOAc és BBT(OAc)2 komponensek reagáltak a legérzékenyebben, mennyiségük jelentősen csökkent. Ezzel szemben a BBTOH koncentrációja ugyanezen körülmények hatására fokozatosan nőtt, így valószínűsíthetően, a helytelen mintaelőkészítés során, műtermékként is képződik (Sütfeld és Breteler 1988). Az extraktumokban végbemenő degradációs

folyamatok

vizsgálata

vékonyréteg-kromatográfiás

módszerekkel

modellezhető, ugyanis a nagy felületen finoman eloszló anyagok fokozottabban ki vannak téve a fény, oxigén és egyéb károsító tényezők hatásainak. A BBT és az α-T visszanyerhetősége közvetlenül a szilikarétegre történő felvitel után azonnal 86 és 88 %, míg 24 óra elteltével csupán 35 és 57 % volt (Lam és Thomasen 1988). 2.8.2. Tiofén-extrakciós módszerek A kutatók az utóbbi 30 évben számos kivonási eljárást fejlesztettek ki és alkalmaztak. A kivonószer apoláris vagy szemipoláris oldószer, hexán, diklórmetán, etanol,

metanol

vagy

akár

70 %-os

vizes

metanol

volt.

Leggyakrabban

szobahőmérsékleten történő áztatással extraháltak. A kivonást követően már Chan és mtsai (1979) alkalmaztak egy további tisztítási lépést is. A folyadék-folyadék extrakció során a nyers etanolos kivonatot, vízzel történő hígítást követően, petroléterrel rázták ki,

32


majd a továbbiakban a petroléteres fázissal dolgoztak. Ez a metodika szolgált alapjául a leggyakrabban használt, legkedveltebb tiofén extrakciós módszereknek, ugyanis megbízhatósága mellett nagyszerűen adaptálhatónak bizonyult az egyre gyorsabb ütemben fejlődő és elérhetővé váló kromatográfiás technikákhoz, a HPLC-hez és a GChez is. A kutatók többsége csupán apróbb módosításokkal finomította az eljárást. Sütfeld és Towers (1982) az etanolt metanolra cserélte, majd Downum és Towers (1983) a kvantitatív meghatározás pontossága érdekében a folyadék-folyadék extrakció során háromszori kirázást vezetett be. Croes és mtsai (1989b) a petrolétert hexán : terc-butil-metiléter (1:1, v/v) elegyével váltották fel, majd Margl és mtsai (2002) a metanol helyett 70 %-os metanolt használtak. A nagy változatosságú mintaelőkészítési eljárások között az illékony anyagok kinyerésére szolgáló klasszikus vízgőzdesztilláció (Bicchi és mtsai 1992, Margl 2002, Margl és mtsai 2002) mellet a szuperkritikus fluid fázisú extrakció (SFE) illetve a szimultán vízgőzdesztilláció és extrakció (SSDE) is szerepelt (Wells és mtsai 1993). A vízgőzdesztilláció során azonban egyes tiofénekre vonatkozó szelekció nyilvánult meg, amely a komponensarányokat jelentős mértékben torzította, ami az apolárisabb, illékonyabb komponensek (BBT, α-T) dominanciájában tükröződött (Margl 2002, Margl és mtsai 2002). A tiofének analíziséhez kifejlesztett kivonási eljárásokat és mérési módszereket 2. táblázat foglalja össze. 2.8.3. Tiofének nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiás (HPLC) vizsgálata A tiofének analízisében a fordított fázisú HPLC vizsgálatok használata a 80-as évektől kezdve általánosan elterjedt. A kromatográfiás elválasztást általában oktadecil (C18) szilika állófázissal töltött kolonnákon végezték, 72-85 % acetonitril- vagy 7085 % metanoltartalmú eluenssel izokratikus módszert alkalmazva. A spektrofotometriás detektálás UV tartományban, 320-350 nm hullámhosszon történt (Chan és mtsai 1979, Sütfeld és Towers 1982, Downum és Towers 1983, Norton és mtsai 1985, Croes és mtsai 1988, 1989a, 1989b, Benavides és mtsai 1993, Romagnoli és mtsai 1994, Talou és mtsai 1994, Arroo és mtsai 1995c, Mukundan és Hjortso 2001, Mares és mtsai 2004,

33


2. táblázat. Tiofénekre kifejlesztett extrakciós és mérési módszerek összefoglalása Szerzők

Kivonási eljárás

Tisztítási lépés

Mérés

Chan és mtsai (1979)

etanol

folyadék-folyadék extrakció (petroléter)

GC-MS

Sütfeld és Towers (1982) Downum és Towers (1983) Norton és mtsai (1985) Benavides és Caso (1993) Romagnoli és mtsai (1994) Talou és mtsai (1994) Arroo és mtsai (1995) Mares és mtsai (2004)

metanol


HPLC

Tosi és mtsai (1988)

metanol


HPTLCdenzitometria

Croes és mtsai (1988)

metanol

folyadék-folyadék extrakció (hexán)

HPLC

Croes és mtsai (1989)

metanol

folyadék-folyadék extrakció (hexán : terc-butil-metiléter)

HPLC

Margl és mtsai (2002)

70 %-metanol

folyadék-folyadék extrakció GC-FID (hexán : terc-butil-metiléter) GC-MS

Ketel (1988)

hexán

Nincs

HPLC

Héthelyi és mtsai (1988)

etanol

Nincs

GC-MS

Mukundan és Hjortso (2001) diklórmetán

Nincs

HPLC

Suresh és mtsai (2001)

hexán

Nincs

HPLC

Jin és mtsai (2008)

etanol

Nincs

HPLC

Bicchi és mtsai (1992)

vízgőzdesztilláció

Nincs

GC-MS GC-AES GC-FTIR

Wells és mtsai (1993)

vízgőzdesztilláció SSDE SFE vízgőzdesztilláció

Nincs

GC-FID

Nincs

GC-FID GC-MS

Margl és mtsai (2002)

AES: atomemissziós spektroszkópia; FID: lángionizációs detektor; FTIR: Fourier-transzformációs infravörös spektroszkópia; GC: gázkromatográfia; HPLC: nagyhatékonyságú folyadék-kromatográfia; HPTLC: nagyhatékonyságú vékonyréteg-kromatográfia; MS: tömegspektrometria; SFE: szuperkritikus fluid fázisú extrakció; SSDE: szimultán vízgőzdesztilláció és extrakció

34


Jin és mtsai 2008). Suresh és mtsai (2001, 2005) nem mindennapi, szokatlan, hexán : dioxán (95:5, v/v) eluenselegyet használtak a fordított fázisú HPLC mérések során. A HPLC vizsgálatok folyamán általában a négy leggyakoribb tiofénszármazék (α-T, BBT, BBTOH, BBTOAc) azonosítására és mennyiségének meghatározására került sor. Ketel (1987, 1988) ugyan a Tagetes növények és kalluszok vizsgálatakor a kromatogramokon 15 valószínűsíthető tiofénvegyületet írt le, szerkezetüket azonban nem határozta meg. 2.8.4. Tiofének gázkromatográfiás vizsgálata Az

újabb

vizsgálatok

között

mind

gyakrabban

találkozunk

a

gázkromatográfiával. A gázkromatográfia, és különösképp a kapcsolt MS és egyéb szerkezetvizsgálati technikák (AES, FTIR) alkalmasnak bizonyultak a tiofének komplex biológiai

mátrixból

történő

szerkezetvizsgálatára,

azonosítására,

mennyiségi

meghatározására. A módszer előnye nagy felbontóképességéből és igen kis mintaigényéből ered, továbbá egyszerűen kapcsolható az egyik leggyakrabban használt szerkezetvizsgálati módszerrel, a tömegspektrometriával. E méréstechnika során csak olyan

molekulák

vizsgálhatóak,

melyek

adott

hőmérsékleten

bomlás

nélkül

elpárologtathatók. A gázkromatográf készülékek meglehetősen érzékenyen reagálnak a nem illékony alkotók által okozott szennyezésekre. Az így okozott problémákat gyakran csupán

időigényes

és

költséges

karbantartással

lehet

kiküszöbölni,

ezért

a

mintaelőkészítés során különleges figyelmet kell fordítani a nyers oldószeres kivonatok tisztításának. Kezdetben a GC-MS módszereket izolált tiofénkomponensek azonosítása és tisztaságvizsgálata során alkalmazták (Chan és mtsai 1979, Ketel 1988, Romagnoli és mtsai 1994, Arroo és mtsai 1995c, Margl és mtsai 2001). Majd Margl és mtsai (2002) már kvantitatív analitikai feladatokra is a gázkromatográfiát választották. A tiofének mennyiségének meghatározására többpontos belső standard kalibrációs módszert dolgoztak ki. A minőségi analízisek tömegspektrométer, a mennyiségi meghatározás FID detektor alkalmazásával történt. A kivonatokban nyolc tiofénszármazékot azonosítottak, melyek mennyiségi változásait követték nyomon. A módszer legnagyobb hátránya, hogy polárisabb, magas forráspontú vegyületek közvetlen vizsgálatára kevésbé vagy egyáltalán nem alkalmas. Arroo és mtsai (1995c) beszámolója szerint a

35


monohidroxid származékok (BBTOH, HOCH2BBT) az analízis hőmérsékletén instabilak voltak, ezért ezen alkotók hőbomlását a vizsgálatokat megelőző származékképzéssel, acetilálással kerülték el. Összefoglalásképpen megállapítható, hogy a tiofének kvalitatív és kvantitatív kémiai analízisét a leggyakrabban HPLC módszerekkel végezték. Az utóbbi időben megjelent gázkromatográfia, különösképp a tömegspektrometriával kapcsolt technikák hatékonyabbnak bizonyultak, segítségükkel több származék egyidejű nyomonkövetése valósult meg. A mintaelőkészítés során az extrakciót többnyire egy tisztítási lépés is követte, mely eljárás nagyon jól adaptálhatónak bizonyult a gázkromatográfiás vizsgálatokhoz is. A tiofének analitikai vizsgálatai során további nehézséget okoz a standard vegyületek hiánya, hiszen kereskedelmi forgalomban csupán a szintetikus α-T szerepel. Érdemes megjegyezni, hogy az analitikai témájú publikációk nagy száma ellenére a kivonási és kromatográfiás módszerek analitikai paraméterei nem ismertek, továbbá az elemzési eredmények hihetőségének bizonyítása (validálás) sajnos meglehetősen hiányosan dokumentált.

36


2.9. Tagetes patula in vitro szövettenyésztése és tiofének termelése Az utóbbi 40 évben az értékes kémiai anyagok előállítására alkalmas in vitro növényi sejt- és szövetkultúrák vizsgálatai a kutatások középpontjába kerültek. A szeparált, jól kontrollálható, laboratóriumi körülmények között történő növényi szövettenyésztés bizonyos esetekben a szabadföldi növénytermesztés hatékony alternatívája lehet. Előnyei között szerepel, hogy független a földrajzi elhelyezkedéstől, az időjárás viszontagságaitól, az ellenőrzött körülmények miatt egyenletes termékhozam és minőség érhető el, lehetőséget teremt az anyanövényben nem található új komponensek előállítására, alkalmas biotranszformációs átalakítások elvégzésére, továbbá a genetikailag módosított szövettenyészetek ily módon történő használata ökológiai szempontokból is biztonságosabb. A lassabban osztódó, nagyméretű növényi sejtek biomassza produkciója azonban a baktériumtenyészetekéhez képest alacsonyabb szintű, a növényi sejtszuszpenziós kultúrák jelentős genetikai instabilitása és alacsony metabolit szintézise további problémákat okozott, és meg kell említeni a növényi szövettenyésztés relatív magas költségigényét is. Az utóbbi 25 év biotechnológiai fejlesztései alapján kidolgozott géntranszformált hairy root technológiákra azonban már magas szintű, stabil bioszintetikus kapacitás és jelentős genetikai stabilitás jellemző (Gyurján és mtsai 1992, Toivonen 1993, George és mtsai 2000, Giri és Narasu 2000, László és Szőke 2002, Ramachandra Rao és Ravishankar 2002, Sorvari és mtsai 2006, Tzfira és Citovsky 2006). 2.9.1. Tagetes patula kallusz-, sejtszuszpenziós kultúrák és izolált gyökértenyészetek A T. patula in vitro tenyészetek kémiai analízise során leggyakrabban a négy legismertebb tiofén, a BBT és a BBTOAc főkomponensek, illetve az α-T és a BBTOH mellékkomponensek

mennyiségi

változásait

követték

nyomon.

Kezdetben

a

differenciálatlan sejtekből álló kalluszkultúrák, és az ezekből indított sejtszuszpenziós tenyészetek kerültek előtérbe. Ketel (1988) a levélből jól fejlődő, sárgászöld, igen fragilis kallusztenyészetet hozott létre, melynek tioféntartalma meghaladta az indításhoz használt levél tiofénszintjét, azonban lényegesen alatta maradt a gyökérzetben mérhető értékeknek. A kalluszkultúrák tioféntartalma az egyes kísérletek során jelentős

37


különbségeket mutatott (0,2-74 µg/g száraz tömeg), de lényegesen, legalább két nagyságrenddel alacsonyabb volt, mint az intakt növényben mérhető értékek. Rokon fajokon (T. erecta, T. mendocina, T. minuta) is végzett kutatások eredményei igazolták, hogy a megfelelő szintű tiofén produkció előfeltétele egy bizonyos mértékű szöveti differenciáció

megjelenése.

A

spontán

organizálódó

gyökérszerű

struktúrák

kialakulásával párhuzamosan a tiofénszintézis jelentősen megemelkedett (Ketel és Breteler 1988, Croes és mtsai 1988, 1989a, Benavides és Caso 1993, Margl 2002). A magas tioféntartalmú kalluszok alkalmasnak bizonyultak tioféntermelő sejtszuszpenziós kultúrák indításához. Érdekes módon a tiofénszintézis mértéke nem függött az indító kallusz tiofénprodukciós képességétől, hanem a sejtszuszpenziós kultúra aggregációs képességével és az aggregátumok méretével arányosan változott. A tioféntermelés általában azonban lényegesen az indító kalluszra jellemző értékek alatt maradt. A tioféntermelő aggregátumok szövettani vizsgálata a centrális merisztematikus sejtek körül elhelyezkedő parenchimatikus sejtek jelenlétét igazolta. A nagyobb aggregátumokban tracheidák és kéregszövet formájában a morfológiai differenciáció erőteljesebben jelentkezett. Ez a fajta struktúráltság egy specializációs, differenciációs lépcsőnek fogható fel. A sejtaggregátumok tioféntartalma a kalluszokhoz hasonlóan jelentős szórást mutatott, értéke száraz tömegre vonatkoztatva 1-377 µg/g volt, mely azonban egy-két nagyságrenddel a növényben mért értékek alatt maradt. A táptalajba kibocsátott tiofének között a BBTOH dominált, amely egyébként a sejtekben alig kimutatható. Sajnos hosszabb kultivációs periódust (60-80 nap) követően azonban jelentős mértékben, 90 %-kal visszaesett a tenyészetek tioféntartalma (Helsper és mtsai 1988, Ketel 1988, Ketel és Breteler 1988, Margl 2002). Margl (2002) csupán nyomnyi mennyiségben azonosított tioféneket a sejtszuszpenziós kultúrákban, ezért mennyiségi meghatározásukat nem tartotta indokoltnak. A steril csíranövényekről leválasztott gyökereket hormonmentes táptalajra helyezve izolált gyökérkultúrákat kapunk. A T. patula gyökérkultúráiban az intakt növény gyökeréhez képest akár többszörösére is nőtt a tioféntartalom, amihez azonban alacsony mértékű biomassza produkció járult. A tioféntartalom kultúrváltozatonként jelentős eltérést mutatott, száraz súlyra számítva 8-200 µg/g intervallumba esett. A táptalajba történő tiofénkibocsátás ebben az esetben elhanyagolható volt (Croes és mtsai 1989b, Margl 2002, Margl és mtsai 2002).

38


2.9.2. Tiofének termeltetése Tagetes patula géntranszformált hairy root kultúrákkal A kallusz és sejtszuszpenziós tenyészetekhez képest a géntranszformált hairy root kultúrák számos előnyös tulajdonsággal rendelkeznek. A sejtek nagy része specializálódott, magasabb differenciáltsági szinten van, ami nagyon gyakran elengedhetetlen feltétele a speciális metabolitok magas szintű képzésének. Miután a differenciáció következtében a sejtek nem korlátlanul osztódnak, a hairy root kultúrák nagyobb mértékű genetikai stabilitással rendelkeznek. A biokémiai stabilitás mellett metabolitszintézisük az indításhoz használt intakt növényével összemérhető, továbbá biomassza produkciójuk meghaladja a kallusz vagy izolált gyökérkultúrákra jellemző értékeket. A genetikailag módosított szövettenyészetekből pedig genetikailag stabil transzgén növények is regenerálhatók. Az Agrobacterium rhizogenes egy Gram-negatív, pálcika alakú növénypatogén talajbaktérium, mely kóros gyökérburjánzást idéz elő. A fertőzést követően a növényi sejtek anyagcseréje megváltozik, növényi növekedési hormonok és a baktériumok nitrogénforrásának tekintett poliamin vegyületek, opinok termelése indul be. A géntranszformáció folyamata röviden a következőkben foglalható össze. Az A. rhizogenes plazmidjának (Ri-plazmid) részét képező transzfer-DNS (T-DNS) átkerül a növényi sejtbe, és stabilan integrálódik a genomban, majd járulékos gyökérképződést, úgynevezett hairy root képződést indukál. Az így létrejött hairy root kultúrák nevüket onnan kapták, hogy felületük gyökérszőrökkel sűrűn borított. A baktériummentesítést követően a folyamatosan osztódó szövetkultúrák növekedési hormon termelésük következtében hormonmentes táptalajon is intenzíven növekednek (Toivonen 1993, Giri és Narasu 2000, Ramachandra Rao és Ravishankar 2002, Tzfira és Citovsky 2006). A génátviteli mechanizmust egy rokon faj, a gyökérgolyvát okozó A. tumefaciens mediált géntranszformáció modelljén szemléltetjük (10. ábra). Norton és mtsai (1985) a T. patula szikleveléből és hipokotil szárából indított Agrobacterium tumefaciens mediált géntranszformált tumorszövetekben alacsony szintű tiofénszintézist találtak, ami ráadásul idővel egyre csökkent, a hatodik átoltásra a kezdeti érték tizedére esett vissza.

39


növényi szignálmolekulák

citoplazma

sejtmag Ti plazmid virulencia régió auxin gén

bakteriális

T-DNS citokinin gén

és növényi opin gén

receptorok

érett T-DNS-komplex

T-DNS szál éretlen T-DNS-komplex

integrálódott T-DNS

Agrobacterium

Növényi sejt

10. ábra. Agrobacterium mediált géntranszformáció modellje (Tzfira és Citovsky 2006 után); 1: az A. tumefaciens és a gazdasejt kapcsolódása; 2: a növényi szignálmolekulák beindítják a VirA/VirG kétkomponensű szignáltranszdukciós rendszert; 3: a virulencia régió aktiválódása; 4: létrejön az egyszálú T-DNS, melynek 5’-végéhez kovalens kötéssel kapcsolódik a VirD2 fehérje (éretlen T-komplex); 5: az éretlen T-komplex számos virulencia fehérjével együtt a gazdasejt citoplazmájába jut; 6: a VirE2 proteinek kapcsolódásával létrejön az érett T-komplex; 7: az érett T-komplex aktív transzport mechanizmusok segítségével a gazdasejt sejtmagjába kerül; 8: az integráció helye; 9: a kísérőfehérjék leválása a T-DNS szálról; 10: a T-DNS a gazdasejt genomjába integrálódik

A T. patula géntranszformált hairy root kultúrák intenzív növekedésüknek köszönhetően legalább egy nagyságrenddel jobb és stabil tiofénprodukcióra voltak képesek, mint az izolált gyökérkultúrák (Croes és mtsai 1989b, Breteler és Ketel 1993). Kyo és mtsai (1990) 34 hairy root klónvonalat hoztak létre, melyek α-T tartalma között akár 80-szoros különbségek (15-1268 µg/g száraz súlyra) is előfordultak. Más szerzők munkái szintén a hairy root tenyészetek tioféntermelő képességének jelentős különbségeire világítanak rá, a vizsgálatok alapján a kultúrák száraz súlyra vonatkoztatott össztiofén tartalma a 83 µg/g – 3,6 mg/g értékek közé esett (Rajasekaran és mtsai 1999, Mukundan és Hjortso 2001, Ramachandra Rao és mtsai 2001, Suresh és

40


mtsai 2001, 2005). Eredményeik a tioféntermelő sejtvonalak szelektálásának kiemelt fontosságára hívják fel a figyelmet. Annak érdekében, hogy a növényi kultúrák hatóanyag produkciója a lehető legmagasabb szintet érje el, elengedhetetlen az alkalmazott tenyésztési körülmények optimális megválasztása. Az alkalmazott táptalajok összetevői, a növekedést szabályozó anyagok, vitaminok és elicitorok hatásainak vizsgálata fontos szerephez jut a megfelelő tenyésztési rendszerek összeállításának folyamatában. A táptalaj-optimalizációs kísérletek során a kezdeti pH biomassza produkcióra és tiofén termelésre gyakorolt hatását vizsgálták. A növekedés és hatóanyag képzés tekintetében az 5,7 pH értékűre beállított táptalaj bizonyult ideálisnak (Mukundan és Hjortso 1991b, 2001, SáenzCarbonell és mtsai 1993). Bár nem hairy root kultúrák, hanem izolált gyökértenyészetek alkalmazásával, tanulmányozták a szénforrás és a tiofének szintéziséhez elengedhetetlen kénforrás hatásait (Croes és mtsai 1995, Arroo és mtsai 1997, Margl 2002). A legoptimálisabb szénforrás, a növényi szövettenyésztés során leggyakrabban alkalmazott, szacharóz. Az egyéb szénhidrátok közül csupán a glükóz és a fruktóz rendelkezett hasonló pozitív hatásokkal. A galaktóz, mannóz, szorbóz és xilóz ugyanakkor jelentős mértékben csökkentette a kultúrák növekedését és tiofénszintézisét is (Margl 2002). A különböző szervetlen kénvegyületek a biomassza produkcióra nem voltak hatással, azonban a nátrium-szulfit (Na2SO3) a tioféntermelést jelentős mértékben fokozta. Ezen hatás főként a BBT és α-T megnövekedett szintézisében nyilvánult meg. A szulfátionok jelentős szerepet játszanak a tiofénszintézis szabályozásában. Szulfátmentes táptalajon tenyésztett gyökérkultúrák tioféntartalma drasztikusan lecsökkent, míg normál szulfátkoncentrációjú táptalajra visszahelyezve a tioféntermelés csak fokozatosan állt vissza a kontroll értékre. Ez a restaurációs folyamat az mRNS szintézist gátló kordicepin hozzáadásával volt felfüggeszthető. A szulfát hatására tehát fehérjeszintézis indult be, valószínűsíthetően a tiofének bioszintézisében jelentős egyik enzim vagy enzimek de novo felépülése történt meg (Croes és mtsai 1994, Arroo és mtsai 1997). A kéntartalmú szerves vegyületek közül két természetes aminosav, az L-cisztein és L-metionin, is hatékony kénatom donornak bizonyult (Schulte és mtsai 1962, Schuetz és mtsai 1965, Jente és mtsai 1981, Minto és Blacklock 2008). A növényi szövettenyészetek a táptalajhoz adott aminosavakat bár csekély mennyiségben

41


(maximum 1 %), ugyanakkor a koncentrációval arányos mértékben képesek felvenni. Ismeretes, hogy az aminosavak gyakran már kis koncentrációban (pl. metionin 1 mg/l koncentráció alatt) is jelentősen gátolják a kultúrák növekedését (Maróti 1976). A T. patula szövettenyészetek biomassza képzésére és tiofén anyagcseréjére kifejtett hatásukra vonatkozó kutatási eredmények sajnos nem állnak rendelkezésünkre. Más szerkezetű, kéntartalmú speciális metabolitokat, a glükozinolátokat szintetizáló Tropaeolum majus L. (kerti sarkantyúka) géntranszformált hairy root kultúráinak glükotropeolin tartalma és produkciója L-cisztein kezeléssel fokozható volt, és a beavatkozás a tenyészetek biomassza produkcióját sem csökkentette jelentős mértékben (Wielanek és Urbanek 1999, 2006). A növényi hormonok, növekedési regulátorok (indolecetsav, indolvajsav, naftilecetsav) az izolált gyökérkultúrák és a transzformált hairy root tenyészetek biomassza képzését egyaránt fokozták, azáltal, hogy jelentős mértékben növelték a laterális gyökérágak számát. Ezzel együtt azonban a kultúrák tioféntartalma számottevően csökkent (Croes és mtsai 1989b, Arroo és mtsai 1995b, Margl 2002). A megvilágítás hatására a biomassza és az össztiofén produkció lecsökkent, továbbá a tiofénösszetétel is megváltozott. A vizsgálatok a BBT tartalom jelentős csökkenésére, és a BBTOAc mennyiségének emelkedésére mutattak rá (Mukundan és Hjortso 1991a, 2001). Megemlítendő egy, a fény szerepének vizsgálata kapcsán tapasztalt jelenség, mely szerint a T. patula hairy root kultúrák fényen megzöldültek, a szövetekben fotoszintézisre képes, normális morfológiájú kloroplasztiszok alakultak ki (Flores és mtsai 1988, 1993). Az

elicitálás

vagy

indukált

hatóanyagtermelés

a

növényi

védekező

mechanizmusok működésén alapuló, a speciális anyagcseretermékek képződésének fokozására széleskörűen használt módszer. A leggyakrabban alkalmazott elicitorok kórokozó gomba és baktérium hidrolizátumok, kivonatok voltak. Kísérleteket végeztek továbbá algahidrolizátumok, a növényi védekező mechanizmusokban szerepet játszó jelátvivő vegyületek (jázmonsav, linolénsav), poliaminok (putreszcin, spermidin, spermin)

és

szervetlen

fémsók

(kalcium és vanádium)

elicitorként

történő

alkalmazásával is. A közölt analitikai eredmények összességükben 160-374 % tiofénszint növekedésről számoltak be (Flores és mtsai 1988, Mukundan és

42


Hjortso 1990, 2001, Buitelaar és mtsai 1992, 1993, Arroo és mtsai 1995a, Rajasekaran és mtsai 1999, Bais és mtsai 2000, Ramachandra Rao és mtsai 2001, Margl 2002). A speciális anyagcseretermékek mennyiségének fokozására kedvező lehetőséget kínál a géntranszformált hairy root kultúrák bioreaktorban történő tenyésztése. Az összekapaszkodó gyökércsomókból álló, tömött szerkezetű szövetek növekedésének nyomon

követése

vezetőképességének

csupán és

indirekt

módszerek

ozmolaritásának

alkalmazásával,

mérésével

valósítható

a meg.

tápközeg Hamar

nyilvánvalóvá vált, hogy a klasszikus mechanikus kevertetésű, impelleres bioreaktorok a hairy root kultúrák esetében nem használhatóak. Számos új reaktormodell vizsgálatára került sor, melyek közül az úgynevezett „akusztikus mist bioreaktor” teljesítménye egyértelműen kiemelkedett. E reaktortípus esetében a tenyészetek a tápközeg fölé vannak rögzítve, miközben levegőben finoman porlasztott tápoldat „ködöt” juttatnak rá, ami a szöveteken lecsapódik, a felesleg pedig lecsepeg. A konstrukció hatékonysága vélhetően abból adódik, hogy a növényi biomasszát a tápközeg csupán egy keskeny folyadékfilmként veszi körül, ahol a gáz-folyadék fázishatáron keresztüli anyagátadási folyamatok a lényegesen nagyobb felület következtében hatékonyabban játszódnak le. A legmagasabb tiofénprodukciót (2,01 mg/l; a tápközeg térfogatára vonatkoztatva) itt nem a sejtek magas tioféntartalma, hanem az igen jelentős biomassza növekedés okozta (Gyurján és mtsai 1992, Suresh és mtsai 2001, 2005, Kim és mtsai 2002, Sorvari és mtsai 2006). Komoly gondot okoz, hogy az apoláris karakterű tiofének a tápközegbe nem oldódnak ki jelentős mennyiségben. Így csupán a kevésbé hatékonyan üzemeltethető, szakaszos üzemű fermentációval lehet a tioféneket előállítani. Buitelaar és mtsai (1991) a tiofének folyékony tápközegbe történő kibocsátását egy kétfázisú folyadéktartalmú bioreaktorban történő tenyésztéssel, in situ extrakció megvalósításán keresztül kívánták növelni. A tápközeghez 5 % szerves oldószert adtak, melyek közül a hexadekán és a Fluorinert® FC-40 polifluorokarbon a növekedést és a tiofénprodukciót nem gátolta, ugyanakkor a teljes tioféntartalom 30-70, illetve 10-20 %-a a megfelelő szerves oldószerben dúsult fel. Egy későbbi munkájuk során egy szilárd adszorbens, a XAD-7 poliakrilát gyanta alkalmazásával elérték, hogy a sejtek által szintetizált tiofének 50 %-a a tápközegbe került (Buitelaar és mtsai 1993). Ezek az eredmények lényeges előrelépést jelentenek a gazdaságos in vitro tioféntermelés megvalósításához vezető úton.

43

________________________________________________________Anyag és módszer

3. Anyag és módszer 3.1. Növényi anyag 3.1.1. Az intakt növények A vizsgált Tagetes patula L. (Asteraceae) növény szaporítóanyaga Murau-ból, Ausztriából származik. A növényeket Magyaratádon (északi szélesség: 46º 27’ 35,47”, keleti hosszúság: 17º 54’ 05,19”) neveltük, a szabadföldi magvetést márciusban végeztük. A növényeket augusztusban, a teljes virágzási periódusban, gyűjtöttük be. Az egyes növényi részeket (gyökérzet, levél és virágzat) izoláltuk, mosással tisztítottuk, majd szobahőmérsékleten, fénytől védve, jól szellőző helyen szárítottuk. A botanikai azonosítás a Semmelweis Egyetem Farmakognózia Intézetében történt, ahol elhelyeztük a vizsgálati ellenmintákat. A minták porítása és szárítási veszteségének meghatározása közvetlenül a vizsgálatok előtt történt. 3.1.2. In vitro, géntranszformált hairy root kultúrák 3.1.2.1. Géntranszformáció Steril csíranövények létrehozásához a T. patula kaszatterméseinek felszínét biocid oldattal (30 mg/100 ml etil-higany-klorid és 60 mg/100 ml cetil-piridin-klorid) csíramentesítettük, steril desztillált vízzel háromszor leöblítettük, majd szilárd MS (Murashige és Skoog 1962) táptalajra helyeztük, és sötétkamrában csíráztattuk. A genetikailag módosított hairy root kultúrák létrehozásának céljából a steril csíranövényeket Agrobacterium rhizogenes R-1601 és A4Y baktériumtörzsekkel fertőztük, mikroinjektálás technikát alkalmazva. A géntranszformációhoz felhasznált agrobaktérium törzseket YMB (Hooykaas és mtsai 1977) táptalajon tenyésztettük, és a virulencia fokozása érdekében a fertőzés előtt 3 nappal frissen készített YMB táptalajra (3. táblázat) oltottuk át.

44

________________________________________________________Anyag és módszer

3. táblázat. A szilárd YMB táptalaj összetétele Összetevők

Koncentráció (g/l)

K2HPO4 . 3 H2O

0,6550

MgSO4 . 7 H2O

0,20

NaCl

0,10

mannit

10,0

élesztő kivonat (Difco)

0,40

agar

20,0

pH = 7,0

A baktériumtenyészetbe mártott steril tűvel sebeztük meg a 2-3 hetes, kb. 23 cm-es növénykék hipokotil szárát. Az 1-2 hét múlva a sebzés helyén megjelenő járulékos

gyökérképződményeket,

azaz

hairy

root

klónokat

izoláltuk,

majd

baktériummentesítés céljából antibiotikum tartalmú (1,00 g/l ampicillin és 0,25 g/l cefotaxim) szilárd MS táptalajra helyeztük. A klónok tenyésztését az antibiotikum tartalmú táptalajon addig folytattuk, míg azok baktériummentessé váltak (3-4 átoltás). A továbbiakban 35 ml 2 % szacharóz és felére csökkentett nitrogén tartalmú folyékony MS (1/2 NMS) táptalajt tartalmazó 100 ml-es Erlenmeyer lombikban, klimatizált inkubáló készülékben (Certomat BS 4, B. Braun Biotech International, Melsungen, Germany), 100 rpm horizontális rázási sebességgel, fénymegvonás mellett, 22±1 ºC hőmérsékleten, 3-4 hetes átoltási periódusokkal tenyésztettük (Kuzovkina és mtsai 1996). A klónszelekciós kísérletekhez 3 hetes kultúrákat gyűjtöttünk be. A növekedésdinamikai és táptalaj-optimalizációs kísérletek során a kultúrákat 80 ml folyékony 1/2 NMS táptalajt tartalmazó 200 ml-es Erlenmeyer lombikokban tenyésztettük. A kémiai analízishez a növényi anyagot a 4. hét végén gyűjtöttük be. A kultúrákat több mint 4 éven át folyamatosan fenntartottuk. Szilárd MS táptalajon kizárólag fenntartási célból kultiváltuk.

45

________________________________________________________Anyag és módszer

3.1.2.2. A Tagetes patula hairy root kultúrák tenyésztésének kísérleti körülményei • Klónszelekciós kísérletek A klónszelekciós kísérletek során 1,5 g friss súlyú T. patula hairy root kultúrát 35 ml folyékony 1/2 NMS táptalajba oltottunk. A sötétben nevelt kultúrákat (Certomat BS 4, 100 rpm, 22±1 ºC) a kémiai analízishez 3 hetet követően gyűjtöttük be (párhuzamos minták száma: n = 15). • Növekedésdinamikai kísérletek 1,5 g friss súlyú #TpA6 jelű hairy root klónt oltottunk 80 ml folyékony 1/2 NMS táptalajba. A kultúrákat 7 hétig sötétben (Certomat BS 4, 100 rpm, 22±1 ºC) tenyésztettük és az analitikai vizsgálatokhoz hetente gyűjtöttük be a növényi anyagot (párhuzamos minták száma: n = 6). • Az optimális alaptáptalaj kiválasztása Az optimális alaptáptalaj kiválasztásának érdekében a #TpA6 jelű hairy root klón 2 g friss súlyú inokulumait 80 ml folyékony B5 (Gamborg és mtsai 1968), MS (Murashige és Skoog 1962) és 1/2 NMS (Kuzovkina és mtsai 1996) táptalajba oltottuk, a kultivációt sötét körülmények között (Certomat BS 4, 100 rpm, 22±1 ºC) 4 hétig folytattuk (párhuzamos minták száma: n = 10). A tápközegek összetételét a 4. táblázatban foglaltuk össze. • A MgSO4 tartalom módosítása A folyékony 1/2 NMS tápközegben nevelt #TpA6 jelű hairy root klón (2 g friss súlyú inokulum) esetében a tápközeg MgSO4 tartalmának a szövettenyészetek növekedésére és tiofén tartalmára kifejtett hatását vizsgáltuk. A tápközeg 0; 370 (az 1/2 NMS

táptalaj MgSO4 koncentrációjának felel

46

meg); 600 és 1600 mg/l

________________________________________________________Anyag és módszer

koncentrációban tartalmazta a magnéziumsót. A tenyésztést sötétben (Certomat BS 4, 100 rpm, 22±1 ºC) 4 hétig folytattuk (párhuzamos minták száma: n = 7). 4. táblázat. A B5, MS és 1/2 NMS tápközegek összetétele B5 Makroelemek NH4NO3 (NH4)2SO4 KNO3 CaCl2 . 2 H2O MgSO4 . 7 H2O KH2PO4 NaH2PO4

MS

1/2 NMS

Koncentráció (mg/l) 134 2500 150 250 150

1650 1900 440 370 170 -

825 950 440 370 170 -

3 13,2 2 0,75 0,25 0,025 0,025 28 -

6,2 22,3 8,6 0,83 0,25 0,025 0,025 27,85 37,25

6,2 22,3 8,6 0,83 0,25 0,025 0,025 27,85 37,25

100 1 1 10,0 5,7

100 0,5 0,5 0,1 5,7

100 0,5 0,5 0,1 5,7

Mikroelemek H3BO3 MnSO4 . 4 H2O ZnSO4 . 4 H2O KI Na2MoO4 . 2 H2O CuSO4 . 5 H2O CoCl2 . 6 H2O FeSO4 . 7 H2O Fe-kelát Na2-EDTA . 2 H2O Vitaminok Inozit Nikotinsav Piridoxin . HCl (B6) Tiamin . HCl (B1) pH

• Kéntartalmú prekurzor aminosavak hatásának vizsgálata Cisztein és metionin folyékony 1/2 NMS táptalajhoz történt hozzáadásával vizsgáltuk ezen aminosavak #TpA6 jelű hairy root klón (2 g friss súlyú inokulum) növekedésére és tiofén tartalmára gyakorolt hatásait. Az előkísérletek során 1,0 mM

47

________________________________________________________Anyag és módszer

aminosavat tartalmazó tápközegben 4 hétig tenyésztettük a kultúrákat (Certomat BS 4, sötét, 100 rpm, 22±1 ºC). A későbbiekben az aminosavat a 2. héten adtuk a táptalajhoz olyan mennyiségben, hogy koncentrációja 0,1; 0,6 és 1,0 mM legyen. A kontroll csoportnak az aminosav mentes táptalajban tenyésztett kultúrákat tekintettük. A steril desztillált vízzel készített aminosav oldatokat 0,2 µm pórusátmérőjű Sartorius Minisart membránszűrőn keresztül adagoltuk a táptalajhoz. A beavatkozást követően a tenyésztést további 2 hétig folytattuk (párhuzamos minták száma: n = 6). 3.1.2.3. A kultúrák növekedési aktivitásának jellemzése • Friss súly meghatározása A szövetek leoltási és begyűjtési friss súlyának (g) meghatározása analitikai mérlegen (Mettler AE 240) történt, 2 tizedes jegynyi pontossággal. A leoltási friss súly meghatározásához a tápközeget tartalmazó lombikokat közvetlenül az átoltást megelőzően és azt követően lemértük. Az értékek különbségéből számítással határoztuk meg a leoltási friss súly értékét. Begyűjtést követően a táptalaj maradékát desztillált vízzel mostuk le a kultúrákról, majd papírvattán történt leitatása után mértük meg a begyűjtési friss súly értékét. • Száraz súly meghatározása A szövetek száraz súlyának (g) meghatározása a fentiekhez hasonlóan analitikai mérlegen történt, 4 tizedes jegynyi pontossággal, fagyasztva-szárítást (liofilizálást) követően,

melyet

Christ

Alpha

1-4

típusú

készülékben

(Martin

Christ

Gefriertrocknungsanlagen, Osterode am Harz, Germany) végeztünk. A leoltási száraz súly számításánál a leoltott tenyészetek szárazanyag tartalma szolgált alapul.

48

________________________________________________________Anyag és módszer

• Szárazanyag tartalom meghatározása A szárazanyag tartalom számításához az inokulum friss és liofilizált száraz súly értékeit vettük figyelembe. Az értékeket az aktuális friss súly százalékában adtuk meg (%). • Relatív növekedési (GV) érték számítása A növekedés mértékét a száraz súlyra vonatkoztatott relatív növekedési érték (GV) reprezentálta, mely a kísérletek során a begyűjtött (mb) és a leoltott (m0) kultúrák tömegének különbsége, valamint a leoltott (m0) tömeg hányadosa: GV = (mb-m0)/m0. 3.1.2.4. A géntranszformáció igazolása hairy root kultúrákban PCR technikával • A növényi DNS izolálása és tisztítása A növényi DNS izolálása Promega Wizard® Genomic DNA Purification Kit (Madison, WI, USA) segítségével történt. A sejtek feltárását dörzsmozsárban végeztük, 0,1 g friss hairy root mintát folyékony nitrogénben (-196 ºC) porítottunk el. Az így előkészített növényi anyagot Eppendorf csövekbe helyeztük, hozzáadtunk 600 µl Nuclei Lysis oldatot és 1-3 másodpercig homogenizáltuk (vortex), majd 15 percig 65 ºC hőmérsékleten inkubáltuk (DNS kivonás). A lizátumhoz 3 µl RNase oldatot adtunk, majd óvatos összerázás után 37 ºC hőmérsékleten 15 percig inkubáltuk (RNS emésztés). Miután a minta szobahőmérsékletre hűlt (kb. 5 perc), 200 µl Protein Precipitation oldattal elegyítettük (fehérjék kicsapása), és 20 másodperces erőteljes homogenizálást (vortex) követően 5 percig centrifugáltuk 12000 rpm fordulatszámon (fehérjék és sejttörmelékek eltávolítása). A DNS-tartalmú felülúszót 600 µl izopropanolt tartalmazó Eppendorf csőbe pipettáztuk (DNS kicsapása). Centrifugálást követően (2 perc, 12000 rpm) a felülúszót dekantáltuk, a maradékhoz 600 µl 70 %-os etanolt adtunk. Óvatos homogenizálást, majd újbóli centrifugálást (2 perc, 12000 rpm) követően a felülúszót

ismételten

óvatosan

dekantáltuk,

49

majd

az

izolált

DNS-pelletet

________________________________________________________Anyag és módszer

szobahőmérsékleten 15 percig szárítottuk. A DNS rehidrálása 100 µl DNA Rehydration oldattal történt 4 ºC hőmérsékleten 24 órán át. Az így izolált DNS oldatot 2-8 ºC hőmérsékleten, hűtőszekrényben tároltuk. • A bakteriális plazmid izolálása és tisztítása Az A. rhizogenes A4Y törzs plazmid DNS izolálása és tisztítása a QIAGEN Plasmid Mini Kit (Hilden, Germany) segítségével történt. Az izolálást megelőzően a baktériumtörzset frissen készített, 2-3 ml agarmentes folyékony YMB táptalajra oltottuk és 6 napig sötétben, rázóasztalon (140 rpm), 24±2 ºC hőmérsékleten kultiváltuk. A baktérium szuszpenzió 1,5 ml-es részletét Eppendorf csövekbe helyeztük, és 10000 rpm fordulatszámon 15 percig centrifugáltuk. A táptalaj óvatos dekantálását követően 0,3 ml RNase A-t tartalmazó Buffer P1 oldatban reszuszpendáltuk a baktérium-pelletet. 0,3 ml Buffer P2 oldat hozzáadását követően az elegyet 5 percig szobahőmérsékleten inkubáltuk, majd 0,3 ml lehűtött Buffer P3 oldat hozzáadása után a mintát 5 percre jégre (0±1 ºC) helyeztük (fehérjék kicsapása). Centrifugálást (10 perc, 10000 rpm) követően a felülúszó részt egy előzetesen 1 ml Buffer QBT oldattal ekvilibrált QIAGEN-tip 20 anioncserélő műgyanta oszlopra pipettáztuk. A plazmid DNS tisztításának érdekében az oszlopot 4×1 ml Buffer QC oldattal mostuk, majd 0,8 ml 65 ºC hőmérsékletű Buffer QF oldattal egy tiszta Eppendorf csőbe eluáltuk. A tisztított frakcióból a plazmid DNS-t 0,6 ml izopropanol hozzáadásával csaptuk ki. Centrifugálást (30 perc, 10000 rpm) követően a felülúszót óvatosan dekantáltuk, majd 1 ml 70 % etanol hozzáadásával mostuk és újból centrifugáltuk (5 perc, 12000 rpm). Az alkoholt óvatosan dekantáltuk, majd a DNS-t szobahőmérsékleten 5 percig szárítottuk. Az izolált plazmid DNS-t 200 µl TE pufferban oldottuk, majd 2-8 ºC hőmérsékleten, hűtőszekrényben tároltuk. • A minták előkészítése és vizsgálata PCR technikával A rol B gén és man 2 gén amplifikálásához tervezett primerek (rol B: 5’TACTGCAGCAGGCTTCATGCA-3’ és 5’-GCTTTCCCGACCAGAGACTG-3’ és man 2: 5’-GCGCATCCCGAGGCGATG-3’ és 5’-AGGTCTGGCGATCGCGAGGA3’) liofilizátumait (Invitrogen Co., Carlsbad, CA, USA) 13000 rpm fordulatszámon

50

________________________________________________________Anyag és módszer

1 percig centrifugáltuk (Jouanin 1984, Slightom és mtsai 1986, Fu és mtsai 2005), majd steril desztillált vízben oldottuk. A PCR vizsgálatokhoz 10 µM-os munkaoldatokat használtunk. A minták előkészítését aszeptikus lamináris áramlású fülkében (BDK UVF 6.09, BDK Luft- und Reinraumtechnik GmbH, Sonnenbühl, Germany) végeztük. Az alkalmazott DNS nélküli összetevők (PCR Mix): 7,25 µl steril desztillált víz, 5 µl 10×Taq puffer, 1,5 µl 50 mM MgCl2, primerekből 2,5-2,5 µl, 1 µl dezoxi-nukleotidtrifoszfát (dNTP) mix és 0,25 µl DNS polimeráz (Taq DNA Polymerase). A fenti oldathoz (20 µl) adtunk 20 µl tisztított DNS-t tartalmazó oldatot és 10 µl steril desztillált vizet (összesen 50 µl). A polimeráz láncreakciót Bio-Rad iCycler Thermal Cycler 3.021 (Hercules, CA, USA) készülékben végeztük el: denaturáció 95 ºC-on 1 percig, primerek hibridizálása 60 ºC-on 1 percig, DNS szál szintézise 72 ºC-on 1 percig, mindhárom lépés 30 cikluson át ismételve. A PCR termékeket agarózgél elektroforézis segítségével vizsgáltuk és méretük alapján azonosítottuk a keletkezett fragmenseket (rol B: 862 bp és man 2: 513 bp). A 2 % agaróz gélre (1,32 g agaróz és 66 g TBE puffer) 30 µl mintát, illetve 5 µl Sigma DNA Marker (50-10000 bp) oldatot vittünk fel. A kifejlesztés 100 V konstans cellafeszültség mellett 60 percig történt. A festés 5 µg/ml etidium-bromid tartalmú TBE pufferben történt hűtőszekrényben 15 percig, majd a gélt 15 percig desztillált vízben áztattuk. A kiértékelést UV fényben (λ=312 nm), BTS-20.M transzilluminátor (AQUATERRA Lab Kft., Veszprém, Magyarország) alkalmazásával végeztük. Az UV fény hatására a narancssárga színnel fluoreszkáló DNS-etidium-bromid komplex jól látható a gélben.

51

________________________________________________________Anyag és módszer

3.2. Kémiai reagensek Az analitikai standard anyagokat (2,2’:5’,2”-tertiofén, 2,2’-bitiofén, valamint az n-alkán és Grob standard elegyek), aminosavakat (L-cisztein és L-metionin), antibiotikumokat (cefotaxim és ampicillin), a Gamborg’s B5 és Murashige és Skoog alaptáptalajokat, illetve a terc-butil-metilétert, DirectLoadTM Wide Range DNA Marker oldatot, etidium-bromid oldatot, TBE puffert és a DNáz, RNáz és proteáz mentes steril desztillált vizet a Sigma-Aldrich-tól (Saint Louis, MO, USA) szereztük be. A n-hexán és a HPLC tisztaságú kloroform a Carlo Erba-tól (Milan, Italy) származik. A vizsgálatokhoz Millipore Direct-QTM5 (Millipore, Billerica, MA, USA) készülékkel 0,2 µm pórusátmérőjű szűrőn tisztított ionmentes vizet használtunk. A felsorolásban nem szereplő valamennyi oldószer és reagens analitikai tisztaságú volt és a Reanal Finomvegyszergyár Rt-től (Budapest, Magyarország) került beszerzésre. 3.3. Tagetes patula speciális anyagcseretermékeinek vizsgálati módszerei 3.3.1. Mintaelőkészítési és extrakciós módszerek 3.3.1.1. Vízgőzdesztilláció A friss növényi anyagot desztillált vízben turmixgéppel (HOMOGENIZER type 302), a légszáraz mintákat darálóban aprítottuk. Az illékony komponenseket módosított Clevenger készülékkel 3 órás vízgőzdesztillációval vontuk ki a növényekből. Az eljárás során 3 ml n-pentán vagy n-hexán segédfázist alkalmaztunk. A művelet befejeztével a szerves oldószert a kohobációs víztől elválasztottuk, majd szobahőmérsékleten fénytől védve bepároltuk. A bepárlási maradékot gravimetriásan mértük (Szőke és mtsai 2009). Ezt követően a mintákat 0,5 vagy 1,0 ml n-hexánban oldottuk és hűtőszekrényben 5 ºC hőmérsékleten tároltuk.

52

________________________________________________________Anyag és módszer

3.3.1.2. Statikus gőztéranalízis (sHS) Az analíziseket CTC Combi PAL (CTC Analytics AG, Zwingen, Switzerland) többfunkciós automata mintaadagolóval végeztük. A 0,5 g porított légszáraz növényi anyagot 20 ml-es headspace (HS) üvegekbe mértük be. A minta feletti légtérből 2,5 mles gáztömör fecskendővel (Gerstel GmbH & Co. KG, Mülheim an der Ruhr, Germany) 250 µl gőzmintát vettünk 15 perces 25 vagy 60 ºC hőmérsékleten történt termosztálást követően. A fecskendő hőmérséklete 70 ºC volt, tisztítását inert hélium vivőgáz 5 perces átfúvatásával végeztük. 3.3.1.3. Szilárdfázisú mikroextrakció (SPME) Az analíziseket CTC Combi PAL (CTC Analytics AG, Zwingen, Switzerland) többfunkciós automata mintaadagolóval végeztük. A 0,5 g porított légszáraz növényi anyagot 20 ml-es HS üvegekbe mértük be. Az SPME extrakciót 65 µm PDMS/DVB (poli-dimetil-sziloxán/divinil-benzol) bevonattal rendelkező Stableflex szilika szállal (Supelco, Bellefonte, PA, USA) végeztük. Öt perces inkubációs időt követően az extrakciót a minta feletti légtérből 25 vagy 60 ºC hőmérsékleten 10 percig végeztük. Az adszorbens szálat közvetlenül a GC készülék injektorába juttattuk, ahol a magas hőmérsékleten pillanatszerűen végbement a deszorpció (1 perc deszorpciós idő 250 ºC hőmérsékleten).

Az

SPME

szálat

szálkifűtő

egységben

tisztítottuk,

250 ºC

hőmérsékleten inert nitrogéngáz befúvatása közben 15 percig. 3.3.1.4. Szuperkritikus fluid fázisú széndioxid extrakció (SFE) Az SFE kivonatokat ISCO SFX 2-10 (Teledyne Isco, Lincoln, NE, USA) kísérleti laboratóriumi szuperkritikus extraktor készülékkel állítottuk elő. A légszáraz porított minták (0,3 g, részecskeméret: 0,6-0,7 mm) kivonását széndioxiddal 40 ºC hőmérsékleten és különböző nyomáson (10, 20, 30 vagy 40 MPa) végeztük, szerves módosító nélkül, illetve 20 % metanol szerves módosító alkalmazásával. A szuperkritikus fluidummal 30 percig statikus, ezt követően 60 perces dinamikus (fluidum átlagos áramlási sebessége: 0,6 ml/perc) extrakciót végeztünk. A kivonatokat

53

________________________________________________________Anyag és módszer

5 ml metanolban fogtuk fel, majd a GC-MS vizsgálatokat megelőzően bepárlást (csökkentett nyomás, 40 ºC) követően HPLC tisztaságú kloroformban oldottuk. 3.3.1.5. Oldószeres extrakció • GC-MS analitikai vizsgálatokhoz A légszáraz növényi anyagot (0,5-1,0 g) közvetlenül az oldószeres kivonást megelőzően darálóban aprítottuk. A kivonást 20 ml 70 %-os metanollal ultrahangos sejtfeltáró

készülékben

(Braun

Labsonic

U,

Melsungen,

Germany)

27±2 ºC

hőmérsékleten végeztük (Hank és mtsai 2004, Papp és mtsai 2004, Kursinszki és mtsai 2005, Kursinszki és mtsai 2006, Sárközi és mtsai 2006). A klónszelekciós kísérletek során a kivonási idő háromszor 10 perc, a további kísérletek esetén háromszor 3 perc volt. Az egyes extrakciós lépéseket követően a kivonatokat 7000 rpm fordulatszámon 10 percig centrifugáltuk, és a felülúszó metanolos oldatokat gyűjtöttük. Az egyesített kivonatok további tisztítása folyadék-folyadék extrakcióval történt. Az extraktumot 50 ml n-hexán:terc-butil-metiléter (1:1, v/v) elegyével háromszor kiráztuk, majd az egyesített felső (apoláris) fázist rotációs vákuumbepárló készüléken (Bücchi Rotavapor R-200, Flawil, Switzerland) csökkentett nyomáson 40 ºC hőmérsékleten szárazra pároltuk (Croes és mtsai 1989a, 1989b, Margl és mtsai 2002). A GC-MS vizsgálatokat megelőzően a mintákat megfelelő mennyiségű HPLC tisztaságú kloroformban oldottuk. • Flash kromatográfiás vizsgálatokhoz preparatív célokra A légszáraz aprított gyökereket (50 g) 200 ml metanollal extraháltuk ultrahangfürdőben (RS-95S, Realsonic, Budapest, Magyarország) háromszor 15 percig. Az egyes extrakciós lépéseket követően a kivonatokat 5000 rpm fordulatszámon 10 percig centrifugáltuk, a felülúszó metanolos oldatokat egyesítettük, majd rotációs vákuumbepárló készülékben csökkentett nyomáson 40 ºC hőmérsékleten szárazra pároltuk. A bepárlási maradékot 5 ml n-hexánban oldottuk, majd a flash kromatográfiás vizsgálatokhoz 2-3 g szilika állófázisra szárítottuk.

54

________________________________________________________Anyag és módszer

3.3.2. Gázkromatográfiás-tömegspektrometriás (GC-MS) módszerek a Tagetes patula illékony alkotóinak vizsgálatára 3.3.2.1. A vízgőzdesztillációval előállított illóolaj GC-MS vizsgálata Az illóolajok vizsgálatát ioncsapdás analizátorral felszerelt Finnigan MAT GCQ (San Jose, USA) GC-MS készülékkel végeztük. A gázkromatográfiás elválasztás MDN5S (30 m × 0,25 mm × 0,25 µm filmvastagság, megosztófolyadék: 5 % difenil 95 % dimetil polisziloxán) analitikai kapilláris kolonnán történt. A kolonnatér hőmérséklete 3 perc izoterm szakasz után 60 ºC-ról 8 ºC/perc felfűtési sebességgel 200 ºC-ig (2 perc izoterm), 10 ºC/perc-cel 230 ºC-ig (5 perc izoterm), végül 10 ºC/perc sebességgel 250 ºC-ig változott, amit 10 percig tartottunk. A nagytisztaságú hélium vivőgáz áramlási sebessége 1,0 ml/perc volt. Az injektor hőmérséklete 220 ºC, a splitarány 1:62 volt. A 0,5-1,0 µl térfogatú mintarészleteket (20-30 mg/ml) manuálisan adagoltuk a készülékbe. A tömegspektrométer elektronütközéses ionforrással (70 eV) rendelkezett, a tömegspektrumokat pásztázó (scan) üzemmódban vettük fel (tömegtartomány: 40650 m/z, mintavételi frekvencia: 1 scan/s). A készülék vezérlését és az adatfeldolgozást Finnigan GCQ 2.2 szoftverrel végeztük. 3.3.2.2. Az illékony komponensek SPME-GC-MS és sHS-GC-MS vizsgálata Az illékony komponensek vizsgálatához SPME-GC-MS és sHS-GC-MS vizsgálati módszereket alkalmaztunk. Az analíziseket CTC Combi PAL (CTC Analytics AG, Zwingen, Switzerland) többfunkciós automata mintaadagolóval felszerelt Agilent 6890N (Santa Clara, CA, USA) gázkromatográf készülékkel kapcsolt kvadrupol tömeganalizátorral rendelkező Agilent 5973 (Santa Clara, CA, USA) Network Mass Selective Detector-ral végeztük. A gázkromatográfiás elválasztás Agilent HP-5MS (30 m × 0,25 mm × 0,25 µm filmvastagság, megosztófolyadék: 5 % difenil 95 % dimetil polisziloxán) analitikai kapilláris kolonnán történt. A kolonnatér hőmérséklete 3 perc izoterm szakasz után 60 ºC-ról 8 ºC/perc felfűtési sebességgel 200 ºC-ig (2 perc izoterm), 10 ºC/perc-cel 230 ºC-ig (5 perc izoterm), végül 10 ºC/perc sebességgel

55

________________________________________________________Anyag és módszer

250 ºC-ig változott, amit 1 percig tartottunk. A nagytisztaságú hélium vivőgáz áramlási sebessége a teljes analízisidő alatt konstans 1,0 ml/perc volt (átlagos lineáris áramlási sebesség: 37 cm/s). A készülék programozható hőmérsékletű (PTV) és nyomású split/splitless üzemmódokban működtethető injektor rendszerrel rendelkezett. Az injektor hőmérséklete 250 ºC, a splitarány 1:50 volt. A tömegspektrométer elektronütközéses ionforrással (70 eV) rendelkezett, a tömegspektrumokat pásztázó (scan) üzemmódban vettük fel (tömegtartomány: 40500 m/z,

mintavételi

frekvencia:

3,2 scan/s).

A

készülék

vezérlését

és

az

adatfeldolgozást MSD ChemStation D.02.00.275 szoftverrel végeztük. 3.3.3. Kromatográfiás módszerek a Tagetes patula tiofénjeinek vizsgálatára 3.3.3.1. Vékonyréteg-kromatográfiás (VRK) vizsgálatok Vizsgálatainkhoz az előzőekben ismertetett módon előállított kivonatoknak és αtertiofén

tesztanyag

(1 mg/ml)

n-hexános

oldatának

10-20 µl-es

részleteit

20 cm × 10 cm-es 0,2 mm rétegvastagságú állófázissal bevont Kieselgel 60 F254 szilikagél VRK réteglapra (Merck, Darmstadt, Germany) vittük fel. A mintafelvitel mikrofecskendővel

történt

(Hamilton,

Bonaduz,

Switzerland).

A

mozgófázis

hexán:dioxán 3:1 (v/v) arányú elegye volt. Felszálló kromatográfiás elválasztást alkalmaztunk szobahőmérsékleten (23-25 ºC), a kifejlesztés távolsága 8 cm volt. A zónák detektálását 254 és 366 nm hullámhosszúságú UV fényben végeztük. A kromatogramok értékeléséhez a zónák retenciós faktorát [Rf = a zóna távolsága a starttól (cm) / kifejlesztés távolsága (cm)] adtuk meg. 3.3.3.2. Flash kromatográfia oldószeres kivonatok frakcionálására A

metanolos

kivonatok

további

tisztítását,

frakcionálását

automata

frakciószedővel, UV detektorral rendelkező FlashMaster II (Jones Chromatography, Mid-Glamorgan, UK) flash kromatográfiás készülékkel végeztük. A normál fázisú kromatográfia során 25 ml-es, 5 g szilika állófázissal (64 µm átlagos részecskeátmérő, 521 m2/g specifikus felület) töltött FlashPack SIL (Jones Chromatography) oszlopokat

56

________________________________________________________Anyag és módszer

használtunk. Az eluens n-hexán-dioxán volt, melynek összetételét lépcsőzetes gradiens módszerrel változtattuk (5. táblázat). Az eluens áramlási sebessége 5 ml/perc volt, a tioféneket 340 nm hullámhosszon detektáltuk.

5. táblázat. A normál fázisú flash kromatográfiás elválasztás lépcsőzetes gradiens módszer eluens profilja Idő (perc) 0-15 16-35 36-50 51-55 56-60 61-65 66-70

Hexán (v/v %) 100 95 85 50 25 10 0

Dioxán (v/v %) 0 5 15 50 75 90 100

A fordított fázisú kromatográfia során 15 ml-es, 2 g módosított, oktadecil (C18) szilika állófázissal (64 µm átlagos részecskeátmérő, 521 m2/g specifikus felület) töltött FlashPack SIL (Jones Chromatography) oszlopokat használtunk. Az eluensek 0,1 % hangyasav (A) és metanol (B) voltak, a gradiens program a következők szerint változott (A% : B%): 0 perc 40:60, 5 perc 40:60, 25 perc 0:100 és 35 perc 0:100. Az eluens áramlási sebessége 2 ml/perc volt. A készülék vezérlését és az adatfeldolgozást a FlashMaster – Version 3. 1. 3 szoftverrel végeztük. 3.3.3.3. Tiofének GC-MS vizsgálatai A tiofének szerves oldószeres és SFE kivonatokból történő GC-MS vizsgálatait CTC Combi PAL (CTC Analytics AG, Zwingen, Switzerland) többfunkciós automata mintaadagolóval felszerelt Agilent 6890N (Santa Clara, CA, USA) gázkromatográf készülékkel kapcsolt kvadrupol tömeganalizátorral rendelkező Agilent 5973 (Santa Clara, CA, USA) Network Mass Selective Detector-ral végeztük. A gázkromatográfiás elválasztás

Agilent

HP-5MS

(30 m × 0,25 mm × 0,25 µm

filmvastagság,

megosztófolyadék: 5 % difenil 95 % dimetil polisziloxán) analitikai kapilláris kolonnán

57

________________________________________________________Anyag és módszer

történt. A kolonnatér hőmérsékletét 1 perc izoterm szakasz után 60 ºC-ról 10 ºC/perc felfűtési sebességgel 280 ºC-ig változtattuk, amit 7 percig tartottunk. A nagytisztaságú hélium vivőgáz áramlási sebessége a teljes analízisidő alatt konstans 1,0 ml/perc volt (átlagos lineáris áramlási sebesség: 37 cm/s). A készülék programozható hőmérsékletű (PTV) és nyomású split/splitless üzemmódokban működtethető injektor rendszerrel rendelkezett. Az injektált minta térfogata 1,0 µl volt. A különböző mintabeviteli technikák kísérleti paraméterei a következők voltak: • a split injektálást 1:20 splitaránnyal 280 ºC hőmérsékleten; • a hot splitless injektálást 280 ºC hőmérsékleten 0,4; 0,7 és 1,0 perces splitless időértékekkel; • a hot pulsed splitless injektálást 280 ºC hőmérsékleten 40 psi nyomáspulzussal (1 percig) különböző splitless időértékekkel (0,4; 0,7 és 1,0 perc); • végül a hőmérséklet-programozott (120-300 ºC, 720 ºC/perc) pulsed splitless injektálást 40 psi nyomáspulzussal (1 percig) különböző splitless időértékekkel (0,4; 0,7; 0,8 és 1,0 perc) végeztük. A GC-MS vizsgálatok során a továbbiakban a hőmérséklet-programozott pulsed splitless mintabeviteli technikát alkalmaztuk 0,8 perces splitless időtartammal. A tömegspektrométer elektronütközéses ionforrással (70 eV) rendelkezett, a tömegspektrumokat pásztázó (scan) üzemmódban vettük fel (tömegtartomány: 40500 m/z, mintavételi frekvencia: 3,2 scan/s). A mennyiségi meghatározásokat szelektív ionkövetéses (SIM) üzemmódban végeztük (6. táblázat). A készülék vezérlését és az adatfeldolgozást MSD ChemStation D.02.00.275 szoftverrel végeztük.

6. táblázat. Tiofének mennyiségi meghatározására kidolgozott GC-MS SIM módszer során detektált ionok Komponens Célion Minősítő ionok Mintavételi frekvencia (m/z) (m/z) (ciklus/s) 2,2’-bitiofén 166 121, 134, 168 8,1 BBT 216 95, 171, 218 8,1 α-T 248 127, 203, 250 8,1 BBTOAc 216 171, 203, 276 8,1 AcOCH2BBT 229 288 14,0 232 219, 274, 334 8,1 BBT(OAc)2

58

________________________________________________________Anyag és módszer

3.3.4. A gázkromatográfiás-tömegspektrometriás minőségi azonosítás és mennyiségi elemzés módszerei 3.3.4.1. Minőségi azonosítás A komponensek azonosítása retenciós idejük, retenciós indexük és a regisztrált tömegspektrumuk alapján történt, mely adatokat autentikus standard anyagok megfelelő adataival vetettük össze. Irodalmi adatok (Héthelyi és mtsai 1986a, 1986b, 1987b, 1988, Bicchi és mtsai 1992, Stojanova és mtsai 2000, Adams 2001, Krishna és mtsai 2002, Margl és mtsai 2002, Marotti és mtsai 2004) és a számítógépes NIST 05 Spectral Library adatait is felhasználtuk, illetve bizonyos esetekben fragmentációs tanulmány kidolgozásával erősítettük meg feltételezéseinket (McLafferty és Tureček 1993, Balla 2006). A retenciós index kiszámítása a Kováts-féle retenciós index rendszer lineáris felfűtésű hőmérsékletprogramra alkalmazott Van den Dool és Kratz-féle módosítás alapján történt: IPTGCi = 100×(z2-z1)×(Ti-Tz1)/(Tz2-Tz1)+z1×100, ahol IPTGCi az i-edik alkotó lineáris hőmérsékletprogramra alkalmazott retenciós indexe, z1 és z2 az i-edik komponens előtt és után eluálódó n-alkánok szénatomszáma, Ti az iedik alkotó, illetve Tz1 és Tz2 a megfelelő n-alkánok retenciós hőmérséklete Kelvin fokban kifejezve (Van den Dool és Kratz 1963). 3.3.4.2. Mennyiségi elemzés • Az illékony alkotók százalékos összetételének meghatározása Az illékony komponensek százalékos adatait terület-normalizációs módszerrel, területkorrekciós faktor alkalmazása nélkül számítottuk. Az egyes adatok minimum három párhuzamos mérés átlagát jelentik (Lemberkovics 2006).

59

________________________________________________________Anyag és módszer

• A tiofének mennyiségi analízise A mennyiségi meghatározások alapjául a SIM mérések célion detektorjelének csúcs alatti területértékei szolgáltak. Az α-T mennyiségi analízise kalibrációs belső standard módszerrel történt. Belső standard anyagként egy tiofén analógot, a 2,2’bitiofént használtuk 10 µg/ml koncentrációban. A belső standard oldatát közvetlenül a GC-MS analíziseket megelőzően adtuk hozzá a vizsgálandó oldatokhoz. A 6 pontos kalibrációs egyenes pontjait 3-4 párhuzamos mérés átlagaként kaptuk. Az α-T koncentrációját 1-50 µg/ml értékek között változtattuk oly módon, hogy a belső standard koncentrációja mindvégig állandó maradt. Az extraktumok α-T tartalmát a feldolgozott növényi minta száraz tömegére vonatkoztatva adtuk meg (µg/g). A mért adatokból a kultúrák száraz súlyának és száraz súlyra vonatkoztatott α-T tartalmának szorzataként kaptuk az α-T produkció értékeket (µg/kultúra). A négy másik társvegyület [BBT, BBTOAc, AcOCH2BBT és BBT(OAc)2] esetében belső standardra vonatkoztatott relatív területhányados értékeket számítottunk. 3.4. Az eredmények értékelésének statisztikai módszerei Minden kísérleti körülményt legalább 6 ismétléssel jellemeztünk. Az analitikai vizsgálatokhoz minden kísérleti csoportból 3-4 extrakciót végeztünk. A mérési eredményeket minimum három párhuzamos mérés átlagaként adtuk meg. A mérési adatokból átlagot, szórást (SD), relatív standard deviációt (RSD) és 95 %-os konfidencia intervallumot (CI) számítottunk. A mérési eredmények matematikai-statisztikai értékeléséhez egyváltozós variancia-analízist (ANOVA) alkalmaztunk. Szignifikancia szintnek a p < 0,05 értéket vettük. A matematikai számításokat és eredményeink statisztikai kiértékelését Microsoft® Office Excel 2003 és MicroCal Origin 3.0 programcsomagok használatával végeztük.

60

_______________________________________________Eredmények és megbeszélés

4. Eredmények és megbeszélés 4.1. Kémiai analízis, módszertani fejlesztések 4.1.1. Az illékony komponensek GC-MS vizsgálata 4.1.1.1. A vízgőzdesztillációval előállított illóolaj GC-MS vizsgálata A szabadföldön nevelt T. patula jelentős mennyiségű illóolajat tartalmaz, melynek összetételét GC-MS módszerrel vizsgáltuk. A különböző növényi részekből (virágzat, levél és gyökér) és az in vitro géntranszformált #TpR hairy root kultúrákból vízgőzdesztillációval előállított illóolaj mennyiségét gravimetriásan mértük. A virágzat illóolaj tartalma lényegesen alacsonyabbnak bizonyult, mint a levélben vagy a

Illóolaj tartalom (m/m % száraz súlyra vonatkoztatva)

gyökérben. A hairy root kultúra illóolajtartalma az intakt gyökérhez hasonló (11. ábra).

0,40 0,35 0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 virágzat

levél

gyökérzet

#TpR hairy root kultúra

11. ábra. T. patula növényi részek és a #TpR hairy root kultúra illóolaj tartalma

Az intakt növény különböző részeinek és a géntranszformált kultúra illóolajának összetételét a 7. táblázat foglalja össze. A virágzat illóolaját a szeszkviterpén komponensek (62,0 %) dominanciája jellemzi, míg a levelek esetén döntően monoterpén vegyületeket (75,8 %) detektáltunk.

61


7. táblázat. T. patula növényi részek és #TpR hairy root kultúra vízgőzdesztillációval előállított illóolajának alkotói Komponens

IPTGC

Százalékos összetétel (%) virágzat

levél

gyökérzet

#TpR hairy root

Monoterpének: Limonén

1034

ny.

5.9 ± 0.83

n.d.

n.d.

(Z)-β-ocimén

1038

3.8 ± 1.86

6.9 ± 0.80

n.d.

n.d.

Terpinolén

1093

3.3 ± 1.04

21.1 ± 0.76

n.d.

n.d.

(Z)-tageton

1150

0.6 ± 0.17

4.4 ± 1.32

n.d.

n.d.

(E)-tageton

1157

0.6 ± 0.12

9.5 ± 2.78

n.d.

n.d.

(Z)-ocimenon

1236

4.2 ± 0.90

4.1 ± 0.71

n.d.

n.d.

(E)-ocimenon

1244

1.9 ± 0.47

5.8 ± 1.53

n.d.

n.d.

Piperiton

1265

0.7 ± 0.12

11.2 ± 2.73

n.d.

n.d.

Piperitenon

1350

1.6 ± 0.15

4.6 ± 2.64

0.2 ± 0.06

n.d.

Piperitenon oxid

1375

0.3 ± 0.06

2.3 ± 0.86

n.d.

n.d.

Szeszkviterpének: α-gurjunén*

1416

n.d.

n.d.

4.3 ± 0.50

1,4 ± 0,05

β-kariofillén*

1433

53.5 ± 2.80

3.5 ± 0.58

0.7 ± 0.15

0,5 ± 0,02

(E)-β-farnezén*

1457

ny.

ny.

3.9 ± 0.10

4,3 ± 0,43

α-humulén

1462

ny.

ny.

n.d.

n.d.

Germakrén D

1496

3.5 ± 1.37

1.5 ± 0.43

0.6 ± 0.06

n.d.

Spatulenol

1592

0.9 ± 0.26

0.8 ± 0.40

n.d.

n.d.

kariofillén oxid

1599

4.1 ± 1.53

0.7 ± 0.28

n.d.

n.d.

Tiofének: BBT PBT α-T

1936 2043 2210

0.8 ± 0.11 5.1 ± 1.42 2.4 ± 0.55

ny. n.d. ny.

44.0 ± 3.82 0.3 ± 0.06 21.8 ± 2.94

21,7 ± 1,25 n.d. 3,5 ± 0,52

BBTOAc

2321

ny.

ny.

6.1 ± 1.55

9,3 ± 2,31

IPTGC = lineáris hőmérsékletprogramra alkalmazott retenciós index; n.d. = nem detektált; ny. = nyomokban (< 0,05%); ± SD (n = 3); *T. patula gyökér és hairy root kultúrák illóolajának elsőként azonosított komponensei

62


Kiemelést érdemel, hogy a gyökérzet és a hairy root kultúra illóolaja nagyfokú hasonlóságot mutat, ellenben jelentősen eltér a földfeletti részek illóolajának összetételétől. A gyökérzet terpenoid összetevőit korábban nem vizsgálták, így elsőként azonosítottuk a szeszkviterpén α-gurjunén, β-kariofillén és (E)-β-farnezén jelenlétét (12. ábra). A földfeletti részekben közülük csupán a β-kariofillén szintetizálódik jelentős mennyiségben. Ugyanitt a tiofén vegyületek, bár kis mennyiségben, de egyértelműen jelen voltak. A gyökérzet és a hairy root kultúra illóolaja ugyanakkor döntően tioféneket tartalmaz (72,2 és 34,5 %), míg a „klasszikus” terpenoid vegyületek csupán nyomokban jelennek meg. Margl (2002) felvetette annak lehetőségét, hogy a vízgőzdesztilláció során az egyes tiofénekre vonatkozó szelekció nyilvánul meg, amely torz

komponensarányokat

eredményez,

melyet

az

apolárisabb,

illékonyabb

komponensek (BBT, α-T) dominanciája tükröz. Ezért fontosnak tartottuk más extrakciós eljárások alkalmazhatóságának vizsgálatát is.

α-gurjunén

204

100

91 41 0

40

55

67

70

100

130

147

H

120 55

147

189 175

190

220

0

40

60

80

100

93

50

161

175

160

(E)-β-farnezén

69

100

41

105

161 133

H

133

50

105 119

77

β-kariofillén

69 79

41

189 50

93

100

120

140

160

m/z

180

55

204 200

0

40

60

79 107 80

100

120

133 161 175 189 204

147 120

140

160

180

m/z

m/z

12. ábra. A T. patula gyökér és hairy root kultúra illóolajában újonnan azonosított komponensek kémiai szerkezete és tömegspektruma

4.1.1.2. Illékony összetevők sHS-GC-MS vizsgálata Fontosnak tartottuk tehát illékony alkotók meghatározására egy másik módszert – közvetlenül a növényi minta fölötti légtér gázkromatográfiás analízisét – alkalmazni. A módszer további előnye a vízgőzdesztillációval szemben, hogy jelentősen kisebb, gramm alatti mintamennyiségeket igényel, a mintaelőkészítés jóval egyszerűbb és gyorsabb, valamint automatizálható, így szkrínvizsgálatokra kifejezetten alkalmas. A statikus gőztéranalízis során kétfajta mintaadagolási eljárást alkalmaztunk. Első esetben a légtérből gáztömör fecskendővel vettünk mintát, majd injektáltuk a GC készülékbe. Vizsgáltuk

továbbá

a

szilárdfázisú

63

mikroextrakciós

200

(SPME)

technika


alkalmazhatóságának lehetőségét is. Az SPME eszköz lelke az SPME szál, ami egy vékony kvarc- vagy fémszálon rögzített szorbensréteg. A mintavétel során a gázfázisban levő molekulák egy megoszlásos egyensúlyi folyamat következtében a szorbensrétegen vagy szorbensrétegben feldúsulnak. A fecskendős mintavételhez képest az SPME technika használatával látványosan, egy-három nagyságrenddel növekedett minden egyes

komponens

detektorjele

(8. táblázat),

így

a

módszer

érzékenysége.

8. táblázat. A T. patula levél gőzterében található komponensek detektorjele a fecskendős és az SPME mintabeviteli technika alkalmazása során Komponens Fecskendő (250 µl) SPME Monoterpének: limonén (Z)-β-ocimén (E)-β-ocimén terpinolén

115 ± 28,6 56 ± 18,4 3 ± 1,5 193 ± 34,8

1961 ± 271,7 1436 ± 199,9 157 ± 19,5 6057 ± 242,8

Szeszkviterpének: β-kariofillén germakrén D

2,0 ± 0,55 n.d.

2752 ± 127,4 1288 ± 115,5

n.d. = nem detektált; ± SD (n = 3); inkubációs hőmérséklet = 60 ºC; inkubációs és mintavételi idő = 15 perc

A

legdrámaibb

eltérést

a

nagyobb

molekulatömegű,

magasabb

forráspontú

szeszkviterpének esetében tapasztaltuk, a fecskendős mintabevitel során germakrén D komponenst nem is detektáltunk a levél gőzterében. A gyökér és hairy root minták gőzteréből a fecskendős mintaadagolást követően egyáltalán nem tudtunk terpenoid vagy tiofén komponenseket kimutatni. Az SPME mintavétel során – az alkalmazott hőmérséklet hatásának vizsgálata érdekében – az extrakciót 25 ºC és 60 ºC hőmérsékleten is elvégeztük. A 9. táblázatban összefoglalt eredmények mutatják, hogy a kisebb molekulatömegű monoterpén komponensek extrakciójának hatékonysága a magasabb hőmérséklet hatására csekély mértékben csökkent. Ezzel szemben a nagyobb méretű szeszkviterpén alkotók a magasabb hőmérsékleten sokkal nagyobb arányban jelentek meg. Látható, hogy a komplex, sok komponensből álló illékony anyagok SPME-GC vizsgálata során nagyon fontos szerepe van az extrakciós hőmérsékletnek. Az extrakciós hőmérséklet

64


változtatása két egymással ellentétes hatású folyamatot befolyásol. Egyrészt a hőmérséklet növelésével nő az alkotók gőztérben levő mennyisége, azonban csökken a gőztér és SPME szorbens közötti, az egyes alkotókra jellemző megoszlási hányados. 9. táblázat. A T. patula levél gőzterében található komponensek detektorjele a különböző hőmérsékleten alkalmazott SPME extrakció során Komponens 25 ºC 60 ºC Monoterpének: limonén (Z)-β-ocimén (E)-β-ocimén terpinolén Szeszkviterpének: β-kariofillén germakrén D kariofillén oxid

2755 ± 309,2 1960 ± 185,0 206 ± 14,7 6347 ± 126,9

1961 ± 271,7 1436 ± 199,9 157 ± 19,5 6057 ± 242,8

451 ± 31,0 116 ± 24,4 n.d.

2752 ± 127,4 1288 ± 115,5 102 ± 3,0

n.d. = nem detektált; ± SD (n = 3); mintavételi idő = 10 perc

Túl magas hőmérsékleten tehát ugyan több molekula kerül a gőztérbe, de nem képesek a szorbens rétegre adszorbeálódni. Ennek következtében a detektálható komponensek száma nem nő. A levelek vizsgálata során bebizonyosodott, hogy szobahőmérsékleten végzett SPME alkalmatlan a nagyobb molekulatömegű szeszkviterpén alkotók vizsgálatára.

A

növény

(büdöske)

jellegzetes

illatáért

viszont

a

légtérben

szobahőmérsékleten is előforduló monoterpén szénhidrogének felelősek. 60 ºC hőmérsékleten a monoterpének detektorjele csekély mértékben csökken, ugyanakkor a szeszkviterpéneké nagyságrendekkel nő. A hőmérséklet további növelését nem tartottuk indokoltnak, így a T. patula intakt növényi részek és hairy root kultúra SPME extrakcióját 60 ºC hőmérsékleten végeztük. A növényi minták gőzterének relatív összetételét

a

10. táblázat

foglalja

össze.

Az

eredményeket

összevetve

a

vízgőzdesztillációval előállított illóolaj közvetlen injektálása során kapott adatokkal (lásd 7. táblázat) megállapítható, hogy a megfelelően optimált SPME technika hasonló illékony

komponensarányokat

eredményez.

A

fő

komponensek

a

virág

és

levélmintákban mindkét esetben megegyeznek, ugyanakkor a gyökér és hairy root minták esetében lényeges a különbség. Az utóbbiakra jellemző tiofének közül az SPME

65


analízis során csupán a BBT-t azonosítottuk. A levélben és virágzatban azonosított tiofének közül pedig egyiket sem detektáltuk. Nyilvánvalónak tűnik tehát, hogy a vízgőzdesztillációhoz hasonlóan az SPME eljárás során is jelentős mértékű szelekció történik, a magasabb forráspontú (nagyobb molekulatömegű, polárisabb) alkotók kinyerése lényeges mértékben csökken.

10. táblázat. T. patula növényi minták gőzterének SPME-GC-MS vizsgálata Komponens

Százalékos összetétel (%) virágzat

levél

gyökérzet

#TpR hairy root

Monoterpének: limonén (Z)-β-ocimén terpinolén (Z)-tageton (E)-tageton (Z)-ocimenon (E)-ocimenon piperiton piperitenon

ny. ny. ny. ny. ny. 2,8 ± 0,32 ny. 1,2 ± 0,14 1,4 ± 0,20

8,5 ± 0,96 6,2 ± 0,70 26,2 ± 0,37 3,8 ± 0,12 6,5 ± 0,48 1,62 ± 0,091 2,9 ± 0,39 ny. 0,75 ± 0,065

n.d. n.d n.d n.d. n.d. 3,2 ± 0,34 n.d 9,4 ± 0,35 1,59 ± 0,093

n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. ny. n.d.

Szeszkviterpének: α-gurjunén β-kariofillén (E)-β-farnezén germakrén D β-bizabolén spatulenol kariofillén oxid

n.d. 72 ± 2,7 1,3 ± 0,17 9,4 ± 0,53 n.d. 0,8 ± 0,26 1,9 ± 0,29

n.d. 11,9 ± 0,24 0,60 ± 0,092 5,6 ± 0,64 n.d. 0,4 ± 0,13 3,22 ± 0,074

5,66 ± 0,082 36 ± 1,2 7,9 ± 0,71 n.d 20,9 ± 0,62 ny. 7,8 ± 0,41

4,0 ± 0,39 13 ± 1,4 36,4 ± 0,39 n.d. 34 ± 2,8 n.d. ny.

n.d.

n.d.

6 ± 1,5

Tiofének: BBT

9 ± 4,1

n.d. = nem detektált; ny. = nyomokban (< 0,05%); ± SD (n = 3); inkubációs hőmérséklet = 60 ºC; mintavételi idő = 10 perc

Összefoglalásképpen megállapíthatjuk, hogy a vízgőzdesztilláció és a statikus gőztéranalízis a terpenoidok kinyerésére kiválóan alkalmazható ugyan, azonban a jelentős mértékű szelekció miatt tiofének vizsgálatára már kevésbé használható.

66


4.1.2. Tiofének vizsgálata GC-MS módszerekkel 4.1.2.1. Tiofének tömegspektrometriás azonosítása A szakirodalomban fellelhető adatok szerint a gázkromatográfia alkalmas a tiofének komplex biológiai mátrixból történő szerkezetvizsgálatára, azonosítására, mennyiségi meghatározására. A módszer előnye nagy felbontóképességéből és igen kis mintaigényéből ered, továbbá egyszerűen kapcsolható az egyik leggyakrabban használt szerkezetvizsgálati módszerrel, a tömegspektrometriával (Romagnoli és mtsai 1994, Margl és mtsai 2001, Margl 2002, Margl és mtsai 2002). A T. patula növényben azonosított tiofénvázas összetevők döntő többségben kismolekulájú szerves vegyületek, nem rendelkeznek olyan funkciós csoportokkal (pl. hidroxilcsoportok), melyek a vegyületek bomlás nélküli elpárologtatását megakadályoznák. Éppen ezért az analízis egyszerűen, származékképzés nélkül elvégezhető. Kivételt csupán két ismert komponens, a BBTOH és a HOCH2BBT képez, melyek Arroo és mtsai (1995c) beszámolója szerint az analízis hőmérsékletén instabilak voltak, elbomlottak. Fokozott figyelmet kell fordítani ugyanakkor a megfelelő mintaelőkészítésre, mivel a minta nem illékony komponensei a gázkromatográf készüléket szennyezik. A GC-MS analízisek során a leggyakrabban a BBT, α-T, BBTOAc, AcOCH2BBT és BBT(OAc)2 fordultak elő a kivonatokban, továbbá sikerült azonosítani a gyakran csupán nyomokban jelentkező MeBBT, PBT és BBTOH származékokat is. A minőségi analízis során a tiofének felismerését, azok speciális tömegspektrometriás sajátságai segítik. A 32-es rendszámú kénatom

34

S stabil izotópjának 4,2 %-os

természetes előfordulási gyakorisága magasnak számít. Emiatt a kéntartalmú vegyületek tömegspektruma jellegzetes izotópmintázatot mutat, ami a kiemelkedően intenzív [M+2]+-es fragmens jelenlétében nyilvánul meg (13. ábra). Továbbá, a következő összefüggés felhasználásával a tömegspektrum alapján megbecsülhető a molekulában található kénatomok száma: ns ≈ (I[M+2]+×100)/(IM+×4,4) ahol ns a molekulában található kénatomok száma, I[M+2]+ az [M+2]+ tömegszámú

34

S

izotópot tartalmazó ion normalizált intenzitása, míg IM+ a molekulaion normalizált

67


A

M+ [M+2]+

m/z

B

M+ [M+2]+

m/z 13. ábra. A két kén heteroatomot tartalmazó BBT (A) és kénatomot nem tartalmazó palmitinsav (B) tömegspektruma, a BBT [M+2]+ fragmensionjának intenzitása lényegesen nagyobb, mint a palmitinsav esetében megfigyelhető

intenzitása (McLafferty és Tureček 1993, Balla 2006). A fenti összefüggéssel számított kénatomszámok

minden

azonosított

tiofénvegyület

esetében

megfeleltek

a

feltételezéseknek. Ezen poliacetilén eredetű vegyületek számos konjugált kettős illetve hármas kötést is tartalmaznak, melyek kiterjedt delokalizált elektronrendszert alkotnak. A 14. ábra szemlélteti, hogy ez a szerkezet jelentős mértékben stabilizálja az ionforrásban kialakult molekulaiont, aminek megfelelően igen csekély mértékű fragmentáció látható a tömegspektrumokon. A legintenzívebb ion, a bázision, nagy fajlagos tömegű fragmens, gyakran maga a molekulaion.

68


H3 C

C S

C

CH

CH2 S

S

MeBBT (Mr=230)

S

α-T (Mr=248)

S

m/z

m/z

14. ábra. A MeBBT és az α-T tömegspektruma. A legintenzívebb ion a molekulaion; Mr = relatív molekulatömeg

Autentikus

standard

vegyületek

hiányában

fragmentációs

tanulmány

kidolgozásával erősítettük meg feltevéseinket. A 15. ábrán két tiofén acetát észter tömegspektruma és feltételezett fragmentációs mechanizmusa látható. A spektrumokon

A

AcOCH2BBT (Mr=288) 43

α

H3 C C

O

C

CH2 S

O

β

C

CH

CH2

S

229

m/z

B

BBTOAc (Mr=276)

203 H C

S

C

C

S

m/z-32

H

α

β

43 O

CH2

O

C

CH3

216 M

m/z

15. ábra. Az AcOCH2BBT (A) és a BBTOAc (B) tömegspektruma és feltételezett fragmentációs mechanizmusa; Mr = relatív molekulatömeg; α = α-hasadás; β = allil-, vagy β-hasadás; M = McLafferty-átrendeződés

69


látható 43 fajlagos tömegű fragmens megjelenése az acetát észterekre jellemző, a 32-es tömegszámkülönbségek pedig elemi kén kilépését jelzik. A BBTOAc spektrumán látható 216 tömegszámú hasadási termék a McLafferty-átrendeződés eredménye, mely során az acetát csoporttól számított második szénatomról hidrogéngyök vándorol az acetát funkciós csoportra, és a 60 tömegszámú ecetsav egység lép ki a molekulából. Látható, hogy az AcOCH2BBT esetében ez a folyamat nem valósul meg, miután az acetát szubsztituenstől számított második szénatomon nem található hidrogén. A retenciós idő adatból számított Van den Dool és Kratz (1963) féle lineáris hőmérsékletprogramra alkalmazott retenciós index (IPTGC) készüléktípusoktól független értéket eredményez, jelentősen megkönnyítve a komponens azonosítását. Az identifikált tiofének MS fragmentációs mintázatát és retenciós indexét a 11. táblázat foglalja össze. Az általunk számolt retenciós indexek kis mértékben eltérnek a szakirodalomban megtalálható értékektől (Margl 2002, Margl és mtsai 2002). Ennek legvalószínűbb oka, hogy kísérleteinket 5 % difenil funkciós csoportot tartalmazó poli-dimetil-sziloxán állófázisú kapillárkolonnán végeztük, míg Margl és mtsai poli-dimetil-sziloxán állófázist használtak. Ez magyarázhatja az általunk mért következetesen magasabb értékeket, ugyanis az aromás funkciós csoport növelheti az aromás alkotók retencióját.

11. táblázat. A T. patula gyökérzet tiofénjeinek GC-MS jellemzői Komponens BBT MeBBT PBT BBTOH α-T BBTOAc AcOCH2BBT BBT(OAc)2

IPTGC 1940 2055 2102 2224 2244 2358 2443 2580

M+ 216 230 230 234 248 276 288 334

Fragmensionok (normalizált intenzitás [%]) 95 (9,7) 171 (19,9) 216 (100) 217 (15,5) 218 (10,1) 102 (10,5) 197 (18,7) 229 (36,0) 230 (100) 231 (18,5) 197 (7,6) 229 (22,3) 230 (100) 231 (17,8) 232 (10,6) 171 (14,9) 203 (100) 234 (69,8) 235 (10,2) 236 (7,2) 127 (10,3) 203 (11,3) 248 (100) 249 (15,6) 250 (14,4) 43 (12,7) 171 (10,3) 203 (14,4) 216 (100) 276 (10,8) 43 (6,6) 95 (4,2) 229 (100) 230 (20,2) 288 (61,9) 43 (37,9) 219 (32,0) 274 (46,8) 232 (100) 334 (14,9)

IPTGC = lineáris hőmérsékletprogramra alkalmazott retenciós index; M+ = molekulaion

70


4.1.2.2. Az optimális GC mintabeviteli technika kiválasztása A mintabevitel a gázkromatográfiás analízis egyik legkritikusabb művelete. A legfőbb problémát az okozza, hogy a folyadék halmazállapotú mintát egy olyan fűtött térbe kell juttatni, ahol arra törekszünk, hogy a minta pillanatszerűen és kvantitatíve elpárologjon (Balla 2006). Az optimális GC mintabeviteli megoldás kiválasztása érdekében több injektálási technika (split, splitless, pulsed splitless és hőmérsékletprogramozott pulsed splitless) alkalmazhatóságát vizsgáltuk. Modellvegyületnek az α-T tiofénszármazékot választottuk. A magas hőmérsékletre fűtött injektorba történő térfogatos mintaadagolás hibája belső standard elemzési módszerrel kiküszöbölhető. Belső standard anyagként egy tiofén analógot, a 2,2’-bitiofént használtuk 10 µg/ml koncentrációban. Az analízisek során a tömegspektrométer ionkövetéses (SIM) üzemmódban működött. Kísérleteink kezdeti szakaszában a különböző splitless módszerek mintaáram megosztó (splitter) szelepének optimális nyitási idejét (splitless time) kerestük. A mintaáram megosztó szelep nyitási ideje akkor optimális, amikor a regisztrált kromatogramon a vizsgált komponens csúcs alatti területe maximális, továbbá a csúcs alakja szabályos, szimmetrikus (gaussi) jellegű (Yang és mtsai 1978, Poy és mtsai 1981, Schomburg és mtsai 1984). Ennek érdekében a 10 µg/ml koncentrációjú α-T oldat 1 µles részleteinek injektálása során a splitless time értékét 0,4 és 1,0 perc között változtattuk. Az eredményeket a 16. ábra szemlélteti. A splitless injektálás során az optimális splitless time 1 perc lett, míg a 40 psi nyomáspulzus (pulsed splitless injektálás) hatására ez az idő jelentősen, 0,4 percre csökkent. A nyomáspulzus ugyanis megnövelte a vivőgáz áramlási sebességét az injektorban, így a minta rövidebb idő alatt jutott az analitikai oszlopra. A hőmérséklet-programozott pulsed splitless technika során kapott 0,8 perces optimális érték magasabb, mint a pulsed splitless mintabevitelnél tapasztalt,

miután

az

alacsony

hőmérsékletű

injektornak

először

az alkotó

forráspontjánál magasabb hőmérsékletre (pl. 2,2’-bitiofén forráspontja: 260 ºC) kellett melegednie, ami kb. 0,3 percet vett igénybe.

71


9000000

splitless

8000000 pulsed splitless

α-T csúcsterülete

7000000 6000000

hőmérsék letprogramozott pulsed splitless

5000000 4000000 3000000 2000000 1000000 0 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 Splitless time (perc)

1

1,1

16. ábra. Splitless mintabeviteli technikák splitless time értékének optimálása; a hibasávok a szórást jelölik

Ezt követően az optimált splitless módszereket és egy szakirodalmi split (Margl és mtsai 2002) mintabeviteli módszert hasonlítottuk össze. Az eredményeket a 12. táblázat összegzi. Az elvárásoknak megfelelően a split injektálás eredményezte a legalacsonyabb

csúcsterület

értékeket.

A

splitless

technika

alkalmazása

nagyságrendekkel növelte az érzékenységet, ugyanakkor csupán a hőmérsékletprogramozott módszer szolgáltatott megbízható, ismételhető adatokat (RSD < 2,0 %).

12. táblázat. A mintabeviteli technikák összehasonlítása Split Splitless Pulsed splitless Hőmérséklet-programozott pulsed splitless

Aa 43834 664968 7165143 13424681

RSDa (%) 27,6 49,4 32,6 1,0

Arel 0,6370 0,1740 0,9743 1,4539

RSDrel (%) 25,9 46,4 21,5 1,0

Aa = α-T abszolút csúcsterülete; RSDa = Aa relatív standard deviációja; Arel = α-T belső standardra vonatkoztatott csúcsterülete; RSDrel = Arel relatív standard deviációja; n = 3

72


A magas hőmérsékletű injektálások

A

során tapasztalt jelentős szórás nagy valószínűség szerint abból adódhat, hogy a beadott oldószer gőzének térfogata az adott hőmérsékleten meghaladta

a

béléscső

(liner)

térfogatát (150 µl). Így a túltelített béléscsőből az oldószer egy nem kontrollálható B

része

a

minta-

komponensekkel együtt az injektor port

egyéb

részein

(szeptum

vagy

szeptum

tömítetlensége öblítőgázvezeték) vozva

növelte

keresztül a

eltá-

meghatározás

bizonytalanságát. Feltételezéseinket gőztérfogat számításokkal erősítettük meg, melyeket a Hewlett-Packard FlowCalc 2.0 szoftverrel végeztük el C

(17. ábra). Eredményeink legnagyobb

alapján

csúcsterületeket,

a így

jobb érzékenységet, a megbízhatóan ismételhető

mérési

adatokat

hőmérséklet-programozott splitless

mintabeviteli

a

pulsed technika

szolgáltatta, így további méréseink során ezt a módszert alkalmaztuk. 17. ábra. Gőztérfogat számítások splitless (A), pulsed splitless (B) és hőmérsékletprogramozott pulsed splitless (C) mintabeviteli technika esetén, a béléscső túlterheltségét a piros jelzés mutatja

73


4.1.2.3. Tiofének GC-MS vizsgálata szerves oldószeres kivonatokban 4.1.2.3.1. Tiofének optimális szerves oldószeres extrakciója Kísérleteink kezdeti szakaszában célunk egy GC-MS analízishez alkalmas extrakciós módszer kiválasztása volt, amely kis mintamennyiséget igényel, megbízható eredményeket szolgáltat, egyszerűen kivitelezhető, alkalmas a tiofénvegyületek kivonására az intakt növény különböző részeiből és az in vitro kultúrákból egyaránt. A korábban bemutatott vízgőzdesztilláció és SPME kivonási eljárások nem bizonyultak igazán alkalmasnak a tiofének vizsgálatára, így a szakirodalomban fellelhető különböző oldószeres extrakciós módszerek közül a Margl (2002) által GC mérésekhez kidolgozott eljárást adaptáltuk, melynek módosított változatát alkalmaztuk. Az eredeti extrakciós módszer 2 órás szobahőmérsékleten történő áztatás volt, amit mi ultrahangos sejtfeltáró készülékben történő 10 perces kivonással helyettesítettünk. A totálextrakció elérése érdekében az ultrahangos kivonást háromszor ismételtük meg, és a következő tisztítási lépéshez az egyesített extraktumot használtuk. A szerves oldószeres kivonatok összetételét GC-MS módszerrel határoztuk meg. A T. patula gyökér kivonatának teljes ionáram kromatogramja (TIC) a 18. ábrán látható.

5 9 Detektor jel

8 6

2

7

3

10

11

4

1 1 Idő (perc)

18. ábra. A T. patula gyökér szerves oldószeres kivonatának teljes ionáram kromatogramja (TIC); 1 = α-gurjunén, 2 = β-kariofillén, 3 = (E)-β-farnezén, 4 = β-bizabolén, 5 = BBT, 6 = palmitinsav, 7 = linolsav, 8 = α-T, 9 = BBTOAc, 10 = AcOCH2BBT és 11 = BBT(OAc)2

74


A kivonat jelentős részét a tiofénvegyületek képezték, a főbb komponensek a BBT, az α-T és a BBTOAc voltak. Az AcOCH2BBT és a BBT(OAc)2 minor komponensek mellett a nyomokban előforduló MeBBT és PBT is azonosítható volt. Az itt azonosított nagyobb molekulatömegű és vélhetően magasabb forráspontú AcOCH2BBT és a BBT(OAc)2 származékok a vízgőzdesztillációval előállított illóolajban meg sem jelentek (lásd 4.1.1.1 alfejezet). Jellemző volt a szeszkviterpén szénhidrogén illóolaj komponensek jelenléte is, melyek közül az α-gurjunént, a β-kariofillént, a (E)-βfarnezént és a β-bizabolént azonosítottuk. Ez utóbbi alkotók megjelennek a gyökér vízgőzdesztillációval előállított illóolajában és a gyökér gőzterének is jellemző, meghatározó összetevői. Az alifás szerves karbonsavak közül a palmitinsavat, annak metilészter származékát és a két telítetlen kettős kötést tartalmazó linolsavat detektáltuk. Az eredmények meggyőzően igazolták, hogy a szerves oldószeres extrakció, a vízgőzdesztillációval és a sHS módszerekkel összevetve, alkalmasabb tiofének GC-MS analitikai vizsgálatának mintaelőkészítésére, miután lehetővé teszi a legtöbb tiofénvegyület egyidejű vizsgálatát. Az eljárás továbbá egyszerűen kivitelezhető, kis mintamennyiséget igényel és a kivonatok főként tioféneket tartalmaznak. A későbbiekben azonban a jelentősen megnövekedett mintaszámok miatt célszerűnek tartottuk a kivonási időt csökkenteni. Ennek érdekében a T. patula gyökérzet három fő tiofén komponense, a BBT, α-T és BBTOAc belső standardra vonatkoztatott

detektorjelét

(SIM

analízis)

hasonlítottuk

össze

Relatív csúcsterület

5,0 4,5

10 perc

4,0

3 perc

3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 BBT

α-T

BBTOAc

19. ábra. A BBT, α-T és BBTOAc relatív csúcsterület értékei a 10 perces és a 3 perces ultrahangos extrakciót követően; a hibasávok a szórást jelölik

75

(19. ábra).


A 10 perces és 3 perces extrakciót követően a tiofének meghatározása GC-MS módszerrel történt. Láthatóan az extrakciós hatékonyság a rövidebb kivonási idő ellenére nem változott, miután az egyes alkotók relatív intenzitása a 3 perces extrakciós idő esetén nem csökkent. A rutin analitikai feladatokhoz ezek után már a 3 perces ultrahangos kivonást alkalmaztuk, ezáltal a mintaelőkészítés egy meglehetősen időigényes lépésének időtartamát a harmadára sikerült csökkentenünk. 4.1.2.3.2. Az elemzési eredmények hihetőségének bizonyítása (validálás) és a módszer analitikai teljesítményjelző paraméterei Az analitikai feladat elvégzését nehezítette, hogy a növényben fellelhető tiofének közül csupán az α-T komponens található kereskedelmi forgalomban. Az α-T mennyiségi meghatározását kalibrációs belső standard módszerrel végeztük el, mely eredményeként a növényi minta száraz súlyára vonatkoztatott abszolút koncentráció értékeket kaptunk. Autentikus referenciaanyagok hiányában a társtiofének abszolút mennyiségének meghatározása nem volt kivitelezhető, ugyanakkor azok mennyisége, vagy mennyiségük változása fontos többletinformációkat szolgáltathat. A növényi tiofének közül így még négy komponenst – a BBT, BBTOAc, AcOCH2BBT és a BBT(OAc)2 származékokat – választottuk ki további kvantitatív meghatározás céljára. Választásunkat az indokolta, hogy az általunk azonosított egyéb tiofének közül a MeBBT és a PBT nem volt meghatározó összetevője a kivonatoknak, mennyiségük nagyon alacsonynak bizonyult. A BBTOH GC-MS analízise pedig a szakirodalmi adatok (Arroo és mtsai 1995c) és saját megfigyeléseink alapján is meglehetősen bizonytalan eredményeket szolgáltatott, vélhetően e komponens hőérzékenysége folytán. A kiválasztott tiofének mennyiségét a belső standardra vonatkoztatott relatív csúcsterület hányados értékekkel jellemeztük. Bár ez a számítás abszolút mennyiségeket nem szolgáltat, a kapott relatív értékek tökéletesen megfelelnek arra, hogy a különböző kísérleti csoportok, minták közötti mennyiségi különbségeket demonstráljuk. Tehát meg tudjuk mondani, hogy pl. két vizsgálati minta közül melyik tartalmaz egy bizonyos komponenst nagyobb mennyiségben, ugyanakkor azt nem tudjuk, hogy konkrétan mi az a mennyiség, és a különbség is csak becsülhető. Azonban ez csakis abban az esetben

76


érvényes,

amennyiben

az

egyes

mintaelőkészítési

lépések

(mintamennyiség,

hígítások, stb.) állandóak. A tiofének szerves oldószeres kivonatban történő mennyiségi meghatározására kidolgozott módszerek analitikai paraméterei, validálási adatai a szakirodalomban meglehetősen hiányosan dokumentáltak. Ezért kiemelten fontosnak tartottuk, hogy a kifejlesztett GC-MS SIM módszert részletesen jellemezzük. A mérőrendszer és a módszer validálását az ICH Q2(R1) (2005), az FDA Guidance (2001) és Balla (2006) ajánlásai alapján végeztük. A gázkromatográf készülék megfelelő működését standard elegyek, n-alkán sorozat, Grob-tesztelegy, 2,2’-bitiofén és α-T standard oldatok rendszeres injektálásával ellenőriztük. A béléscsövet (liner) rendszeresen cseréltük és tisztítottuk, a reinstallálást követően tesztelegyek alkalmazásával bizonyítottuk a megfelelő működést. A tömegspektrométert rendszeresen hangoltuk (autotune) perfluorotributilamin (PFTBA) referenciaanyag használatával. • Szelektivitás Az univerzális és egyben specifikus tömegspektrométer detektorként történő alkalmazása több és pontosabb analitikai információt szolgáltat, mint az általánosan használt FID detektor. A szelektivitás vizsgálata során azt bizonyítjuk, hogy a használt analitikai módszer a vizsgálandó alkotót meg tudja különböztetni a mátrix egyéb komponenseitől.

Ennek

érdekében

tiszta

oldószer injektálásával bizonyítottuk, hogy az Detektor jel

oldószer nem tartalmazott a vizsgálandó alkotók megjelenése helyén szennyező komponenseket (20. ábra).

Belső

injektálásával

standard

igazoltuk,

hogy

vak

minta

szennyező

alkotók nem zavarták a vizsgálandó alkotók meghatározását. Belső standard referenciaanyag Idő (perc)

20. ábra. Az oldószer (kloroform) öt független analízis során regisztrált SIM kromatogramjai

nélküli

kivonat

SIM

kromatogramjának

regisztrálásával győződtünk meg arról, hogy a belső standard megjelenése helyén szennyező

77


komponensek nem jelentkeztek. A kivonatok GC-MS analízise során felvett kromatogramok csúcstisztaság vizsgálatát az MSD ChemStation (Agilent) szoftverrel végeztük el, ezzel igazoltuk, hogy a kromatogramokon látható detektorjelhez, kromatográfiás csúcshoz csakis egy komponens rendelhető, nem történt koelúció. • Ismételhetőség A 13. táblázat demonstrálja a retenciós adatok ismételhetőségét, melyet az adatokból számított relatív standard deviációval (RSD) jellemeztünk. A vizsgálatokhoz a T. patula #TpA6 hairy root klón oldószeres kivonatát használtuk. Az intra-assay során egyazon napon történő mérési eredményeket dolgoztuk fel, míg az inter-assay a hosszú távú vizsgálatot jelöli, mely során három egymást követő napon végzett analízisek eredményeit használtuk fel. A retenciós adatok kiváló ismételhetősége a gázkromatográf készülék pneumatikus, és a kolonnatér hőmérséklet-szabályozó rendszerének kifogástalan működését jelzi. 13 táblázat. T. patula #TpA6 hairy root klón oldószeres kivonatában található tiofének retenciós idő adatainak ismételhetősége Komponens Retenciós adatok RSD (%) intra-assaya inter-assayb belső standard 0,004 0,015 BBT 0,003 0,012 α-T 0,004 0,018 BBTOAc 0,005 0,006 AcOCH2BBT 0,005 0,005 0,004 0,011 BBT(OAc)2 a b

n=5 n = 15

A belső standard anyagra vonatkozatott relatív csúcsterületek ismételhetősége a mennyiségi meghatározás precizitását jelzi. Ennek jellemzésére a T. patula #TpA6 jelű hairy root klón oldószeres kivonatát használtuk, a GC-MS analíziseket SIM

78


üzemmódban végeztük. Intra- és inter-assay vizsgálatokat végeztünk, továbbá három eltérő (egy alacsony, közepes és magas) koncentráció tartományt vizsgáltunk, oly módon, hogy a hígított kivonatokat az α-T tartalomra standardizáltuk. Eredményeinket a 14. táblázatban foglaltuk össze.

14. táblázat. Tiofének GC-MS SIM analízise során regisztrált relatív csúcsterület értékeinek ismételhetősége a T. patula #TpA6 hairy root klón α-T-re standardizált különböző hígítású kivonataiban (n = 3) Komponens Relatív csúcsterületek ismételhetősége RSD % (1,3 µg/ml)a

RSD % (11 µg/ml)a

intra-assay inter-assay BBT α-T

RSD % (45 µg/ml)a

intra-assay inter-assay

intra-assay inter-assay

2,7 0,7

2,4 5,8

1,3 1,6

2,4 2,5

1,5 1,2

3,9 2,1

BBTOAc 3,5 AcOCH2BBT 5,8 10,7 BBT(OAc)2

13,2 19,0 17,6

1,7 4,6 1,9

2,8 7,1 3,4

1,4 8,6 2,7

8,4 17,1 9,0

a

a kivonatok α-T tartalma

A vizsgált tiofének csúcsterület adatainak ismételhetősége megfelelt az elvárásoknak, miután nem haladták meg az FDA irányelvei szerinti 15 %-os RSD értéket. Csupán két komponens, az AcOCH2BBT és a BBT(OAc)2 inter-assay adatai mutattak jelentősebb szórást, amit az okozhatott, hogy ez a két alkotó csak igen kis mennyiségben volt jelen a vizsgált kivonatban. • α-T kalibráció Előzetes

kísérletek

során

igazoltuk,

hogy

1-100 µg/ml

koncentráció

tartományban az α-T és a belső standard anyagként használt 2,2’-bitiofén detektorjele és anyagmennyisége

között

lineáris

összefüggés

áll

fenn.

Az

α-T

kvantitatív

meghatározása kalibrációs belső standard módszerrel történt. Hat pontos kalibrációt készítettünk, az egyes pontokat 4 párhuzamos mérés átlagaként kaptuk, a kalibrációs egyenest súlyfaktor alkalmazása nélkül illesztettük a mérési pontokra. Az alkalmazott

79


koncentráció tartományban a korrelációs együttható minden esetben meghaladta a 0,99 értéket (15. táblázat).

15. táblázat. Az α-T kalibrációs adatai (R = a + bc) c tartomány (µg/ml) A Sa b 1-50 -0,12 0,065 1,55 LOD LLOQ Pontosság (torzítatlanság) 11,1 % (LLOQ)

Sb RSDb (%) 0,056 3,6 3,1 ng/ml 1,2 µg/ml 2,0 % (12 µg/ml)

Linearitás (R2) 0,9990

n 6

0,4 % (50 µg/ml)

R = relatív csúcsterület; c = koncentráció; a = tengelymetszet; Sa = tengelymetszet szórása; b = meredekség; Sb = meredekség szórása; RSDb = meredekség RSD; R2 = korrelációs együttható; n = kalibrációs pontok száma; a kalibrációs paraméterek hat független kalibráció adatainak átlagértékei; minden egyes kalibrációs pont négy mérés átlaga; a belső standard koncentrációja 10 µg/ml; LOD = kimutatási határ; LLOQ = alsó meghatározási határ

Alsó kimutatási határnak (LOD) tekintettük az α-T azon koncentrációját, ahol az alkotó csúcsterülete az alapvonali zajszint háromszorosa volt. Érdekes módon, a kalibrációs

egyenes

egyenletéből

számított

LOD

[ICH Q2(R1)

2005]

érték

nagyságrendekkel magasabb, 741 ng/ml lett. Ez alapján nyilvánvalóvá vált, hogy a kalibráció az LOD környékén már nem lineáris. LLOQ értéknek a legalacsonyabb koncentrációjú kalibrációs pontot választottuk. Érdemes megjegyezni, hogy bár az LOD és LLOQ az analitikai módszer fontos jellemző paraméterei, esetünkben túl nagy jelentőséggel nem bírtak, miután a minták α-T tartalma általában jóval meghaladta e határértékeket. Az analitikai módszer pontossága, torzítatlansága a kapott, mért érték és a valódi érték egyezésének mértéke. E paramétert három koncentráció tartományban vizsgáltuk és az eltérést a valódi értékben kifejezett százalékban adtuk meg. A különbségeket a koncentráció függvényében ábrázolva kapjuk a reziduum „görbét”, mely az analitikai módszer pontosságának nagyon szemléletes ábrázolásmódja (21. ábra). A reziduumok eloszlásából és nagyságából látszik, hogy az eljárás alapvetően megbízható pontossággal rendelkezik, csupán a legalsó, az LLOQ tartományban van jelentősebb eltérés, azonban még ez sem haladja meg az FDA 20 %-os határértékét.

80

Reziduum (%)


10 5 0 -5 -10 0

10

20 30 40 α-T koncentráció (µg/ml)

50

60

21. ábra. Az α-T egy tipikus kalibrációjának reziduum „görbéje”; (n = 4)

• Az oldószeres extrakció ismételhetősége, kivonási hatékonyság, visszanyerés

16. táblázat. Szerves oldószeres extrakció ismételhetősége Komponens RSD (%) BBT 4,5 α-T 5,0 BBTOAc 8,2 AcOCH2BBT 12,6 BBT(OAc)2 7,8 az adatokat három független extrakció három analízisének átlaga szolgáltatja (n = 9)

A

szerves

ismételhetőségének

oldószeres vizsgálata

során

extrakció egyazon

T. patula #TpA6 hairy root mintából három kivonatot állítottunk elő, majd mindegyik kivonatot GC-MS módszerrel elemeztük (16. táblázat). Mind az öt vizsgált tiofén esetében megfelelő szórás értékeket kaptunk, kiugró adatot ebben az esetben is csupán

a

kis

mennyiségben

előforduló

AcOCH2BBT szolgáltatott.

A kivonási hatékonyság vizsgálata az extrakciós módszer tökéletességét, teljességét jelzi. A kivonást a 3.6.1.5. alfejezetben ismertetett módszer szerint végeztük el háromszor 3 perces kivonási idővel (A kivonat). Ezt követően az előzetesen már kiextrahált növényi anyagot tiszta oldószerrel újra kivontuk (B kivonat), majd az eljárást még egyszer megismételtük (C kivonat). Az α-T tartalmat GC-MS módszerrel határoztuk meg. Az utolsó kivonatban (C kivonat) már nem találtunk számottevő mennyiségben α-T-t, így a kivonási hatékonyságot a következő összefüggés alapján számítottuk: kivonási hatékonyság (%) = cA/(cA+cB)×100, ahol cA az A kivonat α-T koncentrációja száraz tömegre vonatkoztatva (µg/g), cB a B kivonatban mért α-T koncentráció száraz tömegre vonatkoztatva (µg/g). Eredményeink

81


alapján az α-T kivonási hatékonysága 96,8 ± 0,16 % (RSD = 0,2 %) lett, amely érték meglehetősen jól ismételhetőnek bizonyult. A

visszanyerés

vizsgálata

az

alkalmazott

módszer

pontosságáról,

a

mintaelőkészítési lépések során bekövetkező esetleges hibákról nyújt információt. A vizsgálat során a mintaelőkészítési lépések legelején ismert mennyiségű analitot adunk az analitot nem tartalmazó vak mátrixhoz, majd a mérés során regisztrált detektorjelét ugyanolyan mennyiségű, tiszta autentikus standard anyag jelével hasonlítjuk össze. Miután az általunk vizsgált komponensek a növényi mintákban esszenciálisan jelen vannak, tiofénvegyületeket nem tartalmazó mátrix minta hiányában standard addíciós eljárással végeztük a visszanyerés vizsgálatot. 75, 150 és 300 µg/ml koncentrációjú metanolos α-T törzsoldatokat készítettünk, melynek 1,0 ml-es részleteit (75, 150 és 300 µg α-T) adtuk az előzetesen elporított T. patula intakt gyökérmintákhoz. A kontroll mintákhoz 1,0 ml tiszta metanolt adtunk. Ezt követően a mintákat a 3.6.1.5. alfejezetben ismertetett módszer (3 perc kivonási idő) szerint extraháltuk, az α-T tartalmat GC-MS módszerrel határoztuk meg. A módszer visszanyerést a következő összefüggés alapján számítottuk: R (%) = 100×c2/(c1+m1/m2), ahol R a visszanyerés (%), c1 a kontroll minta α-T koncentrációja száraz tömegre vonatkoztatva (µg/g), c2 az addícionált minta α-T koncentrációja száraz tömegre vonatkoztatva (µg/g), m2 az addícionált minta tömege (g) és m1 a hozzáadott α-T mennyisége (µg). Az α-T meglehetősen magas és megbízhatóan ismételhető visszanyerési százalékkal rendelkezett mindhárom koncentrációtartományban (75 µg: R = 94,6 ± 0,72 %, RSD75 µg = 0,8 %; 150 µg: R = 89 ± 4,9 %, RSD150 µg = 5,5 %; és 300 µg: R = 95 ± 7,8 %, RSD300 µg = 8,2 %). Autentikus standard referenciaanyagok hiányában ezt a kísérletet a többi vizsgált tiofén esetében nem tudtuk elvégezni. • A szerves oldószeres kivonatok rövidtávú, poszt-preparatív stabilitási vizsgálata A poszt-preparatív stabilitási teszt során a GC-MS analízishez előkészített szerves oldószeres kivonatok rövidtávú stabilitását vizsgáltuk. Egy átlagos mérési sorozat körülbelül két-három napot vett igénybe, a minták ez idő alatt az automata

82


mintaadagolóban helyezkedtek el, szobahőmérsékleten. Annak érdekében, hogy meggyőződjünk a felől, hogy ez idő alatt minőségi és mennyiségi változások nem következnek be, a lemért oldószeres kivonatokat 72 órás szobahőmérsékleten történő állást követően újra elemeztük. A vizsgálatokhoz a T. patula #TpA6 jelzésű hairy root klón szerves oldószeres, tisztított kivonatait használtuk (17. táblázat). 17. táblázat. Tiofének poszt-preparatív stabilitási vizsgálata T. patula #TpA6 hairy root klón oldószeres kivonatában Komponens Tétel Kontroll 72 órát követően 1 2 3

Koncentráció (µg/ml) ± CIa 6,08 ± 0,090 6,03 ± 0,069 8,5 ± 0,22 8,2 ± 0,13 5,3 ± 0,14 5,4 ± 0,17

α-T

1 2 3

Relatív csúcsterület ± CIa 0,470 ± 0,0084 0,466 ± 0,0064 0,69 ± 0,019 0,66 ± 0,012 0,40 ± 0,012 0,41 ± 0,015

BBT

1 2 3

1,86 ± 0,028 2,13 ± 0,054 2,50 ± 0,076

1,84 ± 0,020 2,01 ± 0,033b 2,56 ± 0,090

BBTOAc

1 2 3

1,45 ± 0,028 0,66 ± 0,023 0,64 ± 0,016

1,47 ± 0,028 0,626 ± 0,0091b 0,66 ± 0,024

AcOCH2BBT

1 2 3

0,0315 ± 0,00093 0,028 ± 0,0014 0,0265 ± 0,00024

0,032 ± 0,0013 0,025 ± 0,0013b 0,0269 ± 0,00087

BBT(OAc)2

1 2 3

0,191 ± 0,0042 0,158 ± 0,0061 0,208 ± 0,0043

0,196 ± 0,0050 0,145 ± 0,0048b 0,213 ± 0,0074

α-T

n = 3; a 95 %-os konfidencia intervallum; b szignifikáns különbség

Az eredmények alapján megállapítható, hogy az esetek döntő többségében a 72 órás időtartam alatt szignifikáns változások nem következtek be. Egy esetben, a 2. tétel vizsgálata során azonban a BBT, BBTOAc, AcOCH2BBT és a BBT(OAc)2 relatív csúcsterület értékei csekély, de szignifikáns mértékben csökkentek (egyenként 5,6; 5,2;

83


10,1 és 8,2 %-os csökkenés), azonban az α-T mennyisége változatlan maradt. A legszembetűnőbb változások ismét a minor komponensek, az AcOCH2BBT és a BBT(OAc)2 esetében következtek be. Mindezek alapján elmondható, hogy a szerves oldószeres minta a háromnapos időszakon belül megtartja eredeti összetételét. • Alkalmazás, rutin analízisek A rutin analízisek során egy mérési szekvencia első mintája a vak oldószer volt, melyet a vak belső standard követett. Ezek után történt a kalibrációs pontok, majd maguk a vizsgálandó minták analízise. A vizsgálati minták közé kontroll (QC) mintákat helyeztünk, melyek belső standardot tartalmazó ismert koncentrációjú α-T oldatok voltak. A QC mintákat párosával, három koncentrációban alkalmaztuk (LLOQ, közepes és magas tartomány). Az analitikai eredményeket abban az esetben fogadtuk el, ha a QC minták legalább 67 %-a elfogadható volt (FDA Guidance 2001). Eredményeinket összegezve megállapíthatjuk, hogy a vizsgált öt tiofén anyagcseretermék szerves oldószeres extrakciót követő GC-MS analízise pontos és ismételhető adatokat szolgáltat. A módszer megfelelő szelektivitással és érzékenységgel rendelkezik, így alkalmas a biotechnológiai kísérletek elemzési feladatainak megoldására, a tiofének monitorozására. 4.1.2.4. Tiofének GC-MS vizsgálata SFE kivonatokban A szuperkritikus fluid fázisú szén-dioxid extrakció (SFE) egy nagyon vonzó alternatív kivonási művelet, mely alkalmas lehet tiofének komplex biológiai mátrixból történő preparatív vagy analitikai célú extrakciójára. Ez a környezetbarát technológia sok esetben teljesen, vagy részlegesen helyettesítheti a veszélyes szerves oldószerek használatát. A szuperkritikus fluidumok magasabb diffúziós együtthatóval és alacsonyabb viszkozitással rendelkeznek, mint a megfelelő folyadékok, szelektivitásuk a hőmérséklet és a nyomás befolyásolásával, illetve poláris oldószerek (pl. metanol) kis koncentrációban történő hozzáadásával változtatható. A szén-dioxid igen előnyös tulajdonságú szuperkritikus oldószer, mivel kritikus hőmérséklete (31 ºC) és kritikus

84


nyomása (7,3 MPa) alacsony, inert, nem toxikus, nem káros a környezetre és az extrakció után maradék nélkül eltávozik a termékből (Lang és Wai 2001, Simándi és Kéry 2004, Zougagh és mtsai 2004, Herrero és mtsai 2006, Abbas és mtsai 2008). A tiofének SFE extrakciója egy korábban még nem tanulmányozott, teljesen új eljárás. Rokon növényfajok (T. erecta, T. lucida és T. minuta) SFE kivonatait ugyan már vizsgálták, azonban a tanulmányok az illóolaj és karotinoid színanyagok terpenoid komponenseire összpontosítottak (Wells és mtsai 1992, Vasudevan és mtsai 1997b, Bicchi és mtsai 1999, Naranjo-Modad és mtsai 2000, Ma és mtsai 2008, Gao és mtsai 2009). • Az SFE kivonatok összetétele Az T. patula gyökeréből 40 ºC hőmérsékleten, különböző nyomáson (10, 20, 30 vagy 40 MPa), szerves módosító nélkül, illetve 20 % metanol szerves módosító alkalmazásával SFE kivonatokat állítottunk elő, és elvégeztük tájékoztató jellegű VRK vizsgálatukat (felvitt minta mennyisége: 17-24 µg). A három fő tiofénkomponens, BBT (Rf = 0,82), α-T (Rf = 0,77) és BBTOAc (Rf = 0,62), azonosítható volt a kivonatokban (22. ábra). A VRK alapján a metanol módosító nélkül készített SFE kivonatok (14 minta)

megfelelő

F

tisztaságúak

voltak

ahhoz,

A

hogy

azokat

közvetlenül

B

BBT α-tertiofén BBTOAc

S 1

2

3

4

5

6

7

8

1

2

3

4

5

6

7

8

22. ábra. T. patula gyökér SFE kivonatainak tájékoztató jellegű VRK (Kieselgel 60 F254 szilikagél) vizsgálata; a detektálás λ = 254 nm (A) és λ = 366 nm (B) hullámhosszúságú UV fényben történt; az eluens hexán:dioxán (3:1, v/v) elegye volt; F = front; S = start; 1-4 = szerves módosító nélkül; 5-8 = metanol szerves módosítóval; 1, 5 = 10 MPa; 2, 6 = 20 MPa; 3, 7 = 30 MPa és 4, 8 = 40 MPa nyomáson készített kivonatok

85


gázkromatográfiás analízishez használhassuk. A metanol módosítóval készült kivonatok esetén (5-8 minta) azonban, 254 nm hullámhosszúságú fényben vizsgálva, a lemez startpontján látható erőteljes sötét elszíneződés jelentős mennyiségű poláris összetevő jelenlétére utalt. A módosító tehát számottevően csökkentette az extrakciós eljárás szelektivitását, így a tioféneken kívül egyéb, azoknál polárisabb természetű kísérőanyagok dúsultak fel a mintákban. Ezért e kivonatok GC-MS vizsgálatát megelőző további tisztítása – a szerves oldószeres (metanolos) extrakcióhoz hasonlóan – elkerülhetetlenné vált. Az SFE termékek GC-MS analízise a VRK vizsgálatok eredményeit erősítette meg. A három fő tiofén (BBT, α-T és BBTOAc) minden mintában detektálható volt. A 23. ábrán feltüntetett TIC kromatogramokat vizsgálva elsőre szembetűnik, hogy a szerves módosító nélkül előállított SFE termék összetétele (B) nagymértékben hasonlít a tisztított szerves oldószeres kivonat (A) összetételére. A metanol módosítóval készült SFE kivonatok (C) kromatogramja jóval összetettebb volt, a tioféneken kívül számos egyéb kísérőanyag jelent meg. Továbbá két polárisabb

komponens,

a

palmitinsav,

és

egy

hidroxilcsoportot

tartalmazó

tiofénszármazék, a BBTOH intenzitása jelentősen megnőtt. • Az SFE optimális kísérleti körülményeinek megválasztása Az SFE optimalizációs tanulmányok során a kivonás közben alkalmazott nyomás (10-40 MPa) és a szerves módosító alkalmazásának hatásait vizsgáltuk. Célunk a lehető legmagasabb tiofén kihozatal elérése volt. A T. patula intakt gyökerekből készített SFE termékeket α-T tartalmukra standardizáltuk, melynek meghatározása kalibrációval

történt.

Figyelembe

vettük

továbbá

a

BBT

és

BBTOAc

fő

társkomponensek relatív mennyiségét, mely értékeket a relatív csúcsterület értékekből származtattunk.

86


Detektor jel

7

A

12 11 9 13 8

2

3

1

4

Idő (perc) Detektor jel

7

B

11 12 10 9

3

2

1

13

8 4 5

Detektor jel

Idő (perc)

7 6 17 10

17 15

C

11

7 8

17 20

17 25

17 30

17 35

17 40

17 45

17 50

17 55

17 60

8

17 65

6

12 10

Idő (perc)

23. ábra. T. patula gyökér szerves oldószeres kivonatának (A), SFE kivonatának (B) (T = 40 ºC, p = 30 MPa) és 20 % metanol módosítóval készített SFE kivonatának (C) (T = 40 ºC, p = 30 MPa) TIC kromatogramja; 1 = α-gurjunén, 2 = β-kariofillén, 3 = (E)-β-farnezén, 4 = β-bizabolén, 5 = kariofillén alkohol, 6 = palmitinsav-metilészter, 7 = BBT, 8 = palmitinsav, 9 = linolsav, 10 = BBTOH, 11 = α-T, 12 = BBTOAc és 13 = BBT(OAc)2

A szerves módosító nélkül készített kivonatok között a legalacsonyabb α-T tartalommal a 10 MPa nyomáson készített kivonat rendelkezett. A legmagasabb értékeket a 30 MPa nyomás használata esetén mértük, ez azonban szignifikánsan nem különbözött a 20 és 40 MPa alkalmazása során mért eredményektől (18. táblázat).

87


A 24. ábra a szerves módosító nélkül készült kivonatok relatív tiofén mennyiségét ábrázolja. A nyomás változtatása a BBT mennyiségére nem volt hatással, ugyanakkor az α-T-hez hasonlóan a BBTOAc relatív aránya is a 30 MPa nyomás használata során volt a legmagasabb. 18. táblázat. α-T tartalom a T. patula intakt gyökerek SFE kivonataiban Nyomás (MPa) α-T (µg/g) ± SD RSD (%) 10 267 ± 86,8 32,5 20 511 ± 28,0 5,5 30 653 ± 153,3 23,5 514 ± 17,6a 3,4a 40 500 ± 34,2 6,8 az adatokat három független extrakció három analízisének átlaga szolgáltatja (n = 9) melyet a növényminta száraz súlyára vonatkoztattunk; a metanol módosítóval készült SFE kivonat

A mintákban nyomokban előforduló BBT(OAc)2 mennyisége túl alacsony volt

ahhoz,

hogy

érdemi

következtetéseket vonhassunk le. A tioféntartalom tekintetében tehát a szerves módosító alkalmazása nélküli 30 MPa nyomáson végzett SFE

kivonási

optimálisnak.

eljárás Bár

bizonyult

az

előzetes

kísérletek során nyilvánvalóvá vált, hogy a szerves módosító használata a tiofénekre nézve lényegesen lecsökkenti a kivonás szelektivitását, összehasonlítás céljából a 30 MPa

nyomással

végzett

kísérleteket

metanol

módosító

hozzáadásával

megismételtük. A kivonatokban mérhető α-T mennyisége a módosító hatására nem változott, azonban a további tisztítási lépések miatt a mintaelőkészítés időigényesebbé és bonyolultabbá vált. Ezért a későbbi kísérletek során a szerves módosító használatától eltekintettünk. 1,8

BBT


1,6

α-T

1,4

BBTOAc

1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 10

20 30 Nyomás (MPa)

40

24. ábra. Tiofének relatív mennyisége a T. patula intakt gyökerek eltérő nyomáson előállított SFE kivonataiban; a hibasávok a szórást jelölik (n = 9)

88


• Az SFE módszer ismételhetősége és kivonási hatékonysága A vizsgálatok következő fázisában az előzőleg optimált, szerves módosító alkalmazása nélküli 30 MPa nyomáson végzett SFE kivonási technika egyes analitikai paramétereit kívántuk jellemezni. A kivonatokat a T. patula #TpA6 jelű hairy root kultúrából állítottuk elő, majd GC-MS SIM technikával vizsgáltuk a tiofének detektorjelét. Az egyes komponensekre jellemző RSD értékek a 19. táblázaton 19. táblázat. Az SFE (p = 30 MPa) kivonás ismételhetősége Komponens RSD (%) BBT 12,8 α-T 8,5 BBTOAc 17,0 BBT(OAc)2 17,0 az adatokat három független extrakció három analízisének átlaga szolgáltatja (n = 9)

láthatóak. Jól látszik, hogy az SFE kivonatokban mért

adatok

nagyobb

rendelkeznek, mint a

bizonytalansággal

„klasszikus”

oldószeres

extrakcióval kapott eredmények (lásd 16. táblázat). Ez

a

robusztusságbeli

különbség

az

SFE

bonyolultabb extrakciós mechanizmusaira illetve a készülék

tökéletlenségeire

(pl.

kapillárisok

eldugulása) vezethető vissza. A

kivonási

hatékonyság

vizsgálata

érdekében az előzőleg kivont hairy root kultúrán megismételtük az extrakciós eljárást. A kivonatok α-T tartalmát GC-MS módszerrel mértük, a kivonási hatékonyságot a 4.1.2.3.2. alfejezetben leírt összefüggés alapján számítottuk. Az α-T kivonási hatékonysága így 88 ± 3,3 % (RSD = 3,8 %) lett, amely érték meglehetősen jól ismételhetőnek, azonban a szerves oldószeres extrakció hatékonyságánál szignifikánsan alacsonyabbnak bizonyult (lásd 4.1.2.3.2. alfejezet). 4.1.2.5. Flash kromatográfiás vizsgálatok tiofénvegyületek izolálására Autentikus tiofén referenciaanyagok hiányában célul tűztük ki a T. patula gyökerében található fő tiofénszármazékok izolálását. A rendelkezésünkre álló nagyobb mennyiségű (50 g) növényi anyag nyers metanolos kivonatát automata frakciószedővel felszerelt flash kromatográf készüléken frakcionáltuk. A kezdeti normál fázisú folyadék kromatográfiás paramétereket VRK előtanulmányok eredményei alapján állítottuk be. A gyökér kivonatának flash kromatogramja a 25. ábrán látható.

89


1

2

Detektor jel

4

3

5-6

Idő (perc)

25. ábra. T. patula intakt gyökér szerves oldószeres kivonatának flash kromatogramja; körülmények: FlashPack SIL oszlop (5 g, 25 ml); eluensek: hexán – dioxán; áramlási sebesség: 5 ml/perc; detektálás: λ = 340 nm

A normál fázisú frakcionálás során 6 frakciót gyűjtöttünk, melyek összetételét először VRK, majd GC-MS módszerekkel vizsgálatuk. A VRK alapján az 1. frakció BBT-t, a 2. BBT és α-T elegyét tartalmazta. A 4. frakció BBTOAc, a 6. frakció BBTOH komponensekben dús oldatok voltak (26. ábra).

F BBT α-T BBTOAc BBTOH

S 1

2

3

4

α-T

5

6

26. ábra. Flash frakciók VRK vizsgálata; F = front; S = start; λ = 254 nm

A frakciók GC-MS analízise a VRK vizsgálatok eredményeit erősítette meg. A 27. ábrán a két legfontosabb célmolekulát tartalmazó 1. és 4. frakciók TIC kromatogramja látható. Az 1. frakció tehát döntően a BBT komponenst tartalmazta, míg a 4. frakcióban a BBTOAc dúsult fel. A két komponens további tisztításának érdekében megismételtük az egyes frakciók flash kromatográfiás elúcióját, ezúttal azonban fordított fázisú elválasztást alkalmaztunk.

90


A

BBT

fordított

kromatográfiás vegyületeket nyertünk

Idő (perc)

Detektor jel

elválasztás

flash ered-

tartalmazó (28. ábra).

oldatokat A

BBT

gázkromatográfiás tisztasága 97,0 %, a

BBTOAc

4. frakció

fázisú

ményeként igen tiszta BBT és BBTOAc

α-T

Detektor jel

1. frakció

BBTOAc tisztasága 95,1 % volt. A két izolált tiofént azonban sajnos nem tudtuk kikristályosítani,

Idő (perc)

α-T

fordított

matografálása

anyagot kaptunk.

tartalmú

fázisú

tiszta

kroα-T-t

BBT

2. frakció

és

óvatos

sűrű, olajszerű, folyékony halmazállapotú

Detektor jel

BBT

oldószer

eltávolítását követően sárgásbarna színű,

27. ábra. Az 1. és 4. frakció TIC kromatogramja

A

az

eredményezett (GC tisztaság: 98,4 %), kloroform:metanol 1:1 (v/v)

Idő (perc)

α-T

amely történő

óvatos

áttetsző,

bepárlást

sárgás

színű,

követően nagyméretű

Detektor jel

arányú elegyéből, szobahőmérsékleten

kristályként vált ki.

juk,

hogy

az

alkalmazott

flash

kromatográfiás frakcionálás alkalmas

Detektor jel

Összegzésképpen megállapíthat-

BBTOAc

Idő (perc)

volt tiszta BBT, BBTOAc és α-T komponensek izolátumok gálatát,

izolálására. további

analitikai

felhasználását

csupán

Az vizskis

Idő (perc)

28. ábra. Az izolált és tisztított BBT, α-T és BBTOAc komponensek TIC kromatogramja

anyagmennyiségük gátolta meg.

91


4.2. Tagetes patula intakt növények tiofénvegyületei A magas szintű in vitro hatóanyag-termeléshez alapvető követelmény a kérdéses vegyületből számottevő mennyiséget termelő növényfaj kiválasztása, speciális anyagcseretermékeinek karakterizálása. Irodalmi adatok szerint a vizsgált fajok között a T. patula kiemelkedő tioféntartalommal rendelkezik (Bohlmann és Zdero 1979, Downum és Towers 1983, Ketel 1987, Jacobs és mtsai 1994, Talou és mtsai 1994, Massera és mtsai 1998, Gil és mtsai 2002, Margl 2002), így megfelelő objektumnak találtuk metabolittermelő szövetkultúrák létrehozásának céljára. A teljes virágzási periódusban begyűjtött növények egyes szerveire jellemző tiofénösszetételt szerves oldószeres és optimált SFE extrakciót követően GC-MS módszerekkel határoztuk meg. A növényi szervek tiofénösszetétele jelentős

Detektor jel

különbségeket mutatott (29. ábra).

1

A

5

Detektor jel

2

Detektor jel

6

3

3

2

B

7

4 4

Idő (perc)

5

1

Idő (perc)

4

C

2 1

3

5

6

Idő (perc)

29. ábra. T. patula gyökér (A), virágzat (B) és levél (C) oldószeres kivonatának TIC kromatogramja; 1 = BBT; 2 = palmitinsav; 3 = PBT; 4 = telítetlen zsírsavak; 5 = α-T; 6 = BBTOAc és 7 = BBT(OAc)2

92


A legtöbb tiofénszármazékot az intakt növények gyökérzetében detektáltuk. A BBT, α-T és BBTOAc főkomponenseken kívül a PBT, BBTOH, AcOCH2BBT és BBT(OAc)2 minor összetevők is jelen voltak. A virágzat fő tiofén alkotói ugyanakkor a PBT és α-T voltak, kis mennyiségű BBT-n kívül más tiofént nem detektáltunk. Ugyanakkor jelentős arányban jelentek meg hosszú szénláncú zsírsavszármazékok. A levelek kivonatában is ezek a zsírsav komponensek domináltak, tiofének csupán nyomnyi mennyiségben voltak jelen. Az extrakciós eljárástól függetlenül, a társtiofénekhez hasonlóan, a legnagyobb mennyiségű α-T-t az intakt gyökérzetben mértük (20. táblázat). Az 20. táblázat. T. patula intakt növényi szervek α-T tartalma Minta α-T (µg/g) ± CIa Oldószeres kivonat

SFE kivonat

Virágzat

312 ± 4,2

480 ± 26,6

Gyökérzet

575 ± 23,1

717 ± 31,3

az adatokat három független extrakció három analízisének átlaga szolgáltatja (n = 9) melyet a növényminta száraz súlyára vonatkoztattunk; a 95 %-os konfidencia intervallum

eredmények

alapján

megállapíthatjuk, hogy a növényi szervek

közül

elsődleges

tiofénforrásnak a gyökérzetet kell tekintenünk. Az általunk vizsgált intakt

gyökerekben

dalomban

a

fellelhető

szakiroadatokhoz

hasonló nagyságrendű, ugyanakkor kiemelkedően magas α-T tartalmat

mértünk (Ketel és Breteler 1988, Sütfeld és Breteler 1988, Margl 2002). A növényt tehát alkalmasnak találtuk magas szintű tiofénprodukciós képességgel rendelkező szövettenyészetek indításához. Miután a tiofének legnagyobbrészt a gyökérben lokalizálódtak, a gyökérszerű szövetkultúrák, így a géntranszformált hairy root kultúrák létrehozása igen perspektivikusnak tűnt. A növényi mátrixtól függetlenül mindkét kivonási eljárás esetén azonos tendenciák

voltak

megfigyelhetők,

meglehetősen hasonló

kvalitatív

és

kvantitatív

szempontokból

kivonatokat eredményeztek. Az SFE eljárás ráadásul

szignifikánsan magasabb mennyiségi adatokat szolgáltatott. Az egyszerűbben kivitelezhető és környezetbarát SFE kivonási eljárás tehát alkalmas a „klasszikus” szerves oldószeres extrakció helyettesítésére. Érdemes azonban megjegyezni, hogy a virágzat és levelek kivonatainak rutinszerű GC-MS analízise, jelentős karotinoid tartalmuk miatt, nem javasolt, ugyanis ezen metabolitok a GC rendszert szennyezhetik, ami a hibalehetőségek és a szükséges karbantartások gyakoriságát növelheti.

93


4.3. Tagetes patula géntranszformált hairy root kultúrák 4.3.1. Géntranszformáció, klónszelekció A T. patula in vitro szikleveles csíranövények (30. ábra) hipokotil szárának A. rhizogenes R-1601 és A4Y törzsekkel megjelenő

történt

mikroinjektálás

járulékos

gyökereket

következményeként –

izolálást

és

baktériummentesítést követően – szilárd és folyékony, 2 % szacharózt tartalmazó 1/2 NMS táptalajon tenyésztettük, sötétben. A géntranszformáció eredményeképpen létrejött 30. ábra. 1 hetes steril T. patula szikleveles csíranövény szilárd MS táptalajon

hairy root tenyészetek közül öt életképes, jó növekedési sajátságokkal rendelkező klónt izoláltunk, melyek a #TpR, #TpA1, #TpA5, #TpA6 és #TpA7 jelöléseket kapták. Az R1601 törzzsel történt transzformációt követően létrejött klón

„R” jelzést kapott, az A4Y törzzsel fertőzött kultúrák „A” jelölést kaptak. A szilárd táptalajon nevelt kultúrák a 31. ábrán láthatóak. A 31/F. ábra szetereomikroszkópos képe szemléletesen mutatja, hogy ezen kultúrák nevüket onnan kapták, hogy felületük

A

B

C

D

E

F

31. ábra. T. patula hairy root kultúrák (3 hetes) szilárd táptalajon; A = #TpR; B = #TpA1; C = #TpA5; D = #TpA6; E = #TpA7; F = hairy root gyökér sztereomikroszkópos képe

94


gyökérszőrökkel igen sűrűn borított. A két baktériumtörzzsel indított hairy root kultúrák jellegzetes morfológiai eltéréseket mutattak. Az R-1601-gyel fertőzött tenyészetet lineáris hossznövekedés jellemezte, mely során kevés oldalággal rendelkező hosszú gyökérszálak jöttek létre. Ezzel szemben az A4Y törzs hatására képződött kultúrák sűrűn elágazó, rövidebb gyökérszálakat hoztak létre, melyek meglehetősen tömött, csomós szerkezetet vettek fel. Továbbá ez utóbbi tenyészeteken gyakran bizonyos mértékű dedifferenciáció mutatkozott, mely során kallusz-szerű képződmények alakultak ki. A legerőteljesebb elváltozásokat a #TpA7 jelű klón esetében figyeltük meg, ahol már a kisebb oldalgyökérágak is jelentősen megvastagodtak. Ezzel szemben folyékony táptalajon kalluszosodást csak nagyon ritkán tapasztaltunk. A legjobb növekedési sajátságokkal és speciális metabolit produkciós képességgel rendelkező vonal kiválasztása érdekében klónszelekciós kísérletet végeztünk. A kultúrákat azonos kísérleti körülmények között, folyékony 1/2 NMS táptalajon, klimatizált inkubátor szekrényben tenyésztettük (32. ábra). Szakirodalmi adatok alapján a maximális tiofénprodukció a 34. héten várható (Mukundan és Hjortso 1991b, 2001, Margl 2002), így begyűjtési időpontnak a leoltást

követő

begyűjtött

21. napot

minták

oldószeres

tioféntartalmát

extrakciót

módszerekkel

A

szerves

követően

határoztuk

kromatogramokat

választottuk.

GC-MS

meg.

A

vizsgálva

TIC

azonnal

szembetűnik a #TpR jelű klón a többitől jelentősen

eltérő

tiofénmintázata,

ahol

a

háromgyűrűs α-T igen alacsony intenzitással jelent meg (33. ábra). A klónok jellemző 32. ábra. szekrény

Klimatizált

inkubátor

biomassza

képzését

összehasonlításával

a

növekedési

vizsgáltuk,

értékek

mely

a

szövettenyészet kezdeti tömegére vonatkoztatott biomassza gyarapodást fejezi ki (34. ábra). A kultúrák száraz súlyára vonatkoztatott α-T tartalma és az egy kultúrára eső átlagos α-T produkció a 35. ábrán látható. A #TpR jelű klón kiemelkedő biomassza

95

Detektor jel


1

#TpR

4

7

5

Detektor jel

Idő (perc) 1

#TpA1

4

7

2 3

5 6

Detektor jel

Idő (perc) 1

#TpA5

4

6 7

3 2

5

Detektor jel

Idő (perc) 1

#TpA6

4

7

5 6

3 2

Detektor jel

Idő (perc)

#TpA7

1 4

5

2 7

Idő (perc)

33. ábra. Géntranszformált T. patula hairy root klónok szerves oldószeres kivonatainak TIC kromatogramjai; 1 = BBT; 2 = MeBBT; 3 = PBT; 4 = α-T; 5 = BBTOAc; 6 = AcOCH2BBT; 7 = BBT(OAc)2

96


N ö veked ési érték

14 12 10 8 6 4 2 0

#TpR

#TpA1

#TpA5

#TpA6

#TpA7

34. ábra. T. patula hairy root klónok biomassza produkciója; a hibasávok a 95 % konfidencia intervallumot jelölik (n = 15)

produkciója ellenére α-T termelése elhanyagolhatónak bizonyult. Ezzel szemben a #TpA1 és #TpA6 jelű klónok kimagasló növekedési értékeik mellett kiemelkedő mennyiségű α-T metabolitot állítottak elő (294 ± 95,5 µg/g és 421 ± 18,0 µg/g). Az α-T produkció tekintetétben e két utóbbi vonal között nem találtunk szignifikáns

α -T p r o d u k c ió (µ g /k u ltú r a )

α -T ta r ta lo m (µ g /g )

különbséget, ugyanis a #TpA1 alacsonyabb α-T tartalmát intenzívebb növekedésével

500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0

#TpR

#TpA1

#TpA5

#TpA6

#TpA7

180 160 140 120 100 80 60 40 20 0

#TpR

#TpA1

#TpA5

#TpA6

#TpA7

35. ábra. T. patula hairy root klónok α-T tartalma és produkciója; a hibasávok a 95 % konfidencia intervallumot jelölik (n = 9)

kompenzálta. A társtiofének relatív mennyiségét vizsgálva ugyanakkor a #TpA6 jelű kultúra kimagasló tioféntartalmával egyértelműen kitűnt a klónok közül (36. ábra). A #TpA7 kultúrák tioféntermelése folyékony táptalajon igen csekély volt. Megjegyezzük, hogy e klón szilárd táptalajon kalluszosodásra volt hajlamos.

97

Relatív csúcsterület értékek


20 18

BBT

16

α-T

14

BBTOAc

12

AcOCH2BBT

10

BBT(OAc)2

8 6 4 2 0

#TpR

#TpA1

#TpA5

#TpA6

#TpA7

36. ábra. T. patula hairy root klónok relatív tioféntartalma; a hibasávok a 95 % konfidencia intervallumot jelölik (n = 9)

Eredményeink alapján további vizsgálatok céljára az öt klón közül a magas biomassza

produkcióval

és

kiemelkedő

tioféntermeléssel jellemezhető #TpA6 jelű géntranszformált T. patula hairy root klónt választottuk ki (37. ábra). 4.3.2. A géntranszformáció igazolása A legjobb növekedési és speciális metabolittermelő tulajdonsággal rendelkező #TpA6 jelű géntranszformált T. patula hairy root

klón

genetikai

vizsgálata,

a

37. ábra. 3 hetes T. patula #TpA6 jelű hairy root kultúra folyékony 1/2 NMS táptalajon

transzformáció igazolása, PCR módszerrel történt. Az agrobakteriális Ri plazmid T-DNS részét képező, a hairy root képződésben kulcsfontosságú, az auxin szignáltranszdukciós folyamataiban szerepet játszó rol B és az opinok szintézisét meghatározó man 2 gének meghatározott szakaszait specifikus primerekkel sokszoroztuk meg (Fu és mtsai 2005). A PCR termékek azonosítása gélelektroforézissel történt, a termékek méretét ismert méretű DNS-fragmentumokat tartalmazó

molekulatömeg

markerek

használatával

határoztuk

meg.

A

géntranszformáció sikerességét a fent említett két gén hairy root kultúrákban meglevő

98


jelenléte igazolja. A vizsgálat során a hairy root kultúrán kívül negatív kontrollként az indításhoz használt in vitro növény gyökereit, pozitív kontrollnak pedig az A. rhizogenes A4Y baktériumokat is feldolgoztuk. A gélelektroforézis eredménye a 38. ábrán látható. A T. patula in vitro növényi gyökerekből (negatív kontroll) izolált DNS nem tartalmazta a rol B és man 2 gének jelenlétére utaló szekvenciákat. Az A. rhizogenes A4Y törzsből izolált plazmid DNS (pozitív kontroll) tartalmazta a megfelelő méretű rol B és man 2 gének szekvenciáit. Az eredmények alapján igazoltuk, hogy a #TpA6 hairy root klón szöveteiből izolált DNS egyértelműen tartalmazta a bakteriális plazmidra jellemző génszekvenciákat. Ezáltal bizonyossá vált a gyökeresedésért felelős plazmid szakasz jelenléte a vizsgált hairy root kultúrában.

1

2

3

4

5

6

7

1000 bp 862 bp (rol B)

750 bp

513 bp (man 2)

500 bp

38. ábra. PCR termékek elektroforetikus képe; 1 és 2 = T. patula in vitro intakt gyökér (negatív kontroll); 3 és 5 = T. patula #TpA6 jelű hairy root klón; 4 és 6 = A. rhizogenes A4Y törzs (pozitív kontroll); 7 = DNS-molekulatömeg marker; bp = bázispár

4.3.3. A hairy root kultúra növekedési jellemzőinek és tiofén produkciójának vizsgálata Az optimális biomassza képzés és tiofén produkció meghatározása érdekében úgynevezett növekedésdinamikai vizsgálatot végeztünk. A #TpA6 jelű hairy root klónt folyékony 1/2 NMS táptalajon 7 héten keresztül tenyésztettük, és hetente meghatároztuk friss és száraz súlyát, továbbá GC-MS módszerrel jellemeztük tioféntartalmát.

99


A hairy root kultúrák biomassza gyarapodása egészen az 5. hétig exponenciális jelleget mutatott. A friss súly és száraz súly kultivációs idő függvényében ábrázolt érékeire meglehetősen jól illeszkedő exponenciális görbét tudtunk illeszteni (R2 = 0,9547 és R2 = 0,9539). A kultúrák friss súlya az egész kultivációs periódus alatt folyamatosan nőtt, míg a száraz súly értékek az 5. héttől kezdve nem változtak (39/A. ábra). A növekedési értékek alapján a biomassza produkció az 5. héten érte el tetőpontját, ettől kezdve a növekedés a 7. hét végére szignifikáns mértékben lassult (39/B. ábra).

Friss súly (g)

20

friss súly

0,8

száraz súly

0,7 0,6

A

15

0,5 0,4

10

0,3

Száraz súly (g)

0,9

25

0,2

5

0,1 0

0,0 0

7

14

21

28

35

42

49

52

Tenyésztési idő (nap)

Növekedési érték

25 20

B

15 10 5 0 14

21

28

35

42

49


39. ábra. T. patula #TpA6 hairy root kultúra biomassza produkciós jellemzői; A = friss súly és száraz súly; B = növekedési érték; a hibasávok a 95 % konfidencia intervallumot jelölik (n = 6)

A tiofének termelődése a növekedéstől függetlenül folyamatosan ment végbe, így a bioszintézis megindulása nem mutatott összefüggést a kultúrák fejlődési

100


stádiumaival. A szövetek α-T tartalma feltételezésünknek megfelelően a 3. és 4. héten érte el a maximumot (a 21. napon 212 ± 58,3 µg/g). Az egy kultúrára eső α-T termelés, azaz az α-T produkció a tenyészetek jelentős biomassza növekedése következtében egészen a 6. hét végéig folyamatosan nőtt. A 7. hét végére az α-T tartalom tetemes visszaesése miatt az α-T produkciója is szignifikánsan lecsökkent (40/A. ábra). A 40/B. ábrán a tiofének relatív mennyiségének kultivációs idő függvényében kifejezett változásai láthatóak. A kétgyűrűs BBT szintje az α-T-hez hasonlóan a 3. héten érte el maximális értékét, ugyanakkor ez az érték a vizsgált időszak végéig állandó maradt.

α-T tartalom

α-T tartalom (µg/g)

250

A

α-T produkció

120 100

200

80 150

60

100

40

50

20

0

0 0

7

14

21

28

35

42

49

α-T produkció (µg/kultúra)

140

300

52

Tenyésztési idő (nap) 4,0

α-T BBTOAc

3,0 Relatív csúcsterület

B

BBT

3,5

BBT(OAc)2

2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 0

7

14

21

28

35

42

49


40. ábra. T. patula #TpA6 jelű hairy root klón tioféntartalmának változása a tenyésztési periódus során; A = α-T tartalom és produkció; B = tiofének relatív mennyisége; a hibasávok a 95 % konfidencia intervallumot jelölik (n = 12)

101


A tiofénanyagcsere végtermékeinek számító két komponens, a BBTOAc és BBT(OAc)2 mennyiségi változásai ugyanakkor egészen más képet mutattak. Egy kezdeti, viszonylag magas szintről kiindulva egészen az 5. hét végéig tartó folyamatos csökkenést követően a 7. hét végére mennyiségük szignifikáns mértékben emelkedett. Eredményeink eltértek a nem transzformált in vitro gyökérkultúrák vizsgálata során kapott értékektől, melyek a 4. héttől a tiofének erőteljes visszaeséséről számoltak be (Margl 2002). A

3 hetes

kultúrák

tápközegének

GC-MS

vizsgálata

során

pásztázó

üzemmódban egyáltalán nem, a lényegesen érzékenyebb SIM módban is csupán nyomokban tudtunk tioféneket kimutatni. Az α-T és BBT(OAc)2 jele épphogy csak meghaladta a kimutatási határértéket (41. ábra). Miután a tiofének táptalajba oldódásának mértéke elhanyagolható, a szöveti szintek változását a molekulák

BBT(OAc)2

α-T

BBTOAc

BBT

Detektor jel

asszimilációjának és degradációjának mértéke határozza meg.

Idő (perc)

41. ábra. A folyékony 1/2 NMS táptalaj apoláris frakciójának GC-MS SIM kromatogramja

A növényi szövettenyésztés egy máig megoldatlan problémája, hogy méretnövelés során a tenyészetek speciális metabolit tartalma és produkciója gyakran jelentős mértékben csökken (Giri és Narasu 2000, Suresh és mtsai 2001, 2005). Vizsgálataink eredményei is ezt a tendenciát erősítették meg, amikor a #TpA6 hairy root vonal klónszelekciós és növekedésdinamikai kísérleteinek adatait hasonlítottuk össze. A klónszelekciós kísérletek során 35 ml, a növekedésdinamikai vizsgálatok alkalmával pedig 80 ml folyékony 1/2 NMS táptalajon tenyésztettük a kultúrákat.

102


A méretnövelés során a kultúrák α-T tartalma a felére, míg az egységnyi táptalajra vonatkoztatott α-T produkció közel a negyedére csökkent (42. ábra). Összegzésképpen megállapíthatjuk, hogy a T. patula #TpA6 jelű hairy root klón szöveteinek BBT és α-T tartalma a kultivációs időszak 3. és 4. hetében éri el maximumát. Így későbbi kísérleteink során a 4. hét végét jelöltük meg begyűjtési időpontnak.

4,0

400

α-T tartalom

350

α-T produkció

300

3,5 3,0 2,5

250

2,0

200

1,5

150 100

1,0

50

0,5

0

α-T produkció (mg/l)

α-T tartalom(µg/g)

450

0,0 35 80 Tápközeg térfogata (ml)

42. ábra. #TpA6 hairy root klón α-T tartalma és produkciója a tápközeg térfogata függvényében; a hibasávok a 95 % konfidencia intervallumot jelölik (n = 9)

4.3.4. A T. patula géntranszformált hairy root klón növekedési sajátságainak és tiofén produkciójának retrospektív összehasonlítása Szakirodalmi adatok alapján a géntranszformált hairy root szövettenyészetekre magas szintű, stabil bioszintetikus kapacitás és jelentős genetikai stabilitás jellemző (Toivonen 1993, George és mtsai 2000, Giri és Narasu 2000, Ramachandra Rao és Ravishankar 2002, Tzfira és Citovsky 2006). A 43. ábrán a #TpA6 jelű T. patula hairy root kultúráinak növekedési jellemzői hosszú távú vizsgálatának eredményei láthatóak. A vizsgált közel másfél év során a hairy root szövettenyészetek biomassza produkciója a 80 ml folyékony 1/2 NMS táptalajon 4 hetes kultivációs periódust követően meglehetősen stabilnak mutatkozott. Csupán egy esetben tapasztaltunk

103


szignifikáns

eltérést.

A

vizsgált

időszakban

a

kultúrák

átlagos

növekedési

értéke 10 ± 2,1 (RSD = 20,8 %) volt.

F ris s s ú ly (g )

20 15

száraz súly

A

10 5 0 2008. jan.

2008. szept.

2009. feb.

14 12 N ö v e k e d é s i é rt é k

1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0

friss súly

S z á ra z s ú ly (g )

25

B

10 8 6 4 2 0 2008. jan.

2009. ápr.

2008. szept.

2009. feb.

2009. ápr.

43. ábra. T. patula #TpA6 hairy root kultúrák növekedési sajátságainak retrospektív vizsgálata folyékony 1/2 NMS táptalajon; A = friss súly és száraz súly; B = növekedési érték; a hibasávok a 95 % konfidencia intervallumot jelölik

A szöveti α-T tartalom, α-T produkció és a társtiofének relatív mennyisége is meglehetősen

kiegyenlített

volt.

Az

átlagos

α-T

tartalom

143 ± 34,6 µg/g

(RSD = 24,1 %), az α-T produkció 95 ± 25,3 µg/kultúra (RSD = 26,6 %) volt. A másfél éves vizsgálati időtartam alatt egyértelmű csökkenő tendenciákat nem tapasztaltunk (44. ábra). Vizsgálataink eredményei meggyőző bizonyítékot szolgáltattak arra, hogy a T. patula növényből létrehozott #TpA6 jelű géntranszformált hairy root szövettenyészet hosszútávon is meglehetősen stabil biomassza produkciós képességgel rendelkezik, amihez ráadásul egyenletes bioszintetikus potenciál társul, így tiofén vegyületek nagyobb léptékben történő biotechnológiai előállításában történő felhasználása igen perspektivikusnak tűnik. Eredményeink alapján tehát a vizsgált #TpA6 jelű hairy root klón megfelel a szakirodalomban közölt, géntranszformált hairy root kultúrákkal szembeni elvárásoknak.

104


300


250

A

200 150 100 50 0 2008. jan.

2008.szept.

2009. feb.

2009. ápr.

2008.szept.

2009. feb.

2009. ápr.

140 120

B

100 80 60 40 20 0


[BBT, α-T, BBTOAc, BBT(OAc) 2]

2008. jan.

4,5 4,0

0,20 BBT α-T BBTOAc BBT(OAc)2 AcOCH2BBT

C

3,5 3,0 2,5

0,18 0,16 0,14 0,12 0,10

2,0

0,08

1,5

0,06

1,0

0,04

0,5

0,02

0,0

0,00 2008. jan.

2008.szept.

2009. feb.

Relatív csúcsterület (AcOCH 2BBT)

α -T p ro d u kcó (µ g /ku ltú ra)

160

2009. ápr.

44. ábra. Folyékony 1/2 NMS táptalajon tenyésztett #TpA6 hairy root kultúrák α-T tartalmának (A) és produkciójának (B), illetve a tiofének relatív összetételének (C) retrospektív összehasonlítása; a hibasávok a 95 % konfidencia intervallumot jelölik; folytonos vonallal a teljes vizsgálati időszakra vonatkozó átlagértékeket, szaggatott vonallal azok 95 % konfidencia intervallumát jelöltük

105


4.3.5. A hairy root klón és az intakt gyökerek tiofén metabolitjainak összehasonlítása Vizsgálataink következő szakaszában a 4 hetes folyékony 1/2 NMS táptalajon tenyésztett #TpA6 jelű hairy root kultúra és az indításhoz használt szabadföldön termesztett intakt T. patula növény gyökerének tiofén összetételét hasonlítottuk össze (45. ábra). Az azonos mennyiségű növényi minta tioféntartalmát szerves oldószeres extrakciót követően GC-MS módszerrel elemeztük. A szabadföldi intakt növényi gyökerek

α-T

tartalma

(590 ± 11,1 µg/g)

több

mint

háromszorosa

volt

a

géntranszformált #TpA6 hairy root klón szöveteiben mért értékeknek (169 ± 9,6 µg/g). Érdemes azonban kiemelni, hogy a hairy root tenyészetek BBT (2,9-szeres), BBTOAc (2,8-szeres) és BBT(OAc)2 tartalma szignifikánsan felülmúlta a gyökérben mért értékeket. Úgy tűnik tehát, hogy a géntranszformált kultúrák tiofén anyagcseréje a két tioféngyűrűből felépülő szerkezetek szintézise felé tolódott el.


6 intakt gyökér

5

#TpA6 hairy root

4 3 2 1 0 BBT

α-T

BBTOAc

BBT(OAc)2

45. ábra. Tiofének relatív mennyisége T. patula szabadföldi intakt gyökerek és #TpA6 hairy root kultúra szerves oldószeres kivonatában; a hibasávok a 95 % konfidencia intervallumot jelölik (n = 9)

Összefoglalásként megállapíthatjuk, hogy a #TpA6 jelű géntranszformált hairy root klón az anyanövényhez mérten megfelelő bioszintetikus potenciállal rendelkezett, így alkalmasnak találtuk további biotechnológiai kísérletek céljára.

106


4.4. A T. patula hairy root klón (#TpA6) biomassza képzésének és tiofén produkciójának befolyásolása A produktív sejtvonalak szelekcióját követően a speciális metabolit produkció növelését célzó stratégia következő lépése az alkalmazott tápközeg összetételének optimális megválasztása. A kultúrák közvetlen környezetük változásaira az univerzális és speciális anyagcseréjük megváltoztatásával reagálnak. Az alkalmazott tenyésztési körülmények, ásványi elemek, vitaminok, prekurzorok, növekedést szabályozó anyagok és elicitorok hatásainak vizsgálata fontos szerephez jut a megfelelő tenyésztési rendszerek összeállításának folyamatában. 4.4.1. Az optimális alaptáptalaj kiválasztása Vizsgálataink első lépésében arra kerestünk választ, hogy a növényi szövettenyésztésben általánosan alkalmazott Gamborg B5, Murashige-Skoog (MS) és 1/2 NMS alaptáptalajok milyen hatást gyakorolnak a #TpA6 hairy root kultúrák biomassza és tiofén produkciójára. Általánosságban elmondható, hogy a B5 táptalaj alacsony makroelem koncentrációval, ugyanakkor kiemelkedő vitamin összetétellel rendelkezik. Az MS táptalajok magas makroelem tartalommal bírnak, az 1/2 NMS pedig felére csökkentett nitrogén tartalmú MS táptalajnak felel meg (lásd 4. táblázat). A három alaptáptalajon tenyésztett #TpA6 kultúrákat a 4. hét végén gyűjtöttük be és mértük friss illetve száraz súlyukat. A liofilizált szövetek szerves oldószeres kivonatainak tiofén összetételét GC-MS módszerrel határoztuk meg. A kultúrák biomassza produkcióját jellemző paraméterek a 46. ábrán láthatóak. A tenyészetek friss súly és növekedési értékei nem mutattak szignifikáns különbséget a három vizsgált táptalajon. Az 1/2 NMS és B5 táptalajon kultivált tenyészetek megegyező száraz súllyal rendelkeztek, csupán az MS táptalaj esetén mértünk szignifikánsan alacsonyabb értékeket. Az 1/2 NMS táptalajon kultivált hairy root rendelkezett a legmagasabb α-T tartalommal (122 ± 31,1 µg/g) és produkcióval (98 ± 25,1 µg/kultúra), a többi táptalaj esetén ezen értékek a felére csökkentek. Az α-T tartalom tekintetében tehát egyértelműen az 1/2 NMS a leginkább megfelelő táptalaj, a társtiofének relatív mennyiségét vizsgálva azonban nem ilyen egyszerű kép tárult elénk.

107

20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0

A


12

friss súly

1,2

száraz súly

1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 1/2 NMS

14

1,4 Száraz súly (g)

Friss súly (g)


MS

B5

MS

B5

B

10 8 6 4 2 0 1/2 NMS

46. ábra. Különböző táptalajon (1/2 NMS, MS és B5) tenyésztett 4 hetes #TpA6 hairy root kultúrák biomassza produkciójának jellemzői; A=friss és száraz súly; B=növekedési érték; a hibasávok a 95 % konfidencia intervallumot jelölik (n=10)

A 47. ábra a különböző táptalajon tenyésztett kultúrák tiofén összetételének változásait mutatja. Az MS táptalajon a kétgyűrűs tiofének anyagcsereútjainak két végtermékét képező BBTOAc mennyisége jelentős mértékben, míg az AcOCH2BBT aránya csekély, ugyanakkor szignifikáns mértékben emelkedett. A B5 táptalaj hatására pedig ugyanennek az anyagcsereútnak egyik köztitermékének tekinthető BBT halmozódott fel nagyobb mértékben a szövetekben. Érdekes módon a harmadik anyagcsere végtermék BBT(OAc)2 produkciója meglehetősen stabilnak mutatkozott, mennyisége mindhárom táptalaj esetén megegyezett. Az α-T analízis eredményeinek megfelelően az 1/2 NMS táptalaj a szöveti α-T magas relatív mennyiségével tűnt ki. Miután munkánk során alkalmazott analitikai módszer a szövettenyészetek α-Tre történő standardizálását támogatja leginkább, így további kísérleteink alapjául a magas α-T hozamot nyújtó 1/2 NMS táptalajt választottuk. Magasabb BBT hozamú szövettenyészetek létrehozására ugyanakkor a B5, a BBTOAc mennyiségének növelése érdekében az MS táptalaj alkalmazása ajánlott.

108



6

A

BBT

5

α-T BBTOAc

4

AcOCH2BBT

3

BBT(OAc)2

2 1 0 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0

MS

B5

140



1/2 NMS

B

120

C

100

1/2 NMS

MS

80 60 40 20 0

B5

1/2 NMS

MS

B5

47. ábra. Tiofének relatív összetétele (A), α-T tartalom (B) és α-T produkció (C) eltérő táptalajokon (1/2 NMS, MS és B5) tenyésztett #TpA6 hairy root kultúrákban; a hibasávok a 95 % konfidencia intervallumot jelölik (n = 9)

A táptalaj összetételének változása a génműködés befolyásolásán keresztül hatást gyakorol a kultúrák biomassza képzésére és speciális metabolizmusára. A megfelelő

alaptáptalaj

kiválasztását követően fontosnak

tartottuk

a tiofének

bioszintézisében kiemelkedő jelentőségű kénforrások hatásának vizsgálatát. 4.4.2. A MgSO4 hatásának vizsgálata A tápközegek ásványi összetevői között kiemelt jelentősége a MgSO4-nak van, ami tioféntermelő szövettenyészetek esetében két támadásponttal rendelkezik. Egyrészt a magnézium alapvető szerepet tölt be a sejtek univerzális és speciális anyagcsere folyamataiban, számos enzim kofaktoraként szerepel. Kedvező hatást gyakorol hairy root tenyészetek biomassza képzésére, és sok esetben a speciális metabolit produkcióra egyaránt. Hiányában úgynevezett koralloidos, rövid, tömzsi, kevés oldalággal rendelkező gyökerek alakulnak ki, melyek megfelelő élettani funkciójukat kevésbé

109


képesek ellátni (Szőke 1994). Másrészt az alaptáptalajok a magnéziumot szulfátsó formájában

tartalmazzák.

A

kéntartalmú

tiofénvázas

anyagcseretermékek

kialakulásában nélkülözhetetlen a megfelelő mennyiségű és minőségű kénforrás jelenléte, így a szulfátionok is kiemelkedő jelentőséggel rendelkeznek. A szulfátion ezen kívül a tiofénszintézis szabályozásában is fontos szerepet tölt be, nemcsak metabolikus, hanem DNS szinten molekuláris-genetikai kontrollt is gyakorol a tiofének képződésére (Croes és mtsai 1994, Arroo és mtsai 1997). Kísérletünk során azt tanulmányoztuk, hogy a folyékony 1/2 NMS táptalaj MgSO4 tartalma milyen hatással van a hairy root kultúrák növekedésére és tiofén termelésére. Kontrollnak a 370 mg/l MgSO4 koncentrációjú 1/2 NMS alaptáptalajt tekintettük. A 48. ábra mutatja, hogy MgSO4 hiányában a növekedés jelentős mértékben visszaesett, bár a jellegzetes hiánytüneteket nem tapasztaltuk. Miután Margl (2002) a növekedés visszaesését szulfátmentes táptalajon tenyésztett izolált gyökérkultúrák esetében nem tapasztalta, így a biomassza produkció visszaesése inkább a magnézium hiányának tudható. A MgSO4 magasabb koncentrációban ugyanakkor tovább már nem növelte a biomassza produkció mértékét, ami a kontroll szinten állandósult.

A

0,8

10

0,6

8 6

friss súly

4

száraz súly

2

0,4 0,2 0,0

0

0

370 (kontroll)

600

1600

N ö v e k e d é s i é rté k

12

S z á ra z s ú ly (g )

F ris s s ú ly (g )

14

20

1,0

16

15

B

10 5 0 0

MgSO4 koncentráció (mg/l)

370 (kontroll)

600

MgSO4 koncentráció (mg/l)

48. ábra. #TpA6 hairy root klón biomassza produkciójának jellemzői eltérő MgSO4 tartalmú folyékony 1/2 NMS táptalajon; A=friss és száraz súly; B=növekedési érték; a hibasávok a 95 % konfidencia intervallumot jelölik (n=7)

A kultúrák tioféntartalma ugyancsak jelentős mértékben lecsökkent a MgSO4mentes táptalajon. A kénforrás hiányában a szövetek α-T tartalma majd a negyedére esett vissza (49/A. ábra). A MgSO4 koncentrációjának növelése a vizsgált tiofének szintjeinek emelkedését eredményezte. Növekvő MgSO4 koncentráció hatására két

110

1600


tiofén, az α-T és a BBTOAc mennyisége a kontrollhoz képest szignifikánsan nőtt, míg a társtiofének szintje a kontrollhoz képest már nem változott szignifikáns mértékben (49/B. ábra). A leglátványosabb változás az α-T tartalom tekintetében következett be, az 1600 mg/l MgSO4 tartalmú táptalajon tenyésztett kultúrák α-T tartalma a kontrollhoz képest másfélszeresére, a MgSO4-mentes tápközeghez képest pedig 5,6-szeresére nőtt. Látszik, hogy a szulfátmentes táptalajon a szűkös kénforrások felett főként az univerzális anyagcsere „rendelkezett”, a minimális kénfelesleg pedig metabolikus és vagy molekuláris kontroll mechanizmusok irányítása révén a kisebb kénigényű kétgyűrűs tiofének felépülésének irányába „csordogált”. A „kénspóroló” mechanizmusok aktiválódásának eredményeként a három kénatomot tartalmazó α-T relatív mennyisége nagyon alacsony lett. 3,0 α-T tartalom (µg/g)

A


2,5

150

100

50

2,0

α-T

B

BBTOAc BBT(OAc)2

1,5

0,04 0,03

1,0

0,02 0,01

0,0 0

370 (kontroll)

600

1600

0,00 0

370 (kontroll) 600 MgSO4 koncentráció (mg/l)

MgSO4 koncentráció (m g/l)

1600

49. ábra. #TpA6 hairy root kultúrák α-T tartalma és produkciója (A), illetve a tiofének relatív összetétele (B) eltérő MgSO4 tartalmú folyékony 1/2 NMS táptalajon;

a hibasávok a 95 % konfidencia intervallumot jelölik (n = 9)

Érdekes megfigyelés, hogy a T. patula #TpA6 hairy root kultúrák igen jól toleráltak magasabb MgSO4 koncentrációt is. Intézetünkben más növényfajokon végzett kísérletek eredményei ugyanis azt mutatták, hogy a táptalaj magasabb MgSO4 tartalma (kb. 1000 mg/l) már jelentősen redukálta a biomassza képzést és a speciális metabolit produkciót egyaránt (Bálványos és mtsai 2003, Szőke és mtsai 2004, Bányai és mtsai 2006, Hank 2007). Ezt mi nem tapasztaltuk, sőt az α-T és BBTOAc tartalom további

növekedésére

lehet

számítani.

Ugyanakkor

a

MgSO4

koncentráció

függvényében ábrázolt szöveti α-T tartalom adatpontjaira igen pontosan illeszkedő logaritmus görbe (R2 = 0,9929) azt vetíti előre, hogy jelentős MgSO4 koncentráció növeléssel is csupán az α-T kismértékű fokozása érhető el.

111

0,06 0,05

AcOCH2BBT

0,5

0

0,07 Relatív csú csterü let (AcO CH 2 BBT )

200

0,08 BBT

Relatív csú csterü let [BBT , α -T , BBT O Ac, BBT (O Ac) 2 ]

250


4.4.3. Kéntartalmú prekurzor aminosavak hatásának vizsgálata A tiofének képződéséhez szükséges kénatom nemcsak szervetlen só formájában képes beépülni a poliacetilén alapvázba. Kísérleteink során a tiofének szintézisében fontos szerepet játszó kéntartalmú potenciális prekurzor aminosavak, az L-cisztein és az L-metionin, hairy root kultúrák biomassza képzésére és tiofén produkciójára kifejtett

25

hatásait vizsgáltuk.

20

előkísérletek

Friss súly (g)

Az

alkalmával

bebizonyosodott, hogy 4 hetes kísérleti periódusban 1,0 mM L-cisztein jelentős

15 10

0 0 (kontroll)

biomassza képzését. Az 1,0 mM L1,4

hatást nem tapasztaltunk. Ezért úgy Száraz súly (g)

1,2

döntöttünk, hogy az aminosavakat a 2 hetes hairy root kultúrák tápközegéhez adagoljuk (0,1 mM; 0,6 mM és 1,0 mM).

0,8 0,6 0,4


és cisztein tartalmú folyékony 1/2 NMS

a kultúrák biomassza képzését, sem a friss illetve száraz súly, sem a növekedési érték

16

m etionin

14

cisztein

C

12 10 8 6 4 0 0 (kontroll)

hairy root klón biomassza produkciójának

tartományban egyáltalán nem befolyásolta

1,0

2

táptalajon tenyésztett T. patula #TpA6 jelű

metionin az alkalmazott koncentráció

0,6

18

Az 50. ábra a különböző metionin

A

0,1

Prekurzor am inosav koncentráció (m M)

végén

ábrázolja.

cisztein

0 (kontroll)

aminosav mentes táptalajt tekintettük.

paramétereit

B

m etionin

0,0

gyűjtöttük be a mintákat. Kontrollnak az

jellemző

1,0

1,0

további két hétig tenyésztettük, így a 4. hét

0,6

0,2

A kultúrákat a kezelést követően még a

0,1


metionin esetében ilyen növekedésgátló

analízishez

cisztein

5

mértékben csökkenti a szövettenyészetek

kémiai

A

m etionin

0,1

0,6

1,0


50. ábra. #TpA6 hairy root klón biomassza produkciójának jellemzői eltérő cisztein és metionin tartalmú folyékony 1/2 NMS táptalajon; A = friss súly; B száraz súly; C = növekedési érték; a hibasávok a 95 % konfidencia intervallumot jelölik (n = 6)

112


a kontrollhoz képest szignifikáns mértékben nem változott. Ezzel szemben, minden erőfeszítésünk ellenére a cisztein még a 2 hetes kísérleti időtartam során is szignifikánsan, dózisfüggő mértékben gátolta a tenyészetek növekedését. A növekedési érték – a cisztein koncentrációjának függvényében ábrázolva – fordítottan arányos lineáris kapcsolatot mutatott (R2 = 0,9059). Az 1 mM cisztein hatására a kultúrák száraz súly értéke a kontrollhoz képest több mint felére, a növekedési érték több mint harmadára csökkent. A szövetek tioféntartalmát elemezve az 51/A. ábrán jól látható, hogy a metionin alacsony koncentrációban alkalmazva a kontrollhoz képest nem változtatta meg a kultúrák α-T tartalmát, azonban 1,0 mM hatására már szignifikánsan csökkent a szöveti α-T tartalom (p < 0,021). A 0,1 mM cisztein hatására a tenyészetek α-T tartalma a kontrollhoz képest 1,6-szeresére nőt (p < 0,003), majd a nagyobb koncentrációk hatására dózisfüggő mértékben lineárisan csökkent (R2 = 0,9996).

250


metionin

150 100 50 0 0 (kontroll)

0,1

0,6

metionin

80 60 40 20 0 0 (kontroll)

1,0

0,12

BBTOAc

0,10

BBT(OAc)2 AcOCH2BBT

0,08

3,0

0,06 2,0

0,04

1,0

0,02

0,0

Relatív csúcsterület [BBT, α-T, BBTOAc, BBT(OAc) 2 ]

4,0

α-T

6,0

0,14

Relatív csúcsterület (AcOCH 2 BBT)

Relatív csúcsterület [BBT, α-T, BBTOAc, BBT(OAc) 2 ]

5,0

C

BBT

0,1

0,6

0,6

1,0

5,0 4,0

D

BBT α-T

0,10

BBT(OAc)2 AcOCH2BBT

0,08

3,0

0,06 2,0

0,04

1,0

0,02 0,00 0 (kontroll)

1,0

0,14 0,12

BBTOAc

0,0

0,00 0 (kontroll)

0,1

Prekurzor aminosav koncentráció (mM)


6,0

B

cisztein

100

0,1

0,6

1,0

L-metionin koncentráció (mM)

L-cisztein koncentráció (mM)

51. ábra. #TpA6 hairy root kultúrák α-T tartalma (A) és produkciója (B), illetve a tiofének relatív összetétele eltérő cisztein (C) és metionin (D) tartalmú folyékony 1/2 NMS táptalajon; a hibasávok a 95 % konfidencia intervallumot jelölik (n = 9)

113

Relatív csúcsterület (AcOCH 2 BBT)


200

120

A

cisztein


Az egy kultúra α-T szintetizáló képességét reprezentáló α-T produkció értékeket szemlélve azonban némileg más kép bontakozott ki előttünk (51/B. ábra). A metionin a korábban leírtakhoz hasonlóan, a tenyészetek α-T produkcióját sem befolyásolta jelentős mértékben, ami 1,0 mM hatására a kontroll értékhez képest csupán közel 20 %kal csökkent (p < 0,015). Ugyanakkor a cisztein, habár 0,1 mM koncentrációban képes volt növelni a hairy root kultúrák α-T tartalmát, az α-T produkcióra nézve már nem volt ilyen jótékony hatással, ami a növekedést gátló hatásának köszönhető. 0,1 mM és 1,0 mM tartományban dózisfüggően csökkentette a kultúrák α-T termelését, a változók között lineáris korrelációt találtunk (R2 = 0,9934). Az 1,0 mM cisztein tartalmú táptalajon az α-T produkció a kontroll érték felére csökkent. A táptalajhoz adagolt cisztein az összes vizsgált tiofén mennyiségére hatással volt (51/C. ábra). A 0,6 mM koncentráció szignifikánsan növelte a BBT mennyiségét (p < 0,015), míg a BBTOAc, az AcOCH2BBT és BBT(OAc)2 mennyisége 1,0 mM cisztein hatására érte el maximumát, az eltérések mindegyik esetben szignifikánsnak bizonyultak a kontrollhoz képest (p < 0,00048; p < 0,017 és p < 0,048). Annak ellenére, hogy a cisztein az összes vizsgált tiofén szöveti mennyiségét növelni tudta, erőteljes növekedésgátló hatása, és az ebből következő tiofén produkció visszaesése miatt jelen kísérleti protokoll alkalmazásával gyakorlati jelentősége elhanyagolható. Ugyanakkor elicitorként történő felhasználása perspektivikus lehet. A táptalajhoz adott metioninra a cisztein esetében tapasztaltaktól eltérő metabolikus válasszal reagáltak a hairy root kultúrák (51/D. ábra). Magasabb koncentrációban alkalmazva két tiofén mennyiségét jelentős mértékben növelte. Az 1,0 mM metionin hatására a kontrollhoz képest a BBT főkomponens mennyisége 240 %-kal nőtt (p < 0,0020), a nyomokban előforduló AcOCH2BBT aránya is kismértékben (130 %-kal) emelkedett (p < 0,0068). Az α-T és az egyéb kétgyűrűs társtiofének mennyisége nem változott jelentős mértékben. A két tiofén (BBT és AcOCH2BBT) mennyiségének emelkedése egyáltalán nem elhanyagolható, tekintettel arra, hogy a kezelés a biomassza képzést nem gátolta, így a tiofén produkció is egyértelműen nőtt.

114

_________________________________________________________Következtetések

5. Következtetések Doktori értekezésemben áttekintést nyújtottam a speciális tiofénvegyületeket szintetizáló és felhalmozó Tagetes patula L. növényfajjal kapcsolatos kutatási eredményekről.

A

tiofén

anyagcseretermékek

kiemelt

vizsgálatát

potenciális

gyógyászati és növényvédelmi jelentőségük indokolja. A saját kutatási munka tervezésénél az a cél vezérelt bennünket, hogy a növénykémiai eredményeinkből kiindulva magas bioszintetikus aktivitással és növekedési képességgel rendelkező, stabil in vitro biotechnológiai rendszer létrehozásán keresztül eljussunk a tiofén produkció befolyásolását, fokozását meghatározó kémiai faktorok felismeréséig, hatásaik jobb megismeréséig. A munkánk főbb eredményeit és tanulságait az alábbiakban foglaljuk össze. A tiofének növényi mátrixból történő vizsgálatának érdekében mindenekelőtt egy

új,

gázkromatográfiás-tömegspektrometriás

(GC-MS)

elemzési

módszert

dolgoztunk ki, mely minőségi és mennyiségi meghatározásra egyaránt alkalmas. Tanulmányoztuk

többféle

mintaelőkészítési

metodika

alkalmazhatóságát.

Megállapítottuk, hogy szilárdfázisú mikroextrakcióval és vízgőzdesztillációval az illékony terpenoid illóolaj komponensek kitűnően vizsgálhatók. Az intakt növényi gyökerek és a géntranszformált hairy root minták illóolajában három szeszkviterpént, az α-gurjunént, a β-kariofillént és a (E)-β-farnezént elsőként azonosítottuk. Bár a vízgőzdesztillátumokban tioféneket is detektáltunk, azt tapasztaltuk, hogy az eljárás során az egyes

tiofénekre

vonatkozó

szelekció

nyilvánult

meg,

amely

torz

komponensarányokban, az apolárisabb, illékonyabb komponensek [5-(3-butén-1-inil)2,2’-bitiofén (BBT) és 2,2’:5’,2”-tertiofén (α-T)] dominanciájában tükröződött. A polárisabb

5-(4-hidroxi-1-butinil)-2,2’-bitiofén

(BBTOH)

és

a

nagyobb

molekulatömegű 5-(3,4-diacetoxi-1-butinil)-2,2’-bitiofén [BBT(OAc)2] komponenseket egyáltalán nem detektáltuk. A szöveti tiofének azonosítására és mennyiségi változásaik nyomonkövetésére igen eredményesnek bizonyult a szerves oldószeres extrakciót követő GC-MS analízis. A molekulákban található kén heteroatom jellegzetes izotópmintázata lehetővé tette a tiofének egyértelmű tömegspektrometriás felismerését. A tömegspektrometriás adatok alapján lehetőség nyílt a kénatomszám becslésére, ami igen hasznosnak bizonyult a

115


minőségi analízisek során. A T. patula intakt gyökérzetének és a géntranszformált hairy root kultúrák oldószeres kivonataiban nyolc tiofénvegyületet azonosítottuk [BBT, 5’-metil-5-(3-butén-1-inil)-2,2’-bitiofén

(MeBBT),

5-(3-pentén-1-inil)-2,2’-bitiofén

(PBT), BBTOH, α-T, 5-(4-acetoxi-1-butinil)-2,2’-bitiofén (BBTOAc), 5-metilaceto-5’(3-butén-1-inil)-2,2’-bitiofén (AcOCH2BBT) és BBT(OAc)2], leírtuk fragmentációs adataikat és retenciós index értékeiket, melyek segítségünkre voltak e vegyületek azonosításában a későbbiek során. Az oldószeres kivonási eljárás optimalizálása során sikerült az időigényes művelet időtartamát harmadára csökkentenünk anélkül, hogy a tiofének elemzésének megbízhatósága csökkent volna. Optimáltuk a gázkromatográfia egyik legkritikusabb műveletének, vagyis a mintabeviteli rendszer paramétereit, melynek eredményeként a hőmérséklet-programozott pulsed splitless injektálási technika 0,8 perc splitless time alkalmazásával bizonyult a legérzékenyebb és legmegbízhatóbb eljárásnak. A későbbi analízisek során mindvégig ezt a módszert alkalmaztuk. A mennyiségi meghatározások során az univerzális és egyben specifikus tömegspektrométert szelektív ionkövetéses üzemmódban használtuk. A tisztított oldószeres kivonatok α-T tartalmát többpontos kalibrációs módszerrel határoztuk meg belső standard alkalmazásával. A háromgyűrűs származékon kívül még négy kétgyűrűs társtiofén mennyiségének nyomonkövetését végeztük [BBT, BBTOAc, AcOCH2BBT és BBT(OAc)2], melyek a legfontosabb vizsgálati objektumokban, az intakt növényi gyökerekben és a géntranszformált hairy root kultúrákban egyaránt jelen voltak. Ez utóbbiak esetében beszerezhető autentikus standard anyagok hiányában a belső standard detektorjelére vonatkoztatott relatív területhányados értékeket számítottunk, melyek azonos kísérleti körülmények között a komponensek relatív mennyiségével arányos adatokat szolgáltattak. A tiofének szerves oldószeres kivonatban történő mennyiségi meghatározására kidolgozott módszerek analitikai paraméterei, validálási adatai a szakirodalomban meglehetősen hiányosan dokumentáltak. Ennek okán kiemelt hangsúlyt fordítottunk a GC-MS analízis elemzési eredményei hihetőségének bizonyítására, és a módszer analitikai teljesítményjelző paramétereinek leírására. A mérőrendszer és a módszer validálását az ICH Q2(R1) (2005), az FDA Guidance (2001) és

Balla

(2006)

ajánlásai

alapján

végeztük.

Eredményeinket

összegezve

megállapíthattuk, hogy a vizsgált öt tiofén anyagcseretermék szerves oldószeres

116


extrakciót követő GC-MS analízise pontos és ismételhető adatokat szolgáltat, megfelelő szelektivitással és érzékenységgel rendelkezik, így a tervezett biotechnológiai kísérletek rutin analitikai feladataira alkalmasnak találtuk. Tanulmányoztuk a szuperkritikus fluid fázisú szén-dioxid extrakció (SFE) környezetkímélő, alternatív kivonási eljárásként történő alkalmazhatóságát. A tiofének hatékony extrakciójának érdekében optimáltuk az SFE módszert, tanulmányoztuk az alkalmazott nyomás és szerves módosító hatásait, végül leírtuk a rendszer jellemző analitikai paramétereit. Az eredmények alapján kijelenthetjük, hogy tiofének extrakciójára a szerves módosító nélkül 30 MPa nyomáson végzett SFE kivonás gázkromatográfiás mintaelőkészítésként tökéletesen alkalmazható. Előnyei között szerepel, hogy jelentős mértékben csökkenti a szerves oldószerek használatát, valamint a kivonat nem igényel további tisztítási lépést, közvetlenül alkalmas gázkromatográfiás analízishez. A „klasszikus” oldószeres extrakcióval összehasonlítva azt tapasztaltuk, hogy kvalitatív és kvantitatív szempontokból meglehetősen hasonló kivonatokat eredményeztek. A módszer hátránya a mérési adatok magasabb empirikus szórásában nyilvánult meg, ami a meghatározás bizonytalanságát növelte. Eredményeink arra engednek következtetni, hogy a tiofének vizsgálata során az SFE technika hatékonyan helyettesítheti az általánosan használt oldószeres kivonási eljárásokat. Autentikus tiofén referenciaanyagok hiányában a T. patula gyökerében található fő tiofénszármazékok izolálását normál, majd azt követően fordított fázisú flash kromatográfiás frakcionálás alkalmazásával kíséreltük meg. A nyers metanolos kivonatokból három nagytisztaságú tiofénvegyületet (BBT, α-T és BBTOAc) sikerült előállítanunk. Azonosításuk és tisztasági vizsgálatuk GC-MS módszerrel történt. Üröm az örömben, hogy a három anyag közül csupán, a kereskedelmi forgalomban is beszerezhető tiofént, az α-T-t tudtuk kristályosítani. A T. patula intakt növényben azonosított tiofén vegyületek megoszlása szervspecifikus mintázatot mutatott. A tiofének legnagyobb számban és mennyiségben (α-T tartalom 575 ± 23,1 µg/g; száraz súlyra vonatkoztatva) a gyökérzetben fordultak elő, így ezt a szervet elsődleges tiofénforrásnak tekinthetjük. A virágzatok jelentős α-T tartalma (312 ± 4.2 µg/g; száraz súlyra vonatkoztatva) mellett egy kevéssé ismert tiofén, a PBT aránya emelkedett ki, ugyanakkor a többi tiofén egyáltalán nem vagy csupán nyomokban volt kimutatható. A levelekben tiofénszármazékokat szintén csak

117


nyomokban találtunk. Az általunk vizsgált intakt gyökerekben a szakirodalomban fellelhető adatokhoz hasonló nagyságrendű, ugyanakkor kiemelkedően magas α-T tartalmat mértünk (Ketel és Breteler 1988, Sütfeld és Breteler 1988, Margl 2002), így alkalmasnak találtuk magas szintű tiofénprodukciós képességgel rendelkező hairy root szövettenyészetek indításához. A

T. patula

in

vitro

szikleveles

csíranövények

hipokotil

szárának

Agrobacterium rhizogenes R-1601 és A4Y törzsekkel történt mikroinjektálása következtében létrejött számos hairy root tenyészet közül öt életképes, jó növekedési sajátságokkal rendelkező klónt izoláltunk (#TpR, #TpA1, #TpA5, #TpA6 és #TpA7). A legjobb növekedési tulajdonsággal és speciális metabolit, azaz tiofén produkciós képességgel rendelkező vonal kiválasztása érdekében klónszelekciós kísérletet végeztünk. Két vonal, a #TpA1 és #TpA6 jelű klónok egyértelműen kitűntek intenzív növekedésük

és

kiemelkedő

α-T

produkciós

(118 ± 38,4 µg/kultúra

és

121 ± 5,2 µg/kultúra) képességük tekintetében. Perdöntő bizonyítékként a társtiofének relatív mennyisége szolgált, amely a #TpA6 jelű klón esetén többszörösen meghaladta a konkurens vonalra jellemző értékeket. Ezek alapján tehát a további vizsgálatok céljára az öt klón közül a magas biomassza produkcióval és kiemelkedő tioféntermeléssel jellemezhető #TpA6 jelű géntranszformált T. patula hairy root klónt választottuk ki. A legjobb növekedési és speciális metabolittermelő tulajdonsággal rendelkező #TpA6 jelű hairy root klón genetikai vizsgálata, a transzformáció igazolása PCR módszert követő gélelektroforézis segítségével történt, mely során azonosítottuk a hairy root tenyészet genomjába beépült transzgén jelenlétét. A vizsgálatok következő szakaszában részletesen jellemeztük a #TpA6 jelű hairy root klón növekedési és tiofén produkciós tulajdonságait. A kultúrák biomassza gyarapodása egészen az 5. hétig exponenciális jelleget mutatott. A tiofének szintézise független

volt

a

tenyészetek

növekedésétől,

a

legmagasabb

α-T

tartalmat

(212 ± 58,3 µg/g; száraz súlyra vonatkoztatva) a 3. héten, az intenzív növekedési szakaszban mértünk. A társtiofének közül a kétgyűrűs BBT szintje az α-T-hez hasonlóan a 3. héten érte el maximális értékét, ugyanakkor a tiofén-bioszintézis végtermékeinek számító két komponens, a BBTOAc és BBT(OAc)2 mennyisége a vizsgált időszak végén, a 7. héten volt a legmagasabb. Eredményeink eltértek a nem transzformált in vitro gyökérkultúrák vizsgálata során kapott adatoktól, melyek a

118


4. héttől a tiofének mennyiségének erőteljes visszaeséséről számoltak be (Margl 2002). Miután a tenyészetek táptalajában tiofének csak nyomokban fordultak elő, arra a következtetésre jutottunk, hogy a tiofének tápközegbe történő oldódásának mértéke elhanyagolható, így a szöveti szintek változását a molekulák asszimilációjának és degradációjának mértéke határozza meg. A hairy root kultúrákat 35 és 80 ml táptalajban tenyésztve azt tapasztaltuk, hogy a méretnövelés során a szöveti α-T tartalom a felére, míg az egységnyi táptalajra vonatkoztatott α-T produkció közel a negyedére csökkent. Összehasonlítottuk a #TpA6 jelű hairy root kultúra és az indításhoz használt szabadföldön termesztett intakt T. patula növény gyökerének tiofén összetételét. A hairy root kultúrákban a kétgyűrűs tiofének – BBT, BBTOAc és BBT(OAc)2 – mennyisége az intakt gyökerekhez képest szignifikánsan, közel háromszorosára nőtt. Ezzel szemben a háromgyűrűs α-T tartalom (hairy root α-T: 169 ± 9,6 µg/g) az intakt gyökérhez képest harmadára esett vissza (intakt gyökér α-T: 590 ± 11,1 µg/g). Úgy tűnik tehát, hogy a géntranszformált kultúrák tiofén anyagcseréje a két tioféngyűrűből felépülő szerkezetek bioszintézise felé tolódott el. Összefoglalásként megállapíthattuk, hogy a #TpA6 jelű géntranszformált hairy root klón az anyanövényhez mérten megfelelő bioszintetikus potenciállal rendelkezik, így alkalmas objektumnak találtuk a tiofének produkciójának befolyásolását, növelését célzó biotechnológiai kísérletekhez. Munkánk

következő

szakaszában

a három

leggyakrabban

alkalmazott

alaptáptalaj, a Gamborg B5, Murashige-Skoog (MS) és felére csökkentett nitrogén tartalmú MS (1/2 NMS) táptalajok biomassza képzésre és tiofén termelésre kifejtett hatásait vizsgáltuk. A kultúrák növekedését az eltérő táptalajok szignifikánsan nem befolyásolták, ugyanakkor a tiofén metabolizmusban lényeges eltéréseket tapasztaltunk. A B5 táptalajon a BBT szintjének kismértékű emelkedését tapasztaltuk, míg az MS táptalaj a BBTOAc relatív mennyiségét növelte jelentősen. A módosított MS táptalajon (1/2 NMS) az α-T tartalom (122 ± 31,1 µg/g) és az α-T produkció (98 ± 25,1 µg/kultúra) egyaránt kétszeresére nőtt. Az MS és az 1/2 NMS táptalaj használata esetén tapasztalt bioszintetikus különbségek egyértelműen a nitrogénforrás mennyiségi különbségére vezethetők vissza. A tápközegek ásványi összetevői közül a kiemelt jelentőségű MgSO4 hatását vizsgáltuk. A MgSO4 hiányában a kultúrák biomassza produkciója és tioféntartalma jelentős mértékben lecsökkent, a szövetek α-T tartalma majd a negyedére esett vissza.

119


A szulfátmentes táptalajon a szűkös kénforrások miatt a kisebb „kénigényű” kétgyűrűs tiofének felépülése preferált. A „kénspóroló” mechanizmusok aktiválódásának következtében

a

három

kénatomot

tartalmazó

α-T

mennyisége

csökkent

legjelentősebben. Növekvő MgSO4 koncentráció hatására a biomassza produkció a kontroll szinten stabilizálódott, és két tiofén, az α-T és a BBTOAc, mennyisége a kontrollhoz képest szignifikánsan nőtt. A többi társtiofén szintje pedig a kontroll értéken állandósult. Az 1600 mg/l MgSO4 tartalmú táptalajon tenyésztett kultúrák α-T tartalma (242 ± 29,5 µg/g; száraz súlyra vonatkoztatva) a kontroll másfélszeresére nőtt. Érdekes megfigyelés, hogy a T. patula #TpA6 hairy root kultúrák igen jól toleráltak magasabb MgSO4 koncentrációt is. Intézetünkben más növényfajokon végzett kísérletek eredményei ugyanis azt mutatták, hogy a táptalaj magasabb MgSO4 tartalma (kb. 1000 mg/l) már jelentősen redukálta a biomassza képzést és a speciális metabolit produkciót egyaránt (Bálványos és mtsai 2003, Szőke és mtsai 2004, Bányai és mtsai 2006, Hank 2007). Ezt mi nem tapasztaltuk, sőt további α-T és BBTOAc szintézist fokozó hatásra lehet számítani. A tiofének szintézisében fontos szerepet játszó kéntartalmú, potenciális prekurzor aminosavak, az L-cisztein és az L-metionin, a hairy root kultúrák biomassza képzésére és tiofén produkciójára kifejtett hatásait is vizsgáltuk. A cisztein az összes vizsgált tiofén mennyiségét szignifikáns mértékben növelte, ugyanakkor dózisfüggően gátolta a szövetek növekedését, ami végül a tiofén produkció csökkenéséhez vezetett. Az 1,0 mM cisztein hatására az α-T produkció a kontroll – az aminosav mentes 1/2 NMS táptalajon észlelt – érték felére csökkent. A táptalajhoz adott metionin nem befolyásolta jelentősen a tenyészetek növekedését. Viszont kiemelést érdemel, hogy a vezető tiofén komponens – a BBT – mennyisége a kontrollhoz képest 2,4-szeresére, a nyomokban előforduló AcOCH2BBT aránya pedig 1,3-szeresére emelkedett. Tekintettel arra, hogy a kezelés a biomassza képzést nem gátolta, ezek a mennyiségi változások a két anyagcseretermék produkciójának egyértelmű növekedését jelzik. A tiofén produkció növelését célzó kísérletek eredményei alapján az alábbi javaslatokat tesszük. Magas α-T produkciójú hairy root szövettenyészet létrehozásához alacsony nitrogén tartalmú 1/2 NMS táptalaj használata mellett az igen magas, akár 1600 mg/l MgSO4 koncentráció alkalmazása javasolt. A BBT szintézise B5 tápközeg használatával és 1,0 mM metionin alkalmazásával növelhető. Magas BBTOAc tartalmat

120


MS táptalajon történő hosszabb (5-6 hetes) kultivációval és 1600 mg/l MgSO4 koncentráció alkalmazásával érhetjük el. Az AcOCH2BBT mennyisége MS táptalajon történő tenyésztéssel és 1,0 mM metionin alkalmazásával fokozható. Érdekes módon, a BBT(OAc)2 mennyisége csupán a cisztein kezelés hatására fokozódott szignifikáns mértékben, azonban a növekedésgátló hatás következtében ez a megfigyelés csupán teoretikus jelentőséggel bír. Ezen tiofénszármazék mennyiségét így csupán hosszabb tenyésztési (5-6 hetes) periódussal tudnánk növelni. A majd másfél éven keresztül végzett sorozatos kísérletek és vizsgálatok eredményeként összegyűlt adatok felvetették annak lehetőségét, hogy az azonos kísérleti körülmények között fenntartott kultúrák vizsgálati eredményeit retrospektív módon összehasonlítsuk, ami által képet kaptunk a géntranszformált T. patula #TpA6 jelű hairy root klón hosszú távú növekedési sajátságairól és tiofén produkciójáról. A szövettenyészetek biomassza képzése a 80 ml folyékony 1/2 NMS táptalajon 4 hetes kultivációs periódust követően meglehetősen stabilnak mutatkozott, az átlagos növekedési érték 10 ± 2,1 (RSD = 20,8 %) volt. A szöveti α-T tartalom, α-T produkció és a társtiofének relatív mennyisége is meglehetősen kiegyenlített volt. Az átlagos α-T tartalom 143 ± 34,6 µg/g (RSD = 24,1 %), az α-T produkció 95 ± 25,3 µg/kultúra (RSD = 26,6 %) volt. A másfél éves vizsgálati időtartam alatt csökkenő tendenciákat nem tapasztaltunk, ami a jövőre nézve is a biokémiai potenciál további stabilitását vetíti előre. A szakirodalomban fellelhető adatokkal összevetve a T. patula hairy root kultúrák hosszú távú stabil bioszintézise jóval felülmúlta a kallusz és sejtszuszpenziós tenyészetek képességeit. Vizsgálataink eredményei meggyőző bizonyítékot szolgáltattak arra, hogy a T. patula növényből létrehozott #TpA6 jelű géntranszformált hairy root szövettenyészet hosszútávon is meglehetősen stabil biomassza produkciós képességgel rendelkezik, amihez ráadásul egyenletes és magas szintű bioszintetikus potenciál társul, így a tiofén vegyületek nagyobb léptékű biotechnológiai előállítása céljából történő felhasználása perspektivikusnak tűnik.

121

_________________________________________________________Összefoglalás

6. Összefoglalás A Tagetes patula L. gyökérzetében jellegzetes, kéntartalmú, tiofénvázas speciális anyagcseretermékek szintetizálódnak, melyek jelentős biocid hatásuk révén kerültek a kutatások előterébe. Célunk magas szintű, stabil tiofén produkciós képességgel rendelkező, jól növekedő T. patula géntranszformált hairy root kultúrák létrehozása volt. A tiofének növényi mátrixból történő vizsgálatára, minőségi és mennyiségi meghatározására egy új, gázkromatográfiás-tömegspektrometriás (GC-MS) elemzési módszert dolgoztunk ki, melyet optimáltunk és validáltunk. Agrobacterium rhizogenes mediált genetikai transzformációval számos hairy root klónt állítottunk elő. Közülük a magas biomassza produkcióval és kiemelkedő tioféntermeléssel jellemezhető #TpA6 jelű klónt választottuk ki részletes vizsgálatok céljára, melynek α-T tartalma a 3. héten érte el maximumát (212 ± 58,3 µg/g). Az intakt növényhez képest e hairy root kultúrák számos tiofént [BBT, BBTOAc és BBT(OAc)2] lényegesen nagyobb mennyiségben szintetizáltak. Megfigyeltük, hogy a hairy root kultúrák α-T tartalma kétszeresére nőtt csökkentett nitrogén tartalmú MS táptalajon (1/2 NMS). Az optimális táptalaj kiválasztását követően a különböző kénforrások tiofén produkcióra kifejtett hatásait vizsgálva megállapítottuk, hogy a MgSO4 koncentráció növelésének hatására az α-T és a BBTOAc mennyisége 1,5-szeresére nőtt. A kéntartalmú prekurzor aminosavak közül a cisztein az összes vizsgált tiofén mennyiségét növelte, ugyanakkor dózisfüggő mértékben gátolta a szövetek növekedését. A táptalajhoz adott metionin pedig nem befolyásolta a tenyészetek növekedését, ugyanakkor 1,0 mM koncentrációban alkalmazva 2,4-szeresére növelte a vezető tiofén komponens, a BBT mennyiségét, és 1,3-szeresére emelte a nyomokban előforduló AcOCH2BBT szintjét a szövetekben. Vizsgálataink eredményei meggyőző bizonyítékot szolgáltattak arra, hogy a T. patula növényből létrehozott #TpA6 jelű géntranszformált hairy root szövettenyészet hosszútávon is meglehetősen stabil biomassza produkciós képességgel rendelkezik, amihez egyenletes és magas szintű bioszintetikus potenciál társul, így tiofén vegyületek nagyobb

léptékű

biotechnológiai

előállítása

perspektivikusnak tűnik.

122

céljából

történő

felhasználása

______________________________________________________________Summary

7. Summary The roots of Tagetes patula L. (French marigold) accumulate a wide range of sulphur-containing thiophenes having remarkable biocide effects. The purpose of our work was to produce T. patula hairy root clones by the Agrobacterium rhizogenes mediated genetic transformation and to study the biomass and special metabolite production in order to select the optimal hairy root line. A new gas chromatographic method coupled with mass spectrometric detection (GC-MS) was developed, optimized and validated for the simultaneous analysis of thiophene compounds in the complex biological matrix. Several hairy root clones formed after the genetic transformation by A. rhizogenes. The #TpA6 hairy root had the highest biomass formation and thiophene production among the clones studied; therefore it was selected for further experiments. The maximal α-T content (212 ± 58.3 µg/g) was observed at the end of the third week, during the intensive growing period. The content of three thiophenes [BBT, BBTOAc, and BBT(OAc)2] in hairy root tissues exceeded significantly the contents in the roots of intact field-grown plants. A 2-fold increase of the α-T content was observed on the MS medium with reduced nitrogen content (1/2 NMS). The selection of the optimal culture medium was followed by the study of the effects of different sulphur-sources. Increasing the MgSO4 concentration resulted 1.5-fold increase of α-T and BBTOAc contents. Cysteine increased the thiophene amounts significantly, however, considerably inhibited the biomass formation in a dose-dependent manner. Whereas, the biomass yield was not affected by the methionine added. Moreover, 1.0 mM methionine caused a 2.4-fold increase in the BBT content, and a 1.3-fold increase in the AcOCH2BBT content. The results of our studies suggest that the T. patula #TpA6 hairy root tissue cultures had fairly stable biomass production and remarkable long-term biosynthetic potential. Consequently it seems to be a promising in vitro plant tissue culture system that can be used for the large-scale biotechnological production of thiophenes.

123

_________________________________________________________Irodalomjegyzék

8. Irodalomjegyzék Abbas KA, Mohamed A, Abdulamir AS, Abas HA (2008) A review on supercritical fluid extraction as new analytical method. Am J Biochem & Biotech, 4: 345-353. Adams RP. Identification of essential oil components by gas chromatography/quadrupole mass spectroscopy. Allured Publ Corp, Carol Stream, 2001. Arroo RRJ, De Brouwer APM, Croes AF, Wullems GJ. (1995a) Thiophene interconversion in elicitor-treated roots of Tagetes patula L. Plant Cell Rep, 15: 133137. Arroo RRJ, Develi A, Meijers H, van de Westerlo E, Kemp AK, Croes AF, Wullems GJ. (1995b) Effect of exogenous auxin on root morphology and secondary metabolism in Tagetes patula hairy root cultures. Physiol Plant, 93: 233-240. Arroo RRJ, Jacobs JJMR, de Koning EAH, de Waard M, van de Westerlo E, van Galen PM, Swolfs AEM, Klunder AJH, Croes AF, Wullems GJ. (1995c) Thiophene interconversions in Tagetes patula hairy-root cultures. Phytochemistry, 38: 1193-1197. Arroo RRJ, Jacobs JJMR, Van Gestel JAM, Kenkel H, Jannink W, Croes AF, Wullems GJ. (1997) Regulation of thiophene biosynthesis by sulphate in roots of marigolds. New Phytol, 135: 175-181. Bais HP, Madhusudhan R, Bhagyalakshmi N, Rajasekaran T, Ramesh BS, Ravishankar GA. (2000) Influence of polyamines on growth and formation of secondary metabolites in hairy root cultures of Beta vulgaris and Tagetes patula. Acta Physiol Plant, 22: 151-158. Balla J. A gázkromatográfia analitikai alkalmazásai. Edison House, Budapest, 2006. Bányai P, Kuzovkina IN, Kursinszki L, Hoff K, Kiss AS, Szőke É. (2006) Effect of magnesium on the growth and anthraquinone production of genetically transformed Rubia tinctorum hairy root cultures. Magnes Res, 19: 72-73. Bálványos I, Szőke É, Kursinszki L. (2003) Effect of macroelements on the growth and lobeline production of Lobelia inflata L. hairy root cultures. Acta Hortic, 597: 245-251. Benavides MP, Caso OH. (1993) Plant regeneration and thiophene formation in tissue cultures of Tagetes mendocina. Plant Cell Tissue Organ Cult, 35: 211-215. Berendschot TTJM, Goldbohm RA, Klöpping WAA, van de Kraats J, van Norel J, van Norren D. (2000) Influence of lutein supplementation on macular pigment, assessed with two objective techniques. Invest Ophthalmol Vis Sci, 41: 3322-3326. Bicchi C, Binello A, Rubiolo P. (1999) Supercritical carbon dioxide in combination with silica gel to fractionate essential oils. Phytochem Anal, 10: 17-21.

124


Bicchi C, Frattini C, Pellegrino G, Rubiolo P, Raverdino V, Tsoupras G. (1992) Determination of sulphurated compounds in Tagetes patula cv. nana essential oil by gas chromatography with mass spectrometric, Fourier transform infrared and atomic emission spectrometric detection. J Chromatogr A, 609: 305-313. Bohlmann F. Naturally-occurring acetylenes In: Lam J, Breteler H, Arnason T, Hansen L (szerk.), Chemistry and Biology of Naturally-Occurring Acetylenes and Related Compounds (NOARC). Elsevier, Amsterdam, Oxford, New York, Tokyo, 1988: 1-19. Bohlmann F, Burkhardt T, Zdero C. Naturally Occurring Acetylenes. Academic Press, New York, 1973. Bohlmann F, Zdero C. (1979) Über dimere Terpenketone aus Tagetes gracilis. Phytochemistry, 18: 341-343. Bohlmann F, Zdero C. Naturally Occurring Thiophenes. In: Gronowitz S (szerk.), Thiophene and Its Derivatives, Pt 1. Wiley, New York, 1985: 261-321. Breteler H, Ketel DH. Tagetes ssp. (marigolds): in vitro culture and the production of thiophenes. In: Bajaj YPS (szerk.), Biotechnology in Agriculture and Forestry (Vol. 21), Medicinal and Aromatic Plants IV. Springer, Berlin, Heidelberg, 1993: 387-412. Buena AP, Díez-Rojo MÁ, López-Pérez JA, Robertson L, Escuer M, Bello A. (2008) Screening of Tagetes patula L. on different populations of Meloidogyne. Crop Prot, 27: 96-100. Buitelaar RM, Casário MT, Tramper J. (1992) Elicitation of thiophene production by hairy roots of Tagetes patula. Enzyme Microb Technol, 14: 2-7. Buitelaar RM, Langenhoff AAM, Heidstra R, Tramper J. (1991) Growth and thiophene production by hairy root cultures of Tagetes patula in various two-liquid-phase bioreactors. Enzyme Microb Technol, 13: 487-494. Buitelaar RM, Leenen EJTM, Geurtsen G, de Groot AE, Tramper J. (1993) Effects of the addition of XAD-7 and of elicitor treatment on growth, thiophene production, and excretion by hairy roots of Tagetes patula. Enzyme Microb Technol, 15: 670-676. Cáceres A, Alvarez AV, Ovando AE, Samayoa BE. (1991) Plants used in Guatemala for the treatment of respiratory diseases. 1. Screening of 68 plants against Gram-positive bacteria. J Ethnopharmacol, 31: 193-208. Cáceres A, Cano O, Samayoa B, Aguilar L. (1990) Plants used in Guatemala for the treatment of gastrointestinal disorders. 1. Screening of 84 plants against Enterobacteria. J Ethnopharmacol, 30: 55-73. Cáceres A, Figueroa L, Taracena AM, Samayoa B. (1993a) Plants used in Guatemala for the treatment of respiratory diseases. 2: Evaluation of activity of 16 plants against Gram-positive bacteria. J Ethnopharmacol, 39: 77-82. Cáceres A, Torres MF, Ortiz S, Cano F, Jauregui E. (1993b) Plants used in Guatemala for the treatment of gastrointestinal disorders. IV. Vibriocidal activity of five American plants used to treat infections. J Ethnopharmacol, 39: 73-75.

125


Cagniant P, Cagniant D. (1975) Recent advances in the chemistry of benzo[b]furan and its derivatives. Part I: occurrence and synthesis. Adv Heterocycl Chem, 18: 337-482. Camm EL, Towers GHN, Mitchell JC. (1975) UV-mediated antibiotic activity of some Compositae species. Phytochemistry, 14: 2007-2011. Caniato R, Filippini R, Cappelletti EM, Scandola M, Traldi P. (1990) Direct analysis of thiophene-containing compounds in Tagetes (Asteraceae) leaf secretory cavities by tandem mass spectrometry. Anal Chim Acta, 232: 253-259. Cespedes CL, Uchoa A, Salazar JR, Perich F, Pardo F. (2002) Plant growth inhibitory activity of p-hydroxyacetophenones and tremetones from Chilean endemic Baccharis species and some analogous: a comparative study. J Agric Food Chem, 50: 2283-2292. Chan GFQ, Lee MM, Glushka J, Towers GHN. (1979) Photosensitizing thiophenes in Porophyllum, Tessaria and Tagetes. Phytochemistry, 18: 1566. Chan GFQ, Towers GHN, Mitchell JC. (1975) Ultraviolet-mediated antibiotic activity of thiophene compounds of Tagetes. Phytochemistry, 14: 2295-2296. Croes AF, Aarts AM, Bosveld M, Wullems GJ. (1989a) Control of thiophene accumulation in calli of two Tagetes species. Physiol Plant, 76: 205-210. Croes AF, Bosveld M, Wullems GJ. Control of thiophene accumulation in Tagetes. In: Lam J, Breteler H, Arnason T, Hansen L (szerk.), Chemistry and Biology of NaturallyOccurring Acetylenes and Related Compounds (NOARC). Elsevier, Amsterdam, Oxford, New York, Tokyo, 1988: 255-265. Croes AF, Jacobs JJMR, Arroo RRJ, Wullems GJ. (1994) Thiophene biosynthesis in Tagetes roots: molecular versus metabolic regulation. Plant Cell Tissue Organ Cult, 38: 159-165. Croes AF, Jacobs JJMR, Arroo RRJ, Wullems GJ. (1995) Molecular and metabolic control of secondary metabolism. Plant Cell Tissue Organ Cult, 43: 127-130. Croes AF, van den Berg AJR, Bosveld M, Breteler H, Wullems GJ. (1989b) Thiophene accumulation in relation to morphology in roots of Tagetes patula. Planta, 179: 43-50. Daniels F Jr. (1965) A simple microbiological method for demonstrating phototoxic compounds. J Invest Dermatol, 44: 259-263. Dános B. Farmakobotanika. Gyógynövényismeret. Semmelweis Kiadó, Budapest, 2006: 234-235. Dános B, Tétényi P, Héthelyi É, Juhász G. (1988) The secretory systems of the Asteraceae family their significance in cosmetics and aromatherapy. Herba Hung, 27: 127-136. Dharmagadda VSS, Naik SN, Mittal PK, Vasudevan P. (2005) Larvicidal activity of Tagetes patula essential oil against three mosquito species. Bioresour Technol, 96: 1235-1240.

126


Downum KR, Towers GHN. (1983) Analysis of thiophenes in the Tageteae (Asteraceae) by HPLC. J Nat Prod, 46: 98-103. Eisenreich W, Bacher A. Elucidation of biosynthetic pathways by retrodictive/predictive comparison of isotopomer patterns determined by NMR spectroscopy. In: Setlow JK (szerk.), Genetic Engineering, Principles and Methods, Kluwer Academyc/Pleum Publishers, New York, 2000: 121-154. Faizi S, Naz A. (2002) Jafrine, a novel and labile β-carboline alkaloid from the flowers of Tagetes patula. Tetrahedron, 58: 6185-6197. Flores HE, Dai Yr, Cuello JL, Maldonado-Mendoza IE, Loyola-Vargas VM. (1993) Green roots: photosynthesis and photoautotrophy in an underground plant organ. Plant Physiol, 101: 363-371. Flores HE, Pickard JJ, Hoy MW. Production of polyacetylenes and thiophenes in heterotrophic and photosynthetic root cultures of Asteraceae. In: Lam J, Breteler H, Arnason T, Hansen L (szerk.), Chemistry and Biology of Naturally-Occurring Acetylenes and Related Compounds (NOARC). Elsevier, Amsterdam, Oxford, New York, Tokyo, 1988: 233-254. Fu CX, Zhao DX, Xue XF, Jin ZP, Ma FS. (2005) Transformation of Saussurea involucrata by Agrobacterium rhizogenes: Hairy root induction and syringin production. Process Biochem, 40: 3789-3794. Gamborg O, Miller R, Ojima K. (1968) Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells. Exp Cell Res, 50: 151-158. Gao Y, Nagy B, Liu X, Simándi B, Wang Q. (2009) Supercritical CO2 extraction of lutein esters from marigold (Tagetes erecta L.) enhanced by ultrasound. J Supercrit Fluids 49: 345-350. Garg SN, Charles R, Kumar S. (1999a) A new acyclic monoterpene glucoside from the capitula of Tagetes patula. Fitoterapia, 70: 472-474. Garg SN, Verma SK, Kumar S. (1999b) Identification of the volatile constituents in the capitula oil of Tagetes patula L. grown in the north Indian plains. J Essent Oil Res, 11: 688-690. George J, Bais HP, Ravishankar GA. (2000) Biotechnological production of plant-based insecticides. Crit Rev Biotechnol, 20: 49-77. Gil A, Ghersa CM, Perelman S. (2002) Root thiophenes in Tagetes minuta L. accessions from Argentina: genetic and environmental contribution to changes in concentration and composition. Biochem Syst Ecol, 30: 1-13. Giri A, Narasu ML. (2000) Transgenic hairy roots: recent trends and applications. Biotechnol Adv, 18: 1-22. Girón LM, Freire V, Alonzo A, Cáceres A. (1991) Ethnobotanical survey of the medicinal flora used by the Caribs of Guatemala. J Ethnopharmacol, 34: 173-187.

127


Gommers FJ, Bakker J. Mode of action of α-terthienyl and related compounds may explain the suppressant effects of Tagetes species on populations of free living endoparasitic plant nematodes. In: Lam J, Breteler H, Arnason T, Hansen L (szerk.), Chemistry and Biology of Naturally-Occurring Acetylenes and Related Compounds (NOARC). Elsevier, Amsterdam, Oxford, New York, Tokyo, 1988: 61-69. Guidance for Industry: Bioanalytical Method Validation. US Department of Health and Human Services, FDA, CDER, CVM, 2001. Guinot P, Gargadennec A, Valette G, Fruchier A, Andary C. (2008) Primary flavonoids in Marigold dye: Extraction, structure and involvement in the dyeing process. Phytocem Anal, 19: 46-51. Gyurján I, László M, Dános B. (1992) Növényi sejtfermentáció; egy új lehetőség a növényi eredetű hatóanyagok gyártására. Acta Biol Debr Suppl, 8th Hung Fermentation Conf: 340-345. Hank H. Adatok az Atropa belladonna L. géntranszformált kultúráinak jellemzéséhez. Doktori értekezés, Semmelweis Egyetem, Gyógyszertudományok Doktori Iskola, 2007. Hank H, Szőke É, Tóth K, László I, Kursinszki L. (2004) Investigation of tropane alkaloids in genetically transformed Atropa belladonna L. cultures. Chromatographia, 60: S55-S59. Hausen BM, Helmke B. (1995) Butenylbithiophene, α-terthienyl and hydroxytremetone as contact allergens in cultivars of marigold (Tagetes sp.). Contact Derm, 33: 33-37. Helsper JPFG, Ketel DH, Hulst AC, Breteler H. Production and secretion of thiophenes by differentiated cell cultures of Tagetes. In: Lam J, Breteler H, Arnason T, Hansen L (szerk.), Chemistry and Biology of Naturally-Occurring Acetylenes and Related Compounds (NOARC). Elsevier, Amsterdam, Oxford, New York, Tokyo, 1988: 279285. Herrero M, Cifuentes A, Ibañez E (2006) Sub- and supercritical fluid extraction of functional ingredients from different natural sources: Plants, food-by-products, algae and microalgae: A review. Food Chem, 98: 136-148. Héthelyi É, Dános B, Tétényi P, Juhász G. (1987a) Phytochemical studies on Tagetes species; infraspecific differences of the essential oil in T. minuta and T. tenuifolia. Herba Hung, 26: 145-158. Héthelyi É, Dános B, Tétényi P, Koczka I. (1986a) GC-MS analysis of the essential oils of four Tagetes species and anti-microbial activity of Tagetes minuta. Flavour Frag J, 1: 169-173. Héthelyi É, Dános B, Tétényi P, Koczka I. GC/MS analysis of essential oils of some Tagetes species. In: Brunke EJ (szerk.), Progress in essential oil research. Walter de Gruyter and Co, Berlin, 1986b: 131-137. Héthelyi É, Dános B, Tétényi P, Koczka I. (1987b) GC/MS analysis of the essential oils of four Tagetes species and the microbial activity of Tagetes minuta. Herba Hung, 26: 49-61.

128


Héthelyi É, Koczka I, Tétényi P. (1989) Phytochemical and antimicrobial analysis of essential oils. Herba Hung, 28: 99-115. Héthelyi É, Tétényi P, Dabi E, Dános B. (1987c) The role of mass spectrometry in medicinal plant research. Biomed Environ Mass Spectrom, 14: 627-632. Héthelyi É, Tétényi P, Kaposi P, Dános B, Kernóczi Zs, Büki Gy, Koczka I. (1988) GC/MS investigation of antimicrobial and repellent compounds. Herba Hung, 27: 89105. Hooykaas PJJ, Klapwijk PM, Nuti MP, Schilperoort RA, Röch A. (1977) Transfer of Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid to avirulent agrobacteria and to Rhizobium ex planta. J Gen Microbiol, 98: 477-484. Hudson JB, Graham EA, Rossi R, Carpita A, Neri D, Towers GHN. (1993) Biological activities of terthiophenes and polyynes from the Asteraceae. Planta Med, 59: 447- 450. Hudson JB, Towers GHN. Antiviral properties of acetylenes and thiophenes. In: Lam J, Breteler H, Arnason T, Hansen L (szerk.), Chemistry and Biology of NaturallyOccurring Acetylenes and Related Compounds (NOARC). Elsevier, Amsterdam, Oxford, New York, Tokyo, 1988: 315-338. Hudson JB, Towers GHN. (1991) Therapeutic potential of plant photosensitizers. Pharmacol Ther, 49: 181-222. ICH Harmonised Tripartite Guideline, Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology Q2(R1). International Conference of Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use, 2005. Jacobs JJ, Arroo RR, de Konig EA, Klunder AJ, Croes AF, Wullems GJ. (1995) Isolation and characterization of mutants of thiophene synthesis in Tagetes erecta. Plant Physiol, 107: 807-814. Jacobs JJMR, Engelberts A, Croes AF, Wullems GJ. (1994) Thiophene synthesis and distribution in young developing plants of Tagetes patula and Tagetes erecta. J Exp Bot, 45: 1459-1466. Jente R, Olatunji GA, Bosold F. (1981) Formation of natural thiophene derivatives from acetylenes by Tagetes patula. Phytochemistry, 20: 2169-2175. Jente R, Richter E, Bosold F, Olatunji GA. Experiments on biosynthesis and metabolism of acetylenes and thiophenes. In: Lam J, Breteler H, Arnason T, Hansen L (szerk.), Chemistry and Biology of Naturally-Occurring Acetylenes and Related Compounds (NOARC). Elsevier, Amsterdam, Oxford, New York, Tokyo, 1988: 187-199. Jin W, Shi Q, Hong C, Cheng Y, Ma Z, Qu H. (2008) Cytotoxic properties of thiophenes from Echinops grijissi Hance. Phytomedicine, 15: 768-774. Johnson EJ, Hammond BR, Yeum KJ, Qin J, Wang XD, Castaneda C, Snodderly DM, Russell RM (2000) Relation among serum and tissue concentrations of lutein and zeaxantin and macular pigment density. Am J Clin Nutr, 71: 1555-1562.

129


Johnson EJ, Neuringer M, Russell RM, Schalch W, Snodderly DM. (2005) Nutritional manipulation of prime retinas, III: Effects of lutein or zeaxanthin supplementation on adipose tissue and retina of xanthophyll-free monkeys. Invest Ophthalmol Vis Sci, 46: 692-702. Jouanin L. (1984) Restriction map of an agropine-type Ri plasmid and its homologies with Ti plasmids. Plasmid, 12: 91-102. Kasahara Y, Yasukawa K, Kitanaka S, Taufiq Khan M, Evans FJ. (2002) Effect of methanol extract from flower petals of Tagetes patula L. on acute and chronic inflammation model. Phytother Res, 16: 217-222. Ketel DH. (1987) Distribution and accumulation of thiophenes in plants and calli of different Tagetes species. J Exp Bot, 38: 322-330. Ketel DH. (1988) Accumulation of thiophenes by cell cultures of Tagetes patula and the release of 5-(4-Hydroxy-1-butynyl)-2,2’-bithiophene into the medium. Planta Med, 54: 400-405. Ketel DH, Breteler H. Morphogenesis and thiophene production in cell cultures of Tagetes species. In: Lam J, Breteler H, Arnason T, Hansen L (szerk.), Chemistry and Biology of Naturally-Occurring Acetylenes and Related Compounds (NOARC). Elsevier, Amsterdam, Oxford, New York, Tokyo, 1988: 267-278. Kim Y, Wyslouzil BE, Weathers PJ. (2002) Invited review: Secondary metabolism of hairy root cultures in bioreactors. In Vitro Cell Dev Biol Plant, 38: 1-10. Knox JP, Dodge AD. (1985) Singlet oxygen and plants. Phytochemistry, 24: 889-896. Krishna A, Mallavarapu GR, Kumar S, Ramesh S. (2002) Volatile oil constituents of the capitula, leaves and shoots of Tagetes patula L. J Essent Oil Res, 14: 433-436. Kursinszki L, Hank H, László I, Szőke É. (2005) Simultaneous analysis of hyoscyamine, scopolamine, 6β-hydroxyhyoscyamine and apoatropine in Solanaceous hairy roots by reversed-phase high-performance liquid chromatography. J Chromatogr A, 1091: 32-39. Kursinszki L, Sárközi Á, Kéry Á, Szőke É. (2006) Improved RP-HPLC method for analysis of isoquinoline alkaloids in extracts of Chelidonium majus. Chromatographia, 63: S131-S135. Kuzovkina IN, Mantrova OV, Al’terman IE, Yakimov SA. (1996) Culture of genetically transformed hairy roots derived from anthraquinone-producing European Madder plants. Russ J Plant Physiol, 43: 291-298. Kyo M, Miyauchi Y, Fujimoto T, Mayama S. (1990) Production of nematocidal compounds by hairy root cultures of Tagetes patula L. Plant Cell Rep, 9: 393-397. Lam J, Thomasen T. Complexing agents for protection of highly-conjugated compounds against photodegradation. In: Lam J, Breteler H, Arnason T, Hansen L (szerk.), Chemistry and Biology of Naturally-Occurring Acetylenes and Related Compounds (NOARC). Elsevier, Amsterdam, Oxford, New York, Tokyo, 1988: 47-60.

130


Lang Q, Wai CM. (2001) Supercritical fluid extraction in herbal and natural product studies – a practical review. Talanta, 53: 771-782. László I, Szőke É. (2002) Biotechnológiai módszerek alkalmazása terápiás szempontból fontos, növényi eredetű hatóanyagok előállítására. Képzés egy életen át, 10: 10-16. Lemberkovics É. Gázkromatográfia alkalmazása. In: Kalász H, Lengyel J (szerk.), A gyógyszerek szervezetbeni sorsa és vizsgáló módszerei. Semmelweis Kiadó, Budapest, 2006: 175-198. Linares E, Bye RA. (1987) A study of four medicinal plant complexes of Mexico and adjacent United States. J Ethnopharmacol, 19: 153-183. Ma Q, Xu X, Gao Y, Wang Q, Zhao J. (2008) Optimisation of supercritical carbon dioxide extraction of lutein esters from marigold (Tagetes erecta L.) with soybean oil as a co-solvent. Int J Food Sci Tech 43: 1763-1769. Makjanič J, Vis RD, Groneman AF, Gommers FJ, Henstra S. (1988) Investigation of P and S distribution in the roots of Tagetes patula L. using Micro-PIXE. J Exp Bot, 39: 1523-1528. Mares D, Tosi B, Poli F, Andreotti E, Romagnoli C. (2004) Antifungal activity of Tagetes patula extracts on some phytopathogenic fungi: ultrastructural evidence on Pythium ultimum. Microbiol Res, 159: 295-304. Mares D, Tosi B, Romagnoli C, Poli F. (2002) Antifungal activity of Tagetes patula extracts. Pharm Biol, 40: 400-404. Margl L. Tagetes fajok tiofénjeinek vizsgálata intakt növényekben és in vitro növényi kultúrákban. Doktori értekezés, Eötvös Loránd Tudományegyetem, Növényszervezettani Tanszék, 2002. Margl L, Eisenreich W, Adam P, Bacher A, Zenk MH. (2001) Biosynthesis of thiophenes in Tagetes patula. Phytochemistry, 58: 875-881. Margl L, Ettenhuber C, Gyurján I, Zenk MH, Bacher A, Eisenreich W. (2005) Biosynthesis of benzofuran derivatives in root cultures of Tagetes patula via phenylalanine and 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate. Phytochemistry, 66: 887-899. Margl L, Tei A, Gyurján I, Wink M (2002) GLC and GLC-MS analysis if thiophene derivatives in plants and in in vitro cultures of Tagetes patula L. (Asteraceae). Z Naturforch (C), 57: 63-71. Marotti M, Piccaglia R, Biavati B, Marotti I. (2004) Characterization and yield evaluation of essential oils from different Tagetes species. J Essent Oil Res 16: 440-444. Maróti M. A növényi szövettenyésztés alapjai. Akadémiai Kiadó, Budapest, 1976: 4952. Massera PE, Talou JR, Giulietti AM. (1998) Thiophene production in transformed roots cultures of Tagetes filifolia. Biotechnol Lett, 20: 573-577.

131


McLafferty FW, Tureček F. Interpretation of Mass Spectra. University Science Books, Sausalito, 1993. Meckes-Lozoya M, Gaspar I. (1993) Phototoxic effect of methanolic extracts from Porophyllum macrocephalum and Tagetes erecta. Fitoterapia, 64: 35-41. Menelaou MA, Fronczek FR, Hjortso MA, Morrison AF, Foroozesh M, Thibodeaux TM, Flores HE, Fischer NH. (1991a) NMR spectral data of benzofuranes and bithiophenes from hairy root cultures of Tagetes patula and the molecular structure of isoeuparin. Spectrosc lett, 24: 1405-1413. Menelaou MA, Vargas D, Fischer NH, Foroozesh M, Thibodeaux TM, Hjortso MA, Morrison AF. (1991b) Biosynthetic studies of bithiophenes in hairy root cultures of Tagetes patula using 13C-labeled acetates. Spectrosc lett, 24: 353-370. Minto RE, Blacklock BJ. (2008) Biosynthesis and function of polyacetylenes and allied natural products. Prog Lip Res, 47: 233-306. Mukundan U, Hjortso MA. (1990) Effect of fungal elicitor on thiophene production in hairy root cultures of Tagetes patula. Appl Microbiol Biotechnol, 33: 145-147. Mukundan U, Hjortso MA. (1991a) Effect of light on growth and thiophene accumulation in transformed roots of Tagetes patula. J Plant Physiol, 138: 252-255. Mukundan U, Hjortso MA. (1991b) Growth and thiophene accumulation by hairy root cultures of Tagetes patula in media of varying initial pH. Plant Cell Rep, 9: 627-630. Mukundan U, Hjortso M. Transgenic Tagetes spp. (Marigold). In: Bajaj YPS (szerk.), Biotechnology in Agriculture and Forestry (Vol. 48), Transgenic Crops III. Springer, Berlin, Heidelberg, 2001: 274-293. Murashige T, Skoog F. (1962) A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol Plant, 15: 473-497. Naranjo-Modad S, López-Munguía A, Vilarem G, Gaset A, Bárzana E. (2000) Solubility of purified lutein diesters obtained from Tagetes erecta in supercritical CO2 and the effect of solvent modifiers. J Agric Food Chem, 48: 5640-5642. Norton RA, Finlayson AJ, Towers GHN. (1985) Thiophene production by crown galls and callus tissues of Tagetes patula. Phytochemistry, 24: 719-722. Papp I, Apáti P, Andrasek V, Blázovics A, Balázs A, Kursinszki L, Kite GC, Houghton PJ, Kéry Á. (2004) LC-MS analysis of antioxidant plant phenoloids. Chromatographia, 60: S93-S100. Parodi FJ, Fischer NH, Flores HE. (1988) Benzofuran and bithiophenes from root cultures of Tagetes patula. J Nat Prod, 51: 594-595. Piacente S, Aquino R, de Tommasi N, Pizza C, de Ugaz OL, Orellana HC, Mahmood N. (1994) Constituents of Werneria ciliolata and their in vitro anti-HIV activity. Phytochemistry, 36: 991-996.

132


Piccaglia R, Marotti M, Grandi S. (1998) Lutein and lutein ester content in different types of Tagetes patula and T. erecta. Ind Crop Prod, 8: 45-51. Ploeg AT, Maris PC. (1999) Effect of temperature on Meloidogyne incognita by Tagetes cultivars. J Nematol, 31: 709-714.

suppression

of

Poli F, Sacchetti G, Bruni A. (1995) Distribution of internal secretory structures in Tagetes patula (Asteraceae). Nord J Bot, 15: 197-205. Poy F, Visani S, Terrosi F. (1981) Automatic injection in high-resolution gas chromatography: A programmed temperature vaporizer as a general purpose injection system. J Chromatogr A, 217: 81-90. Priszter Sz. Növényneveink. Magyar-latin szógyűjtemény. Mezőgazdasági Kiadó, Budapest, 1986. Priszter Sz. Növényneveink. A magyar és a tudományos növénynevek szótára. Mezőgazda Kiadó, Budapest, 1988: 517. Proksch P, Proksch M, Towers GHN, Rodriguez E. (1983) Phototoxic and insecticidal activities of chromenes and benzofurans from Encelia. J Nat Prod, 46: 331-334. Quackenbush FW, Miller SL. (1972) Composition and analysis of the carotenoids in marigold petals. J Assoc Off Chem, 55: 617-621. Rajasekaran T, Madhusudan R, Ravishankar GA. (1999) Elicitation of thiophene production by cultured hairy roots of Tagetes patula. Acta Physiol Plant, 21: 243-247. Ramachandra Rao S, Ravishankar GA. (2002) Plant cell cultures: Chemical factories of secondary metabolites. Biotechnol Adv, 20: 101-153. Ramachandra Rao S, Tripathi U, Suresh B, Ravishankar GA. (2001) Enhancement of secondary metabolite production in hairy root cultures of Beta vulgaris and Tagetes patula under the influence of microalgal elicitors. Food Biotechnol, 15: 35-46. Restello RM, Menegatt C, Mossil AJ. (2009) Effect of the essential oil of Tagetes patula L. (Asteraceae) on Sitophilus zeaminis Motschulosky (Coleoptera, Curculionidae). Rev Bras Entomol, 53: 304-307. Romagnoli C, Mares D, Fasulo MP, Bruni A. (1994) Antifungal effects of α-terthienyl from Tagetes patula on five dermatophytes. Phytoter Res, 8: 332-336. Sacchetti G, Romagnoli C, Bruni A, Poli F. (2001) Secretory tissue ultrastructure in Tagetes patula L. (Asteraceae) and thiophene localization through X-ray microanalysis. Phyton, 41: 35-47. Sáenz-Carbonell LA, Maldonado-Mendoza IE, Moreno-Valenzula O, Ciau-Uitz R, López-Meyer M, Oropeza C, Loyola-Vargas VM. (1993) Effect of the medium pH on the release of secondary metabolites of roots of Datura stramonium, Catharantus roseus, and Tagetes patula cultured in vitro. Appl Biochem Biotechnol, 38: 257-267. Sagar DV, Naik SN, Rout PK, Rao YR (2005) Composition of essential oils of Tagetes patula L. growing in Northern India. J Essent Oil Res, 17: 446-448.

133


Sárközi Á, Janicsák G, Kursinszki L, Kéry Á. (2006) Alkaloid composition of Chelidonium majus L. by using different chromatographic techniques. Chromatographia, 63: 81-86. Schomburg G, Häusig U, Husmann H, Behlau H. (1984) Sampling onto capillary columns. Difficulties with various types of samples a simple accessory to split injectors for avoidance of discrimination. Chromatographia, 19: 29-36. Schuetz RD, Waggoner TB, Byerrum RU. (1965) Biosynthesis of 2,2’;5’,2”-terthienyl in the common marigold. Biochemistry, 4: 436-440. Schulte KA, Reisch J, Hörner L. (1962) Thiophene aus Alkinien, I. Chem Ber, 95: 1943-1954. Slightom JL, Tardif MD, Jouanin L, Tepfer D. (1986) Nucleotide sequence analysis of TL-DNA of Agrobacterium rhizogenes agropine type plasmid. J Biol Chem, 261: 108121. Simándi B, Kéry Á. Supercritical fluid extraction of terpenoids and steroids from plants. In: AINIA (szerk.), State of the Art Book on Supercritical Fluids. AINIA, Valencia, 2004: 281-325. Sorvari S, Fári MG, László M, Toldi O. (2006) Application of tissue culture and molecular farming in the production of pharmaceuticals. Acta Hortic, 725: 585-596. Stojanova A, Primova T, Anastassov Ch. (2000) Effect of mineral fertilization on the essential oil composition of Tagetes patula L. from Bulgaria. J Essent Oil Res, 12: 609612. Suresh B, Bais HP, Raghavarao KSMS, Ravishankar GA, Ghildyal NP. (2005) Comparative evaluation of bioreactor design using Tagetes patula L. hairy roots as a model system. Process Biochem, 40: 1509-1515. Suresh B, Rajasekaran T, Ramachandra Rao S, Raghavarao KSMS, Ravishankar GA. (2001) Studies on osmolarity, conductivity and mass transfer for selection of a bioreactor for Tagetes patula L. hairy roots. Process Biochem, 36: 987-993. Sütfeld R. Enzymological investigations into the metabolism of bithiophene derivatives. In: Lam J, Breteler H, Arnason T, Hansen L (szerk.), Chemistry and Biology of Naturally-Occurring Acetylenes and Related Compounds (NOARC). Elsevier, Amsterdam, Oxford, New York, Tokyo, 1988: 201-208. Sütfeld R, Balza F, Towers GHN. (1985) A benzofuran from Tagetes patula seedlings. Phytochemistry, 24: 876-877. Sütfeld R, Breteler H. Effects of plant material and extract treatment on the yield of natural products from Tagetes. In: Lam J, Breteler H, Arnason T, Hansen L (szerk.), Chemistry and Biology of Naturally-Occurring Acetylenes and Related Compounds (NOARC). Elsevier, Amsterdam, Oxford, New York, Tokyo, 1988: 101-105. Sütfeld R, Towers GHN. (1982) 5-(4-acetoxy-1-butinyl)-2,2’-bithiophene:acetate esterase from Tagetes patula. Phytochemistry, 21: 277-279.

134


Szabó L, Papp E. (1975) A Tagetes-fajok gyógyászati felhasználása – botanikai, kémiai, hatástani és agronómiai jellemzés. Gyógyszerészet, 19: 281-285. Szőke É. The effects of magnesium on changes in growth intensity of hairy root cultures of the Datura candida x D. aurea hybrid. In: Fazekas T, Selmeczi B, Stefanovits P (szerk.), Magnesium in biological systems, Environmental and biomedical aspects. Akadémia Kiadó, Budapest, 1994: 93-94. Szőke É, Kéry Á, Lemberkovics É. Farmakognózia. Növényi drogok farmakobotanikai és fitokémiai vizsgálata. Semmelweis Kiadó, Budapest, 2009: 214. Szőke É, Máday E, Kiss AS, Sonnewend L, Lemberkovics É. (2004) Effect of magnesium on essential oil formation of genetically transformed and non-transformed Chamomile cultures. J Am Coll Nutr, 23: 763S-767S. Talou JR, Cascone O, Giulietti AM. (1994) Content of thiophenes in transformed root cultures of Argentinian species of Tagetes. Planta Med, 60: 260-262. Tang CS, Wat CK, Towers GHN. (1987) Thiophenes and benzofurans in the undisturbed rhizosphere of Tagetes patula L. Plant Soil, 98: 93-97. Toivonen L. (1993) Utilization of hairy root cultures for production of secondary metabolites. Biotechnol Prog, 9: 12-20. Tosi B, Lodi G, Dondi F, Bruni A. Thiophene distribution during the ontogenesis of Tagetes patula. In: Lam J, Breteler H, Arnason T, Hansen L (szerk.), Chemistry and Biology of Naturally-Occurring Acetylenes and Related Compounds (NOARC). Elsevier, Amsterdam, Oxford, New York, Tokyo, 1988: 209-216. Towers GHN, Champagne DE. Medicinal phytochemistry of the Compositae: the activities of selected acetylenes and their sulfur derivatives. In: Lam J, Breteler H, Arnason T, Hansen L (szerk.), Chemistry and Biology of Naturally-Occurring Acetylenes and Related Compounds (NOARC). Elsevier, Amsterdam, Oxford, New York, Tokyo, 1988: 139-149. Towers GHN, Wat CK, Graham EA, Bandoni RJ. (1977) Ultraviolet-mediated antibiotic activity of species of Compositae caused by polyacetylenic compounds. Lloydia, 40: 487-498. Tzfira T, Citovsky V. (2006) Agrobacterium-mediated genetic transformation of plants: biology and biotechnology. Curr Opin Biotechnol, 17: 147-154. Uhlenbroek JH, Bijloo JD. (1959) Investigations on nematicides II. Structure of a second nematicidal principle isolated from Tagetes roots. Rec Trav Chim, 78: 382-390. Van den Dool H, Kratz PD. (1963) A generalization of the retention index system including linear temperature programmed gas-liquid partition chromatography. J Chromatogr A, 11: 463-471. Vasudevan P, Kashyap S, Sharma S. (1997a) Tagetes: a multipurpose plant. Bioresour Technol, 62: 29-35.

135


Vasudevan P, Tandon M, Pathak N, Nuennerich P, Mueller F, Mele A, Lentz H. (1997b) Fluid CO2 extraction and hydrodistillation of certain biocidal essential oils and their constituents. J Sci Ind Res, 56: 662-672. Wang TP, Kagan J, Tuveson RW, Wang GR. (1991) α-terthienyl photosensitizes damage to pBR322 DNA. Photochem Photobiol, 53: 463-467. Wells C, Bertsch W, Perich M. (1992) Isolation of volatiles with insecticidal properties from the genus Tagetes (Marigold). Chromatographia, 34: 241-248. Wielanek M, Urbanek H. (1999) Glucotropaeolin and myrosinase production in hairy root cultures of Tropaeolum majus. Plant Cell Tissue Organ Cult, 57: 39-45. Wielanek M, Urbanek H. (2006) Enhanced glucotropaeolin production in hairy root cultures of Tropaeolum majus L. by combining elicitation and precursor feeding. Plant Cell Tissue Organ Cult, 86: 177-186. Yang FJ, Brown AC. Jr, Cram SP (1978) Splitless sampling for capillary-column gas chromatography. J Chromatogr A, 158: 91-109. Zechmeister L, Sease JW. (1947) A blue-fluorescing compound, terthienyl, isolated from Marigolds. J Am Chem Soc, 69: 273-275. Zougagh M, Valcárcel M, Ríos A. (2004) Supercritical fluid extraction: a critical review of its analytical usefulness. Trends Analyt Chem, 23: 399-405.

136

_________________________________________________Saját publikációk jegyzéke

Saját publikációk jegyzéke Az értekezés alapját képező saját közlemények 1. Szarka Sz, Gyurján I, László M, Héthelyi É, Kuzovkina IN, Lemberkovics É, Szőke É. (2010) GC-MS studies of thiophenes in the supercritical fluid CO2 and solvent extracts of Tagetes patula L. Chromatographia, 71: 1039-1047 (IF: 1,098). 2. Szarka Sz, Héthelyi É, Kuzovkina IN, Lemberkovics É, Szőke É. (2008) GC-MS method development for the analyses of thiophenes from solvent extracts of Tagetes patula L. Chromatographia, 68: S63-S69 (IF: 1,312). 3. Szarka Sz, Héthelyi É, Lemberkovics É, Kuzovkina IN, Farkas E, Bálványos I, Szőke É. (2007) Essential oil constituents of intact plants and in vitro cultures of Tagetes patula L. J Essent Oil Res, 19: 85-88 (IF: 0,368). 4. Szarka Sz, Héthelyi É, Lemberkovics É, Kuzovkina IN, Bányai P, Szőke É. (2006) GC and GC-MS studies on the essential oil and thiophenes from Tagetes patula L. Chromatographia, 63: S67-S73 (IF: 1,171). Folyóiratban megjelent előadás-kivonatok 1. Szarka Sz, Héthelyi É, Kuzovkina IN, Lemberkovics É, Szőke É. (2009) GC-MS studies of thiophenes for the hairy root clone selection of Tagetes patula L. Gyógyszerészet, Supplementum: 111. 2. Szarka Sz, Héthelyi É, Lemberkovics É, Kuzovkina IN, Bálványos I, Szőke É. (2005) Investigation of volatile compounds in Tagetes species. Sci Pharm, 73: 260. Könyvfejezet 1. Szarka Sz, Héthelyi É, Kuzovkina IN, Szőke É. Effects of different media on Tagetes patula hairy root cultures. In: Szilágyi M, Szentmihályi K (szerk.), Trace Elements in the Food Chain Vol. 3. Working Committee on Trace Elements of the Complex Committee Hungarian Academy of Sciences and Institute of Material and Environmental Chemistry of the HAS, Budapest, 2009: 322-326. Az értekezés témájához közvetlenül nem kapcsolódó közlemények 1. Héthelyi É, Szarka Sz, Lemberkovics É, Szőke É. (2010) „In vino veritas” Tanulmány néhány hazai vörösbor species illat- és aromaanyag vizsgálatáról SPMEGC/MS módszerrel. Olaj, Szappan, Kozmetika, 59: 41-48. 2. Héthelyi É, Szarka Sz, Lemberkovics É, Szőke É. (2010) SPME-GC/MS identification of aroma compounds in rose flowers. Acta Agron Hung, 58: 283-287. 3. Héthelyi É, Szarka Sz, Lemberkovics É, Szőke É. (2010) Rózsavirágok szín, forma és illatösszhangjának tanulmányozása a szirmok illatanyagának SPME-GC/MS vizsgálata alapján. Olaj, Szappan, Kozmetika, 59: 1-10.

137

_________________________________________________Saját publikációk jegyzéke

4. Böszörményi A, Szarka Sz, Héthelyi É, Gyurján I, László M, Simándi B, Szőke É, Lemberkovics É. (2009) Triterpenes in traditional and supercritical-fluid extracts of Morus alba leaf and stem bark. Acta Chromatogr, 21: 659-669 (IF: 0,676). 5. Daruházi Á, Szarka Sz, Héthelyi É, Simándi B, Gyurján I, László M, Szőke É, Lemberkovics É. (2009) Terpenoidok az Ononidis spinosae radix szuperkritikus és hagyományos kivonatokban. Olaj, Szappan, Kozmetika, 58: 25-31. 6. Felföldi-Gáva A, Simándi B, Plánder Sz, Szarka Sz, Szőke É, Kéry Á. (2009) Betulaceae és Plantanaceae plants as alternative sources of selected lupane-type triterpenes. Their composition profile and betulin content. Acta Chromatogr, 21: 671-681 (IF: 0,676). 7. Héthelyi É, Galambosi B, Szarka Sz. (2009) Mikkeliben termesztett Perilla frutescens kemotaxonok illóolajának GC/MS-, a herba SPME-GC/MS vizsgálata. Olaj, Szappan, Kozmetika, 58: 61-67. 8. Héthelyi É, Szarka Sz, Lemberkovics É, Szőke É, Galambosi B. (2009) Chemical composition of the essential oil of Perilla frutescens (L.) Britt. by GC, GC/MS methods. Olaj, Szappan, Kozmetika, 58: 44-46. 9. Kuzovkina IN, Szarka Sz, Héthelyi É, Lemberkovics É, Szőke É. (2009) Composition of essential oil in genetically transformed roots of Ruta graveolens. Russ J Plant Physiol, 56: 846-851 (IF: 0,500). 10. Blazics B, Ludányi K, Szarka Sz, Kéry Á. (2008) Investigation of Euphrasia rostkoviana Hayne using GC-MS and LC-MS. Chromatographia, 68: S119-S124 (IF: 1,312). 11. Daruházi Á, Szarka Sz, Héthelyi É, Simándi B, Gyurján I, László M, Szőke É, Lemberkovics É. (2008) GC-MS identification and GC-FID quantitation of terpenoids in Ononidis spinosae radix. Chromatographia, 68: S71-S76 (IF: 1,312). 12. Héthelyi É, Szarka Sz, Galambosi B. (2008) A Rhodiola rosea (Rózsagyökér) sikertörténete napjainkig (I. rész). Olaj, Szappan, Kozmetika, 57: 14-16. 13. Gáva A, Simándi B, Szarka Sz, Kursinszki L, Csedő K, Plánder Sz, Szőke É, Kéry Á. (2007) Betulin és betulinsav előfordulásának vizsgálata Alnus glutinosa, Betula pendula és Platanus hybrida fajokban. Rev Med Farm, 53: 261-268. 14. Héthelyi É, Szarka Sz, Kakasy AZ, Galambosi B, Szőke É, Lemberkovics É. (2005) Dracocephalum speciesek illóolajának kémiai karaktere. Olaj, Szappan, Kozmetika, 54: 75-81. 15. Héthelyi É, Galambosi B, Szarka Sz, Szőke É, Antal I. (2004) Egy kellemes illatú büdöske faj (Tagetes lucida Cav.) fitokémiai jellemzői. Olaj, Szappan, Kozmetika, 53: 164-172. 16. Héthelyi É, Szarka Sz, Antal I, Blázovics A, Galambosi B, Lemberkovics É, Szőke É. (2004) Gentiana Lutea L. fitokémiai- és biokémai vizsgálata. Olaj, Szappan, Kozmetika, 53: 204-211. 17. Héthelyi É, Varga E, Hajdú Zs, Szarka Sz, Galambosi B. (2004) Vadon termő és Finnországban termesztett Rhodiola rosea L. hatóanyagai, farmakológiai hatása és fitokémiai vizsgálata (GC, GC/MS). Olaj, Szappan, Kozmetika, 53: 236-246.

138

______________________________________________________Köszönetnyilvánítás

Köszönetnyilvánítás Hálás köszönettel tartozom témavezetőmnek, Dr. Szőke Éva professzor asszonynak, a biológiai tudományok doktorának, aki akkori intézetvezetőként lehetőséget biztosított arra, hogy doktori kutatómunkámat elkezdhessem. Továbbá hálával tartozom hasznos tanácsaiért, a tudományos életben való eligazodást segítő nélkülözhetetlen irányításáért és szakmai fejlődésemhez nyújtott felbecsülhetetlen támogatásáért. Köszönetemet fejezem ki Dr. Blázovics Annának, a Semmelweis Egyetem Farmakognózia Intézet igazgatójának, aki lehetőséget biztosított kutatómunkám folytatásához. Köszönettel tartozom Dr. Inna N. Kuzovkina-nak, az Orosz Tudományos Akadémia Timiryazev Növényélettani Intézet tudományos főmunkatársának, hogy a T. patula #TpR jelű géntranszformált hairy root kultúrákat rendelkezésemre bocsátotta. Őszinte köszönettel tartozom Dr. Lemberkovics Éva professzor asszonynak a gázkromatográfiás vizsgálatok és a publikációk megírása során nyújtott fáradhatatlan segítségéért, értékes javaslataiért. Rendkívüli hálával tartozom Héthelyi Évának, az MKE műszaki szakértőjének, hogy a T. patula L. szaporítóanyagot rendelkezésemre bocsátotta. Köszönettel tartozom továbbá a GC-MS analitikai munkák során nyújtott felbecsülhetetlen segítségéért. Hasznos tanácsain és szakmai iránymutatásán túl, őszinte hálával tartozom személyes bátorításáért, támogatásáért, áldozatkész, emberi hozzáállásáért. Rendkívüli hálával emlékezem Dr. Gyurján István† professzor úrra, az ELTE Növényszervezettani Tanszék emeritus professzorára, a szuperkritikus fluid extrakció során nyújtott segítségén túl, a számomra felbecsülhetetlen értékű szakmai beszélgetésekért. Köszönettel tartozom Dr. Ludányi Krisztinának, a Semmelweis Egyetem Gyógyszerészeti Intézet docensének, Dr. Blazics Balázs doktorandusz kollégámnak és Dr. Sára-Klausz Gabriellának, a Semmelweis Egyetem Igazságügyi és Biztosításorvostani Intézet munkatársának, a GC-MS analitikai munkák során nyújtott segítségért, javaslatokért és az értékes szakmai konzultációkért. Köszönet illeti Dr. Kursinszki Lászlót, a Semmelweis Egyetem Farmakognózia Intézet docensét, a flash kromatográfiás munkák során nyújtott önzetlen segítségéért. Köszönettel tartozom Dr. Bányai Péter doktorandusz kollégámnak a PCR vizsgálatok és a flash kromatográfiás preparatív munkák során nyújtott rendkívüli segítségéért, és az értékes, alkotó szakmai vitákért. Köszönetemet szeretném kifejezni Mathuny Rudolfnénak a szövettenyésztés során nyújtott értékes és nélkülözhetetlen segítségéért. Köszönöm Dr. Bálványos Istvánnak, hogy tudományos diákköri munkám témavezetőjeként egyengette utamat a doktori tanulmányok felé. Ezúton szeretnék köszönetet mondani a Semmelweis Egyetem Farmakognózia Intézetében dolgozó valamennyi munkatársamnak, akik munkámat mindvégig önzetlen támogatásukkal segítették. Végül, de nem utolsó sorban végtelen hálával tartozom családomnak, hogy doktori értekezésem elkészítése alatt kitartó megértéssel, türelemmel, szeretettel és bíztatással támogattak. Külön köszönettel tartozom nagymamámnak, aki lehetővé tette, hogy a konyhakerti növények helyett büdöskét nevelhessek, és távollétem alatt odaadóan gondozta a növényeket.

139

Tagetes patula L. géntranszformált hairy root kultúrák tiofén anyagcseréjének vizsgálata

Recommend Documents