Szakdolgozat
SZABÓ JUDIT V. éves biológus
A humán 3-foszfoglicerát kináz aktív centrumának vizsgálata irányított mutagenezissel
Témavezetők: Pollnerné Dr. Flachner Beáta Kazinczyné Dr. Vas Mária MTA SzBK Enzimológiai Intézet
EÖTVÖS LORÁND TUDOMÁNYEGYETEM TERMÉSZETTUDOMÁNYI KAR Budapest, 2005.
TARTALOMJEGYZÉK 1.
BEVEZETŐ
1
2.
IRODALMI ÁTTEKINTÉS
2
2.1
A 3-foszfoglicerát kináz (PGK) enzim szerepe az élő szervezetben
2
2.2
A PGK molekula térbeli felépítése
3
2.3 A szubsztrát kötőhelyek jellemzése 2.3.1 A 3-PG kötőhely szerkezete 2.3.2 A nukleotid kötőhely
5 5 5
2.4
A doménzáródás mechanizmusa
8
2.5
A PGK különleges enzimkinetikai viselkedése
8
2.6
A PGK esetén elvégzett korábbi mutagenezis kísérletek
9
3.
CÉLKITŰZÉSEK
12
4.
ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK
13
4.1 Anyagok 4.1.1 Az enzim előállítása során használt anyagok és oldatok 4.1.2 A kinetikai mérésekhez alkalmazott anyagok 4.1.3 Agaróz gélelektroforézishez használt oldatok 4.1.4 A redukáló gélelektroforézishez felhasznált anyagok és oldatok
13 13 13 14 14
4.2 Módszerek 4.2.1 PCR reakció 4.2.2 Transzformálás 4.2.3 Plazmid tisztítása 4.2.4 Emésztés restrikciós endonukleáz enzimekkel és DNS elektroforézis 4.2.5 DNS gélelektroforézis 4.2.6 Fehérje termelése E. coli sejtekben 4.2.7 A fehérje feltárása és tisztítása 4.2.8 Fehérje vizsgálata SDS-gélelektroforézissel 4.2.9 Fehérjekoncentráció meghatározása 4.2.10 PGK enzimaktivitásának meghatározása 4.2.11 A szubsztrátok koncentrációjának meghatározása 4.2.12 Szubsztráttelítési kinetikai vizsgálatok 3-PG-vel és MgATP-vel 4.2.13 Anion aktiválás-gátlás vizsgálatok 4.2.14 Differenciál scanning (DSC) mikrokalorimetria 4.2.15 Cirkuláris dikroizmus (CD) spektroszkópia
15 15 16 16 16 17 17 17 18 19 19 20 21 21 23 23
5.
EREDMÉNYEK ÉS MEGVITATÁSUK
24
5.1
A humán PGK kifejezése és tisztítása
24
5.2
Mutációk tervezése és kivitelezése
27
5.3
A tisztított mutáns fehérjék biofizikai jellemzése
29
5.4 A vad típusú sertés és humán PGK kinetikai összehasonlítása 5.4.1 Szubsztrátok feleslegének aktiváló hatása 5.4.2 Anionaktiválás és gátlás együttes megnyilvánulása 5.4.3 Aniongátlás kinetikai vizsgálata a vad típusú hPGK esetében
30 30 32 33
5.5 A Lys215 mutáció hatása a PGK kinetikai viselkedésére 5.5.1 A mutáns hPGK-k specifikus aktivitása 5.5.2 Szubsztrátfelesleg aktiválás hiánya 5.5.3 Anionaktiválás hiánya 5.5.4 Aniongátlás kinetikai vizsgálata a mutáns enzimek esetében
36 36 37 38 39
5.6
41
A kinetikai eredményekből levonható következtetések
6.
ÖSSZEFOGLALÁS
43
7.
ABSTRACT
44
8.
IRODALMI HIVATKOZÁSOK
45
Ábrák jegyzéke 1. ábra: A sertésizom PGK terner komplexének szerkezete a kötött szubsztrátokkal
3
2. ábra: A PGK doménmozgásai az enzim működése során
4
3. ábra: A sertésizom PGK 3-PG szubsztrát kölcsönhatásának részletei a biner
6
komplexben 4. ábra: A MgATP és nem-reaktív analógjainak kötődési módja a PGK-hoz.
7
5. ábra: SDS–gélelektroforézis a hPGK gén indukciójának ellenőrzésére.
24
6. ábra: A hPGK kimutatása SDS-gélelektroforézissel a tisztítási lépések során
25
7. ábra: Az CM-Sepharose oszlopkromatográfia
26
8. ábra: Az CM-Sepharose oszlopkromatográfia frakcióinak SDS-gélelektroforézise
26
9. ábra: A mutáció hatása a hPGK CD spektrumára
29
10. ábra: A mutáció hatása a hPGK kalorimetriás hőstabilitására
29
11. ábra: A vad típusú PGK-k aktivitásának függése a 3-PG koncentrációtól
30
12. ábra: A vad típusú PGK-k aktivitásának függése a MgATP koncentrációtól
31
13. ábra: Pirofoszfát anion hatása a vad típusú PGK-k aktivitására
33
14. ábra: Pirofoszfát hatása a hPGK 3-PG telítési görbéjére lineáris (a) és reciprok
34
(b) ábrázolásban 15. ábra: Pirofoszfát hatása a hPGK MgATP telítési görbéjére lineáris (a) ill.
35
reciprok (b) ábrázolásban 16. ábra: A két gátló anionkötőhely elhelyezkedése a PGK aktív centrumában
36
17. ábra: A mutáns hPGK-k aktivitásának függése a 3-PG koncentrációtól
37
18. ábra: A mutáns hPGK-k aktivitásának függése a MgATP koncentrációtól
38
19. ábra: Pirofoszfát anion hatása a mutáns PGK-k aktivitására
39
20. ábra: A K215A (a) és K215R (b) mutáns pirofoszfát gátlása különböző
40
szubsztrát körülményeket alkalmazva
Táblázatok jegyzéke 1. táblázat: A 3-PG kötőhelyen elvégzett mutációk hatásának összehasonlítása
10
2. táblázat: A hPGK génjében tervezett mutációk
27
3. táblázat: A K215R és a K215A mutánshoz tervezett primerek
28
4. táblázat: Kinetikai állandók összefoglalása
32
5. táblázat: A mutáns enzimekre vonatkozó gátlási állandók összefoglalása
41
Rövidítések jegyzéke PGK
3-foszfoglicerát kináz
hPGK
humán eredetű 3-foszfoglicerát kináz
GAPDH
glicerinaldehid-3-foszfát dehidrogenáz
3-PG
3-foszfoglicerát
1,3-BPG
1,3-biszfoszfo-glicerát
ATP
adenozine triphosphate
AMP-PCP
β, γ-metilén-adenozin-5’-trifoszfát
AMP-PNP
β, γ-imido-adenozin-5’-trifoszfát
EDTA
Ethylene-Diamine-Tetraacetic-Acid
DTT
ditiotreitol
SDS
Sodium Dodecyl Sulfate
CD
cirkuláris dikroizmus
DSC
Differential Scanning
PCR
Polymerase Chain Reaction
PAGE
poliakrilamid gélelektroforézis
APS
ammónium-perszulfát
TEMED
N, N, N’, N’-Tetrametil-etilén diamin
IPTG
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside
NADH
Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid-Hidrogeen
E. coli
Escherichia coli
DpnI
Diplococcus pneumoniae I
NdeI
Neisseria denitrificans
BamHI
Bacillus amyloliquefaciens H
T. brucei
Trypanosoma brucei
Köszönetnyilvánítás
Köszönetemet fejezem ki témavezetőimnek Kazinczyné Vas Máriának, az MTA doktorának, hogy munkámat irányította és tudásával nélkülözhetetlen segítséget nyújtott dolgozatom elkészítésében, valamint Pollnerné Dr. Flachner Beátának a fehérje expresszió és termelés módszerének kidolgozásáért és a kísérleti munkák irányításáért. Köszönet illeti Matkovicsné Varga Andrea PhD hallgatót a munkában való aktív közreműködésért, tanácsaiért. Hálás vagyok az Intézet igazgatójának, Dr. Friedrich Péter akadémikusnak, hogy lehetőséget biztosított számomra, hogy kutatómunkámat a Magyar Tudományos Akadémia Szegedi Biológiai Központjának Enzimológiai Intézetében végezhettem. Köszönöm Dr. Závodszky Péter akadémikusnak, hogy lehetővé tette laboratóriumában a DNS-szintű munkák kivitelezését és Hajdú István PhD hallgatónak e munkák során nyújtott sokoldalú segítségét. Külön köszönöm Szüleimnek, Családomnak, hogy minden körülmények között mellettem álltak és segítették munkámat szeretetükkel, türelmükkel.
1. BEVEZETŐ
Az élő szervezeteket felépítő makromolekulák között kulcsfontosságú szereppel bírnak a fehérjék, melyek az összes életműködésünkben részt vesznek. Jelentőségük abban áll, hogy specifikus kölcsönhatásba lépve szubsztrátjaikkal, sokszorosára gyorsíthatják azokat a kémiai átalakulásokat, melyek nélkülük nem, vagy csak nagyon lassan mennének végbe. Az enzimeket mindennapi életünk során is számos helyen felhasználjuk, fontosságuk megkérdőjelezhetetlen. A molekuláris biológia utóbbi évtizedeiben bekövetkezett előretörése megteremtette annak a lehetőségét, hogy egy adott fehérje (enzim) szerkezetét genetikus úton módosítsuk és ezáltal annak funkcionális tulajdonságait befolyásoljuk. Ahhoz, hogy ilyen módosításokat előre megtervezett módon hajthassunk végre, a fehérjék (enzimek) szerkezetével, működésével kapcsolatban a jelenleginél pontosabb ismeretekre van szükségünk. Ennek eléréséhez jól használhatjuk a genetikus módosítás, az ún. irányított mutagenezis módszerét. A fehérje oldalláncok kémiai természetét így megváltoztatva megállapíthatjuk, hogy egy adott változás hogyan befolyásolja az adott fehérje működését.
Ezáltal
enzimreakció
mechanizmusok,
allosztérikus
szabályozó
mechanizmusok deríthetők fel. A vizsgálati objektumom a 3-foszfoglicerát kináz, mely egy tipikus kináz enzim. Egyetlen polipeptidláncból épül fel, azaz monomer szerkezetű, mely két doménre tagolódik. Ezt, a legtöbb élő szervezet sejtjében jelenlévő molekulát, nemcsak in vivo betöltött szerepe érdemesíti kutatásokra. Kináz enzimként, vizsgálatával olyan általános kérdésekre kaphatunk választ, mint a foszforiláció, defoszforiláció reakciójának mechanizmusa, a doménzáródás mikéntje vagy akár az univerzális energiatároló vegyület, a MgATP kötődésének módja. TDK munkám során a PGK feltételezett nukleotid-foszfát kötőhelyén irányított mutagenezis kísérleteket végeztem, hogy felderítsem a kötőhely szerepét az aktív enzim konformáció kialakításában.
1
2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS 2.1
A 3-foszfoglicerát kináz (PGK) enzim szerepe az élő szervezetben
A 3-foszfoglicerát kináz az élő sejtek számára alapvető fontosságú enzim. Aerob szervezetekben a glikolízisben, anaerob élőlényekben a fermentációban játszik szerepet, a növények esetében pedig a glükoneogenezisben nélkülözhetetlen enzim. A glikolízisben a PGK az 1,3-biszfoszfo-glicerát (1,3-BPG) savanhidrid kötésben levő foszfo-csoportjának MgADP-re való átvitelét katalizálja, melynek során a 3-foszfoglicerát (3-PG) és ATP, azaz univerzális energiadonor képződik, kétszeres töltésű fémion (általában Mg2+) jelenlétében (1. egyenlet). A növények glükoneogenezisében ennek a folyamatnak a fordítottja megy végbe. 1,3-BPG
3-PG
1. egyenlet: A PGK által katalizált reakció egyenlete a glikolízisben
Az előzőekben említett, anyagcsere folyamatokban betöltött szerepén túl a PGK számos más biokémiai folyamatban szerepet játszik. Így a kation transzportban, a Na+ transzportnál (1), ill. a Ca2+-pumpa működése során (2). Más glikolitikus enzimekkel együtt kapcsolatban áll a szarkoplazmatikus retikulummal, így szolgáltat ATP-t a pumpa működéséhez. Ez a működése kapcsolatban áll az emberi hemolitikus anémia betegséggel (3, 4), melyben a vörösvérsejtek károsodnak, súlyos esetben kipukkadnak. Ekkor ugyanis a sejtmembrán két oldala között eltűnhet a Na+- és K+-gradiens, melynek hátterében X kromoszómán bekövetkező mutáció áll. A PGK funkcionális károsodása ATP hiányt okoz, mely a K-Na-pumpa működését befolyásolja. Egyes vizsgálatok szerint a PGK szerepet játszik a sejtmagban a DNS szintézisénél, transzkripciójánál, valamint javításánál (5). A DNS replikációjánál a PRP (Primer Recognition Proteins) komponenseként azonosították a PGK-t. A PRP szükséges azon első lépésben, amikor az α-DNS-polimeráz a kb. 5-60 nukleotid hosszúságú RNS-láncot szintetizálja meg a DNS-templát irányításával. 2
Újabb kutatások szerint az emberi eredetű PGK gátolja a tumor angiogenezisét (6, 7). Daganatsejtekben diszulfid reduktázként működve részt vesz a plazmin redukciójában, melynek során angiosztatin keletkezik, ennek hatására kerül gátlás alá az angiogenezis. A PGK tiol-reduktáz aktivitására még nem született ésszerű magyarázat. A legújabb eredmények alapján, a PGK aktív centrumának közelében levő két, szekvenciálisan szomszédos tiol-csoport ebben az aktivitásban nem vesz részt (7), bár ez várható volna. A mechanizmust a doménzáródás során létrejövő konformáció változással próbálják magyarázni (8). Jelentős szerepet kap a PGK a vírus-, és tumorellenes terápiákban. A HIV, a Hepatitis B vírus által okozott betegségek, valamint a rák gyógyítására használt L-dezoxinukleotid analógokat foszforilálja, és így a farmakológiailag aktív metabolitot állítja elő, valamint ezen anyagok sejtbeli koncentrációját szabályozza (9-11). 2.2
A PGK molekula térbeli felépítése
A PGK 44,5 kDa molekulatömegű, monomer szerkezetű, azaz egy polipeptidláncból felépülő enzim.
1. ábra: A sertésizom PGK terner komplexének szerkezete a kötött szubsztrátokkal. A másodlagos szerkezeti elemek közül piros színű hordók az α-hélixeket, sárga lemezek a β-redőket jelölik, míg a szubsztrátok gömb-pálcika modellel, szürke színnel láthatók. A terner komplex szerkezetben (12) 3-PG az N-, míg a nukleotid a C-doménen kötődik.
Molekulája két doménből, a C-, és az N-terminálisból áll, melyek kb. azonos méretűek. Mindkét domén központjában 6 parallel β-redőből felépülő hidrofób mag található, melyet α-hélixek vesznek körül (13) (1. ábra). 3
Az aminosav-szekvencia a különböző fajok közt akár 50%-os eltérést is mutathat, azonban az emlős eredetű szekvenciák esetén ez már kb. 96-98%-os azonosságot jelent (14). Az enzim harmadlagos szerkezete az aminosav-szekvenciában mutatkozó különbségek ellenére is meglehetősen konzervatív (15). A röntgenkrisztallográfiás adatok alapján ismert, hogy a PGK mint kétszubsztrátos enzim 3-PG szubsztrátja az N-terminális doménen (16), míg a nukleotid szubsztrát, MgADP, MgATP és analógjai, a C-terminális doménen kötődnek (17-20). A 3-PG kötőhelye az N-terminális domén Arg-ben gazdag bázikus foltja, míg a nukleotid kötőhely a C-doménen a belső hidrofób felszín (1. ábra). A PGK-nak ún. nyitott és zárt konformációjú szerkezetét különböztetjük meg (2. ábra).
2. ábra: A PGK doménmozgásai az enzim működése során
A zárt szerkezet sokáig nem volt ismert. A korán meghatározott nyitott szerkezetben (13) viszont a két doménen megkötött szubsztrát egymástól nagyon távol, kb. 10 Å távolságra helyezkedik el, az ATP γ-foszfátja (P atom) és a 3-PG karboxil-csoportja (O atom) között mérve. A 10 Å-nyi távolság miatt a reakció a nyitott szerkezetben nem jöhetne létre, mivel a PGK által katalizált reakció közvetlen foszfotranszferrel játszódik 4
le (21). Ennek alapján már akkor feltételezték, hogy az enzimreakció lejátszódásához a két doménnek össze kell záródnia. Későbbiekben ezt a hipotézist különböző kísérletek tették valószínűvé, sőt sikerült a zárt konformáció kristályszerkezetét is meghatározni (22, 23). Tehát bebizonyosodott, hogy a szubsztrátok reaktív csoportjainak optimális térközelbe kerülése, a zárt konformáció kialakulásával, azaz a doménzáródással valósul meg. A domének merev testekként a csuklórégiók mentén fordulnak el, így kerülnek közel a szubsztrátok egymással reagáló molekularészei, ami elengedhetetlen a katalízis szempontjából. Nemcsak a kristályokkal történő röntgendiffrakciós vizsgálatok, hanem az oldott enzimmel végzett kisszögű röntgenszórási kísérletek is a doménzáródást igazolták, ahol a mindkét szubsztrátot kötő terner komplexben a girációs sugár csökkenését tapasztalták (24). 2.3
A szubsztrát kötőhelyek jellemzése 2.3.1
A 3-PG kötőhely szerkezete
A szubsztrát 3-PG az N-terminális domén belső felületén lévő bázikus oldalláncokhoz kötődik (1. ábra). A 3-PG kötődésének részleteit a 3. ábra mutatja. A krisztallográfiás adatok szerint a 3-PG negatív töltésű foszfátcsoportja a PGK (sertésizom enzim számozása szerinti) Arg170, Arg122 és Arg65 konzervatív oldalláncok guanidinocsoportjaihoz hidrogénhíd kötéssel és ionos kölcsönhatással kapcsolódik (16). Mindhárom Arg 2-2 kötést (H-híd kötés és ionos kölcsönhatás) formál a foszfát-csoport 3 oxigénatomjával. A negyedik észterkötésben levő oxigénatom a His62 imidazol gyűrűjével alakít ki hidrogénhíd kötést. Az Asn25 és az Asp23 a 3-PG hidroxilcsoportjával alakít ki hidrogénhíd kötést. Ez utóbbi oldalláncokkal való kölcsönhatás felelős a szubszrát sztereospecificitásáért. 2.3.2
A nukleotid kötőhely
A nukleotid szubsztrát a C-terminális belső hidrofób helyén kötődik (1. ábra). A krisztallográfiás adatok szerint a MgADP ill. a MgATP szubsztrátok, valamint ennek analógjai különböző kapcsolatokat alakítanak ki a fehérje oldalláncaival (4. ábra) (12, 20). Míg mindkét nukleotid adenozin és cukor gyűrűje azonos pozíciót foglal el a hidrofób zsebben, addig a foszfát láncok különbözőképpen kapcsolódnak. Az adenozin gyűrű a βH, a βG ill. βJ lemezek által alkotott zsebben kötődik, a ribóz gyűrű pedig a Pro338 pirrolidin gyűrűje fölött. A ribóz 2’- ill. 3’-hidroxil csoportjai pedig a Glu343 karboxilátjával létesítenek hidrogénkötést. 5
3. ábra: A sertésizom PGK 3-PG szubsztrát kölcsönhatásának részletei a biner komplexben (16) A szubsztrátot zöld színű gömb-pálcika modell jelöli, az enzim oldalláncai kék színű pálcika modellel láthatók. A távolságadatok Ǻ-ben értendők.
A Lys219 ε-amino csoportjával mindegyik nukleotid α-foszfátja ionos kölcsönhatásban van. A többi foszfát-csoport kölcsönhatásában már a nukleotidok különbséget mutatnak. A MgADP β-foszfátját az Asn336, a Thr375 és az α13 hélix stabilizálja (17). Az α- és β-foszfát 1-1 negatívan töltött oxigénjével ionos kölcsönhatásban áll a Mg-ion, ami további ionos kötést létesít az Asp374 karboxil csoportjával. A MgATP kötődésének vizsgálatához először ezen szubsztrát analógjait használták. Ezek segítségével, a 3-PG és az enzim jelenlétében stabil, de működésképtelen terner komplexet lehet előállítani. Ilyen ATP analógok az AMP-PNP ill. az AMP-PCP. Míg az ATP esetén a β- és γ-foszfátot oxigén köti össze, addig az AMP-PNP-ben egy aminocsoport, míg az AMP-PCP-ben egy metilén-csoport helyettesíti az O atomot. A helyettesítés izosztérikus, ezért nem okoz lényeges különbséget a kötés jellegét tekintve és csak kevéssé változtatja meg a MgATP-re vonatkozó egyéb tulajdonságokat.
6
4. ábra: A MgATP és nemreaktív analógjainak kötődési módja a PGK-hoz. Az α8 és α13 hélixet szalagdiagram jelzi, míg a szubsztrát és analógjai gömb-pálcika modellel láthatók. Az AMP-PNP-vel (18), az AMP-PCP-vel (19) és az ATP-vel (20) meghatározott kristályszerkezeti adatokat a nukleotidok adenozin gyűrűje alapján illesztettük egymásra.
Az AMP-PNP mindhárom foszfátja segítségével koordinálja a fémiont, míg az AMPPCP csak a β-foszfátja által (18, 19, 23). Ezen kívül a fehérjéhez való kötődésük is különböző. Az AMP-PNP az ADP-hez hasonlóan kötődik, azaz a foszfátlánca az α13-as hélix N-terminálisa felé hajlik. Viszont az AMP-PCP β-és γ-foszfátja a 8-as hélix Nterminálisa felé hajlik. Itt kölcsönhatásba lép egyrészt a Lys215, másrészt a Mg2+-on keresztül az Asp218 oldallánccal. Feltételezhetően a nukleotid-foszfátnak lehetősége van alternatív módon elfoglalnia mind az α13-as hélix, mind pedig a 8-as hélixnél lévő kötőhelyet. A MgATP kötődését leíró újabb szerkezeti munka szerint (20) a nukleotid szubsztrát foszfát lánca viszont a két alternatív kötőhely között közti pozíciót foglal el.
7
2.4
A doménzáródás mechanizmusa
A doménzáródás az a folyamat, melynek során a domének helyzetváltozásával a szubsztrátok
optimális
térközelbe
kerülnek,
lehetővé
téve
a
foszfotranszfer
végbemenetelét. A kristályszerkezetek szerint (22, 23) az enzim csak a mindkét szubsztrátot (esetleg analógot) kötő terner komplex esetében záródik. A záródás során a domének merev testekként fordulnak el egymáshoz képest, a folyamatban fontos szerepet játszik a molekulában feltérképezett néhány csukló régió (hinge). A szubsztrát 3-PG kötődése már önmagában az α7 hélix N-terminális régiójában idéz elő 8o-os elfordulást (16). Ugyanezen hélix C-terminális régiójában a zárt és a nyitott szerkezetek közti nagy átlagos négyzetes eltérés (RMS) alapján, Bernstein és munkatársai bebizonyították a két domén egymáshoz képesti kb. 32o-os elfordulását (22). A PGK legfontosabb csukló régiója az α13 és α14 hélixeket összekötő βL-redő, a doménzáródás mozgatója (12). A szubsztrátok valószínűleg közvetlenül ezt a régiót irányítják. Mivel az α13 hélix a C-domén része és az α14 az N-terminális doméné, így a két hélix elmozdulása a domének helyzetváltoztatását vonja maga után. A doménzáródáshoz az α7 hélixben található csuklórégiók elmozdulása is szükséges, enélkül a fehérjelánc széttörne. A doménzáródás során az α8 és az α13 hélixek egymáshoz viszonyított helyzete is jelentősen megváltozik, közelednek egymáshoz. Ez az elmozdulás feltehetően kapcsolatba hozható a nukleotid szubsztrát foszfát láncával való kölcsönhatással. A fent bemutatott szerkezeti ábra (4. ábra) ugyanis azt sugallja, hogy a MgATP foszfátjai (flexibilitásukból eredően) képesek az analógokkal azonosított két alternatív kötőhely között elmozdulni. Amennyiben ez megvalósul, úgy a MgATP aktívan közreműködik abban, hogy az α8 és az α13 közeledjen egymáshoz, ami a doménzáródást elősegíti. Ebben fontos szerepe lehet az α8 N-terminálisán elhelyezkedő Lys215-nek, amely abszolút konzervatív oldallánc és szerepe az enzimműködésben még nem tisztázott. 2.5
A PGK különleges enzimkinetikai viselkedése
Az enzimekre általánosan jellemző Michalis-Menten kinetika a PGK esetében nem valósul meg. Jellemző tulajdonsága a szubsztrátfelesleg aktiválás (25, 26). A kettősreciprok Lineweaver-Burk ábrázolásban a szubsztráttelítési görbék nem adnak egyenest, hanem a kapott görbe két eltérő meredekségű görbével közelíthető. Ennek 8
magyarázatára korábban két aktív centrum létét feltételezték. Ma már azonban a röntgen diffrakciós kísérletek alapján tudjuk, hogy az enzimnek csak egyetlen aktív centruma van, és mindkét szubsztrátnak csak egyetlen kötőhelye. Jellegzetes további kinetikai tulajdonság, hogy a többértékű anionok alacsony koncentrációban aktiválják, magas koncentrációnál viszont gátolják az enzimet (27, 28). Az aktiválás molekuláris mechanizmusára a következő elméletet alkották meg (29): az anionok, hasonlóan a szubsztrátokhoz, hiszen azok is anionos jellegűek, az aktív centrumon kívüli aktiváló helyre kötődnek, mely a nyitott konformációjú enzimben csak részben létezik és a doménzáródás során alakul ki. Valószínűleg az N-és a C-terminális domén belső felszínén lévő bázikus aminosavak hozzák létre. Feltételezések szerint az anionok gyengíthetik a termék 1,3-biszfoszfo-glicerát (1,3-BPG) kötődését, közvetve pedig csökkenthetik a doménzáródás energiagátját. Feltételezések igazolására még egyéb független kísérletekre van szükség. Ezzel szemben a magas anionos koncentrációnál tapasztalt gátlási jelenség egyértelműen annak tulajdonítható, hogy az anionok kiszorítják a szintén anionos tulajdonságú szubsztrátokat az aktív centrumból. 2.6
A PGK esetén elvégzett korábbi mutagenezis kísérletek
Már azelőtt is, hogy a PGK-ról részletes szerkezeti adatok álltak volna rendelkezésre, végeztek mutációs kísérleteket, melyeknek döntő többsége a 3-PG kötőhely kiderítésére irányult. Az elvégzett mutációk közül egyedül az Arg38 módosítása bizonyult fontosnak a katalízis szempontjából. Az R38A ill. R38Q mutációk (30, 31) az aktivitás teljes elvesztéséhez vezettek, ami az Arg38 kiemelkedő fontosságát mutatja. A mutációs kísérletekből nincs egyértelmű bizonyíték arra vonatkozóan, hogy van-e még ezen kívül más, az enzim katalízisében fontos oldallánc. A 3-PG kötőhelyre vizsgálatára irányuló más mutációk főként az anionaktiválás jelenségéről szolgáltattak információkat. Az egyik ilyen az Arg65 oldallánc Gln-ra való cserélése volt, mely az anion aktiváló viselkedés teljes elvesztéséhez vezetett. Ezen oldalláncnak valószínűsíthető, hogy szerepe van az anion aktiváció mechanizmusában (32). Az Arg65 viszont nem esszenciális oldallánc az enzim aktivitása szempontjából, mivel R65Q, R65S, R65A mutánsok specifikus aktivitása kb. ugyanakkorának adódott, mint a vad típusé (33).
9
Az Arg65, 120 és 169 oldalláncok irányított mutagenezisét is elvégezték (34). A 3-PG foszfátja kötést létesít ezen oldalláncok guanidíno-csoportjaival. Mindhárom oldalláncot Lys-re (ugyanolyan töltés) ill. Met-ra (nincs töltés) cserélték külön kísérletekben. 1. táblázat: A 3-PG kötőhelyen elvégzett mutációk hatásának összehasonlítása (34)
Mutáció jellege
Km (3-PG esetén) 40 mM szulfát jelenlétében
R65K
2,2-szeres növekedés
R65M
20,6-szoros növekedés
R120K R120M R169K R169M
Km (MgATP esetén) 40 mM szulfát jelenlétében Nincs hatása
Kd (3-PG) Szulfát hiányában
kcat
Kcat/Km katalitikus hatékonyság
3,6-szoros növekedés
1,5-szeres növekedés
4,9-szeres növekedés
-
7-szeres csökkenés
Nincs szignifikáns hatás 45-szörös csökkenés
2-szeres növekedés 2,6-szoros növekedés
Nincs hatás
-
3-szoros növekedés
2,3-szoros növekedés
1,5-szeres csökkenés -
3,5-szeres csökkenés 5,5-szörös csökkenés
8,3-szoros növekedés
4-szeres növekedés
14-szeres növekedés
-
34,6-szoros csökkenés
Az elvégzett mutációk bizonyították ezen oldalláncok szerepét a 3-PG szubsztrát megkötésében. Az Arg65, az Arg120 és az Arg169 oldalláncok kicserélése bizonyította továbbá az N-terminális domén belső felszínén levő bázikus régió szerepét a 3-PG-n kívül más anionok kötésében is. Később sikerült laboratóriumunk közreműködésével a PGK 3-PG-vel alkotott biner komplexét kristályosítani és szerkezetét meghatározni (16), mely egyértelműen igazolta a fentieket. Az elvégzett mutációk alapján még eddig nem sikerült az anion aktiválás molekuláris
mechanizmusát
tisztázni,
nincs
pontos
információ
az
aktiváló
anionkötőhely elhelyezkedésére vonatkozóan. A nukleotid kötőhelyre vonatkozóan ismertek azok a kísérletek, melyekben a Glu343-at, a Lys219-et ill. Asn336-ot módosították (9). Az E343A mutáció esetén a ribonukleotid difoszfátokra vonatkozó kcat értékek szignifikánsan csökkentek. Ezen eredmények szerint a Glu343 karboxil-csoportja és a ribonukleotid difoszfát ribózának hidroxilcsoportja közt kialakuló H-kötésnek fontos szerepe van a szubsztrát optimális orientációja szempontjából, elősegíti a foszfotranszfer hatákonyságát. Mindeddig nem végeztek egyetlen mutációs kísérletet sem a Lys215 oldallánccal, melynek szerepét a nukleotid foszfátlánc kötésében, és ezáltal a doménzáródásban, a 10
fentiek alapján jogosan tételezhetjük fel (2.4 pont). A PGK számos ismert kristályszerkezete közül csak két olyan szerkezetet közöltek (23, 35), amelyekben a domének záródtak. A szerzők a szerkezeti adatokat modellezéssel kiegészítve valószínűsítették, hogy a Lys215 közvetlenül stabilizálhatja az enzimreakcióban átadódó foszfo-csoportot. Az egyik szerkezeti munka (23) felveti annak a lehetőségét is, hogy a zárt szerkezetben a Lys215 a 3-PG foszfát-csoportjával is kölcsönhat. Ez annál is inkább érdekes, mert a nyitott PGK szerkezetekben (16, 18) a Lys215 oldallánc NH2csoportja kb. 15 Å távolságra helyezkedik el a 3-PG foszfátjának bármelyik Oatomjától. Ennek alapján feltételezhető, hogy a Lys215 fontos katalitikus oldallánc és pozitív töltése révén az anionaktiválásért is felelős lehet.
11
3. CÉLKITŰZÉSEK
Célul tűztem ki, hogy a PGK Lys215 konzervatív oldalláncának az irodalmi áttekintésben felvetett fontos szerepét tisztázzam: •
az enzim működésében, a katalízisben,
•
a MgATP foszfátlánca kötésében,
•
a doménzáródásban,
•
a szubsztrátfelesleg-és anionok általi aktiválásban.
A kérdések megválaszolása érdekében a következőket terveztem: •
a humán PGK előállítását bakteriális expresszióval, azért, hogy mutációs kísérleteket végezhessek,
•
a Lys215 oldallánc mutációval történő kicserélését neutrális alaninra (K215A) és hasonlóan pozitív töltésű, de eltérő természetű argininre (K215R),
•
a mutáns fehérjék biofizikai jellemzését (DSC mikrokalorimetria és CD spektroszkópia),
•
enzimkinetikai vizsgálatokat (3-PG és MgATP szubsztrátokat használva): i.
egyrészt a vad típusú humán PGK és a korábban vizsgált sertésizom PGK összehasonlítására,
ii.
másrészt
a
kétféle
mutáns
humán
PGK
jellemzésére és a vad típusú enzimmel való összehasonlítására.
12
4. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 4.1
Anyagok 4.1.1
Az enzim előállítása során használt anyagok és oldatok
Az élesztő kivonat, a bacto trypton, a NaCl, a NaH2PO4, a Na2HPO4 Reanal; az ampicillin, a kloramfenikol Sigma; az IPTG Fermentas, az (NH4)2SO4 pedig Merck gyártmány volt. LB tápoldat készítése:
10 g bacto trypton, 5 g élesztő kivonat 5 g NaCl ioncserélt vízzel 1 l-re töltöttem fel. (pH = 7,2 NaOH-dal)
2 M
Ampicillin törzsoldat:
100 mg/ml (20 ml tápoldathoz 20 µl törzsoldat szükséges)
Klóramfenikol törzsoldat:
30 mg/ml etanolban (20 ml tápoldathoz 20 µl szükséges)
LB lemezek készítése:
2,5 g NaCl 2,5 g élesztő kivonat 5 g bacto-tryptont ioncserélt vízzel 500 ml-re, pH=7,2 7,5 g bacto-agar Az így elkészített mennyiség 10 lemezre volt elegendő.
Az ampicillin ill. klóramfenikol antibiotikum tartalmú lemezek készítéséhez az antibiotikumok törzsoldatából 500-500 µl-re volt szükség 10 lemezhez. Oszlopkromatográfiához használt pufferek: NaPi puffer:
20 mM-os NaH2PO4 1mM EDTA oldat pH=6,2-re 20 mM Na2HPO4 1mM EDTA oldattal
Eluáláshoz használt pufferek:
„A” puffer: 20 mM NaPi pH=6.2 „B” puffer: 20 mM NaPi pH=6.2, 1 M NaCl
Az irányított mutagenezist QuikChange mutagenezis kit (Stratagene) segítségével végeztem. 4.1.2
A kinetikai mérésekhez alkalmazott anyagok
A 3-PG és az ATP Na-sója formájában Boehringer gyártmányú volt; a MgCl2, a Tris, a pirofoszfát, az EDTA és a DTT a Sigma-tól származott, a merkaptoetanol, a NADH pedig a Reanal-tól. 13
A PGK enzim és a GADPH segédenzim A sertésizomból izolált PGK-t [EC 2.7.2.3.] és a GAPDH segédenzimet [EC 1.2.1.12] laboratóriumunkban készítették, 3,4 M ammónium-szulfát oldatban kristályszuszpenzió formájában tárolták. Kísérleteimhez dializálva használtam fel. 4.1.3
Agaróz gélelektroforézishez használt oldatok
STOP oldat: 0,1 % brómfenolkék 0,2 M EDTA 50 % glicerin 50 mM Tris-CH3COOH 20 mM CH3COONa 2 mM EDTA pH=8,05
TAE oldat:
4.1.4
A redukáló gélelektroforézishez felhasznált anyagok és oldatok
Az SDS Merk, akrilamid/bisz-akrilamid, mólsúlymarker (Phosphorylase b – 94000 D, Bovin Serum Albumin – 67000 D, Ovalbumin – 43000 D, Carbonic Anhydrase – 30000 D, Soybean Trypsin Inhibitor – 20100 D, α-Lactalbumin – 14400 D) Bio-Rad; ammónium-perszulfát, N,N,N’,N’-Tetrametil etiléndiamin (TEMED) Serva gyártmány volt. Felhasznált oldatok: 10 (w/v%) SDS-oldat 1,5 M Tris-HCl, pH=8,8 (elválasztó puffer) 40 % akrilamid / bisz-akrilamid frissen készített 10 %-os ammónium-perszulfát oldat (APS) 0,5 M Tris-HCl, pH=6,8 (tömörítő puffer) Elválasztó gél:
4,4 ml ioncserélt víz 0,1 ml 10 %-os SDS 2,5 ml 1,5M Tris-HCl pH=8,8 (elválasztó puffer ), 3,0 ml 40 % akrilamid / bisz-akrilamid öntés előtt 100 µl APS, 10 µl TEMED
Tömörítő gél:
6,425 ml ioncserélt víz, 0,1 ml 10 % SDS, 0,975 ml 40 % akrilamid/bisz-akrilamid öntés előtt 100 µl APS, 10 µl TEMED
Mintakoktél:
3,55 ml ioncserélt víz, 1,25 ml 0,5 M Tris-HCl pH=6,8, 2,5 ml glicerol, 2 ml 10 %-os(w/v) SDS, 0,2 ml 0,5%-os (w/v) brómfenol kék 14
Az így elkészített mintakoktél 640 µl-éhez 360 µl DTT-t adtam, mintáimhoz frissen készítettem ezt az oldatot. A futtatáshoz használt puffer(1 l-hez):
30,3 g Tris bázis 144 g glicin 10 g SDS
Ebből a 10-szeres töménységű futtatóból 50 ml-t vettem ki és hígítottam a gélelektroforézishez 500 ml-re ioncserélt vízzel. A gélek festéséhez: Bio-Save Coomassie festéket (Bio-Rad) használtam. A nem említett egyéb vegyszerek is analitikai tisztaságúak voltak. 4.2
Módszerek 4.2.1
PCR reakció
Az irányított mutagenezis kivitelezésére PCR reakciót alkalmaztam, melyet Stratagene’s QuikChange helyspecifikus mutagenezis kit segítségével kiviteleztem. Ez a kit alkalmas pontmutációk elvégzésére. A PCR reakcióban PfuTurbo DNS polimeráz, valamint az előállított megfelelő primerek segítségével lehetett létrehozni a mutáns gént tartalmazó plazmidot. A folyamatban a ciklusok felfűtési szakaszában a két lánc elválik egymástól, a primerek annellálnak és szintetizálják a DNS-t, hűtéskor a komplementer láncok újra összekapcsolódnak. Megfelelő számú ciklus ismétlésével, minden lépésben a duplájára növekedve, megsokszorozható a plazmid mennyisége. PCR elegy összetétele: 5 µl 10X reakció puffer 5-50 ng dsDNA templát (hPGK gént tartalmazó plazmid) 125 ng primer#1 125 ng primer#2 2 µl dNTP mix 1 µl Pfu Turbo DNS polimeráz (2,5U/µl) kiegészítettem 50 µl-re ddH2O-val A hPGK gént tartalmazó plazmidot Philip J. Hogg-tól (Centre for Vascular Research, University of New South Wales, and Department of Haematology, Prince of Wales Hospital, NSW 2052, Australia) kaptuk. T3 Thermocycler (Biometra) készülékkel 20 ciklust végeztettem. 95 oC-os felfűtés után kezdődtek el a ciklusok. Egy ciklus felépítése a következők szerint alakult: 97 oC-on 20
15
sec, 55 oC-on 60 sec, 68 oC-on 14 perc (templát hosszától függ, 2 perc/kb). A ciklusok után 68 oC-on 10 sec-ig tartotta a hőmérsékletet, majd 4 oC-ra hűlt. A reakciótermék mennyiségét 1%-os agaróz gélen ellenőriztem (összehasonlítottam a kiindulási DNS mennyiségével). Emésztés 1µl DpnI enzimet (10 U/µl) adtam a reakcióelegyhez és 37 oC-on 1 órán keresztül inkubáltam. Ekkor az enzim hatására a metilált (szülői, nem mutáns) dsDNS lebomlik. 4.2.2
Transzformálás
A PCR segítségével felszaporított mutációt tartalmazó plazmidot Epicurian Coli XL1Blue szuperkompetens sejtekbe, fehérjetermelés céljából a felszaporított és kitisztított vektort
pedig
BL21-CodonPlus
(DE3)-RIL
(Strategene)
kompetens
sejtekbe
transzformáltam. A -80 oC-on tartott kompetens sejteket jégen lassan felolvasztottam. 50 µl sejthez az 1 µl plazmidot adtam, majd jégen inkubáltam 30 percig. 90 másodpercig 42 oC-on (hősokk) indukáltam a rezisztencia gének kifejeződését, majd 2 percig jégen tartottam. Ezt követően 500 µl 42 oC-ra előmelegített 500 µl LB kondicionált médiummal rázattattam egy órán át 37 oC-on. Antibiotikum tartalmú lemezekre kentem ki, majd 16 órán át növesztettem 37 oC-on. 4.2.3
Plazmid tisztítása
Viogene Mini-M plazmid DNS preparációs kit segítségével történt. 4.2.4
Emésztés restrikciós endonukleáz enzimekkel és DNS elektroforézis
Annak ellenőrzésére, hogy a pET11c vektor valóban tartalmazza a megfelelő nagyságú hPGK génjét NdeI és BamHI restrikciós enzimek segítségével emésztettem a kitisztított plazmidot. A hasítóhelyek a hPGK génjének 5’ ill. 3’ végén találhatók. Ezt követően agaróz
gélelekroforézist
használtam
az
emésztett
termék
tisztaságának
és
mennyiségének ellenőrzésére.
16
4.2.5
DNS gélelektroforézis
A DNS fragmensek elválasztására agaróz gélelektroforézist használtam. A fragmensek méretüknek megfelelően az elektromos térerősség hatására különböző sebességgel vándorolnak, ez szeparálást tesz lehetővé. Az elektroforézishez 1 %-os agaróz gélt készítettem, amit forralás után lehűtve öntöttem a tálcára a fésű megfelelő elhelyezését követően. Az agaróz gél megszilárdulását követően összeállítottam a berendezést és felvittem a mintákat. Az elektroforézist TAE oldatban 80 V feszültségen kb. 50 percig végeztem. A gél festéséhez etídium-bromidot alkalmaztam, mely 20 percig tartott. Ezt követően ioncserélt vízben mostam kétszer, 10 percig. UV fénnyel megvilágítva láthatóvá váltak a szeparálódott DNS sávok. 4.2.6
Fehérje termelése E. coli sejtekben
A plazmidot tartalmazó BL21-C+(DE3)-RIL kinőtt telepek közül egyet 20 ml LB tápoldatba tettem, ami 20 µl ampicillint és 20 µl kloramfenikolt tartalmazott. Ezt a kezdő kultúrát egy éjszakán át növesztettem. A fehérje termelést 2 l-es Erlenmeyer lombikokban végeztem, lombikonként 500 ml LB-táptalajjal, melyhez 5 ml kezdő kultúrát, 500 µl ampicillint, és 500 µl kloramfenikolt adtam. Az így elkészített kultúrákat 180 rpm-en 37 oC-on, kb 3 óra hosszáig növesztettem az optikai denzitását figyelve. OD600=0,6 értéknél 0,5 mM IPTG-vel indukáltam, hogy a PGK termelődése megkezdődjön. 4 órán keresztül termeltettem az enzimet. Ezt követően 4000 rpm-mel, 15 percig 4
o
C-on centrifugáltam a kultúrákat és a
sejtcsapadékot 20 ml NaPi pufferrel felszuszpendáltam, majd folyékony N2-ben lefagyasztottam és -80 °C-on tároltam. 4.2.7
A fehérje feltárása és tisztítása
A sejt szuszpenziót ultrahangos feltárásnak (szonikálás) vetettem alá, mely 5·1 percig jégben történt, a felmelegedés elkerülése érdekében. Ezt követően 12000 rpm-el 4 oC-on 15 percig centrifugáltam. A felülúszót lassan telítettem 2,3 M (357g/l) ammóniumszulfáttal állandó keverés mellett, jeges vízfürdőben. Centrifugáltam 12000 rpm-mel, 15 percig, 4 oC-on. A felülúszót tovább telítettem 3,4 M (195 g/l) ammónium-szulfáttal az előzőekhez hasonló módon. Centrifugáltam 12000 rpm-mel, 15 percig, 4 oC-on. A csapadékot 20 mM NaPi pufferben pH=6,2 feloldottam. Az ammónium-szulfátot 17
kidializáltam a fehérjéből 20 mM-os NaPi pufferben pH=6,2; 5 mM merkaptoetanol jelenlétében. CM-Sepharose oszlopkromatográfia A sómentesített fehérje továbbtisztítását Gradifrac készüléken karboxi-metil-(CM)Sepharose kationcserélő gyantán végeztem el. A készülék programozható, a megadható paraméterek: az eluens áramlási sebessége, a gradiens, a frakciók szedésének módja ill. a frakciók térfogata. A készülék egy UV detektor segítségével méri a rajta átfolyó oldat abszorbanciáját, ami a fehérjekoncentrációval arányos. Az ennek megfelelő jelet rajzolja ki a rekorder. A kromatográfiás elválasztás előtt az „A” pufferrel ( 20 mM NaPi pH=6,2) egyensúlyba hoztam. Ezt követően felvittem az oszlopra a dializált fehérjét. Az „A” puffer segítségével mostam az oszlopot. Ekkor az elegyben lévő azon fehérjék, melyek nem tudtak megkötődni az oszlopon, (mert nincs megfelelő pozitív töltésük) kimosódtak. Ezután „B” puffer segítségével, mely az „A”-hoz képest még 1 M NaCl-ot is tartalmazott gradiens elúciót alkalmaztam. A növekvő sókoncentráció következtében a gyantán megkötött fehérjék fokozatosan „leszorultak” pK értékük alapján más-más iongradiensnél eluálódtak. A frakciókat kémcsövekbe gyűjtöttem. A kromatogram alapján SDS-gélelektroforézis (4.2.8. pont) segítségével azonosítottam a hPGK-t tartalmazó frakciókat, és azok tisztaságát ellenőriztem az enzimre nézve. A hPGK tartalmú frakciókat összeöntöttem, majd Amicon szűrőn kb. 300 µM koncentrációra betöményítettem. A töményítéshez 10000 kDa méret-határig visszatartó membránt használtam. A betöményített enzimet dializáltam 20 mM Tris-HCl pH=7,5 (1 mM EDTA, 5 mM DTT) pufferrel szemben, ezt követően a fehérje koncentrációját és aktivitását mértem. Az így előállított fehérje 98 % tisztaságú volt.
4.2.8
Fehérje vizsgálata SDS-gélelektroforézissel
A termelt fehérje tisztaságát SDS-PAGE módszerrel ellenőriztem. Adott pH-jú oldatban a fehérjék különböző fajlagos töltéssel és térszerkezettel rendelkeznek. Az oldathoz adott SDS hatására a fehérjék denaturálódnak, egységesen nyújtott konformációt vesznek fel, valamint hosszegységenként kb. azonos mennyiségű SDS-t kötnek meg, így a töltés/tömeg arány azonos lesz. A több polipeptidláncból felépülő fehérjék alegységeikre disszociálnak. Ilyen körülmények közt a monomereknek az elektromos 18
tér hatására bekövetkező vándorlása a gélmátrixban arányos lesz a moláris tömeggel az elektroforézis ideje alatt. A gélelektroforézishez Bio-Rad berendezést használtam. Az elválasztó és a tömörítő gél elegyének elkészítése után az elválasztó gélt a futtató berendezés két üveglapja közé pipettáztam, fölé ioncserélt vizet rétegeztem az egyenletes gélfelszín elérése érdekében. A polimerizálást követően rápipettáztam a tömörítő gélt és belehelyeztem a fésűt. A gél polimerizálása után a mintákat a zsebekbe, a futtató puffert pedig a futtató kádba töltöttem. Az elektroforézist 180 V feszültség mellett 60 percig végeztem. Ezt követően a gélt kivettem, ioncserélt vízben mostam, majd festékoldatban (Bio-Rad, 4.1.4 pont) 60 percig festettem. A felesleges festék kimosását követően a fehérjék láthatóvá váltak a gélen. 4.2.9
Fehérjekoncentráció meghatározása
A fehérje koncentrációjának meghatározására 280 nm-en spektrofotométerrel végeztem. A fehérje oldószeréül szolgáló puffer elnyelését is megmértem. A fehérje oldat és a puffer elnyelésének különbségéből számítottam ki a PGK koncentrációját ([PGK]). a Lambert-Beer törvény segítségével: A280 = ε ⋅ lּ [PGK]
2. egyenlet
ahol: A280 a 280 nm-en mért abszorpció ε a PGK moláris abszorbciós koefficiens (0,69 cm3/mg ⋅ cm) l a fényúthossz a küvettában. 4.2.10 PGK enzimaktivitásának meghatározása A PGK enzimaktivitását 3-PG és MgATP szubsztrátok alkalmazásával, GAPDH segédenzim segítségével határoztam meg a NADH oxidációjának spektrofotometriás követése alapján 340 nm-nél (ε=6220 M-1cm-1). A reakció alapja azon konszekutív folyamat (3. egyenlet), melynek során a PGK által katalizált folyamatban keletkező 1,3BPG továbbreagál a GAPDH segédenzimmel és eközben a NADH oxidálódik. A PGK aktivitásának meghatározásához az szükséges, hogy a PGK által katalizált folyamat legyen a sebességmeghatározó. Az időgörbe első 10-20 másodpercéből a kezdeti sebességet határoztam meg. PGK MgATP + 3-PG → MgADP + 1,3-BPG
1,3-BPG +NADH + H+ GAPDH → G-3-P + NAD + Pi
3. egyenlet
19
Az enzimaktivitási méréseket 20 mM-os Tris-HCl pH=7,5 (1 mM EDTA, 5 mM DTT) pufferben végeztem. A reakcióelegy összetétele: 2,5 mM MgCl2 2,5 mM ATP 2,5 mM 3-PG 100 mM hidrazin-HCl 0,25 mM NADH kb. 10-4 mM GAPDH kb. 2*10-6 mM PGK 4.2.11 A szubsztrátok koncentrációjának meghatározása ATP koncentrációjának meghatározása Enzimatikus meghatározás Az enzimaktivitás meghatározásnál említett konszekutív reakció alapján, hasonló összetételű reakcióelegyben végeztem az ATP koncentrációjának az enzimatikus meghatározását. Különbség, hogy itt a MgATP szubsztrátot kis (kb. 0,1 mM) koncentrációban alkalmaztam, hogy teljes mennyiségében átalakuljon, az enzimeket pedig nagyobb koncentrációban, hogy gyorsan lejátszódjon a reakció. A reakcióelegy összetétele:
5 mM DTT 5 mM 3-PG 10 mM MgCl2 100 mM hidrazin-HCl 0,15 mM NADH 0,10 mM GAPDH (kristályos) 0,10 mM PGK (kristályos) 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH=7,5
A NADH 340 nm-nél mért spektrális jelében bekövetkező változást mértem. A NADH koncentrációjának megváltozása, az egyenletek szerint, megegyezik az elegybeli MgATP szubsztrát koncentrációjával, mert az teljes mennyiségében elreagál. Spektrofotometriás meghatározás A Lambert-Beer egyenlet alapján 260 nm-nél ε=15400 M-1s-1 moláris abszorpciós koefficiens segítségével történt. 3-PG koncentrációjának meghatározása Csak enzimatikusan történt, hasonlóan a nukleotid szubsztrát MgATP enzimatikus meghatározásához. Itt viszont a MgATP-t alkalmaztam kis (kb. 0,1 mM) koncentrációban. A reakcióelegy összetétele hasonló volt a MgATP enzimatikus bemérésénél alkalmazotthoz, de 5 mM 3-PG helyett 5 mM MgATP-t alkalmaztam. 20
4.2.12 Szubsztráttelítési kinetikai vizsgálatok 3-PG-vel és MgATP-vel A PGK aktivitását 20 oC-on adott szubsztrát jelenlétében 20 mM Tris/EDTA (pH=7,5) pufferben mértem, mely 1mM EDTA-t és 1mM DTT-t tartalmazott. A NADH-nak a GAPDH által okozott oxidációját követtem 340 nm-nél (4.2.10. pontban leírtak alapján). A szubsztráttelítési görbék analízisére a vad típusú hPGK enzim esetében az alábbi egyenletet alkalmaztam: v = vS
[S ]
K S ( kat ) + [S ]
+ vS ( a − 1)
[S ]
⋅
[S ]
K S ( kat ) + [S ] K S ( akt ) + [S ]
4. egyenlet
Az egyenlet első tagja a katalitikus hely szubsztráttal való telítődését írja le, vagyis azt az aktivitást, amit akkor fejtene ki az enzim, ha nem állna fenn a szubsztrátfelesleg aktiválás jelensége. Így tehát vS adja meg a katalitikus hely telítéskor, aktiválás nélkül mérhető hipotetikus aktivitást. Az egyenlet második tagja azt az aktivitásnövekedést jelenti, mely az aktiváló hely telítődéséből adódik. A KS(kat) a katalitikus, míg a KS(akt) az aktiváló helyre jellemző állandók, lényegileg az ismert Km állandóval analóg mennyiségek. Az a pedig az aktiválási faktor. Amennyiben a szubsztrát a katalitikus és az aktiváló helyet is telíti, akkor az aktivitás a⋅vS lesz. A mutáns enzimek esetében az egyszerűbb Michaelis-Menten kinetika érvényes a szubsztráttelítési görbékre, az alábbi egyenlet szerint:
v = Vm
[S]
K m + [S]
5. egyenlet
Ahol a Vm az elérhető maximális reakciósebességet, az [S] a szubsztrát koncentrációját, míg a Km a Michaelis-Menten állandót jelenti. A szubsztráttelítési vizsgálatokban alkalmazott elegy összetétele: 2,5 vagy 10 mM MgATP (3-PG telítési görbe esetén) 2,5 mM 3-PG (MgATP telítési görbe esetén) 12,5 mM MgCl2 20 mM Tris, 1 mM DTT pH = 7,5 0,25 mM NADH 5-10 nM vad-típusú ill. 1-3 µM mutáns PGK 0,1-0,2 mM GAPDH 4.2.13 Anion aktiválás-gátlás vizsgálatok Az anionaktiválás-gátlás vizsgálatok a PGK azon különleges enzimkinetikai viselkedésén alapulnak, hogy a többértékű anionok alacsony koncentrációban aktiválják, magas koncentrációban pedig gátolják az enzimaktivitást. Kísérleteimet 21
pirofoszfát anionnal végeztem. Az anion koncentrációját változtatva mértem a PGK aktivitását, miközben mindkét szubsztrát koncentrációját állandó szinten (0,5 mM 3-PG és 0,5 mM MgATP) tartottam. A kinetikai mérések leírására a vad típusú PGK-k esetén az alábbi egyenletet alkalmaztam: v = vu + vu ⋅ (a − 1) ⋅
[L]
[L] ⋅ [L]n − vu + vu ⋅ (a − 1) ⋅ K d(act) + [L] K d(act) + [L] K d(inh) + [L]n
6. egyenlet
Az egyenletben vu az enzim aktivitása anion (L) távollétében adott szubsztrát koncentráció mellett, az a pedig egy aktiválási faktor, mely megmutatja, hogy végtelen ligandkoncentrációnál az aktivitás hányszorosára növekszik. Ebben az esetben az a mindig egynél nagyobb érték. A vu (a-1) azt az aktivitásnövekedést jelzi, mely az aktiváló hely telítődéséből származik, feltételezve, hogy a ligand csak az aktiváló helyhez kötődik. A harmadik tag adja meg a gátlást. Az egyenletben az n hatványkitevő jelzi, hogy több, egymással kölcsönhatásban levő gátlóhely feltételezett az enzim szerkezetében. A ligandkoncentráció (L) függvényében felvett kísérleti aktivitási értékek ezen egyenlet segítségével értékelhetők, vagyis megadhatók a vizsgált ligandra az aktiváló és gátlóhelyekhez tartozó disszociációs állandók (Kakt és Kinh), valamint az a és az n paraméterek értéke. Az n a Hill koefficiens, mely megadja a minimális gátlóhelyek számát. Az anionaktiválás-gátlás vizsgálatára használt elegy összetétele: 0,5 mM 3-PG 0,5 mM ATP 1,0 mM MgCl2 100 mM Tris, 5 mM DTT pH = 7,5 0,25 mM NADH 0,1-0,2 mM GAPDH 0,05 µM vad-típusú ill. 2-3 µM mutáns PGK változó koncentrációjú (0-10 mM) pirofoszfát anion KI (valódi) gátlási állandót a következő képlet alapján számítottam, feltételezve, hogy az anion a szubsztrátokat kompetitíven kiszorítja: KI =
KS( kat ) ⋅ K '(inh )
[S] + KS(kat )
7. egyenlet
Ahol a K’(inh) azonos a 6. egyenletben szereplő Kd(inh) állandóval. A valódi gátlási állandó kiszámításához mindkét szubsztrát koncentrációját figyelembe kell venni.
22
A mutáns PGK-k esetén az anionok kompetitív gátló hatását a 8. egyenlet írja le, amely a 6. egyenletből úgy származtatható, hogy az a, aktiválási faktor értéke 1. Ekkor csupán aniongátlást figyelhető meg. v = vu − {vu }⋅
[L]n
K d(inh) + [L ]
n
8. egyenlet
Pirofoszfát anionnal végzett mérési pontjaim Lineweaver-Burk ábrázolásban való megjelenítéséhez az alábbi egyenletet alkalmaztam: 1 ⋅ Km 1 [S] 1 = + v Vm Vm
9. egyenlet
Ahol a Km a Michaelis állandót, a Vm a maximális reakciósebességet, az [S] pedig a szubsztrát koncentrációt jelenti. 4.2.14 Differenciál scanning (DSC) mikrokalorimetria A fehérjék térszerkezetének megváltozását a termodinamikai paraméterek megváltozása kíséri. A kalorimetriás módszer segítségével a molekulák hő hatásával szemben mutatott stabilitását, a natív szerkezetű fehérjék hőmérséklet hatására bekövetkező letekeredését (unfolding) vizsgálhatjuk. Így lehetőséget nyújt a mutáns enzimek esetén a feltételezett korrekt térszerkezet kialakulásának ellenőrzésére. A méréseimet VP-DSC MicroCalorimeter-rel végeztem, 50 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA pH=7,5 pufferben 3 µM (0,13 mg/ml) koncentrációjú enzimekkel, a felfűtési sebesség 1oC/perc volt. 4.2.15 Cirkuláris dikroizmus (CD) spektroszkópia A cirkuláris dikroizmus segítségével szintén a fehérjék szerkezete ill. szerkezet változása vizsgálható. A távoli UV tartományban (180-260 nm) felvett spektrum a másodlagos szerkezeti elemek meglétéről ill. ezeknek a fehérje szerkezetében betöltött arányáról ad információt. Míg a közeli UV tartománybeli spektrum (260-320 nm) alapján az aromás oldalláncokra, ezek egymáshoz viszonyított térbeli helyzetére, azaz a harmadlagos szerkezetre következtethetünk. A vad típusú hPGK és a mutáns PGK-k térszerkezetének ellenőrzésére a távoli UV-ban felvett spektrumok összehasonlítását végeztem el. Kísérleteimet JASCO 720 spectropolarimeter-t használva, 1 mm-es küvettában 50 mM Tris pH=7,5 pufferben végeztem 9 µM (0,4 mg/ml) koncentrációjú enzimekkel. 23
5. EREDMÉNYEK ÉS MEGVITATÁSUK 5.1
A humán PGK kifejezése és tisztítása
Laboratóriumunkban korábban sertésizomból izolált PGK-val dolgoztunk. Azért, hogy irányított mutagenezis kísérleteket végezhessek a PGK génjén, szükség volt egy bakteriális kifejező rendszerre. Mivel a humán PGK génje állt rendelkezésre (4.2.1 pont), ezért ezen enzimre dolgoztam ki az expressziót. A humán PGK szekvenciája 98 %-ban azonos a sertésizom PGK-éval, tehát az új eredetű enzim esetén nem számítottam lényeges eltérésre a korábban vizsgált sertésizom PGK-hoz képest. A
plazmidot
BL21C+(DE3)-RIL
baktériumtörzsbe
transzformáltam.
A
törzs
használatának az az előnye, hogy benne az Arg, Ile és Leu kifejezésében közreműködő humán tRNS-ek is jelen vannak. Ez azért szükséges, mert a humán enzim génjének elején található egy Arg aminosavat kódoló triplett, melyhez tartozó tRNS-t az E.coli csupán 0,04 % gyakorisággal fejezi ki. Ez a törzs klóramfenikol rezisztenciagénnel rendelkezik. A transzformált sejteket ampicillin és klóramfenikolt tartalmazó lemezekre szélesztettem, így biztosítva, hogy csupán azon sejtek maradjanak életképesek és fejlődjön telep belőlük, melyekbe bejutott a pET11c vektor. A kifejlődött telepek egy sejtből alakulnak ki. Egy telepet 20 ml LB tápoldatba oltottam,
IE
IU 94 kD 67 kD 43 kD 30 kD 20,1 kD 14,4 kD
5. ábra: SDS–gélelektroforézis a hPGK gén indukciójának ellenőrzésére. Az indukció 4.2.6 pontban leírtak szerint IPTG segítségével történt: indukálás előtt (IE), indukálás után (IU). A PGK molekulatömege 44,5 kD.
24
melyhez 20 µl ampicillin és 20 µl klóramfenikol antibiotikumot is adtam. Ez volt a kezdő kultúra. Egy éjszakán át inkubáltam. Másnap négy darab 2 l-es lombikba osztottam szét a kezdő kultúrát, melyek egyenként 500 ml LB tápoldatot és 500 µl ampicillint, valamint 500 µl klóramfenikolt tartalmaztak. 37 oC-on 180 rpm rázatással növesztettem. A megfelelő sejtszaporulat elérését követően IPTG indukció segítségével fehérjét termeltettem (4.2.6 pont). Az 5. ábrán megfigyelhető a 43 kD körüli sávban, hogy indukálás után a termelt fehérje jelentős mennyiségű volt a mintában. A sejtszuszpenziót centrifugáltam és a csapadékot a további tisztításig -80 oC-on tároltam. Ezután a sejteket ultrahangos feltárásnak vetettem alá (szonikáltam). Ezt követően centrifugáltam, hogy a sejttörmeléket elválasszam az izolálni kívánt fehérjétől. A PGK a felülúszóba került, a sejttörmelék csapadékként jelentkezett. A felülúszót ammóniumszulfáttal 2,3 M-ig telítettem. Ennél az első kisózásnál a fehérjém még nem csapódott ki. Sz F F1 F2 D
43 kD
6. ábra: A hPGK kimutatása SDS-gélelektroforézissel a tisztítási lépések során A minták vétele Sz=szonikálás után, F=centrifugálás után, F1=1. kisózás felülúszó, F2=2. kisózás felülúszó, D=dialízis után történt.
Centrifugálás segítségével elválasztottam a kisózott egyéb fehérjéktől, a PGK a felülúszóban volt. Ezt követően 3,4 M-ig tovább telítettem ammónium-szulfáttal. Centrifugálást követően a PGK a csapadékban volt. Ezt oldottam fel 20 mM NaPi pufferben pH=6,2 (5 mM merkaptoetanol) és dializáltam, hogy az ammónium-szulfátot eltávolítsam. A merkaptoetanol redukálószer, amely megvédi a fehérje szabad SHcsoportjait az oxidálódástól oly módon, hogy önmaga oxidálódik. 25
Az összes tisztítási lépes során mintát vettem és SDS-gélelektroforézist végeztem a PGK kimutatására (6. ábra). A dializált fehérjét CM-Sepharose oszlopkromatográfia segítségével tisztítottam tovább (4.2.7 pont), amit a 7. ábrán mutatok be.
7. ábra: A CM-Sepharose oszlopkromatográfia Lineáris NaCl-gradienst alkalmazva az eluátumban kapott első csúcs az „áteső” fehérjefrakció, míg a második csúcs tartalmazza a hPGK-t.
A kromatográfia frakcióit SDS-gélelektroforézissel analizáltam (8. ábra). 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 D
8. ábra: Az CM-Sepharose oszlopkromatográfia frakcióinak SDS-gélelektroforézise A frakciókat sorszám jelöli. Összehasonlításképpen az oszlopra vitt dializált minta képe is látható (D).
26
A kb. 98 % tisztaságú hPGK-t betöményítettem, fehérje koncentrációját és aktivitását mértem. Két liter fermentléből kb. 80-100 mg fehérjét állítottam elő. 5.2
Mutációk tervezése és kivitelezése
A vad típusú humán PGK-t kódoló génszakaszban a Lys215 aminosav maradéknak megfelelő szekvenciát Ala-t ill. Arg-t kódoló triplettre változtattam a 2. táblázatban leírtak szerint. 2. táblázat: A hPGK génjében tervezett mutációk
génszekvencia 640’⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅655’
nukleotidcserék száma
vad típusú HPGK
GGA GCT AAA GTT GCA
-
K215A
GGA GCT GCA GTT GCA
2
K215R
GGA GCT AGA GTT GCA
1
Az aminosav kicseréléshez Stratagene QuikChange mutagenezis kit–et használtam. A PCR folyamatban pfu turbo DNS polimerázt alkalmaztam (4.2.1 pont). A mutáció kivitelezéséhez először a primereket kellett megtervezni. Ehhez több szempontot kellett figyelembe venni: 1. mindkét primernek tartalmaznia kell a kívánt mutációt és annellálnia kell a plazmid ugyanazon szekvenciájának szemben lévő szálaihoz, 2. a primerek hosszúságának 25-45 bázis köztinek kell lenni, valamint olvadási hőmérsékletüknek (Tm) nagyobbnak vagy egyenlőnek kell lenni, mint 78 oC. Ennek kiszámításához a következő képletet használtam: Tm=78 oC + 0,41 (GC%) - (675/N) - % mismatch (kicserélt bázispár), ahol (GC%) a primer guanin-citozin % arányát jelenti, az N pedig a primer hosszát bázisokban. Mindkét érték egész szám. 3. A kívánt mutációnak a primer közepén kell lenni, mindkét oldalon 10-15 bázisnyi korrekt szekvenciával. 4. A (GC %)-nak minimum 40-nek kell lenni és egy vagy több G-ra vagy C-ra kell végződnie. A tervezett primereket a következő táblázat (3. táblázat) tartalmazza:
27
3. táblázat: A K215R és a K215A mutánshoz tervezett primerek
K215R 634
AAA →
AGA
5’ CTGGGCGGAGCTAGAGTTGCAGACAAGATCC Tm=80,28 GC%=58 Hossz: 31
Reverz komplementer láncról a mutáció 5’ GGATCTTGTCTGCAACTCTAGCTCCGCCCAG K215A 630
AAA →
3’
664
3’
GCA
5’ CATCCTGGGCGGAGCTGCAGTTGCAGACAAGATC Tm=79,4 GC%=58 Hossz:34
3’
663
Reverz komplementer láncról a mutáció 5’ GATCTTGTCTGCAACTGCAGCTCCGCCCAGGATG 3’ Ezen szempontok alapján megtervezett primerek segítségével, PCR folyamat által, létrehoztam a kívánt mutációkat a hPGK génjében. Majd DpnI enzimmel emésztettem, hogy eltávolítsam az eredeti, metilált szülői szálat és így a mutáns szekvenciát tartalmazó DNS szekvenciából álljon össze a dupla szálú plazmid. Ezt követően XL1Blue baktériumtörzsbe transzformáltam a vektort. Majd ampicillin antibiotikum tartalmú lemezre szélesztettem ki a sejteket. Az antibiotikum segítségével szelektáltam, csak azok a sejtek éltek túl, melyekbe bejutott a vektor, mert a pET11c ampicillin rezisztencia gént tartalmaz. A szélesztés segítségével pedig elértem, hogy egy-egy telep egy-egy sejtből fejlődött ki. Egy telepet 5 ml LB tápoldatba helyeztem steril fogpiszkáló segítségével, melyhez még 5 µl ampicillin antibiotikumot is adtam. Egy éjszakán át 37 oC-on inkubáltam, felszaporítottam. Viogene Mini-M DNS preparációs kittel tisztítottam. Majd pedig NdeI és BamHI restrikciós enzimekkel emésztettem ki a mutáns hPGK gént a plazmidból. Agaróz gélelektroforézist végeztem ill. szekvenáltatni küldtem a kiemésztéssel kapott mutáns hPGK génszakaszt, hogy meggyőződjek a mutáció helyes bekövetkezéséről. A mutáns hPGK gént tartalmazó plazmid 1 µl-ét BL21-C+(DE3)-RIL törzsbe transzformáltam és a fehérje kifejezését és tisztítását a hPGK-nál leírtak szerint folytattam.
28
5.3
A tisztított mutáns fehérjék biofizikai jellemzése
A hPGK, a K215A és K215R enzimeket DSC mikrokalorimetria és CD spektroszkópia módszerekkel
jellemeztem.
Biofizikai
vizsgálatok
szükségesek
voltak
annak
ellenőrzésére, hogy a fehérjében a Lys215 oldallánc mutációja Ala ill. Arg aminosavakra, nem okoz lényeges változást a fehérje térszerkezetében. 2000 1000
θ*10-3(deg M-1cm-1)
0 -1000 -2000 -3000 -4000 -5000 -6000 -7000 200
210
220
230
λ (nm)
240
250
260
9. ábra: A mutáció hatása a hPGK CD spektrumára A vad típusú hPGK (piros), a K215A (zöld) és a K215R (narancssárga) mutánsok spektrumát a 4.2.15 pontban leírtak szerint határoztam meg.
80
Cp (kcal/mole/oC)
60
40
20
0
40
50
60
T (oC) 10. ábra: A mutáció hatása a hPGK kalorimetriás hőstabilitására A vad típusú hPGK (piros), a K215A (zöld) és a K215R (narancssárga) mutánsok hőátmeneteit a 4.2.14 pontban leírtak szerint határoztam meg.
29
A mutáns enzimek CD spektrumai jó egyezést adtak a vad típusú hPGK-val. A DSC mikrokalorimetriával
meghatározott
olvadási
görbék
alakja
és
az
olvadási
hőmérsékletek között sem volt lényeges különbség. Tehát mindkét kísérlet azt igazolja, hogy a mutáció nem okozott kimutatható szerkezetváltozást. 5.4
A vad típusú sertés és humán PGK kinetikai összehasonlítása 5.4.1
Szubsztrátok feleslegének aktiváló hatása
Az enzimológiai vizsgálatok közül elsőként arra volt szükség, hogy a vad típusú sertés PGK és humán PGK enzimek kinetikai viselkedését összehasonlítsam. Mind a 3-PG, mind pedig a MgATP szubsztrátok telítését vizsgáltam (4.2.12 pont). A telítési görbék a 11. és 12. ábrákon láthatók. A PGK korábbról ismert különleges enzimkinetikai viselkedése a humán enzim esetén is megnyilvánult. Ennek megfelelően szubsztrátfelesleg aktiválás jelensége figyelhető meg mindkét vad típusú enzimnél, vagyis nagyobb szubsztrát koncentrációknál a mért
1,4
1,2
v, dAbs340/perc
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0 0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
3-PG, mM
11. ábra:A vad típusú PGK-k aktivitásának függése a 3-PG koncentrációtól 8 nM sertésizom (kék) és ugyanilyen koncentrációjú hPGK (piros) aktivitását 2,5 mM MgATP jelenlétében 4.2.12 pontban leírtak szerint határoztam meg. A kísérleti pontokra a 4. egyenlet szerint illesztettem a görbéket.
30
enzimaktivitás tovább növekszik és a Michaelis-Menten kinetikával ellentétben, nem ér el telítési értéket. Az ábrákon jól látható a humán és a korábban vizsgált sertésizom PGK teljesen azonos viselkedése.
1,2
v, dAbs340/perc
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0 0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
MgATP, mM
12. ábra: A vad típusú PGK-k aktivitásának függése a MgATP koncentrációtól 8 nM sertésizom (kék) és ugyanilyen koncentrációjú hPGK (piros) aktivitását 2,5 mM 3-PG jelenlétében 4.2.12 pontban leírtak szerint határoztam meg. A folyamatos görbéket a 4. egyenlet alapján illesztettem.
A kísérleti pontok jól leírhatóak voltak a szubsztrátfelesleg aktiválásra érvényes 4. egyenlettel. Az illesztés segítségével meghatároztam az egyenletben feltüntetett paramétereket: a Kkat, Kakt-ot mindkét szubsztrátra, melyek a 4. táblázatban vannak feltüntetve.
31
4. táblázat: Kinetikai állandók összefoglalása A feltüntetett értékek a 11-13. és 17-19. ábra kísérleti adataiból származnak.
Vad típusú
K215A
K215A /
K215R
K215R /
HPGK
mutáns
HPGK
mutáns
HPGK
Vm
50000±8000
30,5±5
0,00061
105±10
0,0021
vs
13500±1000
-
-
-
-
0,05±0,03
-
-
0,4±0,04
0,11±0,03
-
-
2,5±0,7
29±21
-
-
-
-
26±24
-
-
-
-
5,6±8,3
-
-
-
-
7,3±6,4
1,07±0,09
6,82
1,85±0,27
3,95
1,82
0,39±0,15
c
1,77
Kinetikai konstansok (1/min)
(mM) Kcat 3-PG Km 3-PG
(mM) Kcat MgATP Km MgATP (mM) Kact 3-PG Kact MgATP (mM) K’act pirofoszfát
a
K’inh pirofoszfát
KI a b c
a
b
0,22
c
0,4±2,5
8
22,73
0,35±0,03 0,53±0,05
7
4,82
A mérés 0,5 mM 3-PG és 0,5 mM MgATP jelenlétében történt. Számított érték, kompetíciót feltételezve mindkét szubsztráttal szemben 3-PG-vel szembeni kompetíciót feltételezve
5.4.2
Anionaktiválás és gátlás együttes megnyilvánulása
Megvizsgáltam azt is, hogy a humán PGK mutatja-e a más PGK-k (élesztő, sertés) vizsgálata során felfedezett anionaktiválási jelenséget. Ezért anionaktiválás-gátlás vizsgálatot végeztem pirofoszfát anionnal (13. ábra). A sertésizom PGK-val teljesen azonos módon a pirofoszfát alacsony koncentrációban megnövelte az enzim aktivitását a hPGK esetén is. Magasabb pirofoszfát koncentrációknál viszont egyre gyengülő enzimaktivitás volt mérhető, mivel a pirofoszfát mint többértékű anion, gátolja az enzimműködést. A sertésizom enzimnél ismert volt, hogy a kísérleti pontok egy aktiváló és két gátló anionkötőhely feltételezésével illeszthetőek (6. egyenlet). Ugyanazon egyenlettel írhatók le a hPGK-nál kapott kísérleti pontjaim is. Ez azt jelenti, hogy a humán enzim esetén is két, egymással együttműködő gátló anionkötőhely létezik.
32
0,6
0,5
v, dAbs340/perc
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
pirofoszfát, mM
13. ábra: Pirofoszfát anion hatása a vad típusú PGK-k aktivitására 5,7 nM sertésizom (kék) és ugyanilyen koncentrációjú hPGK (piros) aktivitását mértem a 4.2.13 pontban leírtak szerint 0,5 mM 3-PG és 0,5 mM MgATP jelenlétében különböző pirofoszfát koncentrációknál. A kísérleti pontokhoz a görbéket a 6. egyenlet alapján illesztettem.
A 13. ábra kísérleti pontjaihoz illesztett görbék paraméterei: K’akt, K’inh a 4. táblázatban láthatóak. 5.4.3 Aniongátlás kinetikai vizsgálata a vad típusú hPGK esetében Mivel munkám során az aniongátlás kvantitatív analízisére volt szükség (5.5 fejezet), ezért a továbbiakban a hPGK szubsztráttelítési görbéit pirofoszfát anion jelenlétében vettem fel. A kísérletek célja az volt, hogy megvizsgáljam, hogy a pirofoszfát kinetikailag milyen típusú gátlást mutat a szubsztrátokkal szemben. A vad típusú enzim esetén a gátlószert viszonylag nagy koncentrációban alkalmaztam, mert alacsony koncentrációban még aktivál. A 14. ábrán a hPGK 3-PG telítési görbéje látható 40 mM pirofoszfát jelenlétében is. Ellentétben a gátlószer nélkül kapott szubsztráttelítési görbével, ami a szubsztrát felesleg aktiválást feltételezve volt illeszthető (4. egyenlet), addig a pirofoszfát jelenlétében felvett görbe hibahatáron belül leírható volt a Michaelis-Menten egyenlettel. Ennek az lehet az oka, hogy a jól vizsgálható szubsztrátkoncentráció tartományban lényegében a katalitikus hely telítését lehet megfigyelni pirofoszfát jelenlétében. Tehát ily módon az anionnak a katalitikus hellyel való kölcsönhatását lehet analizálni. Ebből a célból az adatokat Lineweaver-Burk ábrázolásban (14.b ábra) is megjelenítettem. 33
Ebben a linearizált ábrázolásban megfigyelhető, hogy a pirofoszfát távollétében és jelenlétében kapott egyenesek az ordinátán metszik egymást. Megjegyzem, hogy az anion távollétében kapott adatsornak csak a kezdeti, katalitikus helyre vonatkozó szakasza írható le egyenessel, a magasabb szubsztrát koncentrációjú pontok eltérnek ettől. Lineweaver-Burk ábrázolásban ez 0 értékhez közeli pontoknak felel meg (14.b ábra). Az egyenesek azonos pontban való metszete arra utal, hogy a pirofoszfát kompetitív gátlószerként viselkedik a 3-PG katalitikus helyén, azaz az 1/Vmax értékek, vagyis a Vmax értékek pirofoszfát jelen és távollétében azonosak. Ez azt jelenti, hogy végtelen nagy szubsztrát koncentráció kiszorítja a gátló aniont a kötőhelyről, vagyis szubsztrát és anion a katalitikus helyen vetélkedik az enzimen való kötődésért.
60
1.4
50
1.2
40
1/v, 1/dAbs 340/perc
v, dAbs340/perc
1.6
1.0
0.8
0.6
30
20
10
0
0.4
-10 0.2
-20
0.0 0
1
2
3
4
5
6
7
8
3-PG, mM
14. a ábra
9
10
11
-30 -4
-2
0
2
4
6
8
10
12
14
1/3-PG, 1/mM
14. b ábra
14. ábra: Pirofoszfát hatása a hPGK 3-PG telítési görbéjére lineáris (a) és reciprok (b) ábrázolásban A 7,5 nM hPGK 3-PG telítési görbéjét vettem fel (fekete) valamint 40 mM pirofoszfát jelenlétében is (piros). 10 mM ATP és 12,5 mM MgCl2 körülmények alkalmazásával. Az (a) ábrán a kísérleti pontokra pirofoszfát távollétében a 4., pirofoszfát jelenlétében pedig az 5. egyenlet szerint illesztettem a görbéket. A (b) ábrán a 9. egyenlet szerint fittelt egyenesek láthatók. A vad típusú enzim esetén (fekete) a magas szubsztrát koncentrációknál mért értékeket nem vettem figyelembe.
Hasonló kísérletet végeztem a MgATP koncentrációját változtatva (15. ábra). Míg a 15.a ábrán a lineáris, addig a 15.b ábrán a reciprok ábrázolás látható. Megfigyelhető ez utóbbin, hogy az egyenesek meredeksége növekszik a pirofoszfát koncentráció, azaz a gátlás mértékének növelésével.Az illesztett egyenesek ebben az esetben is az ordinátán 34
egy pontban metszik egymást, azaz a pirofoszfát gátlása a MgATP-vel szemben is kompetitívnek látszik.
1.2
30
25
1.0
20
1/v, 1/dAbs340/perc
v, dAbs340/perc
0.8
0.6
0.4
15
10
5
0 0.2
-5
0.0 0
1
2
3
4
5
6
MgATP, mM
15. a ábra
7
8
9
10
11
-10 -10 -8
-6
-4
-2
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
1/MgATP, 1/mM
15. b ábra
15. ábra: Pirofoszfát hatása a hPGK MgATP telítési görbéjére lineáris (a) ill. reciprok (b) ábrázolásban A 7,5 nM hPGK ATP telítési görbéjét vettem fel (fekete) 30 mM pirofoszfát (piros tömött) illetve 40 mM pirofoszfát (piros üres) jelenlétében is, 2,5 mM 3-PG és 12,5 mM MgCl2 körülményeket alkalmazva. Az (a) ábrán kísérleti pontokra pirofoszfát távollétében a 4., jelenlétében pedig az 5. egyenlet szerint illesztettem a görbéket. A (b) ábrán a 9. egyenlet szerint fittelt egyenesek láthatók. A vad típusú esetén (fekete) az egyenes illesztésekor a magas szubsztrát koncentrációknál mért értékeket nem vettem figyelembe.
A Lineweaver-Burk ábrázolásból formálisan nem dönthető el, hogy egyetlen, vagy több gátló anionkötő hely van-e az enzim aktív centrumában. Azonban szerkezeti adatok alapján az enzim aktív centrumában legalább két anionkötő hely azonosítható (16. ábra). Az ábrán a két anionkötő helyet a pirossal jelzett foszfát ionok foglalják el, melyeket független kristályszerkezetekben határoztak meg (20, 35). Valószínűnek látszik, hogy a két gátló anionkötő hely ezekkel azonos, hiszen az ide kötődő anionok a szubsztrátokat kiszoríthatják. A pirofoszfát koncentráció függvényében végzett mérés (13. ábra) kísérleti pontjainak illesztése valóban egyértelműen megmutatta, hogy két egymással kölcsönható gátló anionkötő hely tételezhető fel, összhangban a 16. ábra szerkezeti adataival. A használt kinetikai egyenlettel (6. egyenlet) a két gátló helyet egyetlen közös gátlási állandóval 35
tudjuk jellemezni. A gátlások kompetitív jellege alapján, a szubsztrát koncentrációkat, valamint a szubsztrátokra vonatkozó Km értékeket figyelembe véve, kiszámolható a valódi Kinh érték (7. egyenlet), amely a 4. táblázatban van feltüntetve.
16. ábra: A két gátló anionkötőhely elhelyezkedése a PGK aktív centrumában A zöld szerkezet a T. brucei PGK zárt konformációjú terner komplexét (MgADP és 3-PG szubsztrátokkal foszfát anion jelenlétében kristályosítva) mutatja (35). A nukleotid γfoszfátjának helyét elfoglaló foszfát iont is ebben a szerkezetben azonosították. A 3-PG kötőhelyén elhelyezkedő foszfát ion a sertésizom PGK függetlenül meghatározott kristályszerkezetéből származik (20). A humán (ill. sertés) PGK-ra vonatkozó oldallánc számozás fekete színnel látható.
5.5
A Lys215 mutáció hatása a PGK kinetikai viselkedésére 5.5.1
A mutáns hPGK-k specifikus aktivitása
A K215A és a K215R mutánsok aktivitásának ellenőrzésekor a vad típusú enzimhez használt aktivitásmérő elegyben (közel telítési szubsztrát koncentrációknál) igen nagy mértékű csökkenést figyeltem meg. A későbbiekben (5.5.2 pont) kiderült, hogy ez kis részben annak tulajdonítható, hogy a mutáns enzimek telítéséhez nem elegendő az a szubsztrát koncentráció, ami a vad típusú PGK-hoz elegendő volt. Ezért a 4. táblázatban megadott specifikus aktivitás értékek a telítési szubsztrát koncentrációra extrapolált adatok. Ennek alapján a vad típusú enzim maximális aktivitásához képest a K215A és a K215R mutáns PGK-k specifikus aktivitása 0,0006-d ill. 0,002-d részére csökkent. Ezek 36
az adatok egyértelműen mutatják, hogy a Lys215 oldallánc fontos szerepet játszik a katalízisben. 5.5.2
Szubsztrátfelesleg aktiválás hiánya
A K215A és a K215R mutánsok enzimkinetikai jellemzéséhez felvettem mindkét szubsztrátra vonatkozóan a telítési görbéket. A 3-PG-vel való telítést a 17. ábra, a MgATP-vel való telítést pedig a 18. ábra mutatja be. 1,4
1,2
v, dAbs340/perc
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0 0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
3-PG, mM
17. ábra: A mutáns hPGK-k aktivitásának függése a 3-PG koncentrációtól 3,4 µM K215A (zöld) és 1,1 µM K215R (narancssárga) mutánsok aktivitását mértem 4.2.13 pontban leírtak szerint 10 mM MgATP jelenlétében. A kísérleti pontokhoz a görbéket az 5. egyenlet szerint illesztettem, a kapott Km és Vm értékek a 4. táblázatban láthatóak. Összehasonlításként az ábrán szerepelnek a vad típusú PGK-val mért és a 11. ábrán bemutatott adatok is.
Mindkét esetben a legszembetűnőbb eredmény az, hogy a vad típusú enzimekre jellemző szubsztrátfelesleg aktiválás a mutánsok esetén teljesen eltűnik. A mutánsok szubsztráttelítési görbéi minden esetben jól leírhatóak a Michaelis-Menten egyenlet alapján (5. egyenlet).
37
A szubsztráttelítési görbék illesztésével meghatároztam mindkét mutáns esetén a szubsztrátokra vonatkozó Km értékeket és az enzimek maximális aktivitását is, melyek a 4. táblázatban vannak feltüntetve. Látható, hogy mindkét mutáns esetén a Km értékek növekednek a vad típusú enzimhez képest, azaz a szubsztrátokkal való kölcsönhatás gyengül. A legnagyobb mértékű a K215A mutáns esetén a MgATP-re vonatkozó Km érték növekedése. Ennek alapján arra következtethetünk, hogy az enzimreakció során a Lys215 oldallánc főként a MgATP terminális foszfátjával való kölcsönhatáshoz szükséges. Adataim alapján valószínűnek látszik az is, hogy ugyanezen oldalláncnak szerepe van az átmeneti komplexben a 3-PG-vel való optimális kölcsönhatás kialakításában is. A 16. szerkezeti ábra jól mutatja, hogy valóban a zárt szerkezetben a Lys215-nek megfelelő oldalláncnak lehetősége van kölcsönhatás kialakítására mind a 3PG-vel, mind a nukleotid szubsztráttal.
1,2
v, dAbs340/perc
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0 0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
MgATP, mM
18. ábra: A mutáns hPGK-k aktivitásának függése a MgATP koncentrációtól 3,4 µM K215A (zöld) és 1,1 µM K215R (narancssárga) mutánsok aktivitását mértem a 4.2.12 pontban leírtak szerint 10 mM 3-PG jelenlétében. A kísérleti pontokhoz a görbéket az 5. egyenlet szerint illesztettem, a kapott Km és Vm értékek a 4. táblázatban láthatóak. Az ábrán láthatóak a vad típusú enzimekkel végzett mérések 12. ábrán bemutatott adatai is.
5.5.3
Anionaktiválás hiánya
Megvizsgáltam a Lys215 oldallánc kicserélése hatással van-e az anionaktiválás és gátlás jelenségére. Megismételtem a vad típusú enzimekkel pirofoszfát jelenlétében végzett kísérletet a két mutáns enzimmel. Amint a 19. ábrán látható, a vad típusú enzimmel éles 38
ellentétben, sem a K215A, sem pedig a K215R mutáns enzim nem aktiválódik pirofoszfát jelenlétében. Az is látható, hogy mindkét mutáns enzimet közel hasonló mértékben gátolja a többértékű anion. A kísérleti adatok jól illeszthetők a 8. egyenlettel, ahol a vad típusú enzimre alkalmazott egyenletet annyiban módosítottam, hogy az a aktiválási faktor értékét 1-nek vettem, mivel a mutánsoknál az anionaktiválás jelensége megszűnt (19. ábra).Az így kapott látszólagos, és a belőlük származtatott valódi gátlási állandókat a 4. táblázat tartalmazza. 0,6
0,5
v, dAbs340/perc
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
pirofoszfát, mM
19. ábra: Pirofoszfát anion hatása a mutáns PGK-k aktivitására 3,0 µM K215A (zöld) és 1,0 µM K215R (narancssárga) mutánsok aktivitását mértem 4.2.13 pontban leírtak szerint 0,5 mM 3-PG ill. 0,5 mM MgATP jelenlétében különböző pirofoszfát koncentrációknál. A kísérleti pontokhoz a görbéket a 8. egyenlet szerint illesztettem. Az ábrán látható a vad típusú enzimekkel végzett és a 13. ábrán bemutatott kísérlet eredménye is.
5.5.4
Aniongátlás kinetikai vizsgálata a mutáns enzimek esetében
A mutáns enzimek (K215A, K215R) esetén megvizsgáltam, hogy a gátló anion, jelen esetben pirofoszfát milyen típusú és mértékű gátlást fejt ki a szubsztrátokkal szemben. Egyrészt, a vad típusú enzimnél bemutatotthoz hasonlóan, szubsztráttelítési görbéket vettem fel különböző állandó koncentrációjú pirofoszfát jelenlétében. Másrészt pedig különböző, de az egyes esetekben állandó szubsztrát koncentráció összeállításoknál pirofoszfát koncentráció függvényében vizsgáltam az enzimaktivitás változását. A kétféle megközelítés hasonló eredményre vezetett, ez utóbbit mutatom be a 20. ábrán.
39
0,9
1,2
0,8 1,0
0,7
0,8
v, dAbs340/perc
v, dAbs340/perc
0,6
0,5
0,4
0,3
0,6
0,4
0,2 0,2
0,1
0,0
0,0
0
1
2
3
4
5
6
7
pirofoszfát, mM
20. a ábra
8
9
10
11
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
pirofoszfát, mM
20. b ábra
20.ábra: A K215A (a) és K215R (b) mutáns pirofoszfát gátlása különböző szubsztrát körülményeket alkalmazva A 10,2 µM K215A mutáns (a) és 3,1 µM K215R (b) mutáns pirofoszfát gátlása látható az ábrán 0,5 mM 3-PG, 0,5 mM ATP, 1 mM MgCl2 (fekete), 2,5 mM 3-PG, 0,5 mM ATP, 1 mM MgCl2 (piros), valamint 0,5 mM 3-PG, 2,5 mM ATP, 4 mM MgCl2 (kék) körülményeket alkalmazva. A kísérleti pontokra a görbéket 8. egyenlet szerint illesztettem.
Jól megfigyelhető, (ahogy várható volt) az egyes görbék kezdeti pontja, azaz a pirofoszfát távollétében mért enzimaktivitás értékek magasabbak a nagyobb szubsztrátkoncentrációk esetén. A kezdeti aktivitások tekintetében legnagyobb mértékű változást a K215A mutáns esetén tapasztaltam, amikor az MgATP koncentrációját 0,5ről 2,5 mM-ra emeltem. A görbék illesztésével az adott szubsztrát koncentrációkra érvényes látszólagos gátlási állandókat határoztam meg. A valódi Kinh értékek kiszámításához a 7. egyenletet alkalmaztam. Az így kapott értékek összehasonlításából megállapítható, hogy míg az illesztett görbe látszólagos K’inh állandói a különböző szubsztrát körülmények közt jelentős eltérést mutatnak, addig a valódi Kinh értékek a 3-PG koncentrációjától hibahatáron belül nem függenek (5. táblázat), ha a MgATP koncentrációja állandó. Ugyanez már nem egészen érvényes a különböző MgATP-nél kapott értékekre.
40
5. táblázat: A mutáns enzimekre vonatkozó gátlási állandók összefoglalása A feltüntetett értékek a 20. ábra kísérleti adataiból származnak
Szubsztrát körülmények 3-PG (mM)
K215A
MgATP (mM) K’inh (mM)
K215R
Kinh (mM)
K’inh (mM)
Kinh (mM)
0,5
0,5
1,1±0,1
0,4
1,85±0,27
0,39
2,5
0,5
4,9±0,7
0,6
3,78±0,37
0,24
0,5
2,5
11,6±1,4
2,8
13,26±1,81
0,96
Úgy látszik, mintha a MgATP a pirofoszfátot az egyszerű kompetitívitáson túlmenően nagyobb mértékű, vagy más jellegű módon is kiszorítaná. Elképzelhető, hogy a két szubsztrát nem egyformán befolyásolja a két kötőhelyet, vagy a MgATP-vel szembeni gátlásnak van nem kompetitív komponense is. Mivel a gátló helyek analízisénél egy közelítéssel éltünk, amely szerint a két egymással együttműködő kötőhelyet egy közös állandóval jellemeztük, ebből adódhat, hogy a Kinh állandók látszólag változnak a MgATP koncentrációjának függvényében. A szerkezeti adatokat tekintve (16. ábra) várható, hogy a mutánsok esetén (Lys215 megváltoztatásakor) különösen a nukleotid kötőhelyet elfoglaló gátló foszfát kötődése gyengül és így a nukleotid nagyobb hatásfokkal képes azt kiszorítani. 5.6
A kinetikai eredményekből levonható következtetések
A különböző típusú kísérleteim eredményeit a 4. táblázat foglalja össze. A specifikus aktivitás nagy arányú csökkenése a K215A ill. a K215R mutánsok esetén igazolja az irodalmi áttekintésben felvetett feltételezést, hogy a Lys215 valóban alapvető katalitikus oldallánc. A mutánsok esetén a szubsztrátok Km értékei jelentősen megnőttek, mely az enzimszubsztrát kölcsönhatás meggyengülésére utal. Legnagyobb változás a K215A mutáns MgATP-re vonatkozó Km értékében következik be, amely alátámasztja a Lys215 szerepét az enzimműködés során a MgATP terminális foszfátjának stabilizálásában. Ez egyben azt is bizonyítja, hogy a Lys215 a MgATP alternatív kötőhelyét képezi, ahogy azt a krisztallográfiás adatok jósolták. Ha ez így van, akkor a Lys215 csak akkor lehet fontos katalítikus oldallánc, ha a dománzáródás során az MgATP terminális foszfátjával együtt bekerül az aktív centrumba és a foszfo-csoport átadódását kíséri. 41
Érdemes még megemlíteni, hogy a 3-PG Km értékében bekövetkező változás sem hanyagolható el, ez arra utal, hogy az aktív zárt szerkezetben a Lys215 a 3-PG foszfátjával is kölcsönhatásba lép a reakció átmeneti komplexében. A 16. szerkezeti ábra jól mutatja, hogy valóban a zárt szerkezetben a Lys215-nek megfelelő oldalláncnak lehetősége van kölcsönhatás kialakítására mind a 3-PG-vel, mind a nukleotid szubsztráttal. A két mutáns nagyon hasonlóan viselkedik annak ellenére, hogy a K215R esetén az oldallánc pozitív töltése megmarad. Ebből arra következtethetünk, hogy az oldallánc töltésén kívül annak mérete (térkitöltése) is fontos szereppel bír az enzimreakció átmeneti komplexének stabilizálásánál. A mutánsoknál a szubsztrát- és az anionaktiválás jelensége megszűnik, és a gátló anionokkal való kölcsönhatás is gyengül. Ez azt jelenti, hogy a Lys215 fontos az enzimaktivitás szubsztrátok/anionok általi szabályozásában is. Valószínűleg az anionok aktiváló kötőhelye az enzimreakció bizonyos fázisában részlegesen átfedhet a katalitikus hellyel.
42
6. ÖSSZEFOGLALÁS A 3-foszfoglicerát kináz (PGK) monomer, két doménből felépülő enzim. A katalízis során lejátszódó doménzáródásról már röntgen krisztallográfiás adatok képet adtak, nem ismert azonban, hogy ennek során a katalitikus oldalláncok hogyan kerülnek a reakció lefolyásához optimális térhelyzetbe. A nyitott szerkezetben a C-terminális domén Lys 215-ös oldallánca az aktív centrumtól távol helyezkedik el. Ez az oldallánc a szubsztrát MgATP foszfát-láncának alternatív kötőhelyén található. Valószínűnek látszik, hogy a Lys 215 oldallánca a katalízis során átadódó foszfo-csoport stabilizálásában vesz részt. Ezen oldalláncnak megközelítőleg 10 Å-nyi elmozdulását tételezzük fel az enzimreakció során, amely a nukleotiddal való kölcsönhatást segítheti elő. Jelen munkám célja a Lys 215-ös oldallánc szerepének vizsgálata volt. A humán PGK (hPGK) enzimnek két mutánsát készítettem el: a 215-ös pozíciójú Lys oldalláncot egyrészről a neutrális Ala-ra, másrészt, a hasonlóan töltött Arg-ra cseréltem ki. A két mutánst (K215A, K215R) enzimológiai vizsgálatokkal jellemeztem. Mind a mutánsokat, mind, pedig a vad típusú enzimet is E. coli sejtekben fejeztem ki és homogenitásig tisztítottam. CD spektroszkópiai és DSC mikrokalorimetriai méréseket végeztem a mutánsok helyes térszerkezetének igazolására. Az enzimkinetikai vizsgálatok a mutánsok esetében drasztikus enzimaktivitás csökkenést mutattak a vad típusú enzimhez viszonyítva, 3-foszfoglicerát (3-PG) és MgATP szubsztrátokat alkalmazva. Az eredmények a Lys 215-nek a katalízisben betöltött esszenciális szerepét mutatják. Míg a vad típusú PGK aktiválódik magas szubsztrát koncentrációknál, valamint többértékű anionok alacsony koncentrációja esetén, addig mindkét mutáns esetében eltűnnek ezek az aktiválási jelenségek és egyszerű Michaelis-Menten kinetikát követnek. A 3-PG-re illetve a MgATP-re vonatkozó Km értékek a mutánsok esetén szignifikánsan megnövekedtek, ami az enzim-szubsztrát kölcsönhatás gyengülésére utal. A kinetikai konstansok közül főként a MgATP Km értékére van hatással a mutáció, különösen a K215A mutáns esetén (20-ad részére csökken), ami a MgATP-vel való kölcsönhatás jelentős gyengülését jelenti Lys 215-nek neutrális oldalláncra való cserélése következtében. Ezek az eredmények a Lys 215-ös oldallánc alapvető szerepét mutatják a katalízis során az ATP átmenő γ-foszfátjának stabilizálásában. Az oldalláncnak nemcsak a pozitív töltése, hanem a mérete (térkitöltése) is egyaránt fontos szereppel bír.
43
7. ABSTRACT 3-Phosphoglycerate kinase (PGK) is a monomeric, two-domain hinge-bending enzyme. During the catalysis the two domains close into proximity. Crystallographic works provided structures both the open and closed conformations. It is still unclear, how catalytic residues are brought into the optimal position for the reaction. In the open conformation the side chain of Lys 215 of C terminal domain is located far away from active site cleft. Interestingly, this side chain constitutes an alternative site for phosphates of the substrate MgATP. On the basis of its possible role in stabilization of the phospho-group during the catalysis, we assume an about 10 Å movement of this residue during the enzyme reaction, promoted by the interaction with the nucleotide. The aim of the present work was to study the role of side chain Lys 215. We constructed two mutants of human PGK (hPGK): Lys 215 was replaced into either the neutral Ala or the similarly charged Arg. The mutants (K215A, K215R) were characterized in enzymological studies. Both mutants and the wild type hPGK were expressed in E.coli cells and purified into homogenous forms. CD and DSC measurements were carried out and approved the correct conformational states of the mutants. Enzyme kinetic studies with these enzymes showed drastic decrease in the activities using the substrates 3phosphoglycerate (3-PG) and MgATP. This result approves the essential role of Lys 215 in the catalytic function. The wild type PGK is activated at high excess of substrates or at low concentrations of anions. Both mutants of Lys 215 lost these activation properties, followed simple Michaelis-Menten kinetics. The Km values of both 3-PG and MgATP are significantly increased upon mutations, thus the enzymesubstrate interactions are weakened. Among the kinetic constants the Km value of MgATP of the mutant K215A is affected substantially (about 20-fold times) indicating the largest weakening of the interaction with MgATP upon mutation of Lys 215 into a neutral side chain. These findings support the essential role of residue Lys 215 in stabilization of the transferring γ-phosphate of ATP during the catalysis. In this function not only the positive charge, but the precise steric position of Lys 215 side-chain atoms in PGK active site are equally important.
44
8. IRODALMI HIVATKOZÁSOK 1. Segel, G. B., Feig, S. A., Glader, B. E., Muller, A., Dutcher, P., Nathan, D. G.: Energy metabolism in human erythrocytes: the role of phosphoglycerate kinase in cation transport. Blood 46 (1975) 271-8 2. Xu, K. Y., Zweier, J. L., Becker, L. C.: Functional coupling between glycolysis and sarcoplasmic reticulum Ca2+ transport. Circ Res 77 (1995) 88-97 3. Miwa, S., Fujii, H.: Molecular basis of erythroenzymopathies associated with hereditary hemolytic anemia: tabulation of mutant enzymes. Am. J. Hematol. 51 (1996) 122-132 4. Martinov, M. V., Plotnikov, A. G., Vitvitsky, V. M., Ataullakhanov, F. I.: Deficiencies of glycolytic enzymes as a possible cause of hemolytic anemia. Biochim Biophys Acta 1474 (2000) 75-87. 5. Vishwanatha, J. K., Jindal, H. K., Davis, R. G.: The role of primer recognition proteins in DNA replication: association with nuclear matrix in HeLa cells. J Cell Sci 101 (1992) 25-34 6. Lay, A. J., Jiang, X. M., Kisker, O., Flynn, E., Underwood, A., Condron, R., Hogg, P. J.: Phosphoglycerate kinase acts in tumour angiogenesis as a disulphide reductase. Nature 408 (2000) 869-73 7. Lay, A. J., Jiang, X. M., Daly, E., Sun, L., Hogg, P. J.: Plasmin reduction by phosphoglycerate kinase is a thiol-independent process. J Biol Chem 277 (2002) 9062-8 8. Hogg, P. J.: Disulfide bonds as switches for protein function. Trends Biochem Sci 28 (2003) 210-4 9. Krishnan, P., Liou, J. Y., Cheng, Y. C.: Phosphorylation of pyrimidine Ldeoxynucleoside analog diphosphates. Kinetics of phosphorylation and dephosphorylation of nucleoside analog diphosphates and triphosphates by 3phosphoglycerate kinase. J Biol Chem 277 (2002) 31593-600 10. Gallois-Montbrun, S., Faraj, A., Seclaman, E., Sommadossi, J. P., DevilleBonne, D., Veron, M.: Broad specificity of human phosphoglycerate kinase for antiviral nucleoside analogs. Biochem Pharmacol 68 (2004) 1749-56 11. Krishnan, P., Gullen, E. A., Lam, W., Dutschman, G. E., Grill, S. P., Cheng, Y. C.: Novel role of 3-phosphoglycerate kinase, a glycolytic enzyme, in the activation of L-nucleoside analogs, a new class of anticancer and antiviral agents. J Biol Chem 278 (2003) 36726-32 12. Szilágyi, A. N., Ghosh, M., Garman, E., Vas, M.: A 1.8 A resolution structure of pig muscle 3-phosphoglycerate kinase with bound MgADP and 3phosphoglycerate in open conformation: new insight into the role of the nucleotide in domain closure. J Mol Biol 306 (2001) 499-511. 13. Banks, R. D., Blake, C. C. F., Evans, P. R., Haser, R., Rice, D. W., Hardy, G. W., Merrett, M., Phillips, A. W.: Sequence, structure and activity of phosphoglycerate kinase: a possible hinge-bending enzyme. Nature 279 (1979) 773-777 14. Watson, H. C., Littlechild, J. A.: Isoenzymes of phosphoglycerate kinase: evolutionary conservation of the structure of this glycolytic enzyme. Biochem Soc Trans 18 (1990) 187-90 15. Mori, N., Singer-Sam, J., Riggs, A. D.: Evolutionary conservation of the substrate binding cleft of 3-phosphoglycerate kinases. FEBS Lett. 204 (1986) 313-317 45
16. Harlos, K., Vas, M., Blake, C. C. F.: Crystal structure of the binary complex of pig muscle phosphoglycerate kinase and its substrate 3-phospho-D-glycerate. Proteins 12 (1992) 133-144 17. Davies, G. J., Gamblin, S. J., Littlechild, J. A., Dauter, Z., Wilson, K. S., Watson, H. C.: Structure of the ADP complex of the 3-phosphoglycerate kinase from Bacillus stearothermophilus at 1.65 A. Acta Crystallogr. D50 (1994) 202209 18. May, A., Vas, M., Harlos, K., Blake, C. C. F.: 2.0 A resolution structure of a ternary complex of pig muscle phosphoglycerate kinase containing 3-phosphoD-glycerate and the nucleotide Mn adenylylimidodiphosphate. Proteins 24 (1996) 292-303 19. Kovári, Z., Flachner, B., Náray-Szabó, G., Vas, M.: Crystallographic and thiolreactivity studies on the complex of pig muscle phosphoglycerate kinase with ATP analogues: correlation between nucleotide binding mode and helix flexibility. Biochemistry 41 (2002) 8796-806 20. Flachner, B., Kovári, Z., Varga, A., Gugolya, Z., Vonderviszt, F., Náray-Szabó, G., Vas, M.: Role of Phosphate Chain Mobility of MgATP in Completing the 3Phosphoglycerate Kinase Catalytic Site: Binding, Kinetic, and Crystallographic Studies with ATP and MgATP. Biochemistry 43 (2004) 3436-3449 21. Webb, M. R., Trentham, D. R.: Analysis of chiral inorganic (160, 170, 180) thiophosphate and the stereochemistry of the 3-phosphoglycerate kinase reaction. J. Biol. Chem. 255 (1980) 1775-1779 22. Bernstein, B. E., Michels, P. A. M., Hol, W. G. J.: Synergistic effects of substrate-induced conformational changes in phosphoglycerate kinase activation. Nature 385 (1997) 275-278 23. Auerbach, G., Huber, R., Grättinger, M., Zaiss, K., Schurig, H., Jaenicke, R., Jacob, U.: Closed structure of phosphoglycerate kinase from Thermotoga maritima reveals the catalytic mechanism and determinants of thermal stability. Structure 5 (1997) 1475-1483 24. Sinev, M. A., Razgulyaev, O. I., Vas, M., Timchenko, A. A., Ptitsyn, O. B.: Correlation between enzyme activity and hinge-bending domain displacement in 3-phosphoglycerate kinase. Eur. J. Biochem. 180 (1989) 61-66 25. Scopes, R. K.: The steady-state kinetics of yeast phosphoglycerate kinase. Anomalous kinetic plots and the effects of salts on activity. Eur. J. Biochem. 85 (1978) 503-516 26. Larsson-Raznikiewicz, M.: Kinetic studies on the reaction catalyzed by phosphoglycerate kinase. II. The kinetic relationships between 3phosphoglycerate, MgATP2-and activating metal ion. Biochim. Biophys. Acta 132 (1967) 33-40 27. Scopes, R. K.: Binding of substrates and other anions to yeast phosphoglycerate kinase. Eur. J. Biochem. 91 (1978) 119-129 28. Khamis, M. M., Larsson-Raznikiewicz, M.: Activation and inhibition of phosphoglycerate kinase by sulphate ion. Biochim. Biophys. Acta 657 (1981) 190-194 29. Szilágyi, A. N., Vas, M.: Anion activation of 3-phosphoglycerate kinase requires domain closure. Biochemistry 37 (1998) 8551-8563 30. Sherman, M. A., Fairbrother, W. J., Mas, M. T.: Characterization of the structure and properties of the His62-->Ala and Arg 38-->Ala mutants of yeast phosphoglycerate kinase: an investigation of the catalytic and activatory sites by site-directed mutagenesis and NMR. Protein Sci. 1 (1992) 752-760 46
31. Sherman, M. A., Szpikowska, B. K., Dean, S. A., Mathiowetz, A. M., McQueen, N. L., Mas, M. T.: Probing the role of arginines and histidines in the catalytic function and activation of yeast 3-phosphoglycerate kinase by sitedirected mutagenesis. J. Biol. Chem. 265 (1990) 10659-10665 32. McPhillips, T. M., Hsu, B. T., Sherman, M. A., Mas, M. T., Rees, D. C.: Structure of the R65Q mutant of yeast 3-phosphoglycerate kinase complexed with Mg-AMP-PNP and 3-phospho-D-glycerate. Biochemistry 35 (1996) 41184127 33. Sherman, M. A., Dean, S. A., Mathiowetz, A. M., Mas, M. T.: Site-directed mutations of arginine 65 at the periphery of the active site cleft of yeast 3phosphoglycerate kinase enhance the catalytic activity and eliminate aniondependent activation. Protein Eng. 4 (1991) 935-940 34. Barber, M. D., Gamblin, S. J., Watson, H., Littlechild, J. A.: Site-directed mutagenesis of yeast phosphoglycerate kinase. Arginines 65, 121 and 168. FEBS Lett. 320 (1993) 193-197 35. Bernstein, B. E., Hol, W. G.: Crystal structures of substrates and products bound to the phosphoglycerate kinase active site reveal the catalytic mechanism. Biochemistry 37 (1998) 4429-4436
47
