Studium látek ovlivňující antimikrobiální účinky medu

Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra analytické chemie

Diplomová práce

Studium látek ovlivňující antimikrobiální účinky medu

Vedoucí diplomové práce: Prof. RNDr. Petr Solich, CSc.

Hradec Králové 2014

Petra Staňková

Na tomto místě bych chtěla poděkovat všem, kteří mi pomohli a podporovali mě při tvorbě této práce. Děkuji především vedoucímu mé práce panu Prof. RNDr. Petru Solichovi, CSc. za odbornou pomoc a podnětné připomínky. A dále bych chtěla poděkovat školiteli v Montpellier panu Pr. Michel Larroque za jeho vedení a pomoc v experimentální části.

2

Prohlašuji, že tato práce je mým původním autorským dílem. Veškerá literatura a další zdroje, z nichž jsem při zpracování čerpala, jsou uvedeny v seznamu použité literatury a v práci řádně citovány. Práce nebyla využita k získání jiného nebo stejného titulu.

3

Abstrakt

Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra analytické chemie Kandidát: Petra Staňková Školitel: Prof. RNDr. Petr Solich, CSc. Název diplomové práce: Studium látek ovlivňující antimikrobiální účinky medu Med se vyznačuje mnoha prospěšnými účinky, ale nejvíce doceněným v dnešní době je efekt antibakteriální. Tato aktivita je připisována mnoha faktorům – nízkému pH, malému množství vody, vysoké osmolaritě, přítomnosti peroxidu vodíku, methylglyoxalu, bee-defensin 1 peptidu a dalším látkám. Stále však nebyly nalezeny všechny látky, které k tomuto efektu přispívají, a tudíž není znám přesný mechanismus antibakteriálního účinku. Objasnění tohoto mechanismu by mohlo pomoci při řešení problému s bakteriemi rezistentními na antibiotika. Tato práce měla za úkol potvrdit domněnku, že se v medu nacházejí látky strukturně

blízké

gentamicinu.

K výzkumu

bylo

použito

sedm vzorků

medu

pocházejících z Francie a jeden med s původem z Německa. Jednalo se jak o medy jednodruhové, tak smíšené, jejichž nektar byl sesbírán z několika druhů rostlin. Za účelem eliminace cukru byla provedena extrakce dichlormethanem. Po derivatizaci fluoreskaminem byly tyto látky separovány nejprve na koloně vysokoúčinné kapalinové chromatografie s reverzní fází, poté byla použita normální stacionární fáze. Přítomnost těchto látek nebyla pravděpodobně zaznamenána fluorescenčním detektorem. Po změně metody na tenkovrstvou chromatografii byla na desce vidět fluoreskující skvrna u každého vzorku medu pod UV zářením o vlnových délkách 254nm a 356nm. V tomto případě byl med rozpuštěn ve vodě nebo v methanolu. Tyto skvrny bylo možné pozorovat nejenom po postřiku roztokem fluoreskaminu ale i bez něj. Nelze potvrdit ani vyvrátit, že nalezené fluorescentní skvrny souvisí s původním cílem práce, ačkoliv během Maillardovy reakce dochází ke vzniku fluorescentních produktů. Pro více informací by bylo potřeba látky separovat a identifikovat je.

Klíčová slova: med, antibakteriální účinek, TLC, HPLC, fluoreskamin

4

Abstract

Charles University in Prague Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Analytical Chemistry Candidate: Petra Staňková Supervisor: Prof. RNDr. Petr Solich, CSc. Title of Diploma Thesis: Study of compounds influencing the antimicrobial effect of honey

Honey has many beneficial effects, but nowadays the antibacterial effect is the most appreciate one. This activity is due to many factors - the low pH, a small amount of water, high osmolarity, the presence of hydrogen peroxide, methylglyoxal, beedefensin 1 peptide and other substances. However, all the substances contributing to this effect still have not been found and therefore we do not know the exact mechanism of antibacterial activity. Clarification of this situation could help with solving the problem with antibiotic resistant bacteria. This work aimed to confirm the presumption that substances structurally close to gentamicine are in honey. Seven samples of honey from France and one with German origin were used for this research. It included monofloral honeys and mixed ones, whose nectar was collected from several plant species. The extraction by dichloromethane was performed to eliminate the sugar. After derivatization by fluorescamine these substances were initially separated on a column of high performance liquid chromatography with a reverse phase, and then a normal stationary phase was used. The presence of these substances was not probably detected by fluorescence detector. After the change of method to thin layer chromatography, a fluorescent stain at each honey sample was seen under UV radiation at wavelengths of 254nm and 356nm. In this case, honey was dissolved in water or methanol. These spots were detectable

in both cases, with or without spraying with fluorescamine solution. It

cannot be confirmed nor excluded that detected fluorescent spots are related to the original aim of the work, although during the Maillard reaction the fluorescent substances are produced. For more information it would be necessary to separate and identify these substances. Keywords: honey, antibacterial effect, TLC, HPLC, fluorescamine

5

OBSAH

SEZNAM ZKRATEK

9

1.

ÚVOD

10

2.

CÍL PRÁCE

12

3.

TEORETICKÁ ČÁST

13

3.1.

Med

13

3.1.1. Chemické složení nektaru

13

3.1.2. Vznik medu

13

3.1.3. Účinky medu

14

3.1.4. Chemické složení medu

14

3.1.5. Antibakteriální složky v medu

15

3.1.5.1.

Vliv vysoké koncentrace cukru............................................................................17

3.1.5.2.

Peroxid vodíku ...................................................................................................17

3.1.5.3.

Nízké pH ............................................................................................................17

3.1.5.4.

Methylglyoxal .....................................................................................................18

3.1.5.5.

Bee defensin-1 ...................................................................................................18

3.2.

Separační metody

19

3.2.1. Chromatografie

4.

19

3.2.1.1.

Rozdělení chromatografických metod .................................................................20

3.2.1.2.

Chromatografická separace ................................................................................20

3.2.1.3.

Instrumentace HPLC ..........................................................................................22

3.2.1.4.

TLC ....................................................................................................................24

EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST

26

6

4.1.

Materiál

26

4.1.1. Chemikálie

26

4.1.2. Medy

27

4.1.3. Laboratorní sklo a pomůcky

28

4.2.

Přístroje, podmínky separace, příprava roztoků

4.2.1. HPLC (reverzní fáze)

29 29

4.2.1.1.

Chromatografická sestava ..................................................................................29

4.2.1.2.

Podmínky separace............................................................................................29

4.2.1.3.

Příprava vzorků ..................................................................................................29

4.2.1.4.

Příprava roztoků .................................................................................................30

4.2.2. TLC

31

4.2.2.1.

Příprava mobilní fáze .........................................................................................31

4.2.2.2.

Podmínky separace............................................................................................31

4.2.2.3.

Příprava roztoku fluoreskaminu ..........................................................................31

4.2.2.4.

Příprava porovnávacích vzorků ..........................................................................31

4.2.2.5.

Příprava vzorků ..................................................................................................32

4.2.2.6.

Nanášení vzorku ................................................................................................33

4.2.3. HPLC (normální fáze)

33

4.2.3.1.

Chromatografická soustava ................................................................................33

4.2.3.2.

Podmínky separace............................................................................................33

4.2.3.3.

Příprava vzorku ..................................................................................................34

VÝSLEDKY A DISKUZE

35

5.1.

HPLC (reverzní fáze)

35

5.2.

TLC

38

5.3.

HPLC (normální fáze)

43

5.

6.

ZÁVĚR

44

7.

CITOVANÁ LITERATURA

46

8.

PŘÍLOHY

49

7

8.1.

Obrázky

49

8.2.

Tabulky

50

8

Seznam zkratek ACN

acetonitril

F

fluorescamin

HPLC

high performance liquid chromatography (vysokoúčinná kapalinová chromatografie)

ot/min

otáček/minuta

MeOH

methanol

MGO

methylglyoxal

Rf

retenční faktor

TLC

thin layer chromatography (tenkovrstvá chromatografie)

UV

ultraviolet (ultrafialový)

9

1. Úvod Med slouží už od pradávna jako potrava a současně i jako lék. Jeho inhibiční efekt ovlivňuje až 60 druhů bakterií a některé medy působí i na houby či viry. Mimo antibakteriální účinky se med vyznačuje i významnou antioxidační aktivitou, na které se podílí široké spektrum látek zahrnující fenolické látky, peptidy, organické kyseliny a enzymy. Již několik studií bylo zaměřeno na zkoumání mechanismu antibakteriálního účinku medu, přesto problematika není stále zcela objasněna. Tato práce vznikla na předpokladu, že složky zodpovědné za tento účinek by mohly být produkty Maillardovy reakce. V medu jsou totiž látky, které mohou podporovat vznik těchto produktů. Jedná se o redukující cukry a látky s aminoskupinami. Vznik produktů Maillardovy reakce byl například zaznamenán v roztoku laktózy či glukózy společně s kaseinem. Jak dokazují některé studie, průběh Maillardovy reakce je spojen se vznikem fluorescence a zabarvení. Gentamicin je z chemického hlediska trisacharid s několika aminoskupinami. V práci vycházím z domněnky, že hledané látky by mohly mít obdobnou strukturu jako právě gentamicin [1]–[6]

Obr. 1. Vzorec gentamicin sulfátu [7]

Dále jsme usuzovali, že by hledané látky mohly mít volnou primární aminoskupinu, na kterou by byl schopen se navázat fluoreskamin a tudíž by bylo možné látky detekovat fluorescenčním detektorem.

10

Obr. 2. Reakce fluoreskaminu s primárním aminem [8]

U hledaných látek se tedy očekává, že budou složeny z cukerných částí a budou obsahovat aminoskupiny, přičemž je nezbytné, aby měly volnou primární aminoskupinu

pro

fluoreskamin.

Po

derivatizaci

se

látka

(či

látky)

stanou

fluorescentními a mohou být tudíž detekovány fluorescenčním detektorem. Podle několika studií, kde byl med zkoumán pomocí HPLC s reverzní fází, byl i v tomto případě zvolen tento druh kolony. Složení mobilní a konkrétní typ stacionární fáze byly vybrány dle možností a zkušeností laboratoře v Montpellier, kde byla naměřena experimentální část v rámci programu Erasmus. Po případném potvrzení přítomnosti těchto látek bude dalším krokem testování jejich antibakteriální aktivity.

11

2. Cíl práce Cílem této práce je pokusit se pomocí různých analytických metod najít dusíkaté látky, které mohou přispívat k antibakteriálnímu účinku u vybraných medů nebo případně zjistit vhodnou metodu pro nalezení a separaci hledaných látek. V dnešní době je všeobecně známo, že med má antibakteriální účinky vůči mnoha bakteriálním kmenům. Podstata těchto účinků je ve vědecké komunitě velmi diskutována, ale zatím není zcela objasněna. Znalost konkrétních antibakteriálních složek i mechanismus jejich účinku, je totiž pro lidstvo důležitá a to především vzhledem ke stále rostoucímu počtu neúčinných antibiotik. Mimo tuto aktivitu byly u některých medů prokázány účinky imunomodulační, antineoplastické, protizánětlivé, hojivé či inhibující obdobně jako inhibitory angiotensin konvertujícího enzymu. Předpokladem této práce je teorie, že hledané dusíkaté látky jsou produkty Maillardovy reakce a obsahují volnou primární aminoskupinu, na kterou se může navázat fluoreskamin a poté se tyto deriváty mohou detekovat fluorescenčním detektorem. Současně je to i myšlenka, že tyto látky (nebo látka) mohou mít strukturu podobnou gentamicinu, proto byl vybrán jako jeden z porovnávacích vzorků.

12

3. Teoretická část

3.1.

Med

3.1.1.

Chemické složení nektaru

Med pochází z nektaru, což je cukerný roztok v rostlinách, který je navíc obohacen o aminokyseliny, proteiny, lipidy, minerály a jiné látky. Složení nektaru je velmi různorodé, záleží především na druhu rostliny a na podmínkách okolního prostředí. Například obsah vody v nektaru se může pohybovat od 5% do 80%. Mezi nejčastější sacharidy, které můžeme v nektaru najít, patří sacharóza, glukóza a fruktóza. Ostatní složky jsou zastoupeny v nektaru pouze v malém množství (například aminokyseliny pouze do 5%). Složení nektaru ovlivňuje chuť a kvalitu finálního produktu - medu. [9]

3.1.2.

Vznik medu

Proces vzniku medu začíná v okamžiku, kdy se nektar smíchá s obsahem žláz včely medonosné (Apis mellifera) v jejím medovém váčku. Důležitý je především obsah slinné žlázy, ve které se nacházejí enzymy jako amyláza, invertáza (oba enzymy rozkládají složené sacharidy na monosacharidy) a glukozaoxidáza. V úlu je budoucí med obohacen o další enzymy a to během předávání nektaru dalším včelám. Nakonec je zahuštěná tekutina, která zbyla z nektaru uložena do plástve, kde med dozrává. Hlavními procesy dozrávání jsou přeměna sacharózy na glukózu a fruktózu a odpaření zbytku vody. Výsledný med obsahuje méně než 20% vody (z původních až 80% vody v nektaru). Včely urychlují proces odpařování tím, že plástve ovívají svými křídly. Jednotlivé buňky plástve jsou postupně zaplňovány a plné komůrky jsou uzavřeny včelím voskem. Včely kromě nektaru přímo z rostlin (květový med) sbírají i medovici, což je tekutina vylučovaná například mšicemi. Tento druh medu se nazývá med lesní či medovicový. [9], [10]

13

3.1.3.

Účinky medu

Med je přírodní látka s mnoha léčivými vlastnostmi zahrnující antibakteriální, hepatoprotektivní, hypoglykemický, antioxidační, antihypertenzivní, protizánětlivý, antineoplastický a hojivý efekt. Přesný mechanismus snížení hypoglykémie není prozatím znám, studie ale prokázala snížení hyperglykémie u diabetických myší a lidí. Už od pradávna byl med používán k rychlejšímu hojení ran a tento potenciál byl několikrát úspěšně ověřen. Med je používán k léčbě vředů, proleženin a infikovaných ran (nejenom u popálenin). Med usnadňuje hojení hned z několika důvodů. Kromě jeho antibakteriální aktivity je to i skutečnost, že med udržuje v ráně vlhké prostředí, jeho vysoká viskozita pomáhá udržovat ochrannou bariéru vůči bakteriím a podstatné jsou i jeho imunomodulační účinky. Mezi další pozitivní vlastnosti patří skutečnost, že med je hygroskopický, což znamená, že může odstranit exsudát z rány a dehydratovat bakterie a zároveň antibakteriální vlastnosti medu urychlují růst nové tkáně. Aplikace medu podporuje hojení infikovaných poranění, které neodpovídají na klasickou léčbu antibiotiky a antiseptiky. [2], [11]–[14]

3.1.4.

Chemické složení medu

Med obsahuje přibližně 200 různých látek. Je složen především z fruktózy, glukózy, ale obsahuje i fruktooligosacharidy. Největší cukernou část zastupují monosacharidy, v menším množství zde můžeme najít disacharidy jako např. sacharózu, maltózu, isomaltózu, nigerózu, turanózu a maltulózu. Vyšší cukry, oligosacharidy a dextriny jsou v medu také přítomny, jejich množství je ale z celkového množství cukru menší než 1%. Zajímavé je, že cukerné spektrum se může měnit v čase, například dochází ke snížení množství fruktózy a glukózy. Kromě sacharidů a kyseliny glukonové můžeme v medu najít i minerály (stejné jako v nektaru), enzymy (amyláza, invertáza, glukozaoxidáza, kataláza a kyselá fosfatáza) a aminokyseliny (nejvíce prolin). Většina aminokyseliny nepochází z nektaru nebo pylového zrna, ale od včel. Přestože med obsahuje hned několik vitaminů, nelze jej považovat jako jejich dostatečný zdroj. [2][9]

14

Průměrné složení medu

sacharidy voda ostatní

Obr. 3. Průměrné složení medu [15]

Antibakteriální složky v medu

3.1.5.

Ačkoliv teprve nedávno vzrostl zájem o klinické použití medu, jeho antibakteriální účinky jsou známy od 19. století a už od období Antiky byl med používán na léčbu a prevenci infekčních zranění. Mechanismus účinku antimikrobiální aktivity medu se liší od antibiotik, které poškozují bakteriální stěnu nebo inhibují intracelulární metabolické cesty. Také bylo zjištěno, že med vykazuje antibakteriální aktivitu i vůči bakteriím rezistentním na antibiotika, avšak stále není znám přesný mechanismus antibakteriálního účinku. Známy jsou pouze faktory, které k tomu přispívají. Patří mezi ně: vysoká koncentrace cukru peroxid vodíku nízké pH methylglyoxal (MGO) antibakteriální peptid bee defensin-1 Poslední dvě zmíněné látky byly identifikovány teprve nedávno a zjistilo se, že také hrají důležitou roli v antibakteriálním účinku medu. Antibakteriální aktivita se liší mezi jednotlivými druhy medu. Záleží totiž především na složení rostlinného zdroje, tedy na nektaru. Díky používání antibiotik se postupně začalo upouštět od klinické aplikace medu (alespoň v západní medicíně, v ostatních kulturách se dál používal). Bohužel

15

dnes je situace jiná a rezistence na antibiotika je stále rostoucím problémem. Tyto okolnosti vedou k přehodnocení terapeutického použití starověkých léků, jako jsou rostliny nebo produkty rostlinného původu, kam patří i med. Je tedy logické, že znovu objevené antibakteriální účinky medu vyvolaly nový zájem o jeho použití v medicíně a již několik medů bylo schváleno pro klinickou aplikaci. Jedná se například o medy Manuka a Revamil. Aby tyto medy mohly být v medicíně použity, bylo nezbytné je sterilizovat pomocí gama záření. Tento sterilizační proces je důležitý, protože mimo prospěšné látky se v medu mohou vyskytovat i nebezpečné bakteriální spory. Tímto zákrokem není ovlivněn žádný typ antibakteriální aktivity medu. U medu pocházejícího z Leptospermum scoparium (Manuka med) bylo zjištěno, že má inhibiční efekt na 60 druhů bakterií, kam se řadí aeroby i anaeroby a gram pozitivní i gram negativní bakterie (včetně závažných bakterií jako je Escherichia coli, Enterobacter aerogenes, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, meticilinrezistentní S. aureus, β-hemolytický streptokok, vankomycin-rezistentní enterokok). Účinek Manuka medu se vztahuje i na bakterii jako je Helicobacter pylori, což z medu dělá slibný prostředek na léčbu žaludečních vředů. Med totiž může podporovat obnovení poškozené sliznice, stimulovat růst nové tkáně a zároveň mít protizánětlivý účinek. Syrový med obsahuje velké množství sloučenin, jako jsou flavonoidy a ostatní fenoly, které působí jako antioxidanty. Během klinických pozorování bylo zjištěno, že med aplikovaný do rány redukuje některé projevy zánětu. Jelikož mikrobiální rezistence na med ještě nebyla hlášena, je med nadějným topickým lékem proti infekcím, jež jsou způsobené bakteriemi rezistentními na antibiotika a předpovídá se i jeho pozitivní účinek při hojení chronických ran, které nereagují na klasickou léčbu. Lze jej tudíž aplikovat dlouhodobě. Mimo aplikaci na rány má med využití i jako náhrada glukózy a jeho antibakteriální aktivita a obsah fruktooligosacharidů zkracuje délku trvání průjmových onemocnění. Dokonce lze úspěšně využít účinků medu u kožních štěpů. Med může působit jak bakteriostaticky, tak baktericidně, přičemž záleží na jeho koncentraci. Pro srovnání - cukerný roztok, který se svým složením podobá medu, účinkuje pouze bakteriostaticky. Minimální inhibiční koncentrace se u některých medů pohybuje mezi 1,8 – 10,8% (v/v), z čehož vyplývá, že med má dostatečný antibakteriální potenciál i po devítinásobném zředění. Dokonce bylo ověřeno, že 56x zředěný med vykazuje stále antibakteriální aktivitu vůči Staphylococcus aureus. [2][13], [16]

16

3.1.5.1. Vliv vysoké koncentrace cukru Zralý med je tvořen zhruba z 80% sacharidy a obsah vody je méně než 18%. Tyto dva faktory jsou zodpovědné za vysoký osmotický tlak. Med je takto chráněn před znehodnocením mikroorganismy a to až do zředění na 30 - 40% roztok. Při dalším zředění je antibakteriální účinek způsoben jinou složkou v medu, avšak už malé zředění medu může vyvolat růst kvasinek. [16]

3.1.5.2. Peroxid vodíku V 60. letech 20. století byl peroxid vodíku (H2O2) v medu považován za jeho hlavní antibakteriální složku. Dnes je však známo, že existují medy, které mají silný antibakteriální účinek a přitom peroxid vodíku obsahují v tak nízké koncentraci, že aktivita nemůže být přisuzována této sloučenině. V případě, že si med ponechal antimikrobiální aktivitu i v přítomnosti katalázy či nepřítomnosti glukozaoxidázy, je tento druh medu nazýván jako neperoxidový. Peroxid vodíku vzniká v medu díky glukozaoxidáze, která je do medu přidána včelami společně s dalšími látkami. Tento enzym je aktivován při středním zředění medu a způsobuje přeměnu glukózy na peroxid vodíku a kyselinu glukonovou a to za aerobních podmínek. Naopak inaktivován může být teplem, světlem či přítomností katalázy. Předpokládá se, že funkce H2O2 v nezralém medu je ochranná, protože koncentrace cukru ještě není dostatečně vysoká, aby zamezila mikrobiálnímu růstu. Po dokončeném procesu zrání je glukozaoxidáza v medu inaktivována, ale je možné její funkci obnovit, jestliže se zvýší obsah vody v medu. Kataláza neutralizuje účinky peroxidu vodíku a po jejím přidání k medu dochází u některých medů ke snížení antibakteriální aktivity. U ostatních medů není aktivita významně ovlivněna. Rozdílné koncentrace H2O2 v různých medech způsobují odlišné antibakteriální účinky. [13], [16][17]

3.1.5.3. Nízké pH Med má nízké pH, jelikož se pohybuje mezi 3,2 – 4,5. Toto kyselé prostředí je dostatečně nízké, aby mohlo inhibovat růst několika bakteriálních patogenů. Z kyselin je v medu nejvíce zastoupená kyselina glukonová, jež vzniká z glukózy pomocí glukozaoxidázy. [13]

17

3.1.5.4. Methylglyoxal Manuka med pochází z nektaru dřeviny Leptospermum scoparium, která roste na Novém Zélandu. Bylo zjištěno, že všechny medy obsahují peroxid vodíku, ale u některých Manuka medů bylo prokázáno, že za hlavní antibakteriální účinek je zodpovědná jiná složka než peroxid. Manuka med má významnou antibakteriální aktivitu, díky které byl podroben detailnímu zkoumání, kdy byly nalezeny mimořádně vysoké koncentrace methylglyoxalu (MGO). Tato antibakteriální látka se nachází, jak bylo zjištěno, i v jiných medech z Nového Zélandu. U ostatních medů se koncentrace MGO pohybovala kolem 24mg/kg, kdežto v Manuka medu byla v rozmezí 381541mg/kg. Zajímavostí je také předpokládaný vznik MGO v Manuka medu. V nektaru Leptospermum scoparium lze nalézt velké množství dihydroxyacetonu. K přeměně dihydroxyacetonu na MGO dochází neenzymaticky a to během skladování medu. MGO může vznikat i ve sladkých potravinách a nápojích a to během zahřívání či dlouhodobém skladování. V tomto případně ale MGO vzniká ze sacharidů a jeho koncentrace nedosahuje tak vysokých hodnot. Při ověřování antibakteriální aktivity vůči vybraným kmenům bakterií byl methylglyoxal neutralizován. Neutralizací byla potlačena či výrazně snížena aktivita proti Staphylococcus aureus a Bacillus subtilis, stále však přetrvával účinek na Escherichia coli a Pseudomonas aeruginosa. Z toho vyplývá, že MGO není zcela zodpovědný za antibakteriální účinek u Manuka medu. [16][17]

3.1.5.5. Bee defensin-1 Tento peptid byl nejdříve identifikován v hemolymfě, hlavě a hrudních žlázách včel, dále byl také nalezen v mateří kašičce, což je hlavní potrava včelí královny. Bee defensin-1 se vyznačuje silnou aktivitou pouze vůči grampozitivním bakteriím. Jedná se především o tyto kmeny - B. subtilis, S. aureus a Paenibacillus larvae, jež způsobuje nemoc nazývanou mor včelího plodu. [16]

18

3.2.

Separační metody

Cílem separace je rozdělit vzorek alespoň na dvě části odlišného složení. Separační metody dělíme dle skupenství fází, mezi které se složky směsi rozdělí. Například fáze: [18] plyn - kapalina plyn - pevná látka kapalina - kapalina kapalina - pevná látka Tab. 1. Příklady metod založených na rovnovážné distribuci složek mezi plyn a jinou fázi [18] Fáze

plyn - kapalina

plyn - pevná látka

Metoda

destilace

plynová chromatografie

plynová chromatografie

sublimace použití molekulových sít

Tab. 2. Příklady metod založených na rovnovážné distribuci složek bez plynné fáze [18] Fáze

kapalina - kapalina

kapalina - pevná látka

Metoda

extrakce

zonální tavení

kapalinová chromatografie

frakční krystalizace kapalinová chromatografie extrakce pevnou fází použití molekulových sít

3.2.1.

Chromatografie

Chromatografické metody se řadí do skupiny separačních metod. Tato separace spočívá v rozdílné distribuci dělených látek ve směsi mezi dvě nemísitelné fáze. Jedná se o fázi mobilní (pohyblivou) a fázi stacionární (nepohyblivou). Dle mobilní fáze rozlišujeme kapalinovou a plynovou chromatografii. Naopak tuhá látka či kapalina

19

ukotvená na tuhém nosiči může být fází stacionární. Často využívaným příkladem kapalinové chromatografie je vysokoúčinná kapalinová chromatografie. [19]

3.2.1.1. Rozdělení chromatografických metod Chromatografických metod je nepřeberné množství, je tedy výhodné si je rozdělit do několika skupin. Jednotlivé skupiny se dělí dle: [18] skupenství mobilní fáze (kapalinová, plynová chromatografie) uspořádání stacionární fáze o

kolonová chromatografie

o

plošné uspořádání (papírová chromatografie, tenkovrstvá chromatografie)

děje, který převládá během separace o

rozdělovací chromatografie

o

adsorpční chromatografie

o

iontově-výměnná chromatografie

o

gelová chromatografie

o

afinitní chromatografie

3.2.1.2. Chromatografická separace Během separace látek se opakovaně ustaluje rovnováha dělených látek mezi mobilní a stacionární fázi. Toto rozdělení popisuje distribuční (rozdělovací) konstanta K D.

KD = CS / Cm CS = koncentrace složky ve stacionární fázi Cm = koncentrace složky v mobilní fázi Pokud chceme rozdělit jednotlivé látky, je nutné, aby se lišily hodnotami distribučních konstant. Dle jejich podobnosti či rozdílnosti volíme typ eluce. Jestliže jsou hodnoty distribučních konstant blízko u sebe, je vhodné zvolit isokratickou eluci, kdy je mobilní fáze o konstantním složení (stejné eluční síle). V opačném případě má využití gradientová eluce, kdy mají složky směsi výrazně odlišné fyzikálně-chemické vlastnosti. [19]

20

Obr. 4. Separační proces [20]

Existuje přímá úměra mezi hodnotou distribuční konstanty dané látky a dobou setrvání této molekuly ve stacionární fázi. S dobou setrvání této molekuly ve stacionární fázi souvisí retenční (eluční) čas a retenční (eluční) objem. Doba od nástřiku vzorku po dosažení vrcholu píku se nazývá retenční čas. Tato hodnota je kvalitativní charakteristikou látky, naopak plocha pod píkem (A) či výška píku (h) vypovídají o charakteristice kvantitativní. Retenční objem je množství mobilní fáze v ml, které proteče kolonou během retenčního času. Podíl retenčního objemu a času pak vyjadřuje objemový průtok mobilní fáze (Fm).

Fm = VR / tR

(ml/min)

VR = retenční objem tR = retenční čas Další uvedenou veličinou je retenční faktor (k), což je míra retence dělených látek. Vztah mezi retenčním faktorem a retenčním objemem či časem uvádí následující rovnice.

VR = V0 (1+k) tR = t0 (1+k) t0 (V0)=mrtvý čas (objem)

21

Mrtvý čas (objem) udává čas (objem) složky, která není na koloně zadržována a pohybuje se tedy stejnou rychlostí jako mobilní fáze. [19]

Obr. 5. Kvalitativní charakteristiky chromatografického procesu [21] tR = retenční čas látky, tM = retenční čas mobilní fáze (či nezadržované látky, která je unášena spolu s mobilní fází)

Ukazatelem kvality chromatografické separace je účinnost kolony. Během separace látek se snažíme dosáhnout co nejlepších podmínek, abychom látky rozdělili, a aby byly separovány v co nejkratším čase. Vliv na separaci látek mají především tyto faktory - délka kolony, retenční faktor, rychlost průtoku mobilní fáze, velikost částic náplně chromatografické kolony, teplota a viskozita mobilní fáze. Všechny uvedené rovnice se vztahují pouze k izokratické eluci, u gradientové eluce platí jiné rovnice. [19]

3.2.1.3. Instrumentace HPLC Vysokoúčinný kapalinový chromatograf (HPLC) je složen z několika částí, každá má určitou funkci, například: uchovávání a transport mobilní fáze (zásobníky mobilní fáze, vysokotlaké čerpadlo) dávkování vzorku (autosampler, manuální dávkovací ventil) separace látek (chromatografická kolona, termostat kolony) detekce látek (detektor) záznam dat pro následné vyhodnocení (počítač, software) Mobilní fáze (a k ní se později přidává i vzorek) prochází jednotlivými částmi kapalinového chromatografu. Mobilní fáze vychází ze zásobníku do vysokotlakého

22

čerpadla. Dále pokračuje přes zařízení pro dávkování vzorku do chromatografické kolony. K separaci analytu dochází na chromatografické koloně, která je umístěna v termostatovaném kolonovém prostoru (tato část udržuje konstantní teplotu během analýz). Poté putuje fáze společně se vzorkem do detektoru, kde dochází k detekci analyzovaných látek. Z detektoru odtéká mobilní fáze a vzorek do odpadu, sběrače frakcí nebo do dalšího detektoru. Celý chromatografický systém je ovládán speciálním softwarem. [19], [22]

Obr. 6. Schéma kapalinového chromatografu [20]

K nejběžnějším typům detektorů v oblasti farmaceutické analýzy řadíme detektory: optické (UV/VIS, fluorescenční detektory) hmotnostní elektrochemické radiometrické Mimo tyto typy existují ještě například detektory vodivostní, chemiluminiscenční, založené na rozptylu světla a refraktometrické. [22]

Fluorescenční detektor Detektory lze rozdělit do dvou velkých kategorií na univerzální a selektivní. Fluorescenční detektor patří mezi vysoce selektivní. Tyto detektory odpovídají na určitou fyzikálně-chemickou vlastnost separované látky, kdežto univerzální detektory reagují na všechny rozpuštěné látky bez ohledu na jejich fyzikálně-chemické vlastnosti. Látky, které mají v molekule fluorofor, mohou být detekovány fluorescenčním detektorem. Pouze malé množství látek je přirozeně fluorescenčních, proto je nezbytné

23

látku upravit pomocí derivatizační reakce. Derivatizace je možná buď před, nebo po separaci látek na koloně ale před vstupem do detektoru. U fluorescenčních detektorů je k detekci využíváno specifické vlastnosti vzorku – fluorescence, díky ní se jedná o vysoce specifický detektor. Detekce probíhá tak, že látka absorbuje excitační elektromagnetické záření a následně uvolní emisní záření, které je zachyceno fluorescenčním detektorem. Vlnová délka emitovaného záření může být stejná jako délka absorbovaného záření, ale častěji bývá vyšší. Fluorescenční detektor je složen z několika částí, mezi ně patří: výbojka, excitační mřížka

(monochromátor),

průtoková

cela,

mikročočky,

filtry,

emisní

mřížka

(monochromátor) a fotonásobič. U moderních detektorů lze nastavit vlnovou délku excitačního i emitovaného záření za použití monochromátoru. Případně lze tyto délky měnit v průběhu eluce, aby se zajistila vyšší citlivost pro každou separovanou látku. Detekční limit tohoto typu detektoru dosahuje až hodnoty 10 -12g/ml. Výtěžek fotoluminiscence závisí na teplotě, na koncentraci a na dalších faktorech. Naopak může být snížen látkami, které zhášejí fluorescenci (jako je například kyslík).[18], [19], [22]–[24]

3.2.1.4. TLC Tenkovrstvá

chromatografie

patří

mezi

planární

techniky

kapalinové

chromatografie. Rozlišujeme dva typy tenkovrstvé chromatografie – rozdělovací a adsorpční. U rozdělovací chromatografie je stacionární fází kapalina zachycena v tenké vrstvě, kdežto u adsorpční chromatografie je stacionární fází tuhý absorbent ve formě tenké vrstvy na podkladu ze skla, hliníku nebo polyesteru. Pevná fáze je obvykle na bázi silikagelu, oxidu hlinitého či křemeliny. Aplikace vzorku je velmi jednoduchá. Vzorek je pomocí kapiláry či mikropipety umístěn na start. Start je předem označená linie blízko kraje plochy. Mobilní fáze se pohybuje pomocí kapilárních sil. Společně se vzlínající mobilní fází se později (od startu) pohybuje i vzorek. Rychlost pohybu složek vzorku závisí na jejich rozpustnosti v mobilní fázi a na jejich schopnosti se vázat na stacionární fázi. Na základě těchto vlastností je vzorek rozdělen na jednotlivé složky. Vyvíjení probíhá v uzavřené chromatografické komoře, jež je nasycena parami mobilní fáze. Než fáze dosáhne opačného konce plochy, je vyvíjení ukončeno a její horní linie (čelo) je označena. Mobilní fází může být cyklohexan, toluen, chloroform, dichlormethan, aceton, ethanol, methanol, voda, amoniak, kyselina octová, jejich směsi a jiné látky.

24

Dle typu separovaných látek se provede jejich detekce. U barevných látek většinou není potřeba jejich další zviditelnění jako je tomu u nebarevných látek, kdy se plocha přestříká aerosolem činidla za vzniku barevných sloučenin. Případně stacionární fáze může obsahovat příměs fluorescenční látky, kdy maximum fluorescence je při 254nm nebo 366nm. Detekce poté probíhá pod UV lampou, přičemž destička nazelenale fluoreskuje a skvrny analyzované látky naopak fluorescenci zhášejí. Může nastat i situace, kdy samotná látka vyzařuje při určité vlnové délce barevnou fluorescenci. Tenkovrstvá chromatografie je využívána i v lékopise pro identifikaci léčiv či pro ověření čistoty léčiva. Předností této metody je především jednoduchost a dostupnost laboratorního vybavení. [18], [25], [26]

Obr. 7. Plošná kapalinová chromatografie před a po vyvíjení [27]

Retenční faktor Retenční neboli retardační faktor (Rf) se používá při kvalitativní analýze. Jedná se o podíl vzdálenosti středu skvrny dané látky od startu a čela od startu. Tato hodnota se nemění pro danou látku za stejných podmínek. Jestliže je tedy na jednu destičku aplikován neznámý vzorek a standard a jejich hodnoty R f jsou stejné, je přítomnost stejné složky pravděpodobná. [18]

Rf = vzdálenost skvrny od startu / vzdálenost čela od startu

25

4. Experimentální část 4.1.

Materiál

4.1.1.

Chemikálie

Aceton, CARLO ERBA Reagents, Francie Acetonitril Chromasolv, Sigma Aldrich, Německo Dichlormethan, CARLO ERBA, Francie Ethanol, Sigma Aldrich, Německo Ethylacetát, CARLO ERBA Reagents, Francie Fluram, Fluka Chemie AG, Švýcarsko Gentamicin sulfát 80mg/2ml, injekční roztok, Panpharma, Francie n-Hexan RPE ACS for analysis Reag. Ph. Eur., CARLO ERBA Reagents, Francie L-Histidin, Fluka Bichemika, Sigma Aldrich, Německo Hydrogenfosforečnan sodný heptahydrát, Sigma Aldrich, Německo Isopropylalkohol RPE, CARLO ERBA Reagents, Francie Kyselina citronová, Sigma Aldrich, Německo Methanol Chromasolv, Sigma Aldrich, Německo Síran sodný bezvodý RPE, CARLO ERBA Reagents, Francie ultračistá voda (A2E Affinage de l'eau, Mauguio, Francie) voda RS for LC/MS, CARLO ERBA Reagents, Francie

26

4.1.2.

Medy

Níže uvedené medy jsou dlouhodobě zkoumány v laboratoři pana profesora Larroque v Montpellier a to především co se týká jejich účinnosti a složení. Z těchto důvodů byly pro práci vybrány tyto vzorky. V této laboratoři bylo například nedávno zjištěno, že antibakteriální účinnost medů z kaštanovníku je vyšší oproti ostatním zkoumaným medům. [15] Sedm medů vzniklo přímo ve Francii v regionu Languedoc-Roussillon, osmý vzorek má původ z Německa. Jedná se jak o medy jednodruhové, tak o medy jejichž nektar je z několika druhů rostlin.

Tab. 3. Testované vzorky medu Název medu

Oblast, ze které med

Druh medu

pochází

Miel Rico

Lozère, Francie

vícedruhový

Nectar des Garrigues de

Des Pyrénées Roussillon,

vícedruhový

Collioure

Francie

Eyne La Valée des Plantes

Des Pyrénées Roussillon,

médecinales

Francie

Miel de Chêne

Des Pyrénées Roussillon,

vícedruhový

dub (Quercus sp.)

Francie Miel de Châtaignier, Maître

Fuilla, Francie

kaštanovník (Castanea)

Miel Vèro

Nyer, Francie

vícedruhový

Miel de Châtaignier

Lluch, Francie

kaštanovník (Castanea)

rucher

Miel de Sapin

Vallei du Kiuria, Německo

27

jedle (Abies)

4.1.3.

Laboratorní sklo a pomůcky

mikropipety HIRSCHMANN 10μl pipeta Eppendorf Research plus 20-200 μl pipeta Eppendorf Research plus 20 μl pipeta Eppendorf Research 1000 μl pipeta Eppendorf Research 100 μl SPE Supelco VISIPREP TM centrifuga Centro 8-BL, Selecta analytické váhy Denver Instrument M-310 Stuart tube rotator SB3 (rotační míchačka zkumavek) Thermo Scientific Heraeus oven termostat Toulemonde kádinky 50ml, 400ml odměrné baňky 10ml, 20ml100ml, 200ml, 500ml zátky plastové a skleněné válce 25ml, 100ml, 125ml, 250ml nerezové lžičky lodičky na navážky tyčinky malé zkumavky (5ml) držák na zkumavky Pasteurovy pipety pH-metr (CyberScan) rozprašovač UV lampa chromatografická vana vakuový extraktor Supelco Visiprep Waters Oasis HLB Cartridge

28

Přístroje, podmínky separace, příprava roztoků

4.2.

4.2.1.

HPLC (reverzní fáze)

4.2.1.1. Chromatografická sestava Chromatografická sestava HPLC Thermo separation products Pumpy:

Spectra System P 1000 XR

Autosampler:

Spectra System AS 3000

Detektor:

Spectra System FL 3000

Kolona:

C18 Nucleosil 100Ǻ - 5µm, 4,6 mm x 250mm (Macherey-Nagel) C8 Eclipse XDB 100Ǻ - 5µm, 4,6 mm x 150mm (Agilent) C18 100Ǻ - 5µm, 3mm x 250mm (Kromasil)

4.2.1.2. Podmínky separace Mobilní fáze:

85% ACN, 10% voda RS, 5% fosforečný pufr 79% ACN, 20% voda RS, 1% fosforečný pufr 70% ACN, 27% voda RS, 3% fosforečný pufr 50% ACN, 45% voda RS, 5% fosforečný pufr

Dávkování:

20μl

Detekce:

400nm (excitační záření), 510nm (emitované záření) 280nm (excitační záření), 560nm (emitované záření)

Průtoková rychlost:

0,8ml/min

Teplota:

laboratorní

Typ eluce:

izokratická

Vyhodnocení:

software ChromQuest 4. 2. 34

4.2.1.3. Příprava vzorků Extrakce dichlormethanem Ze sklenice medu bylo odebráno přibližně 0,2g medu. Med byl rozpuštěn ve 2ml vody RS, poté byl přidán 1ml fosforečného pufru a 1ml acetonitrilu. Ze zkumavky, kde byl daný roztok, byly odebrány 2ml a přidány 2ml dichlormethanu. Danou směsí o objemu 4ml bylo třepáno. Po 10 minutách byla odebrána spodní fáze směsi pomocí Pasteurovy pipety. Tato fáze s dichlormethanem byla vložena do termostatu, kde byla nastavena teplota na 75°C a obsah zkumavky byl odpařen. Odparek byl rozpuštěn

29

v roztoku stejného složení jako na začátku čili ve 2ml vody RS, 1ml pufru a 1ml acetonitrilu (ACN). Roztokem bylo dostatečně třepáno, aby došlo k rozpuštění. Byly odebrány 2ml tohoto roztoku, které byly vstříknuty do vialky a byly přidány 0,2ml fluoreskaminu (F). Vzorek bez fluorescaminu byl připraven stejným způsobem bez závěrečného přidání derivatizačního činidla. Závěrem bylo zkontrolováno, zdali je roztok s F fluorescentní pod UV zářením o vlnové délce 356nm v porovnání s vialkou, kde byl pouze roztok složený z 1ml vody RS, 0,5ml fosforečného pufru a 0,5ml ACN bez fluorescaminu.

Extrakce hexanem Vzorek byl extrahován obdobným způsobem jako při extrakci dichlormethanem s tím rozdílem, že místo dichlormethanu byl jako extrakční rozpouštědlo použit hexan.

Gentamicin Do zkumavky byly dány 2ml vody RS, 1ml pufru, 1ml ACN, 0,2ml injekčního roztoku gentamicinu (40mg/ml) a případně 0,2ml připraveného roztoku fluoreskaminu. Směs byla promíchána.

4.2.1.4. Příprava roztoků Roztok fluoreskaminu Bylo naváženo 10mg fluoreskaminu, které byly rozpuštěny v 5ml acetonitrilu. Výsledný roztok měl koncentraci 2mg/ml.

Fosforečný pufr Bylo naváženo 1,0507g kyseliny citronové tato navážka byla vložena do odměrné baňky o objemu 50ml a doplněna vodou RS po rysku. Obdobně se postupovalo s heptahydrátem hydrogenfosforečnanu sodného, kde bylo naváženo 26,7933g heptahydrátu a dané množství bylo rozpuštěno ve vodě RS a doplněno do objemu 1000ml. Oba roztoky měly molární koncentraci 0,1M. Poté bylo odměřeno 27,5ml připraveného roztoku kyseliny citronové do odměrné baňky o objemu 1000ml a zbylý objem byl doplněn připraveným roztokem hydrogenfosforečnanu. Výsledného pH 8,0 bylo dosaženo přidáním pár kapek kyseliny chlorovodíkové, požadované pH bylo zkontrolováno pH-metrem.

30

4.2.2.

TLC

4.2.2.1. Příprava mobilní fáze Do odměrné baňky o objemu 500ml bylo odměřeno 282,5ml butanolu, 108,5ml kyseliny octové a po rysku byl doplněn objem čištěnou vodou. Výsledná mobilní fáze měla složení - butanol 56,5%, kyselina octová 21,7%, čištěná voda 21,8%.

4.2.2.2. Podmínky separace Mobilní fáze:

butanol 56,5%, kyselina octová 21,7%, čištěná voda 21,8%

Stacionární fáze:

skleněná deska se silikagelem 60 F254, 20x20cm (Merck) hliníková fólie s polyamidem 11 F254, 20x20cm (Merck) hliníková fólie s křemelinou F254, 20x20cm (Merck)

Dávkování:

10μl

Derivatizace:

postřik roztokem fluoreskaminu

Detekce:

UV lampa (356nm a 254nm)

4.2.2.3. Příprava roztoku fluoreskaminu Bylo naváženo 0,0922g fluoreskaminu a dané množství bylo rozpuštěno v 50ml acetonitrilu. Tento zásobní roztok byl uskladněn na tmavém místě a pevně uzavřen zátkou, aby nedocházelo k vypařování roztoku. V případě potřeby bylo přelito malé množství do rozprašovače.

4.2.2.4. Příprava porovnávacích vzorků Gentamicin Původní injekční roztok (40mg/ml) nebyl nijak upraven.

Histidin Bylo naváženo 126,5mg histidinu do odměrné baňky o objemu 5ml a objem byl doplněn vodou RS po rysku. Roztok byl promíchán. Vznikl roztok o koncentraci 25,3mg/ml.

31

4.2.2.5. Příprava vzorků Extrakce dichlormethanem 0,2g medu č. 1 (Miel Rico, Lozère, Francie) bylo rozpuštěno v 1ml vody, poté byly přidány 3ml dichlormethanu a zkumavkou bylo 10minut třepáno. Poté byla odebrána spodní fáze obsahující dichlormethan a na pár minut byla zkumavka vložena do termostatu o teplotě 75°C, aby se zvýšila koncentraci extrahovaných látek pro zřetelnější detekci.

Extrakce ethylacetátem Postup byl stejný jako při extrakci CH2Cl2 jenom s tím rozdílem, že se odebrala horní fáze, kde byl ethylacetát.

Rozpouštění ve vodě Všech osm vzorků medu bylo rozpuštěno ve vodě. Bylo odebráno vždy po 0,2g vzorku, toto množství bylo vloženo do zkumavky a byly přidány 3ml čištěné vody. Pro rychlejší rozpuštění byla zkumavka uzavřena víčkem a vložena do rotátoru Stuart SB3 (10minut, 40ot/min).

Rozpouštění v různých látkách Bylo připraveno 8 zkumavek s 0,2g medu (ve všech zkumavkách byl vzorek medu č.1 - Miel Rico, Lozère, Francie) a do každé zkumavky byla dána jiná tekutina (vždy po 3ml) - voda, methanol, ethanol, isopropylalkohol, dichlormethan, acetonitril a ethylacetát. Všechny zkumavky se točily na přístroji Stuart rotator SB3 po dobu 20 minut při rychlosti 40 ot/min. Med se zcela rozpustil pouze ve vodě a v methanolu.

Rozpouštění v methanolu Z každé sklenice bylo odebráno 0,2g medu, dané množství se rozpustilo ve 2ml methanolu (MeOH) během 10 minutové rotace na přístroji Stuart rotator SB3 (40 ot/min).

Extrakce pevnou fází Bylo rozpuštěno přibližně 0,2g medu ve 2ml vody. Kolonka (Waters Oasis HLB Cartridge) byla nejprve třikrát propláchnuta čištěnou vodou, potom byla aktivována methanolem a nakonec byla ještě několikrát propláchnuta vodou. Poté byl na kolonku nanesen vzorek. Aby byl vzorek zbaven cukru, byla ihned po aplikaci vzorku kolonka

32

propláchnuta vodou. Po jednom propláchnutí vzorku vodou byly extrahovány látky pomocí roztoku o složení 20% ACN a 80% dichlormethanu. Extrakt byl zkontrolován pod UV lampou o vlnové délce 356nm a vzorek ve srovnání s extrakčním činidlem slabě fluoreskoval. Tento fluoreskující roztok byl nanesen na destičku spolu s ostatními medy rozpuštěnými ve vodě a také spolu s gentamicinem a histidinem. Se zbylou částí vzorku se dále ještě pracovalo pro metodu HPLC. Vzorek byl zředěn dichlormethanem, aby výsledný objem roztoku byl 3ml (byly přidáno přibližně 2ml). Tento objem byl rozdělen na polovinu a obě části byly dány do vialky. K jedné vialce bylo přidáno 0,2ml F, ke druhé se nic nepřidávalo. Ani na destičce ani na chromatogramu nebyla žádná známka fluorescence.

4.2.2.6. Nanášení vzorku 10μl roztoku bylo po kapkách aplikováno pomocí mikropipety na destičku, jednotlivé skvrny byly vysušeny fénem, teprve po vysušení byla nanesena další kapka. Roztok byl vždy porovnáván s roztokem gentamicinu a histidinu.

4.2.3.

HPLC (normální fáze)

4.2.3.1. Chromatografická soustava Chromatografická sestava HPLC Thermo separation products Pumpy:

Spectra System P 1000 XR

Autosampler:

Spectra System AS 3000

Detektory:

Spectra System FL 3000

Kolona:

silikagel Nucleosil 100Ǻ - 5µm, 3mm x 250mm (Macherey-Nagel)

4.2.3.2. Podmínky separace Mobilní fáze:

50% ACN, 50% CH2Cl2

Dávkování:

20μl

Detekce:

390nm (excitační záření), 560nm (emitované záření)

Průtoková rychlost:

0,5ml/min

Teplota:

laboratorní

Typ eluce:

izokratická

Vyhodnocení:

software ChromQuest 4. 2. 34

33

4.2.3.3. Příprava vzorku Extrakce dichlormethanem Příprava vzorku probíhala stejně jako při extrakci dichlormethanem u tenkovrstvé chromatografie, na závěr bylo ke vzorku přidáno 10μl F.

Extrakce pevnou fází Postup byl totožný jako při přípravě vzorku u TLC. Byl použit zbylý vzorek obsahující fluorescamin.

34

5. Výsledky a diskuze 5.1.

HPLC (reverzní fáze)

Během optimalizace chromatografických podmínek pro detekci hledaných látek v medu nebyla změněna pouze stacionární fáze, ale i složení mobilní fáze a vlnové délky excitovaného a emitovaného záření. Před vstříknutím vzorku do kapalinového chromatografu byl původní vzorek extrahován a to ze dvou důvodů. Jednak aby vzorek obsahoval především hledané látky a také aby ve vzorku nebyly přítomny sacharidy. Extrakce hexanem nebyla účinná na rozdíl od extrakce dichlormethanem. Po extrakci dichlormethanem a po přidání F vzorek slabě fluoreskoval pod UV zářením o vlnové délce 356nm i 254nm ve srovnání s roztokem, ve kterém byl odparek rozpuštěn. Po úspěšné extrakci bylo zjišťováno, zdali je vzorek více fluorescentní, jestliže je F přidán před nebo po extrakci CH2Cl2. Vzorek se jevil více fluorescentní, když byl F přidán ke vzorku až na závěr před vstříknutím do HPLC. Na chromatogramu ale nebyl zaznamenán žádný výrazný pík, který by odpovídal navázání fluoreskaminu na nějakou strukturu (pocházející z medu) s volnou primární aminoskupinou. Opačný případ byl u vzorku gentamicinu s F, kde byl na chromatogramu vidět výrazný pík. Na chromatogramu, který je složen ze čtyř jednotlivých měření, je vidět rozdíl mezi velikostí píku gentamicinu s F a bez F. Stejně tak lze porovnat rozdílnou velikost píků u obou vzorků s F (med a gentamicin), kdežto velikosti píků, které pravděpodobně odpovídají nějaké extrahované látce z medu s F a bez F, jsou téměř stejné. Až při detailnějším zvětšení je možné vidět, že pík vzorku s F je trochu menší než u vzorku bez F. Vzorek medu slabě fluoreskoval pod UV zářením po extrakci dichlormethanem, na chromatogramu ale nebyly vidět žádné výrazné píky u vzorku medu. Může se jednat o chybu měření, avšak pro vyvrácení této možnosti byl tento pokus několikrát opakován, a proto se tato možnost zdá být nepravděpodobná. Tento rozporuplný výsledek lze také vysvětlit přítomností zhášečů fluorescence v medu, protože med je směs mnoha látek a extrakcí jich mohlo několik přejít do vzorku. Důvodů může být však několik vzhledem ke složité konstituci medu (mnoho látek různé povahy). Z toho lze tedy usuzovat, že pouhé měření fluorescence není vhodnou metodou. Je vidět, že tato metoda je použitelná u gentamicinu. Rozdíl píků po navázání fluoreskaminu a bez něj je výrazný. Bylo by ale potřeba upravit podmínky separace, aby gentamicin nebyl eluován tak brzy. U medu nelze potvrdit, že metoda byla úspěšná, tyto výsledky byly dosaženy opakovaně. Fluoreskamin se pravděpodobně

35

vůbec nevázal na nějakou extrahovanou látku v medu. Překvapivý je i výsledek, že pík extrahované látky z medu je větší bez derivatizace fluoreskaminem než po navázání F. Pravděpodobně se jedná o chybu měření. Stejně jako gentamicin i tento vzorek byl velmi brzo eluován. Všechny vzorky mají přibližně stejný retenční čas, který odpovídá přibližně jeden a půl minutě. Další zajímavostí je počet píků. U vzorku medu se očekávalo, že bude na chromatogramu zaznamenáno více látek. Počet látek ve vzorku byl eliminován extrakcí a také způsobem detekce. Další úbytek látek se dá vysvětlit tím, že látky nebyly zachyceny na koloně a byly vymyty jako mrtvý objem. Obdobných výsledků bylo dosaženo i po změně procentuálního zastoupení jednotlivých složek v mobilní fázi a taktéž po výměně kolony i po změně vlnových délek excitovaného a emitovaného záření. Bylo provedeno několik měření, uvádím ale pouze tyto chromatogramy, které jsou více reprezentativní. Vybrané procentuální složení mobilní fáze – ACN, fosforečný pufr a voda RS bylo vždy vyzkoušeno ve zkumavce před spuštěním metody. Určitý poměr ACN a fosforečného pufru totiž vytvářel sraženiny. K vodě RS v zásobní lahvi bylo přidáno malé množství ACN (do 5%), aby se zamezilo mikrobiálnímu růstu. Použité vlnové délky byly vybrány na základě předchozích zkušeností laboratoře v Montpellier s výzkumem antibakteriálních látek v medu. Nelze jednoznačně vysvětlit, proč se na chromatogramu neobjevily větší píky u vzorku medu. Příčinou může být neúspěšná extrakce, kdy nebyly získány hledané látky, či nevhodné podmínky pro separaci či detekci těchto látek.

Separace probíhala za uvedených chromatografických podmínek: Mobilní fáze:

70% ACN, 27% voda RS, 3% fosforečný pufr

Stacionární fáze:

kolona C8 Eclipse XDB 100Ǻ - 5µm, 4,6mm x 150mm (Agilent)

Detekce:

400nm (excitační záření), 510nm (emitované záření)

Průtoková rychlost:

0,8ml/min

Příprava vzorku:

extrakce CH2Cl2

36

Detector 1-510nm

Detector 1-510nm

miel sans f.dat

gentamicine sans f.dat

miel.dat 10

9

9

8

gentamicin s F

8

7

gentamicin bez F

7

6

med s F

6

5

med bez F

5

4

4

3

3

2

2

1

1

0

0

-1

mV

mV

Detector 1-510nm

10

-1 0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

Minutes

Obr. 8. Záznam ze 4 chromatogramů ve velkém měřítku koncentrace gentamicinu byla 1,82mg/ml vzorku

0.250

Detector 1-510nm

Detector 1-510nm

Detector 1-510nm

miel sans f.dat

gentamicine sans f.dat

miel.dat

0.250

0.225

0.225

gentamicin s F

0.200

0.200

gentamicin bez F 0.175

0.175

med s F 0.150

med bez F

0.125

0.125

0.100

0.100

0.075

0.075

0.050

0.050

0.025

0.025

0.000 0.0

0.000 0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

1.8

2.0

2.2

Minutes

Obr. 9. Záznam ze 4 chromatogramů v malém měříku koncentrace gentamicinu byla 1,82mg/ml vzorku

37

2.4

2.6

2.8

3.0

3.2

3.4

3.6

mV

mV

0.150

5.2.

TLC

Pro nalezení vhodnějších podmínek detekce hledaných látek byla změněna separační metoda z HPLC na TLC. Před zahájením byly nastaveny vhodné podmínky pro separaci gentamicinu a histidinu a také pro jejich detekci. Složení mobilní fáze a druh stacionární fáze byli vybrány pomocí této metodiky. [28] Přednostně byly hledány vhodné podmínky pro separaci aminokyselin. Při separaci na hliníkové fólii s křemelinou či s polyamidem byly skvrny gentamicinu a histidinu velmi nejasné a rozmazané na rozdíl od skvrn na desce se silikagelem. Skvrny byly derivatizovány až po vzlínání mobilní fáze, kdy před vložením pod UV záření byla destička přestříkána roztokem fluoreskaminu. Když byly na destičku aplikovány přímo vzorky obsahující F, byly výsledné skvrny nejasné, což mohlo být pravděpodobně způsobeno nízkým pH mobilní fáze. Reakční prostředí fluorescaminu je kolem 8 - 9.[29] Poté bylo pracováno pouze s jedním vzorkem medu (Miel Rico, Lozère, Francie), aby bylo zjištěno vhodné extrakční rozpouštědlo. Byla zopakována extrakce CH2Cl2, ale ani při opakovaných pokusech na destičce nebyly pozorovány žádné fluoreskující skvrny. Bez úspěchu byla také extrakce ethylacetátem. Na podkladu stacionární fáze byly vidět fluorescentní skvrny v případě, že byl vzorek rozpuštěn ve vodě (bez jakékoli extrakce) a poté aplikován. Tento pokus byl zopakován za stejných podmínek se všemi osmi vzorky medu. Na destičce bylo možné pozorovat osm fluoreskujících skvrn osmi vzorků medu pod UV zářením o vlnové délce 254nm i 356nm. Kromě medu byl nanesen na podklad i gentamicin a histidin. Fluorescentní skvrny nebyly stejně zbarvené ani nebyly ve stejné úrovni. Retenční faktor nebyl měřen z důvodu zjišťování vhodných podmínek pro separaci a tato měření byla pouze orientační. Tři medy se zbarvením a intenzitou fluorescence odlišovaly od ostatních vzorků, jednalo se o med Miel Rico a o oba medy, které pochází z kaštanovníku. Na obr. 10 - 12 jsou tyto medy pod čísly 1 (Miel Rico), 5 a 7 (Miel de Châtaignier). Obdobně bílé zbarvení fluoreskujících skvrn měl i vzorek gentamicinu, jehož skvrna zůstala na startu. Mimo tuto skvrnu byla pozorována i jedna skvrna u horní hranice mobilní fáze, tato skvrna nebyla fluorescentní, naopak při UV záření o vlnové délce 254nm zhášela fluorescenci. Jednalo se pravděpodobně o nějakou pomocnou látku z injekčního roztoku gentamicinu (sodná sůl kyseliny edetové, methylparaben,

propylparaben,

disiřičitan

sodný).[30]

Zbarvení

ostatních

fluoreskujících skvrn vzorků medu bylo spíše žluté, stejně jako u vzorku histidinu. Později bylo zjištěno, že je možné vidět fluoreskující skvrny u všech používaných vzorků medů bez derivatizace fluoreskaminem a to při obou vlnových

38

délkách. Intenzita fluorescence byla bez postřiku nepatrně nižší, což lze vysvětlit přítomností aminokyselin v medu, které po derivatizaci F mohou fluoreskovat. Dále byl učiněn pokus rozpustit vzorek medu č. 1 (Miel Rico, Lozère, Francie) v několika různých rozpouštědlech (voda, methanol, ethanol, isopropylalkohol, dichlormethan, acetonitril a ethylacetát). Med se zcela rozpustil pouze ve vodě a v methanolu. Ze všech zkumavek bylo aplikováno malé množství vzorku na destičku a detekováno. Fluoreskující skvrny byly pouze u vzorku medu s methanolem. A stejně tak jako v předchozím pokuse i u vzorku medu rozpuštěném ve vodě. U ostatních látek nebyly viděny fluorescentní skvrny bez derivatizace F ani po pulverizaci roztokem F. Z toho lze usoudit, že fluorescentní látky v medu jsou rozpustné ve vodě a v methanolu. Následně bylo opět pracováno se všemi 8 vzorky medu a bylo ověřeno, že všechny naše používané medy jsou rozpustné v methanolu stejně jako ve vodě. Jednotlivé vzorky byly aplikovány na destičku. Stejně jako u vzorků rozpuštěných ve vodě bylo možné pozorovat 8 fluoreskujících skvrn se stejným zbarvením. Skvrny byly vidět po postřiku fluoreskaminem i bez něj a taktéž byly pozorovány pod UV zářením o vlnové délce 254nm i 356nm. Bez extrakce byl na destičku nanesen vodný roztok medu, který navíc nebyl ani filtrován, a protože v medu je velké množství látek (například i pylová zrna, prach a podobně), nelze jednoznačně říci, které látky jsou zodpovědné za fluorescenci. Pro větší objasnění by bylo potřeba tyto látky separovat a identifikovat. A později v rámci studia látek ovlivňující antimikrobiální účinky medu tyto látky testovat na antibakteriální aktivitu. Také struktura látek není známa, lze pouze usuzovat, že tyto látky jsou polární, protože jsou rozpustné ve vodě a v methanolu na rozdíl od ostatních použitých rozpouštědel. Intenzita fluorescence u vzorků medu č. 1, 5 a 7 se zdá být vyšší oproti ostatním vzorkům, což může být způsobeno například vyšší koncentrací fluoreskujících látek. Rozdílná barva fluorescentních skvrn může být zapříčiněna rozmanitostí látek přítomných v medu. Každá látka má totiž jiné excitační a emisní maximum. Když se podíváme na obr. 10 – 12 zjistíme, že ačkoliv jsou skvrny rozmazané, tak každý vzorek je reprezentován pouze jednou skvrnou. Výjimkou je med č. 7 na obr. 10, kdy se zdá, že by skvrny mohly být dvě za jiných separačních podmínek. Tato domněnka ovšem nebyla potvrzena dalšími pokusy. Bohužel nejsou známy hodnoty retenčních faktorů, které by mohly blíže vypovídat například o tom, že některé látky s určitým Rf jsou zastoupeny v několika medech. Avšak při pouhém porovnání úrovně skvrn jednotlivých vzorků medu můžeme vidět, že fluorescentní skvrny posledních čtyř medů (med č. 5, 6, 7, 8) jsou přibližně ve

39

stejné úrovni. Zároveň lze pozorovat, že poloha některých skvrn na různých destičkách je odlišná. Zřetelně to je vidět při porovnání destiček na obr. 10 a 11. Jedná se o jiné měření a pravděpodobně došlo k změně separačních podmínek, ačkoliv byla velká snaha, aby tyto podmínky zůstaly stejné během všech měření. Určitou roli zde může hrát i stáří destiček. Při porovnávání destiček před a po postřiku roztokem fluoreskaminu nebyla pozorována výrazná změna. Rozdíl byl minimální a pravděpodobně spočíval v tom, že med obsahuje i aminokyseliny, tudíž se na ně může navázat F a skvrny se pak mohou jevit více fluorescentní. Zběžně byla také porovnána destička se vzorky medu rozpuštěnými ve vodě s destičkou, kde byl jako rozpouštědlo použit methanol. Nebyl zaznamenán žádný viditelný rozdíl mezi destičkami. Pro lepší porovnání je potřeba znát Rf jednotlivých vzorků a pak tyto hodnoty porovnat mezi vodou a methanolem v rámci jednoho vzorku. A pro lepší přehlednost vzorky rozpuštěné v obou rozpouštědlech aplikovat na jednu destičku vedle sebe. Na fotografiích je vidět, že fluorescentní skvrny jsou rozmazané, což může být způsobeno několika faktory, jako je například přítomnost cukru ve vzorku, stáří destiček, příliš nízké pH pro fluoreskamin, vlhkost vzduchu či nedokonalá separace.

Chromatografické podmínky Mobilní fáze:

butanol 56,5%, kyselina octová 21,7%, čištěná voda 21,8%

Stacionární fáze:

skleněná deska se silikagelem 60 F254, 20x20cm (Merck)

Dávkování:

10μl

Detekce:

UV lampa (356nm a 254nm)

Příprava vzorku:

rozpuštění ve vodě nebo v methanolu

40

1

2

3

4

G

H

5

6

7

8

Obr. 10. Vzorky medu rozpuštěné v MeOH pod UV o 254nm (bez postřiku F)

1

2

3

4

G

H

5

6

Obr. 11. Vzorky medu rozpuštěné v MeOH pod UV o 254nm (po postřiku F)

41

7

8

1

2

3

4

G

H

5

6

Obr. 12. Vzorky medu rozpuštěné v MeOH pod UV o 356nm (po postřiku F)

Tab. 4. Popisky k obr. 6 - 8 Označení Vzorek 1

Miel Rico

2

Nectar des Garrigues de Collioure

3

Eyne La Vallée des Plantes médecinales

4

Miel de Chêne

G

gentamicin (40mg/ml)

H

histidin (25,3mg/ml)

5

Miel de Châtaignier, Maître rucher

6

Miel Vèro

7

Miel de Châtaignier

8

Miel de Sapin

42

7

8

5.3.

HPLC (normální fáze)

Na kolonu byly vstříknuty pouze vzorky po extrakci dichlormethanem a po extrakci na pevnou fázi. Ani v jednom případně nebyly na chromatogramu vidět žádné velké píky. Z toho lze usuzovat, že extrakční činidlo nebylo vhodně zvoleno. Další možností je, že metoda není účinná a látky nejsou na koloně zachycovány nebo jsou velmi pevně vázány stacionární fází. Stejně jako u HPLC s reverzní fází měl být na kolonu nanesen i vzorek gentamicinu. To se však bohužel nepodařilo z důvodu vzniku sraženin během ředění acetonitrilem. Tyto sraženiny mohly být způsobeny nějakou pomocnou látkou v injekčním roztoku gentamicinu (sodná sůl kyseliny edetové, methylparaben, propylparaben, disiřičitan sodný).[30] Vhodným řešením by bylo rozpustit práškový gentamicin ve vhodném rozpouštědle. Problémem je však jeho polarita a fakt, že je gentamicin například prakticky nerozpustný v ethanolu, chloroformu a etheru. [31]

43

6. Závěr Cílem této práce bylo najít látky strukturně blízké gentamicinu, které mají volnou primární aminoskupinu pro navázání fluoreskaminu. Aby byly vzorky zbaveny velkého množství cukru, bylo k nim nejprve přidáno rozpouštědlo a došlo tak k extrakci látek. Na chromatogramu bylo možné pozorovat jeden pík, což by mohla být extrahovaná látka z medu. Jeho velikost byla ale velmi malá, ať už vzorek obsahoval fluoreskamin či nikoliv. Jako porovnávací vzorek byl zvolen gentamicin. Výška jeho píku byla mnohem větší po přidání fluoreskaminu. Vzorek látek, které byly extrahované z medu, i gentamicin byly vstříknuty do HPLC jednotlivě při různých měřeních. Nepřítomnost velkých píků u medu lze vysvětlit neúspěšnou extrakcí nebo nevhodnými podmínkami pro separaci. Tudíž mohlo například dojít k tomu, že látky nebyly vůbec zachyceny na koloně nebo naopak byly na ni velmi silně vázány. Odpověď na detektoru byla přibližně stejná i po změně procentuálního složení mobilní fáze, vlnových délek (excitační i emisní) i stacionární fáze. Poté byla kolona s reverzní fází vyměněna za kolonu s normální fází, ale na chromatogramu nebyla zaznamenána žádná změna. Studie, které se zabývaly složením medu a používaly jako metodu HPLC s reverzní fází, zvolily většinou jiný typ detektoru, než byl používán v této práci. A stejně je tomu i v případě mobilní fáze, která byla vybrána na základě zkušeností laboratoře. Mimo separaci látek pomocí HPLC byla vyzkoušena i metoda TLC. Během této metody byly na destičku aplikovány nejprve vzorky po extrakci dichlormethanem a posléze i ethylacetátem. Nebyly ale pozorovány žádné fluorescentní skvrny. Ty byly spatřeny až v případě, že vzorky medu byly rozpuštěny ve vodě nebo methanolu. Tyto skvrny byly v obou případech (po rozpuštění ve vodě i methanolu) vidět při vlnové délce 254nm i 356nm, neměly jednotné zbarvení ani intenzitu a navíc je bylo možné pozorovat jak po derivatizaci tak bez ní. Do budoucna je důležité najít nějakou vhodnou metodu, pomocí které by byl vzorek medu zbaven cukru, aby mohl být poté přímo (bez extrakce) aplikován do HPLC s reverzní fází. Velké množství sacharidů totiž může maskovat jiné píky. Otázkou ale zůstává, zda by během tohoto čištění vzorku nebyly odstraněny i hledané látky. Dále by stálo za uvážení, zda se nepokusit analyzovat med za stejných podmínek, jaké jsou uvedeny v Českém lékopise 2009 u gentamicinu, pokud se předpokládá struktura jemu podobná.

44

V dalších pokusech bych nepoužívala nadále fluorescenci jako způsob detekce, jelikož se nejedná o příliš specifickou vlastnost a to především z toho důvodu, že mnoho látek různé struktury fluoreskuje. Otázkou také zůstává, zdali zjištění, že všechny testované medy přirozeně fluoreskují, nějak souvisí s původním cílem. Tedy najít látky, které by mohly být produkty Maillardovy reakce. Několik studií se totiž zabývalo tím, že během Maillardovy reakce dochází ke vzniku fluoreskujících látek. Pro více informací je nezbytné tyto látky separovat, identifikovat je a poté je podrobit antibakteriálním testům.

45

7. Citovaná literatura [1]

J. Hartl, M. Doležal, M. Miletín, V. Opletalová a P. Zimčík, Farmaceutická chemie IV. Praha, 2008, 166 stran.

[2]

T. Eteraf-Oskouei a M. Najafi, “Traditional and Modern Uses of Natural Honey in Human Diseases: A Review,” Iran. J. Basic Med. Sci., 2013, vol. 16, no. 6, stránky 731–742.

[3]

S. Matiacevich a M. Pilarbuera, “A critical evaluation of fluorescence as a potential marker for the Maillard reaction,” Food Chem., 2006, vol. 95, no. 3, stránky 423–430.

[4]

C. Delgado-Andrade, J. A. Rufián-Henares a F. J. Morales, “Study on fluorescence of Maillard reaction compounds in breakfast cereals.,” Mol. Nutr. Food Res., 2006, vol. 50, no. 9, stránky 799–804.

[5]

L. Bosch, A. Alegria, R. Farre a G. Clemente, “Fluorescence and color as markers for the Maillard reaction in milk–cereal based infant foods during storage,” Food Chem., 2007, vol. 105, no. 3, stránky 1135–1143.

[6]

F. J. Morales a M. A. J. S. Van Boekel, “A Study on Advanced Maillard Reaction in Heated Casein / Sugar Solutions : Fluorescence Accumulation,” 1998, vol. 6946, no. 97, stránky 675–683.

[7]

“Gentamicin Sulfate, chemical structure, molecular formula, Reference Standards.” [Online] Srpen 2014. http://www.newdruginfo.com/pharmacopeia/usp28/v28230/usp28nf23s0_m3485 0.htm.

[8]

“Fluorimetric Protein Quantification Using the Reactive Compound Fluorescamine.” [Online] Srpen 2014. http://www.biotek.de/de/resources/articles/fluorimetric-quantitation-proteinfluorescamine.html.

[9]

D. W. Ball, “The Chemical Composition of Honey,” J. Chem. Educ., 2007, vol. 84, no. 10.

[10]

“Med.” [Online] Srpen 2014. http://www.vcelky.cz/med.htm.

[11]

V. León-Ruiz, A. V González-Porto, N. Al-Habsi, S. Vera, M. P. San Andrés a P. Jauregi, “Antioxidant, antibacterial and ACE-inhibitory activity of four monofloral honeys in relation to their chemical composition.,” Food Funct., 2013, vol. 4, no. 11, stránky 1617–24.

[12]

S. K. Jaganathan, B. Arunpandian, M. V. Vellayappan, A. K. Manjesh, A. Priyadarshini, A. John, E. Supriyanto, S. I. A. Razak a M. Marvi, “A Review on Antiproliferative and Apoptotic Activities of Natural Honey.,” Anticancer. Agents Med. Chem., 2014.

[13]

M. D. Mandal a S. Mandal, “Honey: its medicinal property and antibacterial activity.,” Asian Pac. J. Trop. Biomed., 2011, vol. 1, no. 2, stránky 154–60.

46

[14]

O. O. Erejuwa, S. A. Sulaiman a M. S. A. Wahab, “Fructose might contribute to the hypoglycemic effect of honey.,” Molecules, vol. 17, 2012, no. 2, stránky 1900–15.

[15]

J. Ferrier, “Etude de l’effet antibactérien de différents miels pyrénéens,” Montpellier, 2010.

[16]

P. H. S. Kwakman a S. A. J. Zaat, “Antibacterial components of honey.,” IUBMB Life, 2012, vol. 64, no. 1, stránky 48–55.

[17]

C. J. Adams, C. H. Boult, B. J. Deadman, J. M. Farr, M. N. C. Grainger, M. Manley-Harris a M. J. Snow, “Isolation by HPLC and characterisation of the bioactive fraction of New Zealand manuka (Leptospermum scoparium) honey.,” Carbohydr. Res., 2008, vol. 343, no. 4, stránky 651–9.

[18]

P. Klouda, Moderní analytické metody. Ostrava: Pavel Klouda, 2003, 132 stran, ISBN: 978-80-86369-07-5.

[19]

L. Nováková a M. Douša, Moderní HPLC separace v teorii a praxi I. Praha: Europrint a.s., 2013, 299 stran, ISBN: 978-80-260-4243-3.

[20]

“HPLC.” [Online] Červenec 2014. http://web.natur.cuni.cz/~pcoufal/hplc.html.

[21]

S. H. University, “Chromatography.” [Online] Červenec 2014. http://teaching.shu.ac.uk/hwb/chemistry/tutorials/chrom/chrom1.htm.

[22]

P. Kovaříková a J. Stariat, “Kurz: Využití vysokoúčinné kapalinové chromatografie ve farmaceutické analýze.” [Online] Červenec 2014. http://dl1.cuni.cz/course/view.php?id=2904#L1.

[23]

L. Nováková a M. Douša, Moderní HPLC separace v teorii a praxi II. Praha: Europrint a.s., 2013, 235 stran, ISBN: 978-80-260-4244-0.

[24]

Y. Kazakevich a R. LoBrutto, Eds., HPLC for Pharmaceutical Scientists. 2007, Hoboken, NJ, USA: John Wiley & Sons, Inc.

[25]

“Thin Layer Chromatography, TLC; Paper Chromatography, PC.” [Online] Červenec 2014. http://www.vscht.cz/ktk/www_324/lab/texty/ana/TLC2.pdf.

[26]

J. Klimeš a kolektiv, Kontrolně-analytické hodnocení léčiv lékopisnými metodami. 2011, Hradec Králové: Nucleus HK, 136 stran, ISBN: 978-80-8700929-1.

[27]

“Chromatografie – WikiSkripta.” [Online] Srpen 2014. http://www.wikiskripta.eu/index.php/Chromatografie.

[28]

R. Koplík, “Bílkoviny a aminokyseliny.” [Online] Srpen 2014. http://web.vscht.cz/~koplikr/Bílkoviny a aminokyseliny.pdf.

[29]

“|HPLC.CZ|Derivatizace-HPLC-aminy.” [Online] Srpen 2014. http://www.hplc.cz/Der/amin_FL_4.htm.

47

[30]

“GENTAMICINE PANPHARMA 80 mg sol inj - Vidal.fr.” [Online] Srpen 2014. http://www.vidal.fr/Medicament/gentamicine_panpharma-7479.htm.

[31]

Kolektiv autorů, Český lékopis 2009. Praha: Grada Publishing a.s., 2009.

48

8. Přílohy

8.1.

Obrázky

Obr. 1. Průměrné složení medu

15

Obr. 2. Separační proces

21

Obr. 3. Kvalitativní charakteristiky chromatografického procesu

22

Obr. 4. Schéma kapalinového chromatografu

23

Obr. 5. Plošná kapalinová chromatografie před a po vyvíjení

25

Obr. 6. Záznam ze 4 chromatogramů ve velkém měřítku

37

Obr. 7. Záznam ze 4 chromatogramů v malém měříku

37

Obr. 8. Vzorky medu rozpuštěné v MeOH pod UV o 254nm (bez postřiku F)

41

Obr. 9. Vzorky medu rozpuštěné v MeOH pod UV o 254nm (po postřiku F)

41

Obr. 10. Vzorky medu rozpuštěné v MeOH pod UV o 356nm (po postřiku F)

42

49

8.2.

Tabulky

Tab. 1. Příklady metod založených na rovnovážné distribuci složek mezi plyn a jinou fázi

19

Tab. 2. Příklady metod založených na rovnovážné distribuci složek bez plynné fáze 19 Tab. 3. Testované vzorky medu

27

Tab. 4. Popisky k obr. 6 - 8

42

50