Mikrobiologické aspekty medu

Masarykova univerzita Lékařská fakulta

Mikrobiologické aspekty medu Bakalářská práce v oboru Nutriční terapeut

Vedoucí bakalářské práce:

Autor:

RNDr. Danuše Lefnerová, Ph.D.

Libor Pazdera

Brno, květen 2014

Jméno a příjmení autora: Libor Pazdera Studijní obor: Nutriční terapeut Název bakalářské práce: Mikrobiální aspekty medu Vedoucí bakalářské práce: RNDr. Danuše Lefnerová, Ph. D. Počet stran: 79 Počet příloh: 1 Rok obhajoby bakalářské práce: 2014

Anotace Bakalářská práce se zabývá mikrobiologickými aspekty medu. Teoretická část se zabývá fyzikálními, chemickými i biologickými vlastnostmi medů včetně jejich kontaminace. Praktická část zahrnuje zhodnocení a porovnání mikrobiologické kontaminace medů medovicových a květových, dále medů koupených v obchodním řetězci a medů koupených u maloprodejců. Byly stanovány celkové počty mikroorganismů, anaerobní sporulující bakterie, koliformní bakterie, bakterie Escherichia coli, kvasinky a mikroskopické vláknité houby, bakterie Bacillus cereus a bakterie Staphylococcus aureus. Klíčová slova: med, mikrobiologie, medovicový med, květový med, kojenecký botulismus, mikrobiální biofilm, mikrobiální aktivita

Annotation The bachelor thesis deals with the microbiological aspects of honey. The theoretical part deals with the physical, chemical and biological properties of honey, including contamination. The practical part includes the evaluation and comparison of microbiological contamination of honeydew honey and floral honey, honey bought in chain store and honey bought from retailers. They were camp total numbers of microorganisms, anaerobic spore-forming bacteria, coliform bacteria, Escherichia coli, yeast and microscopic filamentous fungi, Bacillus cereus and Staphylococcus aureus. Key words: honey, mikrobiology, honeydew honey, floral honey, infant botulism, microbiological biofilm, microbiological activity

Prohlášení Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci vypracoval samostatně pod vedením RNDr. Danuše Lefnerové, Ph. D., a že jsem v seznamu uvedl všechny použité literární a odborné zdroje. Souhlasím, aby práce byla půjčována ke studijním účelům a byla citována dle platných norem.

V Brně dne ..............................

Podpis....................................

Poděkování Rád bych poděkoval RNDr. Danuši Lefnerové, Ph. D. za odborné vedení diplomové práce, cenné rady, věcné připomínky a vstřícnost při konzultacích. Dále bych chtěl poděkovat paní asistentce Janě Chaloupkové za pomoc v laboratoři. Nemalé díky bych chtěl věnovat včelařům, kteří mi poskytli vzorky medu.

OBSAH Teoretická část ..................................................................................................... 8 1.

Úvod............................................................................................................ 8

2.

Historie medu ............................................................................................ 9

3.

Definice medu .......................................................................................... 11

4.

Členění medu ........................................................................................... 12

5.

Charakteristika jednodruhových medů................................................ 14

6.

Fyzikální vlastnosti medu ....................................................................... 16

7.

Chemické složení medu .......................................................................... 18 7.1

Voda........................................................................................................ 19

7.2

Sacharidy ................................................................................................ 19

7.3

Dusíkaté látky ......................................................................................... 21

7.4

Tukové látky ........................................................................................... 23

7.5

Vitaminy ................................................................................................. 23

7.6

Minerální látky ....................................................................................... 24

7.7

Kyseliny .................................................................................................. 24

7.8

Aromatické látky .................................................................................... 25

7.9

Barviva.................................................................................................... 25

7.10 Hormony ................................................................................................. 26 7.11 Hydroxymethylfurfural (HMF) .............................................................. 26 Chemická kontaminace .......................................................................... 27

8. 8.1

Pesticidy.................................................................................................. 27

8.2

Léčiva ..................................................................................................... 27

8.3

Jedovaté medy ........................................................................................ 28

9.

Mikrobiální kontaminace ....................................................................... 29

10.

Mikrobiální aktivita medu ..................................................................... 34

11.

Mikrobiální biofilm ................................................................................. 36

12.

Kojenecký botulismus ............................................................................. 38

10.

Med ve výživě a zdraví............................................................................ 40

11.

Med falšování........................................................................................... 42

Praktická část .................................................................................................... 44 12.

Metodika a materiál ................................................................................ 44

12.2 Testované druhy medů ........................................................................... 44 17.2 Používané druhy půd a roztoků .............................................................. 46 17.3 Laboratorní vybavení a pomůcky ........................................................... 49 17.4 Metodika ................................................................................................. 50 17.5 Stanovení celkového počtu mikroorganismů ......................................... 50 17.6 Stanovení počtu anaerobních sporulujících bakterií .............................. 50 17.7 Stanovení počtu koliformních bakterií ................................................... 51 17.8 Stanovení počtu bakterií Escherichia coli .............................................. 51 17.9 Stanovení počtu kvasinek a mikroskopických vláknitých hub .............. 51 17.10 Stanovení počtu bakterií Bacillus cereus ............................................... 52 17.11 Stanovení počtu bakterií Staphylococcus aureus ................................... 52 17.12 Odečítání výsledků ................................................................................. 52 18.

Výsledky ................................................................................................... 54

18.1 Hodnocení celkového počtu mikroorganizmů ....................................... 54 18.2 Hodnocení počtu anaerobních sporulujících bakterií ............................. 56 17.3 Stanovení počtu koliformních bakterií ................................................... 58 17.4 Stanovení počtu bakterií Escherichia coli .............................................. 60 17.5 Stanovení počtu kvasinek a mikroskopických vláknitých hub .............. 62 18.6 Stanovení počtu bakterií Bacillus cereus ............................................... 64 17.7 Stanovení počtu bakterií Staphylococcus aureus ................................... 66 19.

Diskuze ..................................................................................................... 68

20.

Závěr......................................................................................................... 71

Seznam literatury .............................................................................................. 72 Seznam tabulek.................................................................................................. 76 Seznam obrázků ................................................................................................ 77 Příloha ................................................................................................................ 78

TEORETICKÁ ČÁST 1. ÚVOD Med je přírodním produktem, který je konzumován po mnohá staletí. Velké díky můžeme vzdát pouze a jenom včelám, které ho produkují. Je jedinečný oproti ostatním živočišným produktům, jelikož vzniká díky koordinovanosti včel. Jedna včela není schopna med vyprodukovat. Nektar či medovice prochází mnoha procesy, na jejímž konci je unikátní produkt med. Med není jednotvárným produktem díky působení mnoha faktorů, díky odlišnosti prvotní suroviny. Med květový pochází z nektaru květin, med medovicový z medovice hmyzu. Odlišnosti můžeme najít ve fyzikálních, chemických i biologických vlastnostech. Je možno se i setkat s medy jednodruhovými, které mají také své charakteristické vlastnosti. Med je potravinou, ale má také příznivé dietetické a léčivé vlastnosti. Bohužel jako ostatní produkty, může být často falšován. Jako při výrobě a vzniku ostatních produktů, může být i med kontaminován různými mikroby. To jak během jeho vzniku v úlu, tak při jeho zpracování včelařem. Med je znám jako

potravina,

která

má

vysokou

antimikrobiální

aktivitu,

která

med

chrání

před mikrobiologickou zkázou. Zpravidla tedy u medu nehrozí riziko nakažení či otravy. Předmětem mikrobiologického zkoumání se stal až díky nemocnosti na kojenecký botulismus. Je důležité med testovat na jednotlivé mikrobiální činitele včetně bakterie Clostridium botulinum způsobující kojenecký botulismus. V praktické části byly jednotlivé medy testovány na celkové počty mikroorganismů, anaerobní sporulující bakterie, koliformní bakterie, bakterie Escherichia coli, kvasinky a mikroskopické vláknité houby, bakterie Bacillus cereus a bakterie Staphylococcus aureus.

8

2.

HISTORIE MEDU Kdy člověk začal využívat med, nemůžeme zcela jistě říci, avšak existují jisté kresby

a malby, které nám mohou pomoci nastínit tuto dobu. Nejstarší nález pochází z doby paleolitické (před 15 000 lety). V této době vznikla kresba, na které můžeme vidět dvě postavy vybírající med včelstvu, které je usazeno nejspíše ve skalní dutině. Při podrobném zkoumání kresby na ní můžeme rozpoznat žebřík, nádobu a pravděpodobně i kouř. Tento výtvarný poklad, který nám naznačuje historii medu, byl nalezen v Pavoučí jeskyni (Cueva de la Arana) nacházející se u vesnice Bicorp blízko Valencie ve Španělsku. Včely jako domácí zvířata se začaly chovat před 8 000 lety, což dosvědčují jeskynní malby po celém světě. Jsou jisté předpoklady, že skot jako domácí zvíře začal člověk využívat až mnohem později. Díky těmto uměleckým dílům můžeme říci, že člověk již v těchto dobách znal vyspělý způsob sběru medu i včelaření a med patřil k jeho základním potravinám (1, 2). Staří Egypťané věřili, že včely jsou oživlé slzy boha slunce Ra. Med byl považován za pokrm bohů a lidé jej využívali při všemožných náboženských rituálech a obřadech. Kromě rituálů med sloužil jako potravina, součást kosmetických přípravků a obchodní artikl. Roje včel zachytávaly do nádob, které poté přenášeli do chrámů, kde o ně pečovali kněží. Vlastnit a využívat med však bylo výsadou bohatých a mocných. Ti jej využívali i pro jejich poslední cestu. Med byl dáván do malých vzduchotěsných nádob, které byly po té vloženy do hrobek faraónů a členů jeho rodiny. V dnešní době byl nalezen med v Egyptských pyramidách, který byl sice zkrystalizovaný, ale hygienicky zdravotně nezávadný neboli poživatelný (1–3). I ostatní kultury a náboženství se zabývaly včelami a jejich lahodnými produkty. V bibli se nachází asi 300 zmínek o medu. Med je zde představován jako zdraví prospěšná a léčivá potravina. V druhé knize Mojžíšově je napsáno: „Půjdete do země oplývající mlékem a medem. Já však nepůjdu uprostřed vás, abych vás cestou nevyhubil, neboť jste lid tvrdošíjný“ (Druhá kniha Mojžíšova – exodus, kapitola 33, verš 3). V tomto verši má Mojžíš zavést Izraelity do země zaslíbené. Mléko a med upřesňuje, že v zemi zaslíbené bude dostatek potravin. V koránu se med zmiňuje dokonce častěji než v bibli. Je zde představen jako rituálně čistá potravina, a proto se stal důležitou součástí arabské kuchyně. Odtud pochází známý a velmi oblíbený marcipán. Můžeme usoudit, že med se dotkl všech kultur a náboženství (2–5).

9

Ve středověku lidé využívali divoké včely žijící v dutých kmenech stromů, neboli brtích. Tato fáze včelařství se nazývá lesní nebo brtnická. Později se včely chovaly v blízkosti obydlí v uříznutých vydlabaných kmenech nebo špalcích, které stály buď kolmě – stojany nebo vodorovně – ležany. Často byly umělecky vyřezávané a zdobené do podoby různých figurín. Tuto fázi včelařství nazýváme rolnickou. Nejstaršími českými psanými pravidly včelařských cechovních spolků jsou Artikule včelařské, které jsou napsány v Litomyšlské knize smluv v letech 1570 až 1578. Po 30leté válce nastal úpadek včelařství z důvodu úbytku venkovského obyvatelstva, dále sníženou poptávkou po vosku díky reformačním změnám při bohoslužbě a v neposlední řadě medovinu utlačilo pivo a víno (6). Med byl odjakživa jediným sladidlem jídel a nápojů na území Evropy do té doby, než se objevil cukr. Evropané se s ním sice seznámili během křížových výprav, kdy ho dováželi benátští obchodníci spolu s orientálním kořením, jenže se na něj pohlíželo jako na luxus a lék. Na konci 16. století ve vyšších vrstvách cukr zcela vystrnadil med z kuchyní výše postavených občanů. Jelikož import třtinového cukru byl stále drahý, hledala se vhodná alternativní rostlina. V polovině 18. století se poprvé podařilo vyprodukovat cukr z domácí plodiny, bílé krmné řepy. V roce 1801 byl ve Slezsku slavnostně otevřen první cukrovar na světě, jež produkoval cukr z cukrové řepy. Díky tomu se cukr stal mnohem dostupnějším zbožím i pro nižší vrstvu. Produkce cukru se ukázala jako mnohem jednoduší a stabilnější než produkce medu, jelikož včely nereagují dobře na velké klimatické či ekologické změny. Další výhodou cukru je, že dodává čistě sladkou chuť, na rozdíl od medu, který má navíc svou vlastní chuť, která je ovlivněna obdobím a typem rostlin, odkud je sbírán (2, 7). Novodobá historie českých včelařů se vyznačuje rozmachem výzkumu a vzdělávání. Organizace českých a moravských včelařů se dostala na mnohem vyšší úroveň. Byly založeny dva spolky: Moravský včelařský spolek (1868) a Včelařský spolek pro Čechy (1873). Včelařství se dostalo do škol a to jak na odborné školy, tak i na vysoké školy v Praze i v Brně. Roku 1919 byl založen Výzkumný ústav včelařský v Praze, nyní sídlící v Dole u Libčic nad Vltavou. Díky němu je zajištěn základní i aplikovaný výzkum jak v boji proti nemocem včel, tak v šlechtění. Po takzvané „zlaté době včelařství v 80. létech“, nastal v 90. létech prudký pokles včelstev. Tento pokles v sobě skrývá mnoho hlubších příčin: nedostatek zájemců o obor, nepřipravenost včelařů na ekonomické podmínky a nová nemoc – varroáza. V současné době se může pyšnit české včelařství vysokou úrovní. Počty včelstev začaly zase stoupat a tak jejich činnost bude moci pomoct jak zemědělcům, tak i medu jako potravině, aby ho bylo dostatek jak pro domácí spotřebu, tak pro export (1, 6). 10

3.

DEFINICE MEDU V našich předpisech se definuje med jako potravina

přírodního

sacharidového

charakteru, složená převážně z glukosy, fruktosy, organických kyselin, enzymů a pevných částic zachycených při sběru sladkých šťáv květů rostlin (nektar), výměšků hmyzu na povrchu rostlin (medovice), nebo na živých částech rostlin včelami (Apis mellifera), které sbírají, přetvářejí, kombinují se svými specifickými látkami, uskladňují a nechávají dehydratovat a zrát v plástech (8). Dokument Codex aliementarius, mezinárodní legislativa pro celosvětové obchodování s medem, definuje med jako přírodní sladkou substanci, produkt vytvořený ze sesbíraného květního nektaru nebo sekretů z živých částí rostlin nebo sekretů z rostlin sajícího hmyzu včelami, přeměněn zkombinováním se speciálními látkami jejich vlastními, který je dále vyložen, dehydrován, uschován a ponechán v medových plástech k uležení a uzrání (9).

11

4.

ČLENĚNÍ MEDU Podle již výše zmíněné vyhlášky č. 76/2003 Sb. se medy člení dle této osnovy: a) podle původu, 1. květový - med pocházející zejména z nektaru květů, 2. medovicový - med pocházející zejména z výměšků hmyzu (Hemiptera) sajícího z rostlin na živých částech rostlin nebo ze sekretů živých částí rostlin b) podle způsobu získávání a úpravy, 1. vytočený - med získaný odstřeďováním odvíčkovaných bezplodových plástů 2. plástečkový - med uložený a zavíčkovaný včelami do bezplodových plástů čerstvě postavených na mezistěnách vyrobených výhradně ze včelího vosku nebo bez nich a prodávaný v uzavřených celých plástech nebo dílech takových plástů 3. lisovaný - med získaný lisováním bezplodových plástů za použití mírného ohřevu do 45 °C nebo bez použití tepla 4. vykapaný - med získaný vykapáním odvíčkovaných bezplodových plástů 5. med s plástečky - med, který obsahuje jeden nebo více kusů plástečkového medu 6. filtrovaný - med, který byl po získání upraven odstraněním cizích anorganických nebo organických látek takovým způsobem, že dochází k významnému odstranění pylu 7. pastový - med, který byl po získání upraven do pastovité konzistence a je tvořen směsí jemných krystalů (8). Ve vyhlášce při členění medu podle původu chybí med smíšený (květomedovicový),

jelikož oba typy medů mohou obsahovat vždy i příměs druhé skupiny medů. Dále může být med označen jako bio (v některých zemích organic). V tomto případě musí ekologicky včelařit. Takový včelař může být v jednom z chovatelských spolků, které mají různě přísné směrnice pro dosažení kvality bio. Patří mezi ně například Démétér, Bioland, Naturland, Biokreis či EG-Öko-Verordnung. V nedávné době se na českém trhu začal objevovat pojem 12

panenský med. Tento med je vytočen z panenského plástu, tedy z plástu, kde před vytočením nebyla odchována ani jedna generace plodu. Existují však i značení matoucí, jako med získávaný za studena. V dnešní době se však ve včelařství získávání medu za tepla nedělá kvůli následnému vyššímu obsahu hydroxymethylfurfuralu (HMF). Další matoucí označení je pasterizovaný med. Pasterizace je silné ohřátí na krátkou dobu, které se využívá zejména v mlékárenských technologiích ke zničení nežádoucích mikroorganismů. U medu se však z pravidla žádné mikroorganismy ničit nemusí. Ve vyhlášce je i zmíněn med, který je označen jako pekařský. Tento med není určen k přímé spotřebě většinou kvůli nevyhovující normě HMF či vysokému obsahu vody a nízké aktivitě enzymů. Registrovaná ochranná známka Český med, znamená, že včelař je členem Českého svazu včelařů a jeho med splňuje kritéria svazové normy jakosti. Toto označení vzniklo proto, že český med často dosahuje lepších kvalit, než jsou pro něj stanovené normy z české vyhlášky (10–13).

13

5.

CHARAKTERISTIKA JEDNODRUHOVÝCH MEDŮ Existuje obrovské množství různých jednodruhových medů od pomerančového

přes eukalyptový, borůvkový až po levandulový. Jednotlivé medy jsou vzájemně podobné i od sebe odlišné v mnoha vlastnostech. Proto jsem se zaměřil pouze na několik druhů (3, 6). Med řepkový je z pravidla jeden z prvních vytočených medů sezóny. Díky velkým plochám pěstované řepky olejky se ho na našem území vyskytuje hodně. Často bývá s příměsí ovocných stromů, trnek či jarních bylin. Má vysoký obsah glukosy, díky čemuž rychle krystalizuje. Je bohatý na pyl. Barvu má bílou až světle žlutou. Chuť, která je jemně aromatická, se v posledních letech nápadně zlepšila díky zavedení bezerukových odrůd olejky. V medu nacházíme takzvané brassiny, které mají protirakovinné účinky. Často se pastuje a je dodáván do nemocnic a rekreačních zařízení (6, 7, 12). Med akátový oproti medu řepkovému má vysoký podíl fruktosy, takže krystalizuje minimálně a tekutý vydrží několik let. Je vodojasný až lehce nažloutlé barvy se zelenou opalescencí. Chuť je silně sladká s typickým přívětivým aromatem. Díky tekutosti se hodí k prodeji v tubách či dózách. Má nejnižší hodnoty elektrické vodivosti i nejnižší aktivitu enzymů z medů. Z celkové medné produkce v ČR má produkce akátového medu podíl 20 %, což je však pro mednou produkci světa zanedbatelné, jelikož hlavními producenty jsou Maďarsko, Rumunsko a Bulharsko (6, 12). Medy medovicové se nedají přesně dělit na jednotlivé druhy jako medy nektarové, u kterých se dělí dle nektaru jednoho druhu rostlin. Dělení medovicových medů je závislé více na producentech, které zpravidla žijí na stejném druhu dřevin. V dnešní době se však rozlišují jen podle barvy, což není zcela dostatečné hledisko. Všeobecně lze říci, že mají tmavší barvu. Medy smrkové mají barvu hnědočervenou, medy jedlové barvu hnědozelenou a dubové medy mají barvu jednu z nejtmavších. Další jejich vlastností je, že zůstávají dlouho tekuté (kromě cementových medů s obsahem melecitosy). Snadno absorbují vzdušnou vlhkost, což vede k snadnějšímu kvašení medů. Chuť mají harmonickou, někdy více kořeněnou z důvodu vyššího obsahu minerálních látek a menší kyselosti. Zajímavostí je, že obsah fytoncidů z rostlinné šťávy jehličnatých stromů vykazuje vyšší brzdící vliv na mikroorganismy zodpovědné za záněty dýchacích cest. Medovicové medy však často bývají smíšené s medy nektarovými kvůli různým lesním komplexům (6, 12, 14, 15).

14

Zajímavostí u lipového medu je, že je to směs medu z nektaru i medovice lípy, jelikož na lípě se objevuje obojí. Barva je žlutá s nazelenalým nádechem, s převahou medovice až oranžová. Lahodně voní i chutná po mentholu. Objevuje se vzácně, jelikož není velké množství lesů s převahou lip. Dále také pro výnosnější tvorbu nektaru, potřebuje lípa specifické počasí (6, 12, 14). Z thixotropických medů, můžeme uvést med vřesový. Jeho rosolovitá konzistence mícháním ztekutí, avšak ne na dlouhou dobu. Díky této konzistenci se v něm nachází vzduchové bubliny. Barvu má zlatohnědou až červenohnědou. Chuť i vůni má charakteristicky silně kořeněnou. Obtížné je jeho vytočení jako u všech thixotropických medů. Vřesový med má vysoký obsah vody, vysoký obsah enzymů a díky vyššímu obsahu pylu vyšší obsah bílkovin a také koloidních látek. Je to jeden z nejbohatších medů na biologicky aktivní látky, proto se mu připisují léčivé účinky na nemoci močových cest a trávicí soustavy včetně dutiny ústní (6, 7, 12). Módním hitem je med pohankový. Připisují se mu antisklerotické účinky. Přisuzuje se mu, že je to jeden z nejléčivějších medů. Jelikož se pohanka přestala pěstovat jako potravina před půl stoletím a renesanci zažívá až v posledních letech, je po tomto medu vysoká poptávka převažující nabídku. Při krystalizaci má řídkou nevzhlednou konzistenci s usazenými hrubými krystaly na dnu. Zbarvení má červenohnědé. Pohankový med je silně aromatický a jeho chuť může někomu dělat problémy, jelikož někdy připomíná naftu a myšinu. Kdysi se k nám dovážel med ze Sibiře, který měl velký podíl medu pohankového, což způsobilo neprodejnost tohoto medu. Intenzivní aroma tohoto medu však není na závadu při výrobě perníků a medoviny (3, 6, 11, 12, 14).

15

6.

FYZIKÁLNÍ VLASTNOSTI MEDU Hustota medu je důležitou fyzikální vlastností pro stanovení obsahu vody.

Je to hmotnost medu na jednotku jeho objemu. Na hustotu medu má vliv hlavně obsah vody, ale také jeho složení (tento vliv však opomíjíme). Specifická hmotnost medu (při 20°C) se pohybuje mezi 1,4457 g.ml-1 (obsah vody 13 %) a 1,3950 g.ml-1 (obsah vody 21 %). Prakticky v přepočtu 1 litr medu váží průměrně 1,4 kg. Hustotu měříme pyknometricky. Pro kontrolu kvality medu změříme 100 ml v odměrném válci a dle tabulky můžeme zjistit obsah vody (12, 14). Obsah vody se však přesněji stanovuje refraktometricky, tedy měřením indexu lomu. Index lomu (nD) je závislý jak na obsahu vody, tak na teplotě. Med se měří při teplotě 20 °C (stanovování obsahu vody) a 40 °C (stanovování sušiny med) (11, 14). Chemické a fyzikální požadavky uvedené v příloze č. 3 ve vyhlášce č. 76/2003 nařizují maximální obsah vody pro med květový i medovicový 20 %, pro med pekařský 23 %. Požadavkem Českého svazu včelařů pro udělení známky český med, je mít obsah vody pod 19% (8, 13). Díky nízkému povrchovému napětí med pronikne těmi nejmenšími skulinami a netěsnostmi v obalu. Tato vlastnost je však pozitivní pro kosmetický průmysl, jelikož med proniká přes póry pokožky. Povrchové napětí se mění v závislosti na původu medu, jelikož zřejmě souvisí s obsahem koloidů. Může také za tvorbu pěny na povrchu medu spolu s vysokou viskozitou. V této pěně se nachází bílkoviny, pylová zrna a nečistoty jako kousky vosku a košilek (11, 16). Krystalizace je přirozená fyzikální vlastnost medu, kdy nenarůstá množství cukru v medu, ani v něm neprobíhají žádné chemické reakce. Naopak různě obohacované medy nekrystalizují či krystalizace neprobíhá typickým způsobem. Med je ve skutečnosti přesycený roztok cukrů, což znamená, že obsahuje větší množství cukru, než je schopno se rozpustit. Obsah fruktosy k ostatním cukrům zásadně ovlivňuje krystalizaci, čím je jí víc, tím med zůstane déle tekutý. Krystalizace probíhá z pravidla nejrychleji při 15 °C (1, 12). Právě vytočený med se chová jako viskózní kapalina, přičemž viskozita závisí na mnoha různých faktorech. Mezi tyto faktory patří teplota, obsah vody ale i chemické složení, tedy botanický původ medu. Viskozita medu je důležitá, protože ovlivňuje technologické procesy medobraní. Viskozita medu je vysoká. To znamená, že je 10 000krát 16

větší než viskozita vody, tedy stejnou trubkou proteče 10 000krát pomaleji než voda (1, 12, 14). Existují medy, které mají jiný typ viskozity a řadí se mezi nenewtonovské kapaliny. U některých medů můžeme sledovat thixotropické vlastnosti. Thixotropie je časově závislé tokové chování, při kterém viskozita v důsledku nepřetržitého mechanického namáhání klesá, po přerušení dochází k opětovnému vzrůstu viskozity. V praxi to znamená, že při míchání vřesového medu, který má konzistenci rosolovitou, se ztekutí. Pokud míchat přestaneme, vrátí se časem do původní podoby. Naopak například medy nigerijské z opuncie vykazují vlastnosti diletantní. Při dilatanci nastává náhlý vzrůst viskozity zvýšením mechanického napětí. Tedy tyto medy se mohou táhnout až ve 2 metrových nitkách a velice špatně se vytáčí (1, 14, 16–18). Neředěný med má velice nízkou až neměřitelnou elektrickou vodivost, proto se měří jako 20 % roztok ve vodě. Elektrická vodivost se liší u medovicových medů a medů květových. Proto je to jedno z kritérií klasifikace medu. Určená hranice je 80 mS, méně mají medy květové, více medovicové. Důvodem odlišnosti je zejména vyšší obsah minerálních látek v medech medovicových (11, 14). Hygroskopicita je schopnost látek pohlcovat i udržovat vodu. Med je hodně hygroskopický hlavně díky přítomnosti fruktosy. Pokud se med skladuje v prostředí s vysokou vzdušnou vlhkostí a není dobře uzavřen v nádobě, může začít na povrchu řídnout natolik, až začne kvasit. Další nevýhodou je, že s vlhkostí přijímá i pachy. Naopak při pečení perníků je tato vlastnost kladná, jelikož perník převezme tuto vlastnost a sníží sklon k vysychání. Naopak při skladování v příliš suchém prostředí může obsah vody v medu klesat. Za rovnovážnou relativní vlhkost vzduchu se považuje 56 až 59 %, v tomto rozmezí z pravidla med vodu nepřijímá ani nevydává (1, 11, 12, 14). Barva medu se odvíjí jak z botanického původu či stáří, tak ze způsobu zpracování a skladování. V medu se vyskytují barviva rostlinná, barviva pocházející od včely i barviva vzniklá chemickými reakcemi při zpracovávání a skladování medu. Škála barev medu se pohybuje od vodojasné přes tmavě žluté až po černé. Průhlednost ovlivňují drobné částečky, například pyl, který způsobuje opalescenci. Třídění medů podle barvy je však velice nepřesné. Zkrystalizované medy bývají vždy světlejší oproti tekutým, protože krystalky glukosy jsou čistě bílé. Proto zkrystalizovaný řepkový med může připomínat až sádlo. Mezinárodní obchodní deklarace barvy medu využívá stupnice dle Pfunda (11, 12, 14). 17

7.

CHEMICKÉ SLOŽENÍ MEDU Med se skládá z několika hlavních složek a velkého množství složek minoritních, které

se v něm vyskytují ve velmi malém množství. Díky rozvoji analytických metod jsme schopni popsat několik set jedinečných látek a mnoho dalších nepochybně čeká na detailnější objevení i prostudování. Tyto látky jsou často velice složité organické sloučeniny buď produkované rostlinami, vzniklé chemickými reakcemi či působením enzymů včel anebo úplně jinou cestou. Jejich účel často neznáme, ale předpokládá se, že určitou úlohu mají, když jejich producent vynaložil velké množství energie k jejich syntéze. Díky těmto často biologicky aktivním látkám se med odlišuje od cukru řepného a má mnohonásobně větší nutriční význam, než si mnoho konzumentů uvědomuje. (11) Tabulka č. 1: Průměrné složení medu (19) Složka

Průměrné množství

Průměrné množství

ve 100 g lučního medu

ve 100 g lesního medu

17,2 g

16,3 g

Fruktosa

38,2 g

31,8 g

Glukosa

31,3 g

26,1 g

Sacharosa

0,7 g

0,5 g

Ostatní disacharidy

5,0 g

4,0 g

Melecitosa

<0,1 g

4,0 g

Erlosa

0,8 g

1,0 g

Ostatní trisacharidy

0,5 g

3,0 g

Vyšší sacharidy

3,1 g

10,1 g

Aminokyseliny, proteiny

0,3 g

0,6 g

Minerální látky

0,2 g

0,9 g

Kyseliny

0,5 g

1,1 g

pH

3,9

5,2

Voda Monosacharidy

Disacharidy

Trisacharidy

18

7.1

VODA Obsah vody v medu patří mezi základní kritéria kvality. Obecně vodu obsahují

od 14 % do 23 %. Jak již bylo zmíněno, dle národní legislativy by med měl obsahovat maximálně 20 %. Ač se zdá, že med je hustá tekutina, tak se med považuje za poměrně suchou potravinou, díky níž je mikrobiálně stabilní. Medy s vyšším obsahem vody jsou často nezralé a podléhají fermentaci. Medy s obsahem vody pod 17,1 % prakticky nefermentují a jsou vhodné k dlouhodobému skladování (nezkazí se ani při hodnotách > 100 000 KTJ/g). U medů s vyšším obsahem vody (17,1 až 20 %) závisí na počtu buněk osmofilních kvasinek. Obsah vody závisí na vlhkosti v úlu, kde vzniká, na technologii medobraní i následném skladování. Jeho hodnoty se však liší i na původu medu. Například med vřesový obsahuje 19,2 až 26 % vody. Proto tyto druhy medů mají horní limit 23 % (1, 11, 20).

7.2

SACHARIDY Sacharidy představují největší podíl ze všech nutrientů, zaujímají 95 až 99 % obsahu.

Dvěma hlavními monosacharidy jsou převažující fruktosa a glukosa, které tvoří 85 až 95 % sušiny cukrů. Proto určují fyzikální i nutriční vlastnosti medu. Jelikož monosacharidy vznikají enzymatickou hydrolýzou sacharosy, vzniká ekvimolární směs D-fruktosy a D-glukosy nazývána invertní cukr. Během této reakce však mohou vznikat i stopová množství méně obvyklých oligosacharidů (1, 16). Dále bylo v medu identifikováno okolo 25 různých oligosacharidů. Z nich nejvíce zastoupená je maltosa, dále kojibiosa, turanosa a další. V medu se vyskytuje i sacharosa, jelikož nedochází vždy k úplné hydrolýze. V medu se vyskytuje od 1 až 3 %, avšak normy dovolují až 5 %. Při vysokém obsahu sami včely tento med odstraňují z úlu. Jedním z oligosacharidů je též již dříve zmíněná melecitosa (1, 11, 21).

19

Tabulka č. 2: Zastoupení oligosacharidů v medu (22) Oligosacharidy

[%] Disacharidy

Maltosa

29,4

Kojibiosa

8,2

Turanosa

4,7

Isomaltosa

4,4

Sacharosa

3,9

Maltulosa

3,1

Nigerosa

1,7

Trehalosa

1,1

Gentiobiosa

0,4

Laminaribiosa

0,09 Trisacharidy

Erlosa

4,5

Theanderosa

2,7

Panosa

2,5

Maltotriosa

1,9

1-Kestosa

0,9

Isomaltotriosa

0,6

Melecitosa

0,3

Isopanosa

0,24

Centosa

0,05

3-α-Isomaltosylglukosa

sporadicky Vyšší oligosacharidy

Isomaltotetrosa

0,33

Isomaltopentosa

0,16

V medu jsou zastoupeny i dextriny, které jsou jakýmsi mezičlánkem mezi molekulou škrobu a glukosou. Zvyšují viskozitu a vyskytují se hlavně v medech medovicových, ale v květových nejsou výjimkou. Buď to pochází primárně z medovice, nebo reverzním působením enzymů již v medu, proto jejich množství může během skladování narůstat. 20

Medné dextriny se liší od škrobových dextrinů nižší molekulární hmotností i jednodušší skladbou a proto se řadí mezi achrodextriny (1, 12, 20).

7.3

DUSÍKATÉ LÁTKY Dusíkaté látky v medu mají značný biologický význam. V medu je obsaženo průměrně

0,2 až 0,6 % proteinů, hlavně enzymů a volných AMK. Výjimkou je však med vřesový, který jich obsahuje průměrně 1,5 %, což způsobuje jeho thixotropní vlastnosti. Množství AMK je 100 mg na 100 g sušiny. Jejich největším zdrojem je pyl, ale mohou být původu jak nektarového, tak medovicového. Největší podíl má prolin, který tvoří 50 až 85 % aminokyselinové frakce. Jak již bylo zmíněno, prolin slouží k regulaci sekrece invertasy v průběhu zrání medu (1, 11). Tabulka č. 3: Obsah aminokyselin v medu (22) Aminokyselina

Obsah v mg na 100 g medu

Prolin

59,65

Phenylalanin

14,75

Asparagin + Glutamin

11,64

Histidin

3,84

Tryptofan

3,84

Kyselina asparagová

3,44

Kyselina glutamová

2,94

Tyrosin

2,58

Alanin

2,07

Valin

2,00

Arginin

1,72

Isoleucin

1,12

β - alanin

1,06

Leucin

1,03

Lysin

0,99

Glycin

0,68

Cystin

0,47

Methionin

0,33

Ornitin

0,26 21

Daleko významnější roli mají enzymy, díky kterým vzniká z nektaru či medovice med. Jejich aktivita je závislá na kondici včelstva a intenzitě snůšky. Čím lepší kondice a nižší intenzita snůšky, tím vyšší aktivita enzymů a naopak. Dále aktivita klesá během skladování. Enzymy medu se dají rozdělit do 3. skupin: Enzymy včelího původu Invertasa (α-glukosidasa, sacharasa) štěpí sacharosu na glukosu a fruktosu. Nejvyšší aktivitu má při 35 až 40 °C a pH 5,9 až 6,1. Bylo identifikováno 7 až 8 izoenzymů. Oproti ostatním enzymům je značně citlivější k teplotě, a proto je v některých zemích legislativním parametrem kvality. Kromě sacharosy, štěpí též maltosu a vykazuje transglukosidasovou aktivitu. To znamená, že dokáže i naopak z monosacharidů tvořit sacharidy vyšší. Proto může zkrystalizovaný med po delší době samoztekutit. Tento jev je však už nevratný. Aktivita invertasy v medu klesne na polovinu při 20 °C za 820 dní (1, 12). Glukosooxidasa oxiduje glukosu na kyselinu glukonovou, která je majoritní kyselina v medu, a peroxid vodíku. Ten je pokládán za jeden z příčin antimikrobiálních vlastností medu. Peroxid vodíku se však velmi rychle rozkládán na vodu a kyslík, což probíhá po celou dobu zrání medu. Optimální pH je 6,1. Ve zralém medu je její aktivita nulová, protože se zvyšuje množství invertních cukrů. Aktivitu má vyšší v nezralém či zředěném medu při koncentraci sacharidů 25 až 30 %. Kromě glukosy může oxidovat i manosu (1). Diastasa je enzym štěpící škrob. Diastasy se dělí na α-amylasy, které štěpí škrob na dextriny a β-amylasy štěpící škrob na konci molekuly, přičemž následně vzniká disacharid maltosa. Diastasa v medu má obě vlastnosti, ačkoliv při stanovování její aktivity se zjišťuje pouze aktivita α-amylasy, jelikož vzniklou maltosu rozštěpí invertasa. Medná diastasa vykazuje nejvyšší aktivitu při teplotě 40 až 65°C a pH 5,6 až 5,9. Je to termolabilní enzym, avšak termostabilnější než invertasa. Aktivita diastasy se v některých zemích legislativně stanovuje pro hodnocení kvality medu. Její význam v medu není zcela objasněn, ale v experimentu se potvrdilo, že se produkuje pouze v době, kdy se krmí plod. Proto je vysoká pravděpodobnost, že právě včely krmičky tento enzym secernují. Aktivita diastasy klesá při přehřátí medu i pří skladování. Aktivita diastasy v medu klesne na polovinu při 20 °C za 1 480 dnů (1, 12).

22

Enzymy pocházející z jiného sociálního hmyzu Kromě včel může invertasu i glukooxidasu vylučovat do šťáv z rostlin jiný hmyz, jako například mravenci, čmeláci či vosy (1). Enzymy rostlinného původu Katalasa štěpí peroxid vodíku na kyslík a vodu. Proto medy, v kterých tento enzym je zastoupen v menší míře mají velké množství peroxidu vodíku jako květový med z jetele plazivého nebo medovicový med ze skotské borovice. Větší obsah katalasy obsahuje med vřesový a borůvkový (1, 14). Kyselá fosfatasa pochází hlavně z pylu, ale menší podíl může pocházet také z nektaru. Význam enzymu v procesu zrání či v průběhu zpracování nebyl dosud objasněn (1).

7.4

TUKOVÉ LÁTKY V medu se nachází 0,015 % různých lipidů, v přepočtu je to 150 mg látek tukové

povahy v kg medu. Jejich zastoupení je následující: 45 % esterů cholesterolu, 22 % triacylglycerolů, 18 % volných mastných kyselin a 17 % volného cholesterolu. Prozatím identifikované mastné kyseliny, které tvoří estery, jsou kyselina kaprylová, laurová, palmitoolejová, palmitová, stearová, olejová, arachidonová a linolová. V medu se nacházejí nejspíše z mateří kašičky či jiných žlázových produktů mladušek (11, 14).

7.5

VITAMINY Vitaminy tvoří v medu sice minoritní skupinu, přesto jsou složkou významnou.

Pro člověka je med pouhým doplňkovým zdrojem těchto látek. Jde hlavně o vitaminy skupiny B. Jejich původ je hlavně z pylu, v menší míře z nektaru či medovice (11, 14). Tabulka č. 4: Obsah vitaminů v medu (23) Vitaminy

Průměrné množství ve 100 g medu

thiamin

0,004 – 0,006 mg

riboflavin

0,02 – 0,06 mg

niacin

0,11 – 0,36 mg

kyselina pantothenová

0,02 – 0,11 mg

pyridoxal

0,008 – 0,32 mg

kyselina askorbová

2,2 – 2,4 mg 23

7.6

MINERÁLNÍ LÁTKY Med je pouze doplňkovým zdrojem minerálů, stejně jako tomu bylo u vitaminů. Ovšem

existuje málo potravin, které by měly tak ucelený soubor minerálů (mluvě zejména o medech medovicových). Celkový obsah kolísá od 0,02 do 1,0 %. Minerály jsou zpravidla původem rostlinným, proto je nejvíce zastoupen draslík. Jejich obsah je vyšší u medů medovicových nejspíše z důvodu pestřejší minerální výživy jehličnanů. Kromě nich má vysoký obsah minerálů též med vřesový. Zajímavostí je, že medy z českého území obsahují větší množství niklu než medy zahraniční (1, 11, 14, 15). Tabulka č. 5: Minerální látky v medu (23) Minerální látky

7.7

Průměrné množství

Průměrné množství

ve 100 g lučního medu

ve 100 g lesního medu

draslík

20,5 mg

167,6 mg

chlor

5,2 mg

11,3 mg

síra

5,8 mg

10 mg

sodík

1,8 mg

7,6 mg

vápník

4,9 mg

5,1 mg

fosfor

3,5 mg

4,7 mg

hořčík

1,9 mg

3,5 mg

železo

0,24 mg

0,94 mg

mangan

0,03 mg

0,41 mg

měď

0,03 mg

0,06 mg

KYSELINY I když jsou organické kyseliny zastoupeny v medu v minoritním množství (0,5 až 1 %),

jsou významné, jelikož ovlivňují jeho barvu, chuť, pH a vodní aktivitu. Medy nektarové mají pH v rozmezí 3,1 až 4,5 (průměrně 3,9), medy medovicové mají pH o jednotku výš (1, 14, 20). Hlavní kyselinou je kyselina glukonová, která vzniká enzymatickou oxidací z glukosy a je obsažena v rovnováze se svým laktonem. Ostatní kyseliny pochází z pravidla z rostlin. Patří mezi ně kyselina jablečná, citrónová, jantarová, octová, máselná, fumarová, α-ketoglutarová,

24

mléčná, maleinová, štavělová, glutamová, vinná a další. Kyselina levulová a mravenčí vznikají rozkladem HMF (1, 12).

7.8

AROMATICKÉ LÁTKY V medu se nachází široké spektrum aromatických látek. Tyto sloučeniny jsou těkavé,

mají nízký bod varu a medu dodávají charakteristickou chuť a vůni. Dosud bylo v medu nalezeno okolo 600 těchto látek, ale pouhých 300 se jich podařilo identifikovat. Z chemického hlediska to jsou alkoholy, aldehydy, ketony a estery alifatických i aromatických kyselin. Je dokázáno, že jejich obsah bez ohledu na těkavost během skladování klesá, protože dochází k různým změnám. Některé z nich jsou charakteristické pro všechny medy jako formaldehyd, propionylaldehyd, aceton, hydroxymethylfurfural a zejména β-damascenon spolu s fenylacetaldehydem, které vytvářejí medovou vůni i chuť. Jiné zase vytvářejí specifičnost určitého medu jako methylester kyseliny antranilové pro med citrusový či diacetyl (a jiné diketoalkany) pro med vřesový (1, 12).

7.9

BARVIVA Sloučeniny vytvářející barvu medu by se daly rozdělit do tří skupin: rostlinná barviva,

barviva vzniklá Maillardovou reakcí a barviva ze zbytků košilek po včelím plodu (12, 14). Z rostlinných barviv to jsou převážně fenolické sloučeniny (flavonoidy, fenolické kyseliny a deriváty fenolických kyselin). Jejich obsah v medu se pohybuje od 56 do 500 mg na 1 kg medu. Zajímavé je, že v medu je jejich obsah vyšší než v jejich botanickém původu díky kumulaci ve vosku a následném přecházení zpět do medu. U těchto sloučenin zejména u flavonoidů jsou známy antioxidační účinky. Množství flavonoidů se pohybuje od 60 do 460 µg na 100 mg medu. Větší množství je obsaženo ve vzorcích vyprodukovaných během suché sezóny s vysokými teplotami. Jedním ze zástupců flavonoidů je quercetin a jeho glykosid rutin, který snižuje nežádoucí křehkost a propustnost kapilár. Celková antioxidační kapacita medu se dá srovnat s červeným vínem (1 sklenice vína = 4 polévkové lžíce medu) (11, 12, 21). Při Maillardově reakci reagují aminokyseliny s převážně s fruktosou v kyselém prostředí. Vzniklé sloučeniny jsou hnědá barviva, která mají charakteristicky výrazné aroma. Kromě zmíněných barviv, med obsahuje i stopová množství melanoidního barviva vznikající z AMK tyrozinu (1, 12, 14).

25

7.10 HORMONY Med obsahuje také látky hormonálního charakteru. Jednou z nich je acetylcholin, který je neurotransmiterem v periferním nervovém systému. Nachází se v množství až 45 mg/kg a pochází nejspíše z pylu. Dále se v medu vyskytuje adrenalin (20 µg volného a 20 až 60 µg vázaného v 1 kg medu), noradrenalin, dopamin a specifické hormonální látky z mastných kyselin (MK). Z rostlinných hormonů se vyskytuje v medu kyselina abscisová. Je důležité si uvědomit, že tyto látky se v medu nachází ve velmi malém množství (12, 14, 20).

7.11 HYDROXYMETHYLFURFURAL (HMF) Hydroxymethylfurfural neboli 5-hydroxymethyl-2-furankarbaldehyd, je složitá látka vznikající kyselinou katalyzovanou dehydratací monosacharidů (zejména fruktosy) v kyselém prostředí a vyšší teploty. Je to látka bezbarvá a velmi reaktivní, na vzduchu hnědne a reaguje s ostatními sloučeninami medu, přičemž vznikají žlutohnědé barviva. HMF se může začít tvořit při zrání medu v plástech, ale vzniká ho velice málo, 0,6 až 2 mg na kg. Jeho výrazný nárůst je spojen s nešetrným zahříváním medu či jeho dlouhodobým skladováním za teplot vyšších než 30°C. Proto je HMF jedním z nejdůležitějších ukazatelů kvality zakotveným v národní i mezinárodní legislativě (1, 11, 12). U medu nepřehřívaných se HMF pohybuje do 10 mg/kg medu. Při šetrném zahřátí HMF nepřekročí 40mg/kg medu, což je také evropskou normou. Pro označení český med nesmí překročit hranici 30 mg/kg medu. Medy obsahující několik stovek miligramů HMF, se občas nacházejí v obchodních sítích a jejich vysoké HMF svědčí o několikanásobném nešetrném rozehřívání. Je důležité říct, že HMF není pro člověka toxický, je pouhým ukazatelem kvality. Ve vyšších hodnotách se vyskytuje například v kávě či sušeném ovoci. Považuje se maximálně za látku antinutriční, i když novější studie poukazují na jeho mutagenní a karcinogenní potenciál. HMF má vysokou toxicitu na včely (11, 12, 14, 24).

26

8.

CHEMICKÁ KONTAMINACE Med může být ovlivněn některými faktory, které nežádoucím způsobem ovlivňují

biologickou hodnotu, jakost a zdravotní nezávadnost medu. Jednou možností je toxicita medu způsobená jeho původem (jedovaté alkaloidy a glykosidy rostlin). Větší vliv však má spíše kontaminace chemickými látkami ze znečištěného životního prostředí či nevhodnou činností člověka (25).

8.1

PESTICIDY Pesticidy jsou látky, které se využívají k ochraně plodin a k zvýšení jejich produkce.

Patří mezi ně insekticidy, fungicidy, herbicidy, akaricidy a mnohé další skupiny pesticidů. Mnoho sloučenin dříve používaných je dnes zakázáno, díky již známým zdravotním rizikům na lidské zdraví, jako například kancerogenita. Mezi ně patří například: amitraz, celazol, bromopropylát, flumethrin a další. Existují právní předpisy, které minimalizují možný výskyt těchto látek v medu. Včelaři musí každý rok nahlásit kočovná stanoviště včelstev a při zvolení stanoviště ve volné přírodě musí úl vhodně a viditelně označit. Ošetřovatelé porostů a rostlin musí zvolit přípravky, které nejsou jedovaté či škodlivé pro včely (25, 26). Nejvyšší hodnoty reziduí pesticidů mají varroacidy, které se kumulují ve včelím vosku a pylu. I v této době byl nalezen bromopropylát ve včelím vosku v Rakousku, i když se přestal používat před 14 lety. Přesto, že v medu byly nalezeny stopy pesticidů, se med jeví jako čistý produkt. Při srovnání medu z oblasti vysoce zatížené průmyslem a z oblasti zasažené člověkem jen minimálně, se rozdíl množství škodlivých látek neprokázal. U samotných včel však rozdíl byl markantní. Včelstvo je tedy jakýmsi biologickým filtrem (12, 26).

8.2

LÉČIVA Kromě pesticidů se v medu mohou vyskytovat i rezidua antibiotik. Ty se do včelstev

a medu mohou dostat různě, obecně však buď z kontaminovaného životního prostředí, nebo nevhodnými praktikami včelaře. Například byly v medu naleznuty překračující hodnoty oxytetracyklinu a chloramfenikolu. Oxytetracyklin je antibiotikum léčící mor včelího plodu způsobeného Paenibacillus larvae larvae a polybakteriální hnilobu včelího plodu způsobeného Streptococcus Pluton či Paenibacillus alvei. Konzumace reziduí antibiotik v potravinách včetně medu způsobuje jeden z největších problému spojeným s nadužíváním antibiotik a to antibiotickou rezistenci. Z mnoha studií, které testovaly medy po celém světě 27

(3855

vzorků),

pouhých

1,7

%

nesplňovali

evropské

standardy.

Ve

vzorcích

se našly: streptomycin, sulfonamidy, tetracyklin, chloramfenikol, nitrofurany, tylosin a quinolones. Díky citlivým metodám se dnes dokáže detekovat i to nejmenší množství různých antibiotik, díky kterým můžeme předcházet potenciálním rizikům (12, 26).

8.3

JEDOVATÉ MEDY Kromě chemických kontaminantů, mohou některé medy obsahovat přírodní toxiny

z nektarů jistých rostlin. O jedovatých medech se ví již od roku 401. V té době 10 000 řeckých vojáků z Malé Asie putovalo Kolchidou, kde pojedli med (pónský med), po kterém onemocněli. Nemoc se projevila zvracením, průjmy, ztrátou vědomí a v některých případech smrtí. Kolem třetího a čtvrtého dne, ti co přežili, se uzdravili. Hlavním důvodem toxicity byli gryanotoxiny (též andromedotoxiny) I, II, III a tetracyklické diterpeny, které jsou produkovány rostlinami z čeledi Ericaecae (pěnišníky - rododendrony, azalky, kyhanky, kalmie). Tyto toxiny se mimo jiné používají v medicíně jako antihypertonika. Při požití způsobují nevolnost, zvracení, nadměrné slinění, zmatenost a srdeční komplikace. I v dnešní době se na území Turecka občas vyskytnou otravy toxickým „šíleným“ medem, léčba se většinou řeší včasným podáním atropinu (1, 14, 26, 27). Další jedovaté medy pochází z rostliny Coriaria arborae z Nového Zélandu, jejíž medovice obsahuje toxiny tutin a hyenanchin. V Maďarsku se objevují jedovaté medy z rulíku zlomocného nebo durmanu. V Severní Americe pak medy z liány Gelsemium sempervirens. V oblastech, kde se nachází takové velké množství jedovatých rostlin, z kterých by mohl vzniknout toxický med, jsou si včelaři vědomi tohoto nebezpečí a neprodávají ho. V ČR zatím jedovatý med nebyl zaznamenán (1, 11, 14, 21).

28

MIKROBIÁLNÍ KONTAMINACE

9.

V současné době se u medů často provádí mikrobiální hodnocení podle hodnocení pro jiné potraviny, ačkoliv díky antimikrobiální aktivitě medu, některé specifikace nemusí být k medu zcela relevantní. Mezi tyto mikrobiální testy se řadí testy na koliformní bakterie, kvasinky, plísně a jisté patogeny jako Staphylococcus, Salmonella a Clostridium species. Med má schopnosti potlačit či zabít většinu mikroorganismů, proto jsou cílem mikroorganismy, které vydrží vysokou koncentraci sacharidů, kyselé prostředí a antimikrobiální charakter medu. Tyto mikroby se dají rozdělit do čtyř skupin: 

mikroorganismy, které se běžně v medu nachází (jisté kmeny kvasinek a sporulujících bakterií)



mikroorganismy, které indikují sanitární nebo obchodní jakost (koliformní bakterie nebo kvasinky)



mikroorganismy, které za určitých podmínek mohou způsobit nemoc člověka (například klíčení a růst v ne tepelně ošetřeném potravinářském výrobku)



mikroorganismy, které způsobují nemoci včely medonosné

Čtvrtá skupina není pro člověka nebezpečná, ale mohla by se stát zdrojem nákazy pro ostatní včelstva. Nejvýznamnější včelí patogen je Paenibacillus larvae larvae, který způsobuje mor včelího plodu. Dalšími patogeny jsou: Paenibacillus alvei, Aspergillus spp., Ascosphaera apis, Nosema apis (1, 14, 28). Mikroorganismy se do medu dostávají: 

primárně – pylem, trávicím traktem včely, vzduchem, prachem, nečistotami a květinami,



sekundárně – stejně jako u ostatních potravin (medobraní a další zpracování medu) (28).

Primární kontaminace Zdrojem bakterií nebo kvasinek v plástečkovém medu jsou včely, nektar, medovice nebo vnější zdroje. Dostávají se do medu tedy primárně. Larvy jsou z počátku sterilní. To se však mění ještě před kuklením, jelikož začnou být krmeny sladinou a pylem dělnicemi (28). Ekosystém v okolí včelínů bývá rozmanitý včetně rozmanitosti mikroorganismů. V půdě

můžeme

nalézt

Actinetobacter,

Bacillus,

Clostridium,

Corynebacterium, 29

Pseudomonas, Psychrobacter a Vagococcus. Ve vzduchu a prachu se vyskytují Bacillus, Clostridium a Micrococcus. Důležitými kontaminanty řepného i třtinového cukru, kterými mohou včelaři krmit včely, jsou Bacillus a Clostridium spp., v hodně vlhkém cukru můžeme najít

kvasinky

mesenteroides.

Saccharomyces Brochothrix,

a

Torula.

Citrobacter,

V cukrovarech Enterobacter,

se

nachází

Erwinia,

Leuconostoc

Flavobacterium,

Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Listeria a Pediococcus se mohou nalézat v rostlinách a rostlinných produktech včetně nektaru (28). Bacillus spp., Micrococcus spp. a Saccharomyces spp. mohou být izolovány z medových plástů a dospělých včel. Avšak plástečkový med a zdravé larvy neobsahují žádné mikroby, které by se daly zjistit dostupnými metodami. Ve výkalech larvy byly nejvíce zastoupeny Bacillus spp., následovány gram-variabilními pleomorfními bakteriemi, plísněmi, Actinomycetes a gram-negativními bakteriemi. V mikroflóře dospělé včely se vyskytují gramvariabilní pleomorfní bakterie, Bacillus spp., Enterobacteriaceae, Penicillium spp., Aspergillus spp. a kvasinky Torulopsis (28). Pyl je jednou z možností zdroje včelí střevní mikroflóry. Konzumací pylu a vzájemnou výměnou potravy si včely kolonizují střeva. Na rozdíl nektar hraje v tomto procesu roli minimální, ne-li žádnou. Dalšími možnostmi jsou rostliny a úl, půda jako zdroj hraje roli mnohem menší. Aerobní sporulující bakterie (včetně Bacillus spp.) jsou nejfrektovanější mikroorganismy včely jak v jejím traktu, tak na jejím povrchu. Nachází se i v hemolymfě a tracheji včely. Celkové zastoupení mikroorganismů střevní mikroflóry včely je následující: kvasinky (1 %), gram-pozitivní bakterie včetně Bacillus spp., Bacteridium spp., Streptococcus spp. a Clostridium spp. (29 %), gram-negativní nebo gram-variabilní bakterie včetně Achromobacter, Citrobacter, Enterobacter, Erwinia, Escherichia coli, Flavobacterium, Klebsiella, Proteus a Pseudomonas. Jako primární zdroj kvasinek se uvádí nektar, rostliny, tělo včely, vzduch v úlu, vnitřní prostředí úlu a půda (28). Většina studií, které zjišťují primární zdroje mikrobiální kontaminace medu, se provádějí, aby se zjistilo více informací o mikrobiální ekologii včely medonosné. Avšak mikroorganismy střevní mikroflóry včely se nepřekrývají s mikroorganismy nalézanými v medu. To značí, že buď tyto bakterie nepřežívají v medu, nebo se tam ani ze střeva včely nedostávají. Některé mikroorganismy včely se také mohou do medu dostat z jiných zdrojů. Některé spory v medu mohou být původně umělým dokrmováním včel cukrem (28).

30

Sekundární zdroje Údaje o sekundárních zdrojích mikrobiální kontaminace medu nejsou příliš rozsáhlé, ale provedené analýzy poukazují na to, že sekundární kontaminace je výraznější než primární. Mezi sekundární zdroje se řadí lidé, nářadí, nádoby, vítr, prach (během zpracování), hmyz, zvířata a voda. Nejdůležitější pro kontrolu mikrobů ve všech potravinách včetně medu je správná výrobní praxe. Na nářadí se často objevují kvasinky, které se tak mohou dostat do jinak čistého medu. Možné cesty přenosu do vytočeného medu zahrnují vzduch, manipulace s potravinou (kožní infekce, rýma či fekální kontaminace), křížová kontaminace (především ze zvířat a zvířecích produktů) a nářadí (včetně reziduí potravin a vody). Vysoká kontaminace medu z pravidla poukazuje na kontaminaci sekundární, která je kontrolována standardní hygienou a správnou výrobní praxí. Včelařům, provozovatelům potravinářského podniku i hygienikům slouží Systém analýzy rizika a stanovení kritických kontrolních bodů (HACCP) (26, 28). Plísně v medu Plísně jsou často spojeny v souvislosti se střevy včel, úlem a prostředím, ve kterém se včely pohybují. Ve střevech včelí larvy a v jejích výkalech byly nalezeny Aspergillus, Chaetomium, Penicillium a Peyronelia. Zatímco v medu byly nalezeny Ascosphaera, Aspergillus, Cephalosporium a Penicillium. Někteří vědci popisují takzvané špinavé plísně (epifytické osmofilní houby) v medovici a medovicovém medu. Patří mezi ně Atichia, Coniothecium, Hormiscium a Triposporium. Zajímavé je, že pokud je plást uložen ve vlhké části úlu a začíná se pokrývat plísněmi, včely jej vyčistí a obnoví. Pyl skladovaný včelami v úlu může být napaden plísní s názvem Bettsia alvei (28). Kromě tolerance osmotického tlaku, existují další faktory, které ovlivňují růst či přežívání plísní v medu. Není zcela jisté, zda plísně v medu mohou jenom přežívat či i růst a množit se, jak dokazují některá data o nízkém počtu plísní v medu. Vysoké množství plísní může být způsobeno růstem plísní v primárních zdrojích (včela či úl) nebo sekundárních (nářadí) (28). Kvasinky v medu Kvasinky mohou růst v kyselém prostředí a nejsou inhibovány sacharosou. Osmofilní nebo sacharidy tolerující kvasinky jsou problémem v medovém průmyslu, protože mohou růst v limitním množství vody, které se nachází ve zralém medu. Proto často způsobují kvasinky 31

fermentaci medu. Podmínky, které podporují fermentaci medu, jsou zvýšená vlhkost, mírná teplota, granulace, vysoký počet kvasinek a přítomnost prachu a dusíku. Během fermentace rozkládají kvasinky sacharidy za vzniku alkoholu a oxidu uhličitého. Za přítomnosti kyslíku může být alkohol konvertován na kyselinu octovou. Jak již bylo zmíněno, fermentace často nastává na povrchu medu, kde je zvýšený obsah vody (obsah vody vyšší než 20 %) (1, 28). Dominantní kvasinkou medu je Saccharomyces. Mezi objevené kvasinky medu se řadí: Rhodotorula, Debaryomyces, Hansenula, Lipomyces, Oosporoidium, Pichia, Torulopsis, Trichosporan,

Nematospora,

Schizosaccharomyces,

Schwanniomyces,

Torula

a Zygosaccharomyces. Saccharomyces a Zygosaccharomyces typicky fermentují med na povrchu, Torula a Torulopsis z pravidla v celém objemu. Díky pravidelným kontrolám v potravinářském průmyslu, nedosahují kvasinky velkého počtu v medu, jelikož takový med je nepoživatelný a tedy i neprodejný (12, 28). Bakterie v medu Kvantitativních hodnocení medu, s výjimkou hodnocení Clostridium botulinum, nebylo provedeno mnoho. Podle zkušeností průmyslových hodnocení, které korespondují se studiemi, se množství bakterií v hotovém medu pohybuje od 1 do 5000 KTJ/g, což lze ještě snížit následným ošetřením. Při kvalitativním hodnocení můžeme v medu nalézt: Bacteridium,

Bacterium,

Bacillus,

Brevibacterium,

Enterobacter,

Flavobacterium,

Micrococcus, Neisseria, Pseudomonas, Xanthomonas a Staphylococcus. Největší zastoupení nachází Bacillus, zejména B. cereus a B. pujilus. Následují Micrococcus, Pseudomonas a Staphylococcus, které byli nalezeny i v průmyslovém medu v USA. Staphylococcus se však ve zralém hotovém medu nenachází, jelikož z pravidla nepřežívá medobraní a nedokáže v medu růst jako většina bakterií. Flavobacterium lactis se do medu dostává nejspíše díky člověku kontaminovanou vodou. Podle odborníků se vegetativní formy do medu dostanou pouze sekundární kontaminací díky člověku, jelikož přírodní med obsahuje velmi omezený počet typů mikrobů a neobsahuje žádné vegetativní nesporulující bakterie (28). Při studii bakteriálních spor Bacillus a Clostridium v medu se zjistilo, že nejvíce dominantní byl rod Bacillus zejména B. cereus, dále B. coagulans, B. megaterium a B. alvei. Dále se v medu nacházel C. perfringens, C. botulinum identifikován nebyl. Dále se ve všech vzorcích našly spory aerobních druhů. Avšak existuje mnoho studií, které C. botulinum identifikovaly (viz Kojenecký botulismus) (28).

32

Při inokulaci několika kmeny Bacillus spp. do roztoku medu a vody se žádný z kmenů nemohl rozmnožovat, pokud roztok obsahoval 50 % medu či vyšší pH než 4. Mírný růst byl sledován pouze v roztoku o koncentraci 30 %. Bakterie se tedy ve zralém medu rozmnožovat nemohou, jediná možnost růstu bakterií by mohla nastat při zrání nektaru v med, například pro Clostridium (28). Mnoho studií se zabývá přežíváním patogenních bakterií v medu, které se v medu přirozeně nevyskytují, ale do medu se dostaly jinou cestou (například hypotéza, že včely přenesou patogenní mikroorganismus z lidského exkrementu do medu). Po inokulaci nesporulujících intestinálních bakterií do medu, přežili bakterie pouze několik hodin až dní. Pokud byly inokulovány do roztoku s méně než 50 % medu, prodloužilo to jejich život maximálně o 40 dní. Při snížení a udržení teploty na 20 °C se výrazně nic nezměnilo. Avšak při snížení teploty na 10 °C přežívali od 6 měsíců do 2 a půl roku. Proto se doporučuje nezavádět tyto mikroby do medu a tím nepřeceňovat antimikrobiální aktivitu medu. Po inokulaci spor B. cereus, C. perfringens a C. botulinum se zjistilo, že spory v medu mohou přežívat, ale nemohou vyklíčit do vegetativní formy, která je schopna se rozmnožovat (28). Ostatní mikroby v medu V medovicovém medu se mohou nacházet za jistých podmínek řasy. Jedním z klimatických faktorů je vysoká relativní vlhkost. Celulózové schránky obrněnek se do medu mohou dostat používáním křemelinových filtrů, avšak obrněnky již dávno nejsou živé. Některé lidské střevní viry, jako virus hepatitidy A, snese suché podmínky medu. Tyto lidské viry by mohly přetrvávat v medu, ale jejich počet upadá v závislosti na teplotě a čase. Jelikož jsou lidské výkaly výlučným zdrojem lidských střevních virů, tak různá kontrolní opatření udržují jejich odstup dál od potravin, včetně medu. U prvoků a mnohobuněčných parazitů je zcela nepravděpodobné, že by se přenášeli skrze med (28).

33

10. MIKROBIÁLNÍ AKTIVITA MEDU Med má výjimečné vlastnosti, které ho činí bakteriostatickým a bakteriocidním. Mezi faktory, díky kterým má tyto účinky, se řadí: 

vysoký obsah cukrů – nízká vodní aktivita – vysoký osmotický tlak – fyziologické sucho,



vyšší koncentrace kyselin - nízké pH – kyselé prostředí,



glukoso-oxidázový systém – tvořící peroxid vodíku,



vysoká viskozita – nedostatek kyslíku,



nízký obsah bílkovin,



vysoký poměr uhlíku k dusíku,



vysoký obsah redukujících cukrů – nízký redoxní potenciál,



chemické látky a enzymy s antimikrobiálním účinkem (benzol, lysozym, těkavé látky, fenolové kyseliny, terpeny, pinocembrin, methylglyoxal, defensin 1 aj.).

Antibakteriální aktivita je také závislá na botanickém původu medu, což znamená, že antibakteriální aktivita medu je zajištěna rovněž doposud neidentifikovatelnými látkami z rostlin. Při zkoumání bakteriostatických účinků několika medů se zjistilo, že všechny medy měly efekt vůči Bacillus cereus, Micrococcus flavus a Sarcina lutea. Ne všechny však měly efekt na Bacillus subtilis (1, 12, 28). Antimikrobiální aktivita medu byla dokázána vůči velké skupině kmenů, mnoho z nich patogenních, jako například: Bacillus anthracis, Corynebacterium diphtheriae, Escherichia coli, Mycobacterium tuberculosis či Vibrio choleriae. Dokonce se zjistilo, že účinky medu inhibují virus zarděnek, tři druhy prvoků z rodu Leishmania způsobující leishmaniózu a parazita měchožila zhoubného (21). Antimikrobiální aktivita medu se někdy rozděluje na peroxidázovou a neperoxidázovou aktivitu. Bylo dokázáno, že oba typy aktivit jsou účinné vůči jistým bakteriím. Peroxidázová aktivita je založena na glukoso-oxidázovém systému, což je enzymatický proces díky kterému, jak bylo dříve zmíněno, vzniká peroxid vodíku a glukonová kyselina. Glukosooxidázová aktivita je ve zralém medu téměř nulová díky vysoké koncentraci cukrů. Načež peroxid vodíku může být zničen teplem, světlem a skladováním. Kvasinky a plísně se však zdají býti odolnější vůči peroxidu vodíku (21, 28).

34

Neperoxidazová aktivita zahrnuje všechny ostatní mechanismy antimikrobiálních účinků. Příkladem je manukový med, který má nejvyšší obsah methylglyoxalu. Ten vzniká neenzymatickou reakcí a nejvíce je ho v medu, když je čerstvý. Časem a teplotou jeho množství klesá. Díky této látce má manukový med nejsilnější účinek ze všech medů vůči bakterii Escherichia coli, Helicobacter pylori, Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes a mnoho dalších. Neperoxidazová aktivita je též účinná na plísně: Aspergillus, Candida, Penicillium a Saccharomyces (12, 28). Důležité pro podpoření antimikrobiální aktivity je skladování medu v chladu a temnu. Efekt neadekvátního skladování je naznačen v následující tabulce (21). Tabulka č. 6: Účinek tepla, světla a doby skladování na antimikrobiální aktivitu medu. Antimikrobiální aktivita je vyjádřena v % k neošetřenému kontrolnímu medu (29). Neperoxidazová aktivita

Peroxidázová aktivita

Skladování 15 měsíců při teplotě 15 – 20 °C na světle

ve tmě

na světle

ve tmě

Květový med

76

86

19

48

Medovicový

78

80

63

70

med Ohřev 15 minut při teplotě 70 °C Květový med

86

8

Medovicový

94

78

med

35

11. MIKROBIÁLNÍ BIOFILM Bakterie mohou žít volně, tedy planktonicky, ale mohou také žít ve společenství, kdy jsou nevratně přichyceny k podložce či ostatním buňkám a vytvářejí tenkou vrstvu – biofilm. Biofilm je tvořen polymerní mimobuněčnou hmotou, která je secernována samotnými bakteriemi. Zajímavé je, že bakterie žijící v biofilmu se chovají odlišně, tedy mají změněný fenotyp nikoliv genotyp (ovlivněna genová exprese). Již při dotyku bakterie s podložkou se aktivují desítky genů, které řídí a realizují všechny děje odehrávající se v biofilmu – syntéza lepivé polysacharidové hmoty, syntéza toxinů, rezistence k antibiotikům a jiné (30, 31). Nejdéle známým biofilmem, který se nachází v lidském těle je povlak na zubní sklovině – zubní plak. Přesto, že lze odstranit se vždy utvoří znovu. Tento biofilm je fyziologický a vzniká přirozeně. Mikroflóra zubního plaku je heterogenní a je ovlivněna stářím. Udává se, že zubní plak může být tvořen až 500 mikrobiálními druhy, z nichž 60 % lze kultivovat. Mezi nejčastěji zastoupené rody patří Streptococcus, Peptostreptococcus, Neisseria, Bacteroides, Lactobacillus, Aktinomyces, Aktinobacillus, Fusobacterium, Candida a mnohé další. Heterogenita prostředí zajišťuje, že v biofilmu koexistuje velké množství mikrobů s odlišnými vlastnostmi, které by v homogenním prostředí spolu žít nemohli (30, 32). Med, jak je výše uvedeno, má jisté antimikrobiální účinky. Některé jejich mechanismy jsou nám známy, jiné ne. Proto je otázkou, zda může mít med antibakteriální účinek na jednu z hlavních kariogenních bakterií Streptococcus mutans. Zubní kaz vyvolává pouze malá skupina mikrobů ze zubního plaku, avšak zubní kaz je výsledkem interakcí celé mikrobiální komunity. V jedné studii zkoumali, zda med ovlivňuje růst, životaschopnost a mikrobiální biofilm Streptococcus mutans. Jako kontrolní potravina byl vytvořen umělý med, což byl roztok, který obsahoval průměrně stejné množství i zastoupení jednotlivých sacharidů. Výsledkem bylo, že při 12,5 % roztoku přírodní med méně podporoval bakteriální růst a tvorbu biofilmu, než med umělý. Minimální inhibiční koncentrace pro med byla navržena mezi 25 a 12,5 % (32, 33). Med se používá k léčbě ran odedávna. Mnoho studií se zabývá antimikrobiálními účinky na planktonické formy bakterií. Bakterie spojené s chronickými ránami však častěji vytvářejí biofilm. Tento biofilm chrání bakterie před imunitním systémem, antibiotiky, vysoušením i čištěním. Bylo zjištěno, že roztok přírodního medu při koncentraci 12 % má baktericidní účinek na methicilin-rezistentní Staphylococcus aureus, methicilin-rezistentní 36

Staphylococcus epidermidis, a při koncentraci 25 % na ESBL Klebsiella pneumoniae a Pseudomonas aeruginosa. Tedy na bakterie související s chronickými ránami. Ještě lépe na tom byl komerční produkt Medihoney, což je směs převážně manukových medů s antimikrobiálním účinkem. Důležité je zmínit, že med pro léčbu ran musí být vždy ošetřen kvůli potencionálnímu obsahu patogenů (například spory Clostridium botulinum). Další bakterií často spojovanou s chronickými ránami je Streptococcus pyogenes. Manukový med opět obhájil své silné baktericidní účinky, kdy zabránil vytvoření biofilmu i rozrušil stávající biofilm Streptococcus pyogenes. Manukový med má tedy potenciál na léčbu chronických ran touto bakterií infikovanou (34, 35). Přítomnost biofilmu je prokázaná i u chronicky zanícených vedlejších dutin nosních, zejména u chronické rhinosinusitidě. Ukázalo se, že pacienti s tímto onemocněním, kdy je biofilm tvořen bakterií Staphylococcus aureus či Pseudomonas aeruginosa, mají statisticky mnohem horší pooperativní symptomy, návraty nemoci a jiné. Studie ukázaly, že baktericidní účinek na biofilmy těchto bakterií má opět manukový med, u kterého se však potvrdilo, že methylglyoxal není jediným důvodem baktericidity. Dalším medem, který dokázal zničit tyto biofilmy, byl cedrový med z Jemenu, o kterém je dlouho známo, že je úspěšný v léčbě chronických ran (32, 36, 37).

37

12. KOJENECKÝ BOTULISMUS Botulismus obecně je neurotoxický syndrom vyvolaný bakterií Clostridium botulinum, které vede k paralytickému postižení lidí i ostatních zvířat. Clostridium botulinum se vyskytuje v půdě, bahně a vodě, dále v trávicím ústrojí živočichů, odkud může být vylučována do vnějšího prostředí. Jedná se o obligátně anaerobní sporulující grampozitivní tyčky. Existuje 7 sérovarů, které produkují rozdílné typy botulotoxinu (A až G). U člověka většinou nastává otrava botulotoxinem typu A a B (zeleninové či masné konzervy). Botulotoxin typu E se uplatňuje při otravách z ryb a mořských plodů, botulotoxin typu C a D se nachází v bahně a mršinách a intoxikace byla pozorována pouze dobytka a drůbeže. Otravy botulotoxinem typu F a G jsou velice vzácné. Botulotoxin jako takový je termolabilní neurotoxin, zničený několikaminutovým varem. Letální dávka se pro člověka uvádí méně než 1 µg. Do potravin zejména konzerv se dostává po vyklíčení spor, které se do konzerv dostaly z vnějšího prostředí. Pro vyklíčení vegetativní formy Clostridium botulinum jsou zapotřebí anaerobní podmínky, proto se často vyskytují právě v konzervách. V trávicím traktu člověka se rozmnožovat nemůže díky kyselému prostředí. Z tohoto důvodu se nemůže Cl. botulinum rozmnožovat, růst ani tvořit botulotoxin v medu (11, 38–40). Projevy botulismu jsou způsobeny účinkem botulotoxinu, který se gastrointestinálním traktu dobře vstřebává. Jeho enzymatická aktivita inhibuje uvolňování acetylcholinu na presynaptické membráně nervosvalové ploténky a tím blokuje přenos vzruchu na svaly. Jako začínající klinické příznaky botulismu se uvádí dvojité vidění, ptóza víček, chrapot obtížné polykání, celková únava atd. Při postupu nemoci se objevuje obrna měkkého patra, zácpa, zástava močení z důvodů ochrnutí svalů, zvracení, závratě a parézy krčních svalů a horních končetin. Život ohrožující je ochrnutí dýchacích svalů s následnou zástavou dechu. Botulismus se v ČR vyskytne 2 až 3krát za rok (38, 40, 41). Existují však i formy botulismu, kdy se botulotoxin tvoří v organizmu člověka. Jedná se o kojenecký a ranný botulismus. Při ranném botulismu se Cl. botulinum rozmnožuje v ráně postiženého. Jedná se zpravidla o mladé jedince a příznaky jsou shodné jako u otravy alimentární. Při kojeneckém neboli střevním botulismu Cl. botulinum kolonizuje střevo dětí. Výskyt je do 9 měsíců věku. Kolonizace střeva je umožněna díky nedostatečně vyvinuté fyziologické mikroflóře střev dětí tohoto věku. Kojenecký botulismus má široké spektrum klinických příznaků od mírných až po náhlou smrt novorozence. Onemocnění se projevuje

38

zácpou, letargií, neprospíváním, špatným příjmem potravy, svalovou hypotonií a ve velmi vážných případech může dojít k těžké paralýze s dechovým selháním (38, 41, 42). Kojenecký botulismus se poprvé objevil jako syndrom hypotonického dítěte v roce 1976 v USA. V roce 1980 bylo v USA hospitalizováno 150 dětí a do dnešního dne čítá více než 600 případů. Díky toho se v USA intenzivně zkoumal zdroj infekce. Deset kategorií dětských jídel zahrnujících suché cereálie, odtučněné mléko, pasterizované kravské mléko, ovocné konzervy a džusy, třtinový cukr, čerstvé mrkve, med a kukuřičný sirup v celkovém počtu 910 vzorků byli analyzovány na spory Cl. botulinum a všechny byli negativní, kromě 100 vzorků medu a 8 vzorků kukuřičného sirupu. Díky toho se stal med předmětem zkoumání na přítomnost Cl. botulinum a neměl by být podáván dětem do 1 roku (41, 43). Existuje nepřeberné množství studií, které se zabývaly výskytem spor Cl. botulinum v medu. Zkoumané medy pocházely ze všech koutů světa. Souhrn velké části těchto studií dohromady zkoumal 2033 vzorků, z nichž 104 vzorků byli pozitivní na spory Cl. botulinum. Většina studií objevily spory v 5 až 15 % vzorků. U třetiny všech nahlášených případů ve světě bylo nahlášeno, že postižené děti jedly med. Nelze ani zjistit, zda v medu spory opravdu byly či se nenacházely již v nádobě a med nebyl kontaminován sekundárně (11, 28). Kojenecký botulismus se kromě USA vyskytuje i v ostatních zemích, zejména díky ubikvitárnímu výskytu Cl. botulinum. Mezi ně patří Anglie, Francie, Kanada, Japonsko, Argentina, Austrálie a v mnoha dalších státech. V ČR se poprvé vyskytl v roce 1979 ve Východočeském kraji. Po 60 denní hospitalizaci se stav kojence stabilizoval. Druhý a poslední případ byl v témže kraji o 10 let později. Jednalo se o 8měsíčního kojence, který zemřel syndromem náhlého úmrtí kojence, později zjištěného jako kojenecký botulismus (41, 43).

39

13. MED VE VÝŽIVĚ A ZDRAVÍ Díky znalosti složení a vlastností medu je jasné, že med se vyznačuje výbornými dietetickými, nutričními a potencionálně léčivými účinky. V naší zemi se med považuje spíše za přírodní lék než za potravinu. Svědčí o tom i jeho velice malá spotřeba (okolo 0,5 kg na obyvatele na rok). Ve výše popsaných kapitolách jsme se zmínili o antimikrobiálních účincích medu i o antioxidačních vlastnostech. Med se využívá v různých odvětvích potravinářského, farmaceutického a kosmetického průmyslu (12). Ukázalo se, že med má pozitivní účinky na problémy spojené se zažívacími problémy. Použití medu na řešení gastrointestinálních nemocí jako gastritida, gastroenteritida či vředová choroba gastroduodena je obsahem mnoha různých studií a publikací východní medicíny. Med je potencionálním inhibitorem tvorby peptidických vředů žaludku, protože má stimulační účinek na kapsaicin senzitivní smyslové nervy žaludku. Jako druhý mechanismus se udává antioxidační aktivita medu (21). Další účinek medu na lidské trávení a zažívání spočívá v oligosacharidech medu, kterým se přisuzuje podobný probiotický účinek jako fruktooligosacharidům. Největší účinek má oligosacharid panosa. Oligosacharidy zvyšují množství bifidobakterií a laktobacilů. V jiné studii med zvýšil jak in vitro, tak in vivo množství bakterií Lactobacillus acidophilus a Lactobacillus plantarum. V klinických studiích med u dětí zkrátil trvání infekčního průjmu a neprodloužil trvání průjmu neinfekčního. Na druhou stranu konzumace relativně velkého množství medu může působit mírně projímavě u jedinců, kteří mají sníženou schopnost absorpce medové fruktosy. Ve východní medicíně se med užívá k léčbě zácp (21). Med má také účinky na kardiovaskulární systém. Při studiích se jeho účinky porovnávaly s umělým medem (fruktosa a glukosa) či s glukosou. Zvýšení insulinu a C-reaktivního proteinu bylo vyšší po konzumaci glukosy než po medu. Glukosa redukovala cholesterol a LDL-cholesterol, avšak zvyšovala triacylglycerolů (TG). Med snižoval cholesterol, LDL-cholesterol, TG a naopak lehce zvyšoval HDL-cholesterol. U pacientů s hypertriacylglycerolémií umělý med zvýšil hladiny TG, zatímco med snížil. U pacientů s hyperlipidémií umělý med zvýšil hladiny LDL-cholesterolu oproti medu, který je zvýšil (21). Med má využití také v potravinářství (výroba perníků). Pekařským výrobkům med prodlužuje trvanlivost a zvyšuje křehkost pečiva díky vysoké hygroskopicitě. V cukrářství se 40

med v dnešní době využívá méně. Je známo, že z medu se vyrábí alkoholické nápoje medovina a méně známý medovec. Některé piva se doslazují medem či je jím dokonce nahrazena část sladiny. V některých zemích se kombinuje med s mléčnými výrobky jako například UHT mléko s medem, sušené mléko se sušeným medem či jogurty s medem (12).

41

14. MED FALŠOVÁNÍ U medu, stejně jako u ostatních potravin dochází k znehodnocování či falšování. Neúmyslné poškození samotným včelařem může nastat, když vytočí med s vysokým obsahem vody, který ještě nestihl dozrát. Úmyslné falšování by se dalo rozdělit na primitivní snadno odhalitelné a důmyslné odhalitelné pouze novými metodami (např. stanovení obsahu prolinu v medu) (25). Občas se můžeme setkat s úplnými náhražkami medu jako med pampeliškový, což je hustý cukerný sirup svařený s květy pampelišek. Zpřísnění pravidel a kontrol však tyto případy omezuje na výjimky. Na stejném principu je postaven i Turecký med, ten však nikoho nezmate (11). Primitivním způsobem falšování je krmení včelstev cukernými sirupy, kdy včely sice cukr zpracují, avšak sami část zkonzumují. Je otázkou, zda se tento způsob vůbec vyplatí. Ke krmení se využívají cukerné sirupy obohacené ovocnou či zeleninou šťávou. Po vytočení se získá produkt podobný medu. Důležité je si uvědomit, že se o med nejedná. Dalším problémem je, že včely při nadbytku této suroviny se silně vyčerpají a oslabí tak, že často pak podléhají nemocem (11). Nejčastějším způsobem je přidávání cukerných sirupů z cukrové třtiny nebo kukuřice přímo do medu. Sirupy se vyrábí chemickou a enzymovou hydrolýzou sacharidů na fruktosu a další monosacharidy. Někdy výrobci legálně prodávají tyto výrobky jako analoga medu, například HFCS (high fructose corn syrup). Při výrobě sirupů enzymatickým způsobem a navíc následným smícháním s podílem medu, se tyto výrobky velice těžko odhalují. Moderní metody si však i s těmito důmyslnými podvody poradí. Lze do medu přidávat i vodu, pokud se získal med s nízkým obsahem vody, ovšem tyto postupy jsou těžko pochopitelné. Je důležité říci, že zpravidla při tomto falšování produktu nehrozí spotřebiteli ohrožení zdraví. Jsou pouze klamáni, jelikož si místo přírodního medu kupují průmyslový výrobek na bázi škrobu či sacharosy (1, 11). Díky zvyšující se oblibě tmavých medovicových medů, se někdy výrobci a prodejci snaží své světlé produkty obarvit karamelem či jinými potravinářskými barvivy. Další vadou původně neznehodnoceného medu je vysoký obsah hydroxymethylfurfuralu (HMF). Jak již známo, takový med byl opakovaně a nešetrně ohříván či dlouhodobě skladován. Spotřebitele na zdraví neohrožuje, pouze ztratil požadované vlastnosti i účinky. Vada medu je i přítomnost 42

spor bakterií Paenibacillus larvae. Nemoc na člověka sice není přenosná, avšak její přítomnost značí, že pochází z nemocného včelstva. Dalším problémem je, že by mohl obsahovat stopy antibiotik a jiných léčiv (11).

43

PRAKTICKÁ ČÁST 15. METODIKA A MATERIÁL 15.1 TESTOVANÉ DRUHY MEDŮ Pro testování bylo pořízeno 20 kusů vzorků medu. Soubor testovaných vzorků se skládá ze 4 různých skupin vždy po 5 medech. První skupinou jsou medy květové zakoupené od maloprodejců ze dvora. Druhou skupinou jsou medy medovicové zakoupené téže u maloprodejců ze dvora. Třetí skupinu tvoří medy květové zakoupené v obchodním řetězci v Brně. Poslední skupina je tvořena medy medovicovými, které byli také zakoupené v obchodním řetězci. Medovicové medy označené jako lesní měly někdy ve složení napsáno smíšené či květomedovicové. Kvůli tomu jsou do skupiny zařazeny i medy smíšené, i když je naše nynější legislativa nerozlišuje. Bližší popis je v následující tabulce. Tabulka č. 7: Medy květové domácí Medy květové domácí Vzorek č. 1 Valašské Meziříčí

Lokalita úlu

Vzorek č. 2 Rýmařov

Lokalita úlu

Vzorek č. 3 Nové Těchanovice

Lokalita úlu

Vzorek č. 4 Klokočůvek

Lokalita úlu

Vzorek č. 5 Ohaveč

Lokalita úlu

Tabulka č. 8: Medy medovicové domácí Medy medovicové domácí Vzorek č. 6 Lokalita úlu

Valašské Meziříčí Vzorek č. 7

Lokalita úlu

Rýmařov 44

Vzorek č. 8 Lokalita úlu

Nové Těchanovice Vzorek č. 9

Lokalita úlu

Ostravice Vzorek č. 10

Lokalita úlu

Kopřivnice

Tabulka č. 9: Medy květové z obchodního řetězce Medy květové z obchodního řetězce Vzorek č. 11 Název

Med květový luční

Země původu

Směs medů ze zemí ES a ze zemí mimo ES.

Výrobce

MEDOKOMERC s.r.o. Vzorek č. 12

Název

BIO med květový

Země původu

Česká republika

Výrobce

PRO-BIO s.r.o. Vzorek č. 13

Název

MED včelí květový

Země původu

ČR; „směs medů ze zemí ES“

Výrobce

Product Bohemia s.r.o.

Vzorek č. 14 Název

Med luční

Země původu

Směs medů ze zemí ES a ze zemí mimo ES.

Výrobce

JSG med a.s. Vzorek č. 15

Název

Med květový

Země původu

ČR

Výrobce

JANKAR PROFI s.r.o.

45

Tabulka č. 10: Medy medovicové z obchodního řetězce Medy lesní z obchodního řetězce Vzorek č. 16 Název

Med lesní

Země původu

Směs medů ze zemí ES a ze zemí mimo ES.

Výrobce

MEDOKOMERC s.r.o. Vzorek č. 17

Název

Český med lesní

Země původu

Česká republika

Výrobce:

MEDOKOMERC s.r.o. Vzorek č. 18

Název

MED včelí smíšený lesní

Země původu

ČR; „směs medů ze zemí ES“

Výrobce

Product Bohemia s.r o. Vzorek č. 19

Název

Med lesní

Země původu

Směs medů ze zemí ES a ze zemí mimo ES.

Výrobce

JSG med a.s. Vzorek č. 20

Název

Med květovo lesní

Země původu

ČR

Výrobce

JANKAR PROFI s.r.o.

15.2 POUŽÍVANÉ DRUHY PŮD A ROZTOKŮ Plate Count Agar 1 (Standard Methods Agar) Výrobce: Himedia Laboratories Použití: Pro stanovení počtu mikroorganismů v potravině a vodě. Složení přípravku odpovídá požadavkům ČSN ISO 4833, 2293, 7698, 17410 a ČSN P ISO/TS 26844. Příprava: 23,5 g přípravku se rozpustí v 1 000 ml destilované vody a zahřívá se do úplného rozpuštění. Sterilizace v autoklávu při teplotě 121 °C po dobu 15 minut.

46

Složení: 

enzymatický hydrolyzát kaseinu

2,0 g/l



kvasničný extrakt

2,5 g/l



glukosa

1,0 g/l



agar

15,0 g/l

pH 7,0 ± 0,2 Violet Red Bile Agar 1,2 % Výrobce: Himedia Laboratories Použití: Pro selektivní stanovení počtu koliformních bakterií z vody a potravin. Složení přípravku odpovídá požadavkům ČSN ISO 5541/1 a 4832. Příprava: 38,5 g přípravku se rozpustí v 1000 ml destilované vody a zahřívá se do úplného rozpuštění. Neautoklávovat. Ihned ochladit ve vodní lázni na 45 °C. Složení: 

masový pepton

7,0 g/l



kvasničný extrakt

3,0 g/l



směs žlučových solí

1,5 g/l



laktosa

10,0 g/l



chlorid sodný

5,0 g/l



neutrální červeň

0,03 g/l



krystalová violeť

0,002 g/l



agar

12,0 g/l

pH 7,2 ± 0,2 HiCrome E. coli Agar Výrobce: Himedia Laboratories Použití: Pro detekci a stanovení počtu Escherichia Coli v potravinách, bez další konfirmace.

Složení

přípravku

odpovídá

požadavkům

ČSN

ISO

16649-1;

-2

a ČSN P ISO/TS 16649-3.

47

Příprava: 36,58 g přípravku se rozpustí v 1000 ml destilované vody a zahřívá se do úplného rozpuštění. Sterilizace v autoklávu při teplotě 121 °C po dobu 15 minut. Ihned ochladit ve vodní lázni na 50 °C. Složení: 

enzymatický hydrolyzát kaseinu

20,0 g/l



směs žlučových solí

1,5 g/l



X-glukuronid

0,075 g/l



agar

12,0 g/l

pH 7,2 ± 0,2 Gélose Dichloran Rose Bengale Chloramphénicol (DRBC) Výrobce: Biokar Diagnostics Použití: Pro selektivní izolaci a stanovení počtu kvasinek a plísní významně se podílejících na zkáze potravin. Příprava: 30 g přípravku se rozpustí v 1000 ml destilované vody a zahřívá se do úplného rozpuštění. Sterilizace v autoklávu při teplotě 121 °C po dobu 15 minut. Ihned ochladit ve vodní lázni na 44 až 47 °C. Složení: 

polypepton

2,0 g/l



glukosa

10,0 g/l



dihydrogenfosforečnan draselný

1,0 g/l



heptahydrát síranu hořečnatého

0,5 g/l



dichloran

2,0 mg/l



Rose Bengal

25,0 ml/g



chloramfenikol

50,0 mg/l



chlortetracyklin chlorhydrát

50,0 mg/l



heptahydrát síranu zinečnatého

10,0 mg/l



pentahydrát síranu měďnatého

5,0 mg/l



tergitol

1,0 ml/l



agar

12,4 g/l 48

pH 5,6 ± 0,2 Compas Bacillus Cereus Agar Výrobce: Biokar Diagnostics Použití: Půda je určená pro rozpoznání všech kmenů Bacillus cereus, včetně nehemolytických kmenů. Příprava: Půdy byly dodány v naplněných skleničkách po 10 ks. Skleničky se autoklávovaly při teplotě 121 °C po dobu 15 minut. Po zchlazení na 44 až 47 °C se do skleniček aplikoval suplement. Po té se lahvičky důkladně promíchaly. 3M Petrifilm Staph Express Count System Výrobce: 3M Corporation Použití: Použité petrifilmy nesou chromogenní modifikovanou Baird-Parkerovu půdu a jsou určené ke stanovení Staphylococcus aureus. Příprava: Petrifilmy byly dodány v uzavřených balíčcích. Po otevření byly připraveny ihned k použití. Fyziologický roztok Použití: Fyziologický roztok byl použit jako ředící roztok pro zkoumanou potravinu. Příprava: 9 g chloridu sodného se smíchalo s 1 000 ml destilované vody. Roztok se dále autoklávoval při teplotě 121 °C po dobu 15 minut.

15.3 LABORATORNÍ VYBAVENÍ A POMŮCKY Pro práci v laboratoři byly použity následující pomůcky: Petriho misky (průměr 90 mm), mechanické pipety, špičky, lžičky, sáčky, plastové kelímky, váha, peristaltický homogenizátor – stomacher, mikrobiologické hokejky, stojan na zkumavky, alobal, plynový kahan, vodní lázeň, termostaty, anaerostat, vyvíječ plynů (Oxoid), indikátor anaerobiózy (Oxoid), laboratorní sklo. Laboratorní sklo: mikrobiologické zkumavky s hliníkovými uzávěry, Erlenmayerovy baňky (250 ml, 500 ml, 1000 ml), kádinky (500 ml, 1000 ml), odměrný válec (100 ml, 1000 ml). 49

Sterilizace potřebných pomůcek se prováděla v horkovzdušném sterilizátoru či autoklávu. Laboratorní sklo bylo po použití umýváno v myčce. Pro sterilizaci laboratorního skla a lžiček se používal horkovzdušný sterilizátor, který sterilizoval při teplotě 160 °C po dobu 1 hodiny. Při sterilizaci bylo laboratorní sklo vždy přikryto alobalem. Špičky byly sterilizovány v plastové krabičce v autoklávu.

15.4 METODIKA Všech 20 vzorků bylo zpracováno ze začátku stejným způsobem. Nejdříve se přichystaly Erlenmayerovy baňky s 90 ml fyziologického roztoku, které se vysterilizovaly v autoklávu při 121 °C po dobu 15 minut. Dále byly zapotřebí sterilní sáčky na vzorky, homogenizátor, váha, sterilní lžičky, plastové kelímky a automatická pipeta se sterilními špičkami. Z každé skleničky medu byl odebrán vzorek o hmotnosti 10 g. Vzorek byl přímo odvážen do sáčku pomocí plastového kbelíku. Po odvážení a přilití fyziologického roztoku se sáček vložil do homogenizátoru, kde probíhala homogenizace po dobu 2 minut. Po důkladném protřepání se odebral vzorek automatickou pipetou v potřebném množství. Pro všechny stanovení bylo použito ředění 10-1 (44).

15.5 STANOVENÍ CELKOVÉHO POČTU MIKROORGANISMŮ Pro toto stanovení byla použita půda Plate Count Agar. Do dvou připravených sterilních Petriho misek se pipetou naočkovalo 1 ml analytického vzorku o ředění 10-1. Inokulum se přelilo 15 až 20 ml ochlazenou půdou na 44 až 47 °C. Takto zalité inokulum se pečlivě promíchalo kolébáním, aby se vzorek rozprostřel po celé ploše misky. Tato směs se nechala utuhnout na chladné vodorovné ploše. Zatuhlé Petriho misky se vložily dnem vzhůru do termostatu již nastaveném na 30 °C ± 1 °C, kde se inkubovaly po dobu 72 hodin ± 3 hodin. Po uplynutí doby inkubace se zkontroloval a spočítal nárůst mikroorganismů na obou miskách, na kterých nenarostlo více než 300 kolonií (45).

15.6 STANOVENÍ POČTU ANAEROBNÍCH SPORULUJÍCÍCH BAKTERIÍ Pro toto stanovení byla použita půda Plate Count Agar. Do dvou připravených sterilních zkumavek bylo pipetou odebráno 10 ml analytického vzorku o ředění 10-1. Zkumavky se podrobily teplotnímu šoku vložením do vodní lázně o teplotě 80 °C na dobu 10 minut. Po té se roztok pipetou naočkoval do dvou připravených sterilních Petriho misek. Inokulum se přelilo 15 až 20 ml ochlazenou půdou na 44 až 47 °C. Takto zalité inokulum se pečlivě promíchalo kolébáním, aby se vzorek rozprostřel po celé ploše misky. Tato směs se nechala 50

utuhnout na chladné vodorovné ploše. Zatuhlé Petriho misky se vložily dnem vzhůru do anaerostatu. Po té se do anaerostatu vložil vyvíječ plynů a indikátor anaerobiózy. Anaerostat se pečlivě uzavřel a vložil do termostatu již nastaveném na 25 °C, kde se inkuboval po dobu 7 dní. Po uplynutí doby inkubace se zkontroloval a spočítal nárůst mikroorganismů na obou miskách, na kterých nenarostlo více než 300 kolonií.

15.7 STANOVENÍ POČTU KOLIFORMNÍCH BAKTERIÍ Pro toto stanovení byla použita půda Violet Red Bile Agar.. Do dvou připravených sterilních Petriho misek se pipetou naočkovalo 1 ml analytického vzorku o ředění 10-1. Inokulum se přelilo 15 až 20 ml ochlazenou půdou. Takto zalité inokulum se pečlivě promíchalo kolébáním, aby se vzorek rozprostřel po celé ploše misky. Tato směs se nechala utuhnout na chladné vodorovné ploše. Zatuhlé Petriho misky se přelily ještě jednou vrstvou půdy o objemu cca 4 ml a poté se nechaly znovu zatuhnout. Takto zatuhlé misky se vložily dnem vzhůru do termostatu již nastaveném na 37 °C, kde se inkubovaly po dobu 48 hodin. Po uplynutí doby inkubace se zkontroloval a spočítal nárůst mikroorganismů na obou miskách, na kterých nenarostlo více než 150 kolonií (46).

15.8 STANOVENÍ POČTU BAKTERIÍ ESCHERICHIA COLI Pro toto stanovení byla použita půda HiCrome E. coli Agar. Do dvou připravených sterilních Petriho misek se pipetou naočkovalo 1 ml analytického vzorku o ředění 10-1. Inokulum se přelilo 15 až 20 ml ochlazenou půdou na 44 až 47 °C. Takto zalité inokulum se pečlivě promíchalo kolébáním, aby se vzorek rozprostřel po celé ploše misky. Tato směs se nechala utuhnout na chladné vodorovné ploše. Zatuhlé Petriho misky se vložily dnem vzhůru do termostatu, již nastaveném na 43 °C, kde se inkubovaly po dobu 24 hodin. Po uplynutí doby inkubace se zkontroloval a spočítal nárůst mikroorganismů na obou miskách, na kterých nenarostlo více než 300 kolonií (47).

15.9 STANOVENÍ POČTU KVASINEK A MIKROSKOPICKÝCH VLÁKNITÝCH HUB Pro toto stanovení byla použita půda Gélose Dichloran Rose Bengale Chloramphénicol. Do dvou připravených sterilních Petriho misek se pipetou naočkovalo 1 ml analytického vzorku o ředění 10-1. Inokulum se přelilo 15 až 20 ml ochlazenou půdou na 44 až 47 °C. Takto zalité inokulum se pečlivě promíchalo kolébáním, aby se vzorek rozprostřel po celé ploše misky. Tato směs se nechala utuhnout na chladné vodorovné ploše. Zatuhlé Petriho misky se vložily víčky vzhůru do termostatu, již nastaveném na 25 °C, kde se inkubovaly 51

po dobu 7 dní. Po uplynutí doby inkubace se zkontroloval a spočítal nárůst mikroorganismů na obou miskách, na kterých nenarostlo více než 150 kolonií (48).

15.10 STANOVENÍ POČTU BAKTERIÍ BACILLUS CEREUS Pro toto stanovení byla použita půda Compass Bacillus Cereus Agar, která byla již dodávána ve skleněných lahvičkách. Do vyautoklávovaných, již ochlazených lahviček se aplikoval supplement. Po zamíchání lahvičky se půda rozlila do dvou připravených sterilních Petriho misek o objemu 15 až 20 ml. Po zatuhnutí půdy se na povrch naočkovalo 0,33 ml o ředění 10-1. Naočkované inokulum se rozetřelo mikrobiologickou kličkou po povrchu půdy a inkubovalo se dnem vzhůru při teplotě 30 °C po dobu 48 hodin. Po uplynutí doby v termostatu byl pozorován a spočítán mikrobiologický nárůst.

15.11 STANOVENÍ POČTU BAKTERIÍ STAPHYLOCOCCUS AUREUS Pro toto stanovení byl použit 3M Petrifilm Staph Express Count System. Po otevření balíčku s petrifilmy se jeden vyňal a položil na vodorovnou plochu. Nejprve se nadzvedla průhledná svrchní folie, pod kterou se nacházela plotna, na kterou se naočkoval 1 ml analytického vzorku. Následně se svrchní folie opatrně překryla zpět, aniž by se pod ní vytvořily bubliny. Po té se pomocí dodané speciální umělohmotné placky rozprostřelo inokulum krouživými pohyby po celé ploše půdy. Petrifilmy se inkubovaly průhlednou folií nahoru při teplotě 37 °C po dobu 48 hodin. Po uplynutí doby v termostatu byl pozorován a spočítán mikrobiologický nárůst.

15.12 HODNOCENÍ VÝSLEDKŮ Mikrobiologický nárůst byl hodnocen pouze kvantitativně. Na jednotlivých miskách byly spočítány jednotlivé kolonie s použitím černé podložky pouhým okem. Počet mikroorganismů přítomných v analytickém vzorku se spočítal a vyjádřil dle následující rovnice: ∑ ( 

)

∑C: je součet všech kolonií ze všech ploten vybraných pro výpočet ze dvou po sobě následujících ředění, přičemž nejméně jedna z ploten obsahuje 10 kolonií



V: je objem inokula v ml očkovaného na každou z ploten



n1: je počet ploten vybraných k výpočtu z prvního zvoleného ředění 52



n2: je počet ploten vybraných k výpočtu z druhého zvoleného ředění



d: je faktor ředění odpovídající prvnímu pro výpočet zvoleného ředění

Pro použití této rovnice je nutností, aby alespoň jedna miska obsahovala 10 kolonií. Výsledek byl zaokrouhlen tak, aby obsahoval pouze dvě číslice. Počet mikroorganismů se uvedl jako kolonie tvořících jednotek v 1 gramu – KTJ/g (49, 50). Stanovení počtu mikroorganismů u dvojic misek, u kterých ani jedna miska neobsahovala 10 kolonií se vyjádřilo odhadem počtu následující rovnicí: ∑ (

)



∑C: je součet kolonií z obou ploten



V: je objem inokula v ml očkovaného na každou plotnu



n: je počet ploten zvolených k výpočtu



d: je ředící faktor výchozí suspenze nebo prvního z použitých ředění zvoleného k výpočtu

Podmínkou použití této rovnice je, aby na každé z ploten vyrostlo alespoň 4 kolonie. Výsledek se vyjádřil stejně jako u prvního případu (49, 50). Pokud ani na jedné z dvojic nevyrostla žádná kolonie, výsledek byl vyjádřen jako méně než 1/(V.d) na gram medu, tedy <1,0 x 101 KTJ/g (49, 50).

53

16. VÝSLEDKY 16.1 HODNOCENÍ CELKOVÉHO POČTU MIKROORGANIZMŮ Stanovení celkového počtu mikroorganizmů bylo provedeno dle metodiky popsané v kapitole výše a dle horizontální metody pro stanovení celkového počtu mikroorganismů České technické normy ČSN EN ISO 4833 (45). Výsledky jsou uvedeny v tabulkách a grafu viz níže. Tabulka č. 11: Celkový počet mikroorganismů Medy květové domácí

Medy medovicové domácí

Číslo vzorku

KTJ.g-1

Číslo vzorku

KTJ.g-1

č. 1

2,5x101

č. 6

2,5x101

č. 2

1,0x101

č. 7

1,0x101

č. 3

1,5x101

č. 8

1,5x101

č. 4

6,5x101

č. 9

1,5x101

č. 5

7,0x101

č. 10

<1,0x101

Medy květové z obchodního řetězce

Medy medovicové z obchodního řetězce

Číslo vzorku

KTJ.g-1

Číslo vzorku

KTJ.g-1

č. 11

1,8x102

č. 16

1,3x102

č. 12

8,0x101

č. 17

2,5x101

č. 13

2,0x101

č. 18

6,0x101

č. 14

2,3x102

č. 19

2,0x101

č. 15

1,0x101

č. 20

4,0x101

54

Obrázek č. 1: Celkový počet mikroorganismů

Celkový počet mikroorganismů 250

KTJ/g

200

150

100

50

0

Medy květové domácí Medy medovicové domácí Medy květové z obchodního řetězce Medy medovicové z obchodního řetězce

55

16.2 HODNOCENÍ POČTU ANAEROBNÍCH SPORULUJÍCÍCH BAKTERIÍ Stanovení počtu anaerobních sporulujících bakterií bylo provedeno dle metodiky popsané výše. Výsledky jsou uvedeny v tabulkách a grafu viz níže. Tabulka č. 12: Počet anaerobních sporulujících bakterií Medy květové domácí

Medy medovicové domácí

Číslo vzorku

KTJ.g-1

Číslo vzorku

KTJ.g-1

č. 1

<1,0x101

č. 6

<1,0x101

č. 2

<1,0x101

č. 7

<1,0x101

č. 3

<1,0x101

č. 8

<1,0x101

č. 4

1,0x101

č. 9

1,0x101

č. 5

1,0x101

č. 10

<1,0x101

Medy květové z obchodního řetězce

Medy medovicové z obchodního řetězce

Číslo vzorku

KTJ.g-1

Číslo vzorku

KTJ.g-1

č. 11

2,0x101

č. 16

4,0x101

č. 12

<1,0x101

č. 17

<1,0x101

č. 13

<1,0x101

č. 18

2,0x101

č. 14

1,0x101

č. 19

<1,0x101

č. 15

<1,0x101

č. 20

1,0x101

56

Obrázek č. 2: Počet anaerobních sporulujících bakterií

Počet anaerobních sporulujících bakterií 4 3,5

KTJ/g

3 2,5 2 1,5 1 0,5 0

Medy květové domácí Medy medovicové domácí Medy květové z obchodního řetězce Medy medovicové z obchodního řetězce

57

16.3 STANOVENÍ POČTU KOLIFORMNÍCH BAKTERIÍ Stanovení počtu koliformních bakterií bylo provedeno dle metodiky uvedené výše a dle horizontální metody stanovení počtu koliformních bakterií České technické normy ČSN ISO 4832 (46). Výsledky jsou uvedeny v tabulkách a grafu viz níže. Tabulka č. 13: Počet koliformních bakterií Medy květové domácí

Medy medovicové domácí

Číslo vzorku

KTJ.g-1

Číslo vzorku

KTJ.g-1

č. 1

<1,0x101

č. 6

<1,0x101

č. 2

<1,0x101

č. 7

<1,0x101

č. 3

<1,0x101

č. 8

<1,0x101

č. 4

<1,0x101

č. 9

<1,0x101

č. 5

<1,0x101

č. 10

<1,0x101

Medy květové z obchodního řetězce

Medy medovicové z obchodního řetězce

Číslo vzorku

KTJ.g-1

Číslo vzorku

KTJ.g-1

č. 11

<1,0x101

č. 16

<1,0x101

č. 12

<1,0x101

č. 17

<1,0x101

č. 13

<1,0x101

č. 18

<1,0x101

č. 14

<1,0x101

č. 19

<1,0x101

č. 15

<1,0x101

č. 20

<1,0x101

58

Obrázek č. 3: Počet koliformních bakterií

Počet koliformních mikroorganismů 1 0,9 0,8

KTJ/g

0,7 0,6 0,5 0,4 0,3

0,2 0,1 0

Medy květové domácí Medy medovicové domácí Medy květové z obchodního řetězce Medy medovicové z obchodního řetězce

Výsledky ukazují, že žádný ze vzorků medů nebyl kontaminován koliformními bakteriemi.

59

16.4 STANOVENÍ POČTU BAKTERIÍ ESCHERICHIA COLI Stanovení počtu bakterií Escherichia coli bylo provedeno dle metodiky uvedené výše a dle metodického doporučení SZÚ č. 1/1999/CZŽP (47). Výsledky jsou uvedeny v tabulkách a grafu viz níže. Tabulka č. 17: Počet bakterií Escherichia coli Medy květové domácí

Medy medovicové domácí

Číslo vzorku

KTJ.g-1

Číslo vzorku

KTJ.g-1

č. 1

<1,0x101

č. 6

<1,0x101

č. 2

<1,0x101

č. 7

<1,0x101

č. 3

<1,0x101

č. 8

<1,0x101

č. 4

<1,0x101

č. 9

<1,0x101

č. 5

<1,0x101

č. 10

<1,0x101

Medy květové z obchodního řetězce

Medy medovicové z obchodního řetězce

Číslo vzorku

KTJ.g-1

Číslo vzorku

KTJ.g-1

č. 11

<1,0x101

č. 16

<1,0x101

č. 12

<1,0x101

č. 17

<1,0x101

č. 13

<1,0x101

č. 18

<1,0x101

č. 14

<1,0x101

č. 19

<1,0x101

č. 15

<1,0x101

č. 20

<1,0x101

60

Obrázek č. 4: Počet bakterií Escherichia coli

Počet bakterií Escherichia coli 1 0,9 0,8

KTJ/g

0,7 0,6 0,5 0,4 0,3

0,2 0,1 0

Medy květové domácí Medy medovicové domácí Medy květové z obchodního řetězce Medy medovicové z obchodního řetězce

Výsledky ukazují, že žádný ze vzorků medů nebyl kontaminován bakteriemi Escherichia coli.

61

16.5 STANOVENÍ POČTU KVASINEK A MIKROSKOPICKÝCH VLÁKNITÝCH HUB Stanovení počtu kvasinek a mikroskopických vláknitých hub bylo provedeno dle metodiky uvedené výše a dle horizontální metody stanovení počtu kvasinek a plísní České technické normy ČSN ISO 21527 – 1 (48). Výsledky jsou uvedeny v tabulkách a grafu viz níže. Tabulka č. 19: Počet kvasinek a mikroskopických vláknitých hub Medy květové domácí

Medy medovicové domácí

Číslo vzorku

KTJ.g-1

Číslo vzorku

KTJ.g-1

č. 1

<1,0x101

č. 6

1,0x101

č. 2

4,5x101

č. 7

3,5x101

č. 3

<1,0x101

č. 8

1,0x101

č. 4

<1,0x101

č. 9

1,0x101

č. 5

3,5x101

č. 10

4,0x101

Medy květové z obchodního řetězce

Medy medovicové z obchodního řetězce

Číslo vzorku

KTJ.g-1

Číslo vzorku

KTJ.g-1

č. 11

1,0x101

č. 16

<1,0x101

č. 12

<1,0x101

č. 17

<1,0x101

č. 13

<1,0x101

č. 18

<1,0x101

č. 14

<1,0x101

č. 19

<1,0x101

č. 15

<1,0x101

č. 20

<1,0x101

62

Obrázek č. 5: Počet kvasinek a mikroskopických vláknitých hub

Počet kvasinek a mikroskopických vláknitých hub 45 40

KTJ/g

35 30 25 20 15

10 5 0

Medy květové domácí Medy medovicové domácí Medy květové z obchodního řetězce Medy medovicové z obchodního řetězce

63

16.6 STANOVENÍ POČTU BAKTERIÍ BACILLUS CEREUS Stanovení počtu bakterií Bacillus cereus bylo provedeno dle metodiky uvedené výše. Výsledky jsou uvedeny v tabulkách a grafu viz níže. Tabulka č. 21: Počet bakterií Bacillus cereus Medy květové domácí

Medy medovicové domácí

Číslo vzorku

KTJ.g-1

Číslo vzorku

KTJ.g-1

č. 1

<1,0x101

č. 6

<1,0x101

č. 2

<1,0x101

č. 7

<1,0x101

č. 3

<1,0x101

č. 8

<1,0x101

č. 4

1,5x101

č. 9

<1,0x101

č. 5

<1,0x101

č. 10

<1,0x101

Medy květové z obchodního řetězce

Medy medovicové z obchodního řetězce

Číslo vzorku

KTJ.g-1

Číslo vzorku

KTJ.g-1

č. 11

3,0x101

č. 16

1,4x104

č. 12

1,5x101

č. 17

<1,0x101

č. 13

1,4x102

č. 18

<1,0x101

č. 14

<1,0x101

č. 19

<1,0x101

č. 15

1,5x101

č. 20

<1,0x101

64

Obrázek č. 6: Počet bakterií Bacillus cereus

Počet bakterií Bacillus cereus 1400 1200

KTJ/g

1000 800 600 400 200 0

Medy květové domácí Medy medovicové domácí Medy květové z obchodního řetězce Medy medovicové z obchodního řetězce

65

16.7 STANOVENÍ POČTU BAKTERIÍ STAPHYLOCOCCUS AUREUS Stanovení počtu bakterií Staphylococcus aureus bylo provedeno dle metodiky uvedené výše. Výsledky jsou uvedeny v tabulkách a grafu viz níže. Tabulka č. 23: Počet bakterií Staphylococcus aureus Medy květové domácí

Medy medovicové domácí

Číslo vzorku

KTJ.g-1

Číslo vzorku

KTJ.g-1

č. 1

1,0x101

č. 6

<1,0x101

č. 2

<1,0x101

č. 7

<1,0x101

č. 3

1,0x101

č. 8

<1,0x101

č. 4

1,0x101

č. 9

<1,0x101

č. 5

3,0x101

č. 10

<1,0x101

Medy květové z obchodního řetězce

Medy medovicové z obchodního řetězce

Číslo vzorku

KTJ.g-1

Číslo vzorku

KTJ.g-1

č. 11

<1,0x101

č. 16

1,0x101

č. 12

1,0x101

č. 17

1,0x101

č. 13

1,0x101

č. 18

<1,0x101

č. 14

<1,0x101

č. 19

<1,0x101

č. 15

<1,0x101

č. 20

<1,0x101

66

Obrázek č. 7: Počet bakterií Staphylococcus aureus

Počet bakterií Staphylococcus aureus 30 25

KTJ/g

20 15 10 5 0

Medy květové domácí Medy medovicové domácí Medy květové z obchodního řetězce Medy medovicové z obchodního řetězce

67

17. DISKUZE Med jako ostatní přírodní produkty může být kontaminován různými mikroorganismy. Na druhou stranu je známo, že med se vyznačuje silnou antimikrobiální aktivitou. Mikrobiální hodnocení medu často kopíruje hodnocení ostatních potravin, což nemusí být vždy relevantní. U medů se obvykle stanovuje celkový počet mikroorganismů, počet koliformních bakterií, kvasinky, plísně a jednotlivé patogenní bakterie jako Staphylococcus aureus, Salmonella spp., Clostridium spp., a další (28). Celkový počet mikroorganismů se u medů lišil, nejnižší množství měl med medovicový domácí s označením č. 10, který obsahoval celkový počet mikroorganismů <1,0x101 KTJ.g-1. Nejvyšší celkový počet mikroorganismů 2,3x102 KTJ.g-1 byl stanoven u medu květového z obchodního řetězce. Hodnoty se pohybovaly podobně jako výsledky ostatních výzkumů, tedy v rozmezí hodnot od 1,0x100 do 5,0x103 KTJ.g-1 (28). Průměrné hodnoty celkového počtu mikroorganismů dopadly nejlépe u medů medovicových domácích. Při posuzování mikrobiologické kvality smíšených medů ze Slovenské republiky byly hodnoty celkového počtu mikroorganismů v rozmezí od 2,4x101 do 1,4x103 KTJ.g-1 (51). Počet anaerobních sporulujících bakterií se u analyzovaných medů také lišil. Ve 12 z 20 analyzovaných vzorků byl jejich počet nižší než 1,0x101 KTJ.g-1, což činí 60 %. Hodnoty se pohybovaly od <1,0x101 do 4,0x101 KTJ.g-1. Při zkoumání mikrobiologické kvality polských medů byly anaerobní sporulující bakterie detekovány v 14,3 % akátových medů a ve 36,4 % řepkových medů. Velké rozdíly jsou díky množství zkoumaných medů (52). Počet koliformních bakterií byl u všech medů nižší než 1,0x101 KTJ.g-1. Při hodnocení však na žádné misce nebyla detekována ani jedna kolonie koliformních bakterií. Podle mikrobiologických kritérií pro potraviny dle České technické normy ČSN 56 9609 může med při odběru 5 vzorků obsahovat maximálně v jednom z nich až 1,0x102 KTJ.g-1. Koliformní bakterie jsou obecně indikátorem fekálního znečištění, v potravinářství pak indikátorem hygieny a správné výrobní praxe (53). Počet bakterií Escherichia coli byl taktéž u všech medů nižší než 1,0x101 KTJ.g-1. Podle mikrobiologických kritérií pro potraviny dle České technické normy ČSN 56 9609 nesmí být Escherichia coli O 157 a další verocytotoxin produkující E. coli prokazatelná ve 25 g medu. Podle Kamlera et al. (2006) může být Escherichia coli přítomna v počtu méně než 1,0x102 KTJ.g-1 (53, 54). 68

Hodnoty počtu kvasinek a mikroskopických vláknitých hub se pohybovaly od <1,0x101 do 4,5x101 KTJ.g-1. U medu medovicových z obchodního řetězce byly hodnoty u všech medů nižší než 1,0x101 KTJ.g-1. Značně lépe dopadly medy z obchodních řetězců než medy domácí. Vyšší výskyt plísní u domácích medů může být způsoben růstem plísní v primárních zdrojích (včela, úl, prach), ale i kontaminací sekundární (medobraní). U medovicových medů může být vyšší výskyt epifytických osmofilních hub původem z medovice. Kvasinky jsou problémem medového průmyslu, protože mohou růst v kyselém prostředí a nejsou inhibovány sacharosou. Při navození vhodných podmínek mohou způsobit fermentaci medu, která způsobí, že je med nepoživatelný (28). Jejich vyšší obsah v domácích medech mohl být způsoben vyšším obsahem vody v medech. Při zkoumání mikrobiologické kvality polských medů pouze několik vzorků přesáhlo hodnotu 1,0x102 KTJ.g-1. Podle mikrobiologických kritérií pro potraviny dle České technické normy ČSN 56 9609 nejvyšší mezní hodnota pro kvasinky v medu je 1,0x107 KTJ.g-1. Plísně musí být viditelné pouhým okem (52, 53). Všechny zkoumané medy splnili výše uvedené mikrobiologické kritéria. Počet bakterií Bacillus cereus byl ve 14 vzorcích z 20 nižší než 1,0x101 KTJ.g-1. Nejhůře dopadl med medovicový z obchodního řetězce č. 16 s hodnotou 1,4x104 KTJ.g-1. Tento vzorek nevyhovuje nejvyšší mezní hodnotě dle mikrobiologických kritérií pro potraviny dle České technické normy ČSN 56 9609. Ostatní vzorky nejvyšší mezní hodnotě vyhovovaly (53). Bacillus cereus je nejčastější identifikovatelná bakterie medu (28). Potravina obsahující více než 1,0x104 spor či vegetativních forem může vyvolat otravu jídlem. Při izolaci bakterií Bacillus cereus bylo zjištěno, že v jednotlivých vzorcích existuje vysoký stupeň diverzity fenotypů i genotypů. Vysvětlením je nejspíše různorodý původ kontaminace jako například pyl, prach, včely, včelí vosk či nářadí (55). Počet bakterií Staphylococcus aureus byl ve 12 vzorcích z 20 nižší než 1,0x101 KTJ.g-1. Nejhůře dopadly medy květové domácí, zejména vzorek č. 5 s hodnotou 3,0x101 KTJ.g-1. Všechny

vzorky

medů

vyhovovaly

nejvyšší

mezní

hodnotě

1,0x104

KTJ.g-1

dle mikrobiologických kritérií pro potraviny dle České technické normy ČSN 56 9609 (53). Staphylococcus aureus patří také mezi bakterie, které jsou často identifikovány v medu. Jelikož však nepřežívají medobraní jako většina vegetativních forem bakterií, musí se do medu dostat sekundárně až po zpracování medu. Vyšší kontaminace domácích medů může značit špatnou manipulaci včelaře s medem již zpracovaným (28). Při celkovém zhodnocení všech analyzovaných medů dopadly lépe medy domácí, avšak ne jednoznačně. Kromě výjimky medu č. 16, všechny zkoumané medy splňovaly stanovené 69

nejvyšší mezní hodnoty. Přesto je možné vyvodit nepatrné rozdíly u jednotlivých skupin medů. Hodnoty celkového počtu mikroorganismů i počtu anaerobních sporulujících bakterií byl nižší u medů domácích. Při ředění 10-1 nebyla ani na jednom vzorku detekována kolonie koliformních bakterií ani bakterií Escherichia coli, tudíž jejich počet byl nižší než 1,0x101 KTJ.g-1. Hodnoty počtu kvasinek a mikroskopických vláknitých hub byly značně vyšší u medů domácích. Bacillus cereus se vyskytoval spíše v medech z obchodního řetězce, zejména ve vzorku č. 16, kde překročil nejvyšší mezní hodnotu. Staphylococcus aureus se vyskytoval nejvíce v medech květových domácích, v medech medovicových domácích detekován nebyl. U medů z obchodního řetězce se také více vyskytoval v medech květových. I přes antimikrobiální aktivitu medu mohou být medy mikrobiálně kontaminovány jak primárně, tak sekundárně. Proto je důležité dodržovat správnou výrobní praxi a hygienu při vytáčení a dalším zpracování medu. Mikrobiologická analýza medů by se neměla zaměřovat pouze na kvantifikaci celkového počtu mikroorganismů a koliformních bakterií, ale i na doplňkové analýzy s možností širší mikrobiologické charakteristiky s vyvozením možných následků. Například stanovení počtu anaerobních sporulujících bakterií včetně Clostridium botulinum pro prevenci kojeneckého botulismu. Díky potenciálnímu riziku by však med neměl být podáván dětem do jednoho roku.

70

18. ZÁVĚR V této práci bylo testováno celkem 20 medů (5 květových medů zakoupených od maloprodejců, 5 medovicových medů zakoupených od maloprodejců, 5 medů květových zakoupených v obchodním řetězci, 5 medů medovicových zakoupených v obchodním řetězci). Všechny byly testovány na celkové počty mikroorganismů, anaerobní sporulující bakterie, koliformní bakterie, bakterie Escherichia coli, kvasinky a mikroskopické vláknité houby, bakterie Bacillus cereus a bakterie Staphylococcus aureus. Z výsledků vyplývá: 

Celkový počet mikroorganismů u všech medů přesáhl 1,0 x 101 KTJ, kromě vzorku č. 10 (medovicový med domácí). Nejvíce kontaminovány byly medy květové zakoupené v obchodním řetězci.



Počet anaerobních sporulujících bakterií u jednotlivých medů nebyl jednotný. Větší polovina všech medů měla počet nižší než 1,0 x 101 KTJ. Nejvíce kontaminovány byly medy medovicové z obchodního řetězce, zejména vzorek č. 17 s počtem 4,0 x 101 KTJ.



Koliformními bakteriemi nebyl kontaminován žádný med.



Escherichia coli nebyla nalezena v žádném zkoumaném medu.



Kvasinkami a mikroskopickými vláknitými houbami byly kontaminovány zejména medy domácí s výjimkou vzorku medu č. 11.



Bacillus cereus nebyl nalezen v žádném domácím medu kromě výjimky květového medu č. 4. Kontaminace byla zjevná u medů z obchodního řetězce, zejména medů květových. Medovicový med z obchodního řetězce byl kontaminován sice pouze vzorek č. 16, avšak počet bakterií byl 1,4 x 104 KTJ, značně vyšší oproti ostatním.



Medy medovicové domácí nebyly kontaminovány bakterií Staphylococcus aureus. V ostatních skupinách byl vždy alespoň jeden vzorek kontaminován, zejména medy květové domácí.

71

SEZNAM LITERATURY 1. VORLOVÁ, Lenka. Med: souborná analýza. Vyd. 1. Brno: Veterinární a farmaceutická univerzita, Fakulta veterinární hygieny a ekologie, 2002. ISBN 8073054507 9788073054502. 2. HANKE, Eva, Iva KRATOCHVÍLOVÁ a Ernst EGNER. Med: sladký pomocník, ideální léčitel, přírodní kosmetikum. Praktické recepty. Praha: Ivo Železný, 2001. ISBN 8024018462 9788024018461. 3. OREY, Cal. Zázračná síla medu /. Vyd. 1. Praha: Ikar,, 2012. ISBN 802491932X. 4. MÁNEK, Jindřich, Miloš BIČ a Josef Bohumil SOUČEK. Bible: písmo svaté Starého a ového zákona : český ekumenický překlad. 13. vyd., (2. opr. vyd.). Praha: Česká biblická společnost, 2004. ISBN 8085810360 9788085810363. 5. BLAHOVÁ, Kateřina. Med. 1. Vyd. Praha: Sun, 2010. ISBN 9788073713423 807371342X. 6. ŠVAMBERK, Václav. Záhadné včely : tajemný svět včel II /. 2., upr. a dopl. vyd. Líbeznice: Víkend,, 2003. ISBN 8072222856. 7. FRANK, Renate. Zázračný med /. B.m.: Víkend,, 2010. ISBN 8074330249. 8. Vyhláška č. 76/2003 Sb., kterou se stanoví požadavky pro přírodní sladidla, med, cukrovinky, kakaový prášek a směsi kakaa s cukrem, čokoládu a čokoládové bonbony 9. CODEX ALIMENTARIUS. Codex standard for honey. FAO, Rome. 2001, s. 19–26. 10. BENTZIEN, Claudia. Ekologický chov včel : včelaření podle pravidel přírody /. B.m.: Víkend,, 2008. ISBN 8086891860. 11. TITĚRA, Dalibor. Včelí produkty mýtů zbavené : med, vosk, pyl, mateří kašička, propolis, včelí jed /. Vyd. 1. B.m.: Ve spolupráci s Českým svazem včelařů vyd. nakl. Brázda,, 2006. ISBN 802090347X. 12. PŘIDAL, Antonín. Vznik, získávání, zpracování a kontrola medu : odborný kurz : další vzdělávání pedagogických pracovníků Středních odborných škol /. B.m.: Mendelova univerzita v Brně,, 2013. ISBN 8073757370. 13. Svazová norma ČESKÝ MED orma jakosti č . Č SV 1/1999 14. VESELÝ, Vladimír. Včelařství /. Vyd. 3. B.m.: Brázda,, 2013. ISBN 8020903992. 15. HARAGSIM, Oldřich. Medovice a včely /. Vyd. 2., dopl., V nakl. Brázda 1. B.m.: Ve spolupráci s Českým svazem včelařů vydalo nakl. Brázda,, 2005. ISBN 8020903321. 16. PŘIDAL, Antonín. Včelí produkty /. Vyd. 1. B.m.: Mendelova zemědělská a lesnická univerzita,, 2003. ISBN 8071577170. 17. Manuál fyzikálních vlastností potravin /. 1. vyd. B.m.: Středisko technických informací potravinářského průmyslu Výzkumného ústavu potravinářského průmyslu,, 1988. Vybraná inž. data pro potravinářský prům. 18. CAKL, Jiří, UNIVERZITA PARDUBICE a ÚSTAV ENVIRONMENTÁLNÍHO A CHEMICKÉHO INŽENÝRSTVÍ. Úvod do procesů a zařízení potravinářských výrob I. Pardubice: Univerzita Pardubice, 2013. ISBN 9788073956714 8073956713. 72

19. BOGDANOV, S., K. BIERI, G. GREMAUD, D. IFF, A. KÄNZIG, K. SEILER, H. STÖCKLI a K. ZÜRCHER. Bienenprodukte; 23 A Honig. Swiss Food Manual. 2003, s. 1–35. 20.

EIß, Karl. Víkendový včelař : škola včelaření s nástavkovými úly /. 2. vyd. B.m.: Víkend,, 2010. ISBN 8072226827.

21. BOGDANOV, Stefan, Tomislav JURENDIC, Robert SIEBER a Peter GALLMANN. Honey for Nutrition and Health: a Review [online]. nedatováno [vid. 4. duben 2014]. Dostupné z: http://www.researchgate.net/publication/23803275_Honey_for_nutrition_and_health_a_review/fil e/9fcfd507d8f1ebbb94.pdf 22. BELITZ, H.-D., Hans-Dieter BELITZ, Werner GROSCH a Peter SCHIEBERLE. Lehrbuch der lebensmittelchemie. B.m.: Springer DE, 2001. 23. CRANE, Eva. Bees and beekeeping: science, practice and world resources. [online]. B.m.: Heinemann Newnes, 1990 [vid. 25. duben 2014]. Dostupné z: http://www.cabdirect.org/abstracts/19900228408.html 24. MURKOVIC, Michael a Nicole PICHLER. Analysis of 5-hydroxymethylfurfual in coffee, dried fruits and urine. Molecular Nutrition & Food Research [online]. 2006, roč. 50, č. 9, s. 842–846 [vid. 5. duben 2014]. ISSN 1613-4133. Dostupné z: doi:10.1002/mnfr.200500262 25. STEINHAUSEROVÁ, Iva, Jana SIMEONOVOVÁ, Eva NÁPRAVNÍKOVÁ a Bohuslava TREMLOVÁ. Produkce a zpracování drůbeže, vajec a medu. Brno: Veterinární a farmaceutická univerzita Brno, 2003. ISBN 8073054620 9788073054625. 26. AL-WAILI, Noori, Khelod SALOM, Ahmed AL-GHAMDI a Mohammad Javed ANSARI. Antibiotic, Pesticide, and Microbial Contaminants of Honey: Human Health Hazards [online]. 2012 [vid. 7. duben 2014]. Dostupné z: http://www.researchgate.net/publication/232700671_Antibiotic_pesticide_and_microbial_contami nants_of_honey_human_health_hazards/file/72e7e51cca22137458.pdf 27. IOJRIŠ, Naum Petrovič. Včely a zdraví /. 1. vyd. B.m.: SZN,, 1974. Živočišná výroba (Státní zemědělské nakladatelství). 28. SNOWDON, Jill A. a Dean O. CLIVER. Microorganisms in honey. International Journal of Food Microbiology. 1996, roč. 31, č. 1, s. 1–26. 29. BOGDANOV, Stefan. Nature and Origin of the Antibacterial Substances in Honey [online]. 1997 [vid. 25. duben 2014]. Dostupné z: http://www.beehexagon.net/files/file/fileE/Honey/Bogdanov_LWT_1997_sb.pdf 30. SCHINDLER, Jiří. Ze života bakterií /. Vyd. 1. B.m.: Academia,, 2008. Průhledy (Academia). ISBN 802001666X. 31. SCHINDLER, Jiří. Mikrobiologie : pro studenty zdravotnických oborů /. 1. vyd. B.m.: Grada,, 2010. Sestra (Grada). ISBN 8024731703. 32. RULÍK, Martin, UNIVERZITA PALACKÉHO a PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA. Mikrobiální biofilmy. Olomouc: Univerzita Palackého v Olomouci, 2011. ISBN 9788024427478 8024427478. 33. NASSAR, Hani M., Mingyun LI a Richard L. GREGORYA. Effect of Honey on Streptococcus mutans Growth and Biofilm Formation [online]. 2012 [vid. 23. duben 2014]. Dostupné z: http://www.researchgate.net/publication/51753213_Effect_of_honey_on_Streptococcus_mutans_ growth_and_biofilm_formation/file/60b7d521e0c1cbdc9f.pdf 73

34. MERCKOLL, PATRICIA, TOM ØYSTEIN JONASSEN a MARIE ELISABETH VAD. Bacteria, biofilm and honey: A study of the effects of honey on ‘planktonic’and biofilm-embedded chronic wound bacteria. Scandinavian Journal of Infectious Diseases. 2009, roč. 41, s. 341Á347. 35. MADDOCKS, S. E., M. S. LOPEZ, R. S. ROWLANDS a R. A. COOPER. Manuka honey inhibits the development of Streptococcus pyogenes biofilms and causes reduced expression of two fibronectin binding proteins. Microbiology [online]. 2012, roč. 158, č. Pt_3, s. 781–790 [vid. 23. duben 2014]. ISSN 1350-0872, 1465-2080. Dostupné z: doi:10.1099/mic.0.053959-0 36. JERVIS-BARDY, Joshua, Andrew FOREMAN, Sarah BRAY, Lorwai TAN a Peter-John WORMALD. Methylglyoxal-Infused Honey Mimics the Anti-Staphylococcus aureus Biofilm Activity of Manuka Honey: Potential Implication in Chronic Rhinosinusitis. Laryngoscope. 2011, roč. 121, s. 1104–1107. 37. ALANDEJANI, Talal, Joseph MARSAN, Wendy FERRIS, Robert SLINGER a Frank CHAN. Effectiveness of honey on Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa biofilms. Otolaryngology–Head and Neck Surgery. 2009, roč. 141, s. 114–118. 38. BENEŠ, Jiří. Infekční lékařství /. 1. vyd. B.m.: Galén,, c2009. ISBN 8072626442. 39. VLKOVÁ, Eva. Potravinářská mikrobiologie /. 2. vyd. B.m.: Česká zemědělská univerzita,, 2009. ISBN 8021319887. 40. LOBOVSKÁ, Alena. Infekční nemoci /. Vyd. 1. B.m.: Karolinum,, 2001. Učební texty Univerzity Karlovy v Praze. ISBN 8024601168. 41. STÁTNÍ ZDRAVOTNÍ ÚSTAV. Manuál prevence v lékařské pra i. IV., IV.,. Praha: Fortuna, 1996. ISBN 8070710551 9788070710555. 42. HAVLÍK, Jiří. Infekční nemoci. Praha: Galén, 2002. ISBN 8072621734 9788072621736. 43. SCHOCKEN-ITURRINO, Ruben Pablo, Marcelo C. CARNEIRO, Erica KATO, Josë OB SORBARA, Oswaldo D. ROSSI a Luiz ER GERBASI. Study of the presence of the spores of Clostridium botulinum in honey in Brazil. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 1999, roč. 24, č. 379, s. 382. 44. ČS E ISO 6887-1 (560102) A Mikrobiologie potravin a krmiv - Úprava analytických vzorků, příprava výchozí suspenze a desetinásobných ředění. Část 1, Všeobecné pokyny pro přípravu výchozí suspenze a desetinásobných ředění = Microbiology of food and animal feeding stuffs Preparation of test samples, initial suspension and decimal dilutions for microbiological examination. Part 1, General rules for the preparation of the initial suspension and decimal dilutions. 1999. 45. ČS E ISO 4833 (560083) A Mikrobiologie potravin a krmiv - Horizontální metoda pro stanovení celkového počtu mikroorganismů - Technika počítání kolonií vykultivovaných při 30 °C = Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontal method for the enumeration of micro-organisms - Colony-count technique at 30 °C. 2003. 46. ČS ISO 4832 (560085) A Mikrobiologie potravin a krmiv - Horizontální metoda stanovení počtu koliformních bakterií - Technika počítání kolonií = Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontal method for the enumeration of coliforms - Colony-count technique. 2010. 47. SCHLEMMEROVÁ, Ljuba. Stanovení počtu beta-D-glukuronidázopozitivních Escherichia coli na chromogenní plotnové půdě ; Technika počítání kolonií vykultivovaných při 44°C /. B.m.: Státní zdravotní ústav,, 1999. Acta hygienica, epidemiologica et microbiologica. 74

48. ČS ISO 21527-1 (560650) A Mikrobiologie potravin a krmiv - Horizontální metoda stanovení počtu kvasinek a plísní. Část 1, Technika počítání kolonií u výrobků s aktivitou vody vyšší než 0,95 = Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontal method for the enumeration of yeasts and moulds. Part 1, Colony count technique in products with water activity greater than 0,95. 2009. 49. CUPÁKOVÁ, Šárka. Mikrobiologie potravin - praktická cvičení II. : metody stanovení mikroorganismů v potravinách /. Vyd. 1. B.m.: Veterinární a farmaceutická univerzita,, 2010. ISBN 8073051265. 50. ČS E ISO 7218 (560103) A Mikrobiologie potravin a krmiv - Všeobecné požadavky a doporučení pro mikrobiologické zkoušení = Microbiology of food and animal feeding stuffs General requirements and guidance for microbiological examinations. 2008. 51. KŇAZOVICKÁ, Vladimíra, Miroslava KAČÁNIOVÁ, Soňa FELŠÖCIOVÁ, Monika TONKOVÁ, Martin MELICH, Miriam KADÁSI-HORÁKOVÁ a Peter HAŠČÍK. POSÚDENIE MIKROBIOLOGICKEJ KVALTY VZORIEK ZMIEŠANÝCH MEDOV ZO SR A INÝCH KRAJÍN EU EXAMINATION OF MICROBIAL QUALITY OF MIXED HONEY SAMPLES FROM SLOVAKIA AND OTHER EU COUNTRIES [online]. nedatováno [vid. 4. květen 2014]. Dostupné z: http://www.potravinarstvo.com/dokumenty/mc_februar_2010/pdf/4/Knazovicka.pdf 52. RÓŻAŃSKA, HANNA. Microbiological quality of Polish honey. Bull Vet Inst Pulawy. 2011, roč. 55, s. 443–445. 53. ČS 56 9609 (569609) A Pravidla správné hygienické a výrobní pra e - Mikrobiologická kritéria pro potraviny. Principy stanovení a aplikace = Guides to good hygiene and manufacturing practice - Microbiological criteria for foods. Principles for the establishment and application. 2008. 54. KAMLER, František. Produkce kvalitního medu. 3. oprav. a rozš. vyd. Dol u Libčic nad Vltavou: Výzkumný ústav včelařský, 2006. ISBN 80-903442-4-0. 55. LÓPEZ, Ana C. a Adriana M. ALIPPI. Phenotypic and genotypic diversity of Bacillus cereus isolates recovered from honey [online]. nedatováno [vid. 11. květen 2014]. Dostupné z: http://www.aseanfood.info/Articles/11020568.pdf

75

SEZNAM TABULEK Tabulka č. 1: Průměrné složení medu (19) .............................................................................. 18 Tabulka č. 2: Zastoupení oligosacharidů v medu (22).............................................................. 20 Tabulka č. 3: Obsah aminokyselin v medu (22) ....................................................................... 21 Tabulka č. 4: Obsah vitaminů v medu (23) .............................................................................. 23 Tabulka č. 5: Minerální látky v medu (23) ............................................................................... 24 Tabulka č. 6: Účinek tepla, světla a doby skladování na antimikrobiální aktivitu medu (29). 35 Tabulka č. 7: Medy květové domácí ......................................................................................... 44 Tabulka č. 8: Medy medovicové domácí .................................................................................. 44 Tabulka č. 9: Medy květové z obchodního řetězce .................................................................. 45 Tabulka č. 10: Medy medovicové z obchodního řetězce.......................................................... 46 Tabulka č. 11: Celkový počet mikroorganismů ........................................................................ 54 Tabulka č. 12: Počet anaerobních sporulujících bakterií ......................................................... 56 Tabulka č. 13: Počet koliformních bakterií .............................................................................. 58 Tabulka č. 14: Počet bakterií Escherichia coli .......................................................................... 60 Tabulka č. 15: Počet kvasinek a mikroskopických vláknitých hub .......................................... 62 Tabulka č. 16: Počet bakterií Bacillus cereus ........................................................................... 64 Tabulka č. 17: Počet bakterií Staphylococcus aureus ............................................................... 66

76

SEZNAM OBRÁZKŮ Obrázek č. 1: Celkový počet mikroorganismů ......................................................................... 55 Obrázek č. 2: Počet anaerobních sporulujících bakterií ........................................................... 57 Obrázek č. 3: Počet koliformních bakterií ................................................................................ 59 Obrázek č. 4: Počet bakterií Escherichia coli ........................................................................... 61 Obrázek č. 5: Počet kvasinek a mikroskopických vláknitých hub ........................................... 63 Obrázek č. 6: Počet bakterií Bacillus cereus ............................................................................. 65 Obrázek č. 7: Počet bakterií Staphylococcus aureus ................................................................ 67 Obrázek č. 8: Celkový počet mikroorganismů – vzorek č. 7 .................................................... 78 Obrázek č. 9: Počet anaerobních sporulujících bakterií – vzorek č. 11 .................................... 78 Obrázek č. 10: Počet bakterií Bacillus cereus – vzorek č. 11 ................................................... 78 Obrázek č. 11: Počet bakterií Staphylococcus aureus – vzorek č. 12 ....................................... 78 Obrázek č. 12: Počet kvasinek a mikroskopických vláknitých hub – vzorek č. 10 .................. 79 Obrázek č. 13: Počet kvasinek a mikroskopických vláknitých hub – vzorek č. 5 .................... 79 Obrázek č. 14: Peristaltický homogenizátor, plastový kelímek, plynový kahan ...................... 79

77

PŘÍLOHA Obrázek č. 8: Celkový počet mikroorganismů

Obrázek č. 9: Počet anaerobních

– vzorek č. 7

sporulujících bakterií – vzorek č. 11

Obrázek č. 10: Počet bakterií Bacillus cereus

Obrázek č. 11: Počet bakterií Staphylococcus

– vzorek č. 11

aureus – vzorek č. 12

78

Obrázek č. 12: Počet kvasinek a

Obrázek č. 13: Počet a mikroskopických

mikroskopických vláknitých hub

vláknitých hub – vzorek č. 5

– vzorek č. 10

Obrázek č. 14: Peristaltický homogenizátor, plastový kelímek, plynový kahan

79