Biologicky aktivní látky v medu Diplomová práce

Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav chemie a biochemie

Biologicky aktivní látky v medu Diplomová práce

Vedoucí práce: Prof. RNDr. Bořivoj Klejdus, Ph.D.

Brno 2015

Vypracovala: Aneta Strejčková

Čestné prohlášení Prohlašuji, že jsem práci na téma Biologicky aktivní látky v medu vypracovala samostatně a veškeré použité prameny a informace uvádím v seznamu použité literatury. Souhlasím, aby moje práce byla zveřejněna v souladu s § 47b zákona č. 111/1998 Sb.,o vysokých školách ve znění pozdějších předpisů a v souladu s platnou Směrnicí o zveřejňování vysokoškolských závěrečných prací. Jsem si vědom/a, že se na moji práci vztahuje zákon č. 121/2000 Sb., autorský zákon, a že Mendelova univerzita v Brně má právo na uzavření licenční smlouvy a užití této práce jako školního díla podle § 60 odst. 1 autorského zákona. Dále se zavazuji, že před sepsáním licenční smlouvy o využití díla jinou osobou (subjektem) si vyžádám písemné stanovisko univerzity, že předmětná licenční smlouva není v rozporu s oprávněnými zájmy univerzity, a zavazuji se uhradit případný příspěvek na úhradu nákladů spojených se vznikem díla, a to až do jejich skutečné výše. V Brně dne:……………………….

…………………………………………………….. podpis

Poděkování Tímto bych chtěla poděkovat panu prof. RNDr. Bořivoji Klejdusovi Ph.D. za cenné rady, připomínky a vstřícný přístup při vedení diplomové práce.

Abstrakt Tato diplomová práce se zabývá biologicky aktivními látkami v medu. První část se věnuje charakteristice medu, jeho vzniku a jeho složení. Dále se zabývá polyfenoly a významem medu na zdraví člověka. Polyfenoly jsou předmětem mnoha studií a byly proto vybrány jako hlavní zástupci biologicky aktivních látek. Je popsána jejich charakteristika a zastoupení v medu. Druhá část práce se zabývá stanovením polyfenolů. Pro tento účel bylo vybráno 14 sloučenin, které se stanovovaly v 8 druzích medu. Analýza byla provedena pomocí kapalinové chromatografie s hmotnostní spektrometrií (HPLC-MS). Extrakce byla prováděna pomocí extrakce z kapaliny do kapaliny a extrakce pevnou fází za použití dvou rozpouštědel diethyletheru a ethylacetátu. Tyto metody byly následně statisticky porovnány. Výsledky ukazují, že nejvyšší průměrný obsah fenolových kyselin byl v medu medovicovém borovicovém a medovicovém smíšeném. Obecně obsahovaly medy nejvíce kyseliny p-kumarové. Klíčová slova: med, polyfenoly, fenolové kyseliny, biologicky aktivní látky

Abstrakt This thesis is concerned with biologically active substances in honey. The first part describes the characteristics of honey, its origin and its composition. It also deals with the polyphenols and importance of honey on human health. Polyphenols are the subject of many studies and was therefore chosen as representatives of the major biologically active substances. It describes their characteristics and representations of honey. The second part deals with the determination of polyphenols. For this purpose were selected 14 phenolic acids, which was determined in 8 kinds of honey. Analysis was performed by liquid chromatography mass spectrometry (HPLC-MS). Extraction was carried out by extraction by liquid-liquid and solid-phase extraction using two solvents, diethylether and ethylacetate. These methods were then statistically compared. The results show that the highest average content of phenolic acids was in honey pine honeydew and honeydew mixed. Generally, honeys contain most p-coumaric acid. Keywords: honey, polyphenols, phenolic acids, biologically active substances

Obsah 1 ÚVOD ..................................................................................................................... 8 2 CÍL PRÁCE............................................................................................................. 9 TEORETICKÁ ČÁST ........................................................................................... 10 3 VČELSTVO .......................................................................................................... 11 3.1 Plod......................................................................................................................................... 11 3.2 Matka ...................................................................................................................................... 12 3.3 Trubci...................................................................................................................................... 12 3.4 Dělnice.................................................................................................................................... 13

4 MED A JEHO VZNIK.......................................................................................... 13 5 DRUHY MEDU.................................................................................................... 15 5.1 Druhy medu podle původu ..................................................................................................... 15 5.1.1 Květový (nektarový)........................................................................................................... 15 5.1.2 Med medovicový................................................................................................................ 17 5.1.3 Med květovo-medovicový.................................................................................................. 18 5.2 Druhy medu podle způsobu jeho získávání ............................................................................ 18 5.3 Typy medu .............................................................................................................................. 18

6 SLOŽENÍ MEDU ................................................................................................. 19 6.1 Voda ....................................................................................................................................... 19 6.2 Cukry ...................................................................................................................................... 20 6.3 Bílkoviny a aminokyseliny ..................................................................................................... 21 6.4 Minerální látky........................................................................................................................ 21 6.5 Vitaminy ................................................................................................................................. 22 6.6 Barviva.................................................................................................................................... 22 6.7 Enzymy................................................................................................................................... 23 6.8 Organické kyseliny ................................................................................................................. 23 6.9 Vonné látky............................................................................................................................. 23 6.10 Toxické látky .......................................................................................................................... 24 6.10.1 5-hydroxymethylfurfural (HMF)...................................................................................... 24 6.10.2 Fytotoxiny ........................................................................................................................ 25 6.10.3 Těžké kovy ....................................................................................................................... 25 6.10.4 Botulotoxin....................................................................................................................... 26 6.10.5 Alergeny ........................................................................................................................... 26

7 SKLADOVÁNÍ MEDU........................................................................................ 27 8 ANTIOXIDANTY V MEDU................................................................................ 27 8.1 Polyfenoly............................................................................................................................... 28 8.1.1 Flavonoidy.......................................................................................................................... 28 8.1.2 Fenolové kyseliny............................................................................................................... 29

8.2 Polyfenoly v jednotlivích druzích medu ................................................................................. 33

9 VÝZNAM MEDU NA ZDRAVÍ ČLOVĚKA ..................................................... 36 9.1 Med a srdečně cévní onemocnění ........................................................................................... 36 9.2 Med a rakovina ....................................................................................................................... 37 9.3 Med a hojivé (antimikrobiální) účinky ................................................................................... 37 9.4 Med a antivirové účinky ......................................................................................................... 39 9.5 Další pozitivní účinky medu ................................................................................................... 39

10 PYL ..................................................................................................................... 40 11 MATEŘÍ KAŠIČKA........................................................................................... 41 12 PROPOLIS .......................................................................................................... 42 13 VOSK .................................................................................................................. 43 14 VČELÍ JED ......................................................................................................... 44 15 METODY SEPARACE A IDENTIFIKACE POLYFENOLŮ V MEDU.......... 45 15.1 Extrakce .................................................................................................................................. 45 15.1.1 Extrakce z kapaliny do kapaliny (LLE)............................................................................ 46 15.1.2 Nadkritická fluidní extrakce (SFE)................................................................................... 46 15.1.3 Extrakce pevnou fází (SPE).............................................................................................. 47 15.1.4 Tlaková kapalinová extrakce (PLE) ................................................................................. 48 15.1.5 Mikrovlnná extrakce (MAE) ............................................................................................ 49 15.1.6 Ultrazvuková extrakce (UAE) .......................................................................................... 50 15.2 Chromatografie ....................................................................................................................... 50 15.2.1 Kapalinová chromatografie .............................................................................................. 51 15.3 Elektroforéza........................................................................................................................... 53

EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST ................................................................................. 54 16 MATERIÁL ........................................................................................................ 55 17 CHEMIKÁLIE A STANDARDY ...................................................................... 55 18 PŘÍSTROJOVÉ VYBAVENÍ............................................................................. 56 19 EXTRAKCE POLYFENOLŮ ............................................................................ 56 19.1 Extrakce kapaliny do kapaliny (LLE) za použití etylacetátu .................................................. 56 19.2 Extrakce kapaliny do kapaliny (LLE) za použití diethyletheru ............................................. 57 19.3 Extrakce pevnou fází (SPE) za použití ethylacetátu ............................................................... 57 19.4 Extrakce pevnou fází (SPE) za použití diethyletheru ............................................................. 57

20 STANOVENÍ POLYFENOLŮ VE VZORCÍCH ............................................... 57 21 KALIBRACE ...................................................................................................... 58 22 VÝSLEDKY ....................................................................................................... 58 23 STATISTICKÉ VYHODNOCENÍ ..................................................................... 62 23.1 Akátový med 1 (AK 1) ........................................................................................................... 62

23.2 Řepkový med (ŘEP) ............................................................................................................... 63 23.3 Medovicový smíšený med (MED).......................................................................................... 64 23.4 Lipový med (LIP) ................................................................................................................... 65 23.5 Slunečnicový med (SLUN).................................................................................................... 66 23.6 Medovicový borovicový med (BOR) ................................................................................... 66 23.7 Akátový med 2 (AK 2) .......................................................................................................... 67 23.8 Lesní květový med (LK)........................................................................................................ 68

24 DISKUZE............................................................................................................ 70 25 ZÁVĚR................................................................................................................ 77 26 POUŽITÁ LITERATURA.................................................................................. 80 27 SEZNAM TABULEK......................................................................................... 90 28 SEZNAM ZKRATEK......................................................................................... 91 PŘÍLOHY ............................................................................................................... 92 29 SEZNAM PŘÍLOH ........................................................................................... 111

1

ÚVOD

Med je přírodní produkt, který je už od pradávna znám pro svoje výborné nutriční a léčivé vlastnosti. Již staří Egypťané a Řekové jej používali pro léčbu různých onemocnění, na hojení popálenin a jiných zranění. Dnes je používán zejména v tradiční čínské a lidové medicíně. Využívá se proti kašli, únavě, nechutenství a zácpě. Má pozitivní vliv na

imunitu organismu, činnost srdce a krvetvorbu. V poslední době byly zjištěny také antivirové účinky a antibakteriální potenciál medu, který stojí za jeho hojivými vlastnostmi. Med se také hojně používá v potravinářství jako ochucovadlo nebo konzervační prostředek. Může totiž zabránit oxidačním procesům v potravinách jako je oxidace lipidů nebo enzymatické hnědnutí ovoce a zeleniny. Využití má také v kosmetice nebo farmaceutickém průmyslu, kde se přidává do různých sirupů. Med obsahuje vedle jednoduchých, lehce stravitelných cukrů glukózy a fruktózy spoustu cenných látek s biologickou aktivitou. Mezi ně řadíme enzymy, bílkoviny, aminokyseliny a organické kyseliny, vitamíny nebo minerální látky. S biologickou aktivitou a antioxidačním potenciálem jsou však v souvislosti s medem spojovány zejména fenolové kyseliny a flavonoidy, na které je med velice bohatý. Tyto látky, patřící do skupiny polyfenolů, jsou jedny z nejdůležitějších sloučenin vyskytujících se v rostlinách. V těch vznikají jako produkty sekundárního metabolismu. Do dnešní doby bylo popsáno více než 5000 těchto sloučenin a pro svoje pozitivní účinky na zdraví se staly předmětem mnoha studií. Polyfenoly se chovají jako antioxidanty a vykazují tak široký rozsah biologických účinků jako

antibakteriální, protizánětlivé nebo

antitrombotické. Epidemiologické studie poukazují také na jejich možnou roli v prevenci kardiovaskulárních onemocnění a rakoviny. Obsah polyfenolů v medu závisí zejména na druhu rostlin, ze kterých med pochází a také na dalších faktorech jako je klima nebo životní prostředí. Analýza polyfenolů je proto také považována za perspektivní způsob ověřování rostlinného a geografického původu medu. Botanický původ medu je totiž jedním z hlavních kritérií jeho kvality a ceny. Analýza těchto významných látek je proto v mnoha ohledech velmi důležitá.

8

2

CÍL PRÁCE

Cílem diplomové práce je stanovit obsah biologicky aktivních látek v medu a porovnat jejich zastoupení v rámci jednoho i více druhů medů. Obsahy jednotlivých látek se budou zjišťovat pomocí kapalinové chromatografie s hmotnostní spektrometrií (HPLCMS). Protože je těchto látek v medu široká škála, byly pro tento účel vybrány fenolové kyseliny, konkrétně deriváty kyseliny skořicové a kyseliny hydroxybenzoové. Pro dosažení cíle budou prováděny následující úkoly: −

vypracování literární rešerše obsahující základní informace o medu: charakterizace medu, typy medů, složení medu, polyfenoly v medu, význam medu na zdraví člověka

−

separace a identifikace flavonoidních látek v medu

−

zpracování a vyhodnocení dosažených výsledků

9

TEORETICKÁ ČÁST

10

3

VČELSTVO

Včelstvo je tzv. obligátní společenstvo, tedy biologická jednotka, která je tvořena velkým počtem jedinců téhož druhu (Švamberk, 2003). Včelstvo se skládá z matky, několika set trubců (v sezóně) a mnoha tisíc dělnic. Je tvořeno příslušníky dvou generací a to matkou a jejími dcerami dělnicemi, popřípadě i syny trubci (Přidal, 2005). Nedílnou součástí včelstva jsou také plody různého stáří, které se vyvíjí ve včelím díle (tzv. plástech). Nikdo z nich nemůže existovat samostatně. Vzájemně se totiž doplňují a tvoří tak jedinečný pospolitý celek, který zajišťuje existenci včelstva. Pouze při nedostatku potravy, tj. v zimním období, mohou postrádat trubce a plod (Přidal, 2013). Včely se dorozumívají pomocí tanečků, kterými se navzájem informují o směru a vzdálenosti zdroje potravy nebo o vhodném příbytku pro usazení roje. Včely udržují v plodujícím hnízdě teplotu 34 – 35 °C a to pomocí svalového třesu. Na počátku zimního období, kdy je včelstvo bez plodu, si v hnízdě udržují teplotu nad 10 °C (Švamberk, 2003). Včelstva jsou trvalá a díky zásobám potravy přetrvávají zimu i jiná období chudá na zdroje potravy. Tento trvalý životní cyklus včelstva umožňuje jeho enormní růst. Velké zdravé kolonie můžou mít 50 000 nebo i více dělnic a královnu, která klade cca 1 000 kusů vajíček denně (Mader, 2011). Zajímavosti o včelách Pro vytvoření ½ kilogramu medu musí včely obletět asi 2 miliony květů. Při jednom výletu z úlu obletí včela 50 - 100 květů. Včely létají okolo 30 km/h. Pro vytvoření jednoho kilogramu medu, musí včelstvo nalétat více jak 180 000 km (Orey, 2012).

3.1 Plod Vývoj plodu se dělí na otevřený a zavíčkovaný. Otevřený vývoj plodu zahrnuje stadium vajíčka (embryonální vývoj) a larvy (přijímá potravu, roste, ukládá zásobní látky) a probíhá v otevřených buňkách. Potravou larev je krmná kašička vylučovaná hltanovými a kusadlovými žlázami dělnic. Pokud je larva krmena sekretem hltanových a kusadlových žláz v poměru 1:1 (mateří kašička) po celé larvální období, vylíhne se z ní

11

matka. Pokud je krmena sekretem v poměru 3 - 5:1 a to pouze první tři dny, vylíhne se dělnice. Ta je po zbytek dní krmena pouze sekretem hltanových žláz, pylem a medem. Trubci se líhnou z neoplozených vajíček (Přidal, 2013). Zavíčkovaný vývoj plodu probíhá v buňce uzavřené voskovým víčkem a později zámotkem kukly. Je to fáze metamorfózy, kdy musí larva projít tzv. dokonalou proměnou. U larvy dělnic a trubců se vytváří celý kokon, u matky je otevřený, aby mohla přijímat potravu. Larva se dostává do klidového stádia a mění se v předkuklu. V této fázi dochází k přeměně tkání a orgánů (metamorfóze). V okamžiku, kdy jsou ukončeny všechny důležité procesy, se mění předkukla v kuklu, ze které se poté vylíhne včela (Přidal, 2013).

3.2 Matka Ve včelstvu je obvykle pouze jedna matka. Při rojení či tiché výměně (v případě staré matky, nemoci atd.) mohou být však po kratší dobu ve včelstvu dvě i více matek (Přidal, 2013). Úkolem matky je pouze páření a kladení vajíček. Těch může naklást až 2000 denně (Cramp, 2011). Je zcela odkázána na ošetřování dělnicemi, které o ni v počtu 8 - 16 včel usilovně pečují. Tyto včely krmí matku po 10 - 15 minutách pomocí funkční hltanové žlázy. Kromě toho matku čistí, olizují a přijímají její feromony, které působí na další složky včelstva, nejvíce na dělnice. Feromony zabraňují rozvoji vaječníků u dělnic, stavbě nouzových matečníků a zajišťují tak soudržnost včelstva. Feromony také přitahují trubce při snubním letu matky. Ztrátu matky včely zjistí nejpozději do 2 hodin, kdy reagují na nepřítomnost mateřího feromonu. V tom okamžiku začnou se stavbou nouzových matečníků nad mladými samičími larvami dělnic (Přidal, 2013).

3.3 Trubci Trubci vznikají z neoplozeného vajíčka, které položila buď dělnice (menší trubci) nebo matka (plnohodnotní trubci). Ve včelstvu mají jen málo funkcí. Pouze přijímají a předávají potravu nebo zahřívají plod při náhlém ochlazení. Vyskytují se ve včelstvu pouze ve vegetačním období. Říje nastupuje u trubců kolem 10 - 15. dne jejich života, kdy vylétají na trubčí shromaždiště a čekají na říjné matky. V sezóně přijímá včelstvo i

12

trubce z jiných včelstev, toto zalétání se vyskytuje až v 80 %. V okamžiku, kdy ustane snůška, jsou trubci vyháněni z úlu pryč (Přidal, 2013).

3.4 Dělnice Dělnice jsou nedovyvinuté samičky, které mají zakrnělé a nefunkční vaječníky. Ty se mohou rozvinout jen ve zvláštních případech, například při absenci matky. Nejsou však schopné se pářit a kladou tak pouze neoplozená trubčí vajíčka. Počet dělnic se pohybuje kolem 10 000 (v zimě) až 60 000 v létě. Ve včelstvu zabezpečují spoustu činností, které mají rozdělení podle jejich věku (Přidal, 2013). V první části života jsou to včely úlové a pracují uvnitř hnízda. Říká se jim mladušky a mají za úkol zahřívání a krmení plodu. Poté se stávají dělnicemi. Jejich voskové žlázy začnou produkovat vosk, pomocí kterého staví plásty. V poslední fázi se stávají létavkami (Cramp, 2011). Létavky mohou být buď strážkyně, kdy střeží vchod úlu, pátračky, kdy hledají nové zdroje potravy a nebo sběratelky (Přidal, 2013).

4

MED A JEHO VZNIK

Med patří mezi nejdéle používaná sladidla. Říkalo se mu „božský nektar“. Již před 5000 lety ho lidé využívali jako lék, součást jídel, ke konzervaci nebo jako přísadu do mýdel. Vosk se využíval na výrobu svíček (Orey, 2012). Včely využívají med jako zásobu živin pro přežití zimních měsíců, jelikož na rozdíl od vos a čmeláků přezimují jako celé včelstvo. V létě slouží spolu s pylem ke krmení včelích larev. V prvních dnech larválního vývoje je důležité složení potravy, které určuje, zda se z larvy stanou matky nebo dělnice (Frank, 2010). Definice medu Pro účely vyhlášky č. 76/2003 Sb., kterou se stanoví požadavky pro přírodní sladidla, med, cukrovinky, kakaový prášek a směsi kakaa s cukrem, čokoládu a čokoládové bonbony, je med definován jako: Med - potravina přírodního sacharidového charakteru, složená převážně z glukózy, fruktózy, organických kyselin, enzymů a pevných částic zachycených při sběru sladkých šťáv květů rostlin (nektar), výměšků hmyzu na povrchu rostlin (medovice), nebo na živých částech rostlin včelami (Apis mellifera), které sbírají, přetvářejí,

13

kombinují se svými specifickými látkami, uskladňují a nechávají dehydratovat a zrát v plástech (Vyhláška 76/2003 Sb.). Požadavky na jakost Do medu nesmí být přidány, s výjimkou jiného druhu medu, žádné jiné látky včetně přídatných látek. Z medu nesmí být odstraněn pyl ani jakákoli jiná složka, s výjimkou případů, kdy tomu při odstraňování cizích látek, zejména filtrací, nelze zabránit. Med, s výjimkou pekařského (průmyslového) medu, nesmí o mít jakékoliv cizí příchutě a pachy, o začít kvasit nebo pěnit, o být zahřát do takové míry, že jeho přirozené enzymy jsou zničeny nebo se stanou neaktivní. U medu nesmí být uměle změněna kyselost. Filtrovaný med a pekařský (průmyslový) med nesmí být přidáván do jiných medů uvedených v § 8. Smyslové, fyzikální a chemické požadavky na jakost jsou uvedeny v příloze č. 3 tabulkách 1 a 2 této vyhlášky (Vyhláška 76/2003 Sb.) Med vzniká z nektaru, jež prošel trávicí soustavou včely medonosné (Apis mellifera) (Orey, 2012). Včela kromě nektaru sbírá také medovici, což je cukernatá tekutina z listů a jehličí stromů. Produkuje ho hmyz, především mšice a červci (Frank, 2010). Po příletu na květ saje včela nektar, který se ukládá v žaludku spolu se slinami a sekretem žláz. Tím začíná přeměna nektaru v med (Altman, 2014). Dále se nektar a medovice dostávají do medného váčku (rozšířený hltan v zadečku). Zde dojde k prvním chemickým reakcím (Frank, 2010). Při sání nektaru se na včelu také uchytává pyl díky chloupkům, které včelu pokrývají. Včela pak přelétá z květu na květ, čímž se květy opylují. Pyl včela městná do váčků na zadních končetinách a jakmile má pylu a nektaru dostatek, vrací se do úlu (Altman, 2014). Po příletu do úlu včela sladinu vyvrhuje a na sosáku ji předává další včelce. To se několikrát opakuje a sladina je tak obohacena dalšími látkami jako enzymy nebo aminokyselinami. Při předávání sladiny mezi včelami se část vody odpaří a šťáva se tak zahustí (Frank, 2010). Jakmile obsah vody klesne na 35 - 40 % (původní obsah je 60 14

75 %), začne včela tekutinu rozprostírat po stěnách buněk medové plástve. Včela poté tyto buňky ovívá křídly, čímž dojde k dalšímu odpaření vody a zábraně fermentace. Jakmile klesne obsah vody pod 20 %, uzavře včela buňku voskem, který pochází z voskových žláz na jejím zadečku a med může díky přítomným enzymům dozrát (Altman, 2014). Včelař při sklizni odebírá naplněné plásty a pomocí medometu med vytáčí. Vzhledem k tomu, že mají plásty ještě teplotu úlu (30 - 40 °C), není potřeba zahřívání. Jedná se o med vytáčený „za studena“. Dále se provádí přecezení, čímž se odstraní zbytky vosku (Frank, 2010).

5

DRUHY MEDU

5.1 Druhy medu podle původu Existují dva základní druhy medu. Med květový a med medovicový. Květový med je med získávaný z květů rostlin. Medovicový med pochází z listů a jehličí stromů, obyčejně má tmavší barvu. 5.1.1

Květový (nektarový)

Květový med pochází z květů rostlin nebo z rostlinných žláz vylučujících nektar ( Altman, 2014). Vylučování nektaru ovlivňují jednak vnější vlivy jako je sluneční záření, vlhkost nebo teplota a také genetické založení rostliny a fáze kvetení. Nektar je sladká tekutina obsahující v průměru 40 % cukru. Převládá zde sacharóza, glukóza a fruktóza, jejichž poměr závisí na rostlinném druhu. Obsah vody se v nektaru pohybuje v rozmezí 15 - 95 %. Z kyselin se zde nachází zejména kyselina jablečná, vinná, jantarová, citrónová nebo šťavelová. Minerální látky jsou zastoupené jen v malém množství. V nektaru se nachází také pryskyřičné a aromatické látky, terpeny (dodávající vůni a chuť), z barviv flavony, v některém nektaru vitamin C a enzymy. V nektaru bývají přítomné také pevné příměsi jako pylová zrna nebo buňky rostlinných tkání (Přidal, 2003). Vodivost květového medu je do 55 mS⋅m-1 bez výraznější příměsi medovice (Přidal, 2012). Květový med – pochází z různých druhů rostlin, přičemž žádná výrazně nedominuje

15

Květový druhový med – pochází převážně z jednoho druhu rostliny, jeho mikroskopické, organoleptické a chemickofyzikální vlastnosti odpovídají tomuto rostlinnému druhu Květové druhové medy s vodivostí nad 55 mS⋅m-1 – med odpovídající mikroskopickým, organoleptickým a chemickofyzikálním vlastnostem rostlin: Arbutus unedo (planinka), Calluna (vřes), Castanea (kaštanovník), Erica (vřesovec), Eucalyptus (blahovičník), Leptospermum (balmín), Melaleuca (kajeput) (Přidal, 2012). Akátový med Trnovník akát (Robina pseudoakacia L.) je světlomilná rychle rostoucí dřevina s poměrně krátkým kmenem. Kvete na začátku června po dobu tří týdnů. Je jednou z nejlepších nektarodárných dřevin u nás. V teplejších oblastech, kde se hojně vykytuje, tvoří hlavní zdroj snůšky. Pylodárnost je poměrně malá (Haragsim, 2013). Akátový med se vyznačuje světle žlutou barvou a jemnou vůní i chutí. Jeho konzistence je jemně tekutá (Frank, 2010). Poměr glukosy a fruktosy je 1:1,5 - 1,7. Proto zůstává akátový med dlouho tekutý (i po několik let). Obsahuje velice málo pylových zrn a proto většinou nevyvolává pylové alergie. Vykazuje nejnižší enzymatickou aktivitu (Přidal, 2003). Akátový med má uklidňující a regenerační účinky (Blahová, 2010). Lipový med Lípa srdčitá (Tilia cordata MILL.) je statný nektarodárný a pylodárný strom kvetoucí v červnu a červenci. Cukernatost lipového nektaru je však poměrně malá, zdrojem sladiny je proto spíše medovice. Často se tedy vykytují květové medy smíšené s medovicí (Haragsim, 2013). Lipový med má světlou, nazelenale žlutou barvu, tužší konzistenci. V jeho vůni jdou silně cítit květy. (Frank, 2010) Má uklidňující účinky, působí proti migréně a bolestem žaludku (Blahová, 2010). Krystalizuje poměrně rychle (Haragsim, 2013). Slunečnicový med Slunečnice roční (Heliathus annuus L.) je významná pylodárná a nektarodárná jednoletá rostlina kvetoucí od poloviny července do poloviny září. Pro její dobré opylení jako olejniny je třeba 4 - 6 včelstev na 1 ha. Včely často na slunečnicových úborech hynou,

16

což se připisuje pryskyřičnatým látkám květů. Nejlepší tvorba nektaru je údajně (podle maďarských zkušeností) na půdách, kde není hluboko spodní voda (Haragsim, 2008). Pylová zrna slunečnice mají ostnitý povrch se třemi póry a jsou kulovitého tvaru. Je důležitý pro vývoj zimních včel (Haragsim, 2008). Slunečnicový med má žloutkově žlutou barvu, pevnou konzistenci, jemnou vůni a silnou chuť (Frank, 2010). Používá se často do směsí medů. Vyznačuje se vysokým obsahem vitaminu E a hrubou krystalizací (Blahová, 2010, Haragsim, 2008). Řepkový med Řepka olejka (Brassica napus L. var. napus) je kulturní jednoletá olejnatá rostlina, která má velký pylodárný a nektarodárný význam. V České republice je hojně pěstovaná a tvoří tudíž hlavní zdroj jarních medů. Její pyl patří k nejvýznamnějším pro jarní rozvoj včelstev. Pylová zrna jsou poměrně drobná, mají síťovaný povrch a kulovitý tvar se třemi otvory (Haragsim, 2008). Je to většinou v sezóně nejdříve vytáčený med. Díky velkému rozsahu pěstované řepky na našem území se tento med vyskytuje téměř ve všech oblastech. Disponuje vysokým obsahem glukosy, poměr glukosy a fruktosy je téměř 1:1 (Přidal, 2003). Díky tomu poměrně rychle krystalizuje v hrubých krystalech a po jeho krystalizaci se podobá sádlu. Často se u nás pastují (Haragsim, 2008). Řepkový med má bílou až světle žlutou barvu a krémovou až pevnou konzistenci. Vůně je slabší a chuť jemná (Frank, 2010). 5.1.2

Med medovicový

Medovicový med pochází z medovice (ne nektaru), což je cukernatá tekutina, kterou vyměšuje hmyz, především mšice a červci (Titěra, 2013). Tento hmyz cizopasí na větvích, listech nebo pupenech různých listnatých či jehličnatých dřevin a vysává z nich rostlinnou šťávu proudící sítkovicemi. Po projití trávicím traktem ji vylučují ve formě medovice, kterou pak sbírají včely. Medovice obsahuje průměrně 16,3 % vody (může však obsahovat 50 % a čerstvě vyloučená medovice až 80 % vody). Obsah cukru se pohybuje kolem 74 %, převládá sacharóza, glukóza a fruktóza. Dále obsahuje aminokyseliny (alanin, kys. asparagová, histidin, leucin, lyzin atd.), barviva, minerální látky a vitaminy (Přidal, 2003).

17

Vodivost medovicového medu je vyšší jak 70 mS⋅m-1 a obsahuje velké množství medovicových prvků (Přidal, 2012). Medovicový med má žlutou až hnědočervenou barvu. Konzistence je velmi viskózní, vůně sladová a chuť kořeněná. Zůstává poměrně dlouho tekutý a je bohatý na minerální látky. (Frank, 2010) Medovicové medy borovicové z Řecka a východního Středomoří produkují zejména mšice Marchalina Helenina. Tyto medy mají vysoký obsah příměsí řas a hub (Přidal, 2003). 5.1.3

Med květovo-medovicový

Neodpovídá vlastnostem ani květových ani medovicových medů. Jeho vodivost se pohybuje od 50 do 110 mS⋅m-1. Mohou vlastnostmi odpovídat druhovým medům, tedy medům z převážně jednoho druhu rostliny (Přidal, 2012).

5.2 Druhy medu podle způsobu jeho získávání Med vytáčený – z plástů se vytáčí pomocí medometu Med vykapaný – nechává se samovolně z plástů vykapat Med lisovaný – získáváme z plástů tlakem, dnes se tento způsob užívá jen zřídka Med plástový – plásty se nechají zavíčkované a řežou se na kousky (Frank, 2010).

5.3 Typy medu Tekutý med je nejrozšířenějším typem medů. Je průsvitný a bez krystalů. Pastový med je med, který vzniká poměrně složitou průmyslovou úpravou. Přítomné krystaly jsou velmi malé a konzistencí tak připomíná sádlo. Díky tomu se dobře roztírá aniž by stékal. Výhodou tohoto medu je jeho stálá konzistence – dále nekrystalizuje (Orey, 2012). Proces pastování začíná tím, že se do 30 °C teplého medu přidají 2 - 3 % pastového nebo jemně krystalického medu. Med se poté ochladí nejlépe pod 15 °C a dvakrát až třikrát denně se promíchává. Pro míchání by se měla zvolit taková míchadla, která do medu nevpraví vzduchové bubliny. Med plníme do sklenic v okamžiku, kdy získá perleťový vzhled, je zakalený, ale stále tekutý. Ve sklenicích pak ztuhne v konečnou pastovitou konzistenci (Titěra, 2013).

18

Plástový med je med, kterým označujeme kousky plástve se zavíčkovaným medem. Jsou zde kousky včelího vosku, který se ale nekonzumuje. Je tak vhodný pouze na žvýkání. (Orey, 2012). Zkrystalizovaný med je med, u kterého se cukrová složka oddělila od tekutiny,čímž se stal tuhým (Orey, 2012). Krystalizaci ovlivňuje poměr glukózy k fruktóze a obsah vody. Glukóza je velmi dobře rozpustná ve vodě a rychle tvoří krystaly. Fruktóza pohlcuje více vlhkosti ze vzduchu a krystalizuje pomaleji. Čím je tedy vyšší obsah glukózy, tím je krystalizace rychlejší. Tekuté medy mají vyšší obsah fruktózy (akátový med), pevné medy vyšší obsah glukózy (řepkový med). Medy, které obsahují méně jak 17 % vody krystalizují rychleji než medy s obsahem vody v rozmezí 17 - 18 %. Proces krystalizace lze omezit například filtrací a mícháním (Frank, 2010). Na rychlost krystalizace má vliv teplota. Při teplotě nad 25 °C a pod 5 °C krystalizace téměř neprobíhá. Nejrychleji probíhá při teplotě 14 °C a tato teplota se tedy používá při řízené krystalizaci za účelem pastování medu. Krystalizace u medu neprobíhá naráz, ale postupně. Nejdříve se med zakálí a poté ztuhne v kašovitou, pastovitou nebo zcela tuhou konzistenci. Na vzhled zkrystalizovaného medu a rychlost krystalizace má vliv rostlinný původ medu. Např. řepkový med je po krystalizaci téměř bílý a má pastovitou konzistenci, která se dobře natírá. Samovolnou krystalizací vzniká pastovitá konzistence jen u některých medů. Tato vlastnost je velice výhodná, jelikož se med nemusí zahřívat jako jiné medy, které se řízeně pastují. Med si tak zachová řadu cenných biologických látek (Titěra, 2013).

6

SLOŽENÍ MEDU

Med je nasycený roztok cukru a vody. Dále obsahuje bílkoviny, aminokyseliny, minerální látky, vitaminy, barviva, enzymy a organické kyseliny (Titěra, 2013).

6.1 Voda Voda je v medu zastoupena v poměrně malém množství a to v rozmezí 14 - 19 %, díky tomu je med mikrobiálně velice stabilní.. Čím je obsah vody nižší, tím je med kvalitnější. Její obsah můžeme zjistit refraktometricky podle indexu lomu (Titěra, 2013). Na obsah vody má druh květů, ze kterých med pochází, jen malý vliv. Méně vody však zpravidla obsahuje med řepkový, luční a med z ovocných stromů. Bohatší na

19

vodu je pak zpravidla med jetelový, vřesový nebo vojtěškový. Lesní medy obsahují zpravidla méně vody než medy květové (Weiß, 2010). Medy s obsahem vody větším než 20 % se považují za porušené s výjimkou medu vřesového a jetelového. Jejich obsah vody činí až 23 %. Medy, které mají obsah vody vyšší jak 19 % jsou náchylnější ke kvašení (Weiß, 2010).

6.2 Cukry V medu je obsaženo 80 - 85 % cukru. Vyskytují se zde převážně jednoduché cukry – monosacharidy. Nejvíce je zastoupena fruktóza (34 - 41 %) a glukóza ( 28 - 35 %) (Frank, 2010). Poměr těchto dvou cukrů ovlivňuje rychlost krystalizace (Titěra, 2013). Z disacharidů je přítomna sacharóza a maltóza. Zastoupení oligosacharidů záleží na rostlinách, ze kterých je med získán. V medu se nachází okolo 20 druhů oligosacharidů (Frank, 2010). Cukry slouží jako nejdůležitější zdroj energie pro lidské tělo. Některé tkáně a orgány získávají energii výhradně z látkové přeměny cukrů. Jsou to například mozek, červené krvinky nebo nervy. Hladina cukru v krvi by měla být mezi 0,7 - 0,9 g glukózy na litr krve. Nejrychleji se do krevního oběhu dostává glukóza, která prostupuje přes střevní stěnu pomocí nosiče. Je to jednoduchý cukr a proto se nemusí ve střevě již rozkládat. K tomu, aby se glukóza dostala z krve do buněk je potřeba inzulín – hormon vytvářený ve slinivce břišní. Fruktóza se vstřebává pomaleji a to difúzí, tedy z místa s vyšší koncentrací do místa s nižší koncentrací, není tedy potřeba energie. Pro přestup do buněk není potřeba přítomnost inzulínu. Z toho vyplývá, že pomaleji také klesá jeho hladina v krvi a je tedy možné energii čerpat déle (Frank, 2010). Vyšší cukry se musí nejdříve ve střevě rozložit na jednoduché, proto je čas jejich vstřebávání pomalejší. Energie se tedy vytváří stejnoměrně a po delší časový úsek. Schopnost soustředění a výkonnost je pak delší (Frank, 2010). Med má střední glykemický index (cca 61) a převládá v něm fruktóza, která nepotřebuje k přestupu do buňky hormon inzulín. Glykemický index vyjadřuje, jak rychle zvyšují určité potraviny hladinu cukru v krvi, pro glukózu je 100. Kromě toho obsahuje stopový prvek chróm, který taktéž šetří inzulín, resp. slinivku břišní a to tím, že zvyšuje citlivost inzulínových receptorů. Proto může být med zařazen i do jídelníčku 20

diabetikům, ovšem jen v malém množství. Přednost by se mělo dávat medům s vyšším obsahem fruktózy jako je například med akátový a konzumovat ho v kombinaci s potravinami bohatými na vlákninu. Čím více vlákniny, tím stoupá hladina cukru v krvi pomaleji (Frank, 2010).

6.3 Bílkoviny a aminokyseliny Základním stavebním prvkem bílkovin jsou aminokyseliny. Ve 100 g sušiny medu je asi 100 mg aminokyselin. Aminokyseliny se podílí na typickém aroma medu, který konkrétně vytváří fenylalanin spolu s fenylacetaldehydem a kyselinou fenyloctovou (Frank, 2010). Med je zdrojem nejen esenciálních, tedy nepostradatelných aminokyselin, ale dokonce všech, tedy 20-ti aminokyselin. Díky tomu může med přispívat k vyrovnání nedostatečného spektra aminokyselin v různých potravinách. Největší podíl zaujímá prolin (50 – 85 %), druhou nejpočetnější je esenciální aminokyselina fenylalanin. Najdeme zde i velmi důležité aminokyseliny jako tryptofan a histidin. Vzhledem k tomu, že se zde aminokyseliny nacházejí volné, nemusí být již dále rozkládány a prostupují rovnou střevní stěnou do krevního oběhu. To je důležité především pro jedince s poruchami zažívání (Frank, 2010). Obsah volných aminokyselin závisí na rostlinném původu. Nejbohatší jsou smíšené medy. Mezi nejsložitější bílkovinné struktury medu patří enzymy, podle jejichž aktivity se posuzuje kvalita medu. Jsou totiž citlivé na nevhodné skladování a přehřátí medu. Nejčastěji uváděná je normovaná diastáza, kdy minimální aktivita enzymu diastázy je stanovena na 8 stupňů podle Schadeho (Titěra, 2013).

6.4 Minerální látky Obsah minerálních látek je u různých druhů medů různý. Květový med obsahuje okolo 100 mg minerálních látek na kilogram, medovicový med pak 400 až 1000 mg na kilogram. Nejvíce je v medu zastoupen draslík. Med je proto dobrým zdrojem jeho doplnění zejména při horečkách, silném pocení nebo průjmech, kdy jeho hladina v těle klesá. Dále je pak přítomen sodík, vápník, chlor a hořčík. Hořčík projde střevní stěnou jen pokud jsou ve stravě přítomny vitaminy B1, B2 a B6 a ty med obsahuje. Hořčík odbourává svalové napětí, chrání cévní systém a má zklidňující účinek na nervovou

21

soustavu. Ze stopových prvků můžeme zmínit železo, zinek, mangan, měď, síru a fosfor (Frank, 2010).

6.5 Vitaminy Vitaminy jsou v medu zastoupeny pouze v malém množství. Jedná se především o vitamin B1 (thiamin), B2 (riboflavin), B3 (niacin), B6 (pyridoxin), B5 (kyselina pantotenová) a vitamin C (kyselina askorbová) (Frank, 2010). Hlavním zdrojem vitaminů pro včely je pyl (Titěra, 2013).

6.6 Barviva Mezi barviva se řadí zejména flavonoidy, jejichž obsah se pohybuje okolo 0,5 až 2 mg na 100 g medu (Frank, 2010). Dále jsou to anthokyany a produkty degradace cukrů. V medu převažují rostlinná barviva pocházející z medných a pylových zásob, odtud přecházejí do vosku a dále zpět do medu. Živočišná barviva jsou v malém množství a pocházejí ze zbytků košilek po včelím plodu. Jedná se o aminokyseliny jako tyrozin, ze kterého vznikají melanoidní barviva. Aromatické aminokyseliny reagují s fruktózou a vznikají tak hnědá barviva, která můžou mít výrazné aroma (Weiß, 2010). Při zahřátí medu vzniká látka hydroxymethylfurfural (5-hydroxymethyl-2furaldehyd) rozkladem cukrů působením kyselin medu. Hydroxymethylfurfural (HMF) je chemicky velmi reaktivní, za přítomnosti vzduchu hnědne, reaguje s dalšími látkami medu a vznikají tak žlutohnědá barviva. Podle obsahu této látky můžeme prokázat záhřev medu, který výrazně snižuje jeho biologickou hodnotu. Med skladovaný v chladu má obsah HMF do 10 mg⋅kg-1. Med zahřátý na 70 °C v délce 5 hodin má obsah této látky do 40 mg⋅kg-1, což je hranice ještě vyhovující normě. Medy, které byly několikanásobně nešetrně zahřívány mají obsah HMF až několik stovek mg (Veselý, 2013). HO

OH

HC H HOH2C

za vyšších teplot a přítomnosti kyselin

CH

HC

CH

OH C

C O

CH2OH

HOH2C

O

- 3 H2O

Fruktosa

HMF

Obr. 1 Vznik hydroxymethylfurfuralu (HMF) (Přidal, 2003). 22

CHO

6.7 Enzymy Enzymy jsou buď rostlinného původu nebo pocházejí od včel. Enzymy rostlinného původu pocházejí z nektaru a medovice a patří mezi ně kataláza a fosfatáza. Od včel pak pochází sacharáza, diastáza a glukozooxidáza (Frank, 2010). Mezi nejvýznamnější enzymy medu patří diastáza (štěpí škrob) a invertáza (štěpí sacharózu na glukózu a fruktózu). Velice významný je také enzym glukozoxidáza, který za přítomnosti vzduchu mění menší množství glukózy na kyselinu glukonovou a peroxid vodíku, která pak působí proti růstu bakterií, je tedy jejich inhibitorem (Weiß, 2010). Větší množství enzymů obsahují zejména medy smíšené, pocházející z prostřední snůšky. Zato medy z hlaví snůšky mají obsah enzymů obvykle nízký, vyjma medu lesního, který obsahuje enzymy hmyzu sajícího mízu. Na enzymy chudší bývají obvykle medy akátové a jetelové. Účinek enzymů se snižuje skladováním (Weiß, 2010).

6.8 Organické kyseliny Jsou důležitou složkou medu. Mají vliv na chuť, stabilitu a další cenné vlastnosti. Obsah kyselin v medu se pohybuje kolem 30 mval⋅kg-1. Asi z jedné třetiny jsou tvořeny laktony. Kvašením nezralého medu jejich obsah vzrůstá a je proto dán limit na 50 mval⋅kg-1 pro naši i evropskou současnou normu. Nejvýznamnější kyselinou je kyselina glukonová, zastoupena v sušině medu v několika desetinách procent (Titěra, 2013). Kyselina glukonová vzniká působením enzymu glukozooxidázy na glukózu, která se štěpí na kyselinu glukonovou a peroxid vodíku (Přidal, 2003). Dále bychom mohli zmínit kyselinu citrónovou, jablečnou, octovou, mravenčí, máselnou, šťavelovou, kumarovou, salicylovou, skořicovou a hydroxyderiváty a metylestery některých těchto kyselin (Titěra, 2013).

6.9 Vonné látky V medu bylo zjištěno až 120 látek, které se podílejí na jeho vůni. Identifikovat se však podařilo pouze asi polovinu. Mezi tyto látky můžeme zařadit alifatické alkoholy, aldehydy, ketony, kyseliny a estery organických kyselin. V citrusových medech je například přítomna těkavá látka metylantranylát, kterého je zde až 70x více než v jiných medech. Může proto sloužit jako indikační látka citrusových medů. Na tvorbě aroma se podílí také minerální látky, kyselina glukonová, prolin a také 5-hydroxymethylfurfural. 23

Obsah vonných látek klesá s časem při skladování, kdy dochází k různým změnám (Přidal, 2003).

6.10 Toxické látky Med obsahuje kromě látek léčivé povahy také látky toxické, které mohou mít nepříznivé účinky na lidské zdraví. Mezi tyto látky se řadí 5-hydroxymethylfurfural (HMF), těžké kovy nebo fytotoxiny. Med z nektaru některých druhů květin může být psychoaktivní a může vést k toxicitě navzdory tomu, že je pro včely a larvy neškodný. Med pocházející z nektaru rostliny Rhododendron ponticum obsahuje alkaloidy, které mohou být pro člověka jedovaté. Nektar z rostlin rodu Ericaceae a Solanaceae může mít toxický charakter, který je přičítán sloučeninám jako solanin, glykoalkaloidy nebo saponiny. Toxické účinky byly také zjištěny u medu z rostliny starček přímětník (Senecio jacobaea L.), ve kterém byly detekovány hepatotoxické pyrrozilidinové alkaloidy. Ty tvoří aktivní metabolity, které se mohou vázat nevratně v játrech a na další životně důležité orgány. Vysoké hladiny těchto alkaloidů v některých medech můžou způsobit progresivní chronickou toxicitu, zejména u kojenců a plodů. Med získaný z květin Andromeda obsahuje grayanotoxiny, které mohou způsobit ochrnutí končetin nebo dokonce až smrt. Toxický med, který může mít fatální následky produkují také rostliny Melicope ternata a Coriaria arborea z Nového Zélandu. Existují také zprávy, že není bezpečné konzumovat med pocházející z rostlin Datura (z Mexika a Maďarska), květin Belladonna a rostliny Hyoscamus niger (Z Maďarska), Serjania lethalis (z Brazilie), Gelsemium sempervirens (Z amerického jihozápadu), Kalmia latifolia, Tripetalia paniculata a Ledum palustre. U některých jedinců se může také objevit alergie na med a u malých dětí dětský botulismus. Příznaky otravy medem se můžou lišit v závislosti na zdroji toxinů. Mezi nejčastější příznaky patří závratě, nevolnost, zvracení, křeče, bolesti hlavy, bušení srdce nebo dokonce i smrt (Islam a kol., 2013). 6.10.1 5-hydroxymethylfurfural (HMF) 5-hydroxymethylfurfural (HMF) je sloučenina, která může být mutagenní, karcinogenní a cytotoxická. Je to cyklický aldehyd, který se tvoří v procesu Maillardovy reakce v průběhu tepelného zpracování a skladování medu (Islam a kol., 2013). Vzniká jako rozkladný produkt monosacharidů (zejména fruktosy) zejména za vyšších teplot a za přítomnosti kyselin. HMF se v medu začíná tvořit za příznivých podmínek už během 24

zrání v plástech. Takto se ho vytvoří však velmi málo (0,6 - 2 mg⋅kg-1 čerstvého medu). Výrazný nárůst HMF je spojen se zahříváním nebo skladováním při teplotách nad 30 °C (Přidal, 2003). Ve vzorcích medu, zejména v těch, které byly skladovány po dlouhou dobu, je HMF běžně detekovaná látka. Množství HMF může být použito jako indikátor čerstvosti a kvality medu. Proces zahřívání totiž ničí vitaminy, enzymy, minerály a může přispívat k vytvoření nežádoucí chutě a pachutě, které mohou snížit kvalitu medu a jeho nutriční hodnotu. Zahřívání také přispívá k tvorbě sloučenin jako jsou heterocyklické aminy, nitrosaminy a polycyklické aromatické uhlovodíky (Islam a kol., 2013). Codex Alimentarius (Alinorm 01/25 2000) uvádí, že koncentrace HMF v medu po zpracování a/nebo míchání by měla být nižší než 80 mg⋅kg-1. Nicméně Evropská unie (2002) doporučuje nižší limit a to 40 mg⋅kg-1 s těmito výjimkami: je povoleno 80 mg⋅kg-1 pro medy, které pocházejí ze zemí nebo oblastí s tropickými teplotami, zatímco spodní hranice pouze 15 mg⋅kg-1 je povoleno pro med s nízkými enzymatickými úrovněmi (Islam a kol., 2013). 6.10.2 Fytotoxiny Toxiny rostlin mohou přejít do medu, který je produkován z jejich nektaru. U rostliny, které obsahují sekundární metabolity jako jsou pyrrolizidinové alkaloidy, hyoscyamin, hyoscin, saponin, strychnin, gelsemine, tutin, hyenanchin, oleandrin a oleandrigenin, bylo prokázáno, že mají toxické vlastnosti. Bylo zjištěno, že med pocházející z rostlin rodu Ericaceae (Andromeda sp., Rhododendron ponticum, Kalmia sp., Lyonie sp., Pieris sp.) je velmi toxický. Výsledný med může být psychoaktivní a toxický pro člověka, i když pro včely a jejich larvy je zcela neškodný. Například med produkovaný z nektaru Rhododendron ponticum nebo Azalea Pontica obsahuje alkaloidy jako jsou GTX (gephyrotoxiny), které jsou jedovaté pro člověka, ale nepoškozují včely. Historicky byl med z těchto rostlin použit pro otrávení Římských vojáků v prvním století před naším letopočtem. Vojáci po konzumaci medu zvraceli a byly jako v deliriu, což vedlo k jejich porážce (Islam a kol., 2013). 6.10.3 Těžké kovy Včely přicházejí do styku se vzduchem, půdou a vodou z okolí. Hladina těžkých kovů v medu proto závisí na úrovni těžkých kovů v daném prostředí. Med může obsahovat těžké kovy jako olovo (Pb), arsen (As), rtuť (Hg), kobalt (Co), chrom (Cr), nikl (Ni), 25

selen (Se) nebo kadmium (Cd). Vyšší hladiny těžkých kovů mohou být detekovány v medech produkovaných v blízkosti měst a předměstí, které jsou vystaveny většímu tlaku průmyslu a spalovacích motorů. Jedním z nejvíce nebezpečných těžkých kovů nalezených v medu je arsen, který je vysoce toxický a karcinogenní. Může způsobit rakovinu kůže, plic, močového měchýře a jiných orgánů (Islam a kol., 2013). 6.10.4 Botulotoxin Botulotoxin je látka patřící do skupiny neurotoxinů. Způsobuje blokaci uvolňování acetylcholinu z nervových zakončení a brzdí tak jejich činnost, což vede k postupnému ochrnutí svalstva. Botulotoxin je produkován bakteriemi rodu Clostridium botulinum. Clostridie jsou gram pozitivní anaerobní bakterie běžně se vyskytující v půdě, prachu a zemědělských produktech, především jako spory (Fenicia, Anniballi, 2009). Med je jedním z často kontaminovaných potravinových zdrojů sporami Clostridium botulinum. Spory této bakterie mohou kontaminovat med během sběru nektaru, kdy včely přijdou do styku se sporami na kvetoucích rostlinách (Islam a kol., 2013). Med pak může být příčinou dětského botulismu u kojenců. Dětský botulismus je vzácné neuroparalytické onemocnění, které postihuje děti do 12 měsíců věku. Toto onemocnění

je způsobené právě botulotoxiny produkované

bakteriemi rodu Clostridium botulinum. Střevní mikroflóra kojenců není ještě dostatečně vyvinutá, aby dokázala inhibovat jejich růst. Prvním příznakem onemocnění je obvykle zácpa (3 a více dnů bez střevní peristaltiky u kojence), následuje pomalu progresivní průběh, který vrcholí obecnou svalovou slabostí. Ochrnutí obvykle nastupuje po 1 až 2 týdnech (Fenicia, Anniballi, 2009). Kromě toho může med obsahovat řadu antigenů, které mohou u kojenců vyvolat senzibilizaci a anafylaktický šok. Pokud spory spolknou děti, mohou v trávicím traktu klíčit a produkovat botulotoxin. K tomu může dojít i při pouhém oslazení dudlíku medem. Z tohoto důvodu by med neměl být podáván dětem a to zejména v prvních letech života (Islam a kol., 2013). 6.10.5 Alergeny Hlavními alergeny medu jsou zejména včelí proteiny a pyl, který se v medu běžně nachází. Je třeba mít na paměti, že 10 g medu může obsahovat od 20 000 do 100 000 pylových zrn. U pylu se nejčastěji jedná o alergie na rostliny z čeledi Compositae (pelyněk, heřmánek, pampeliška) Příznaky alergie na med jsou různé: kopřivka, 26

angioedém (otok), rýma, trávicí potíže, průjem, astma až anafylaxe. Alergie na med se však vyskytuje spíše ojediněle (Dutau, Rancé, 2009). Bauer a kol. (1996) uvádějí, že proteiny odpovědné za alergii na med jsou odvozeny z proteinů vylučovaných včelami a z proteinů odvozených z rostlinných pylů. Alergie byla zjištěna u 2,3 % pacientů ze 173 jedinců s alergií na potraviny. Mezi pacienty s potvrzenou alergií medu utrpělo 17 % anafylaxi a 30 % mělo astma. (Islam a kol., 2013).

7

SKLADOVÁNÍ MEDU

Med by se měl skladovat na tmavém a suchém místě při teplotě okolo 15 °C. Je velmi citlivý na pachy, a proto by se měl skladovat v dobře uzavíratelných nádobách (Bienefeld, 2006). Materiál nádob musí splňovat hygienické předpisy pro přímý styk s potravinami. Vhodné je například sklo, potravinářská nerezavějící ocel, potravinářský hliník nebo potravinářské plasty (Veselý, 2013). Nádoby by měly být vzduchotěsné, jelikož za přítomnosti kyslíku a vlhkosti med kvasí a zkazí se. Před krystalizací můžeme med chránit uložením v mrazničce (Weiß, 2010). Vlhkost vzduchu by neměla, vzhledem k hygroskopicitě medu, při skladování přesáhnout 65 % (Přidal, 2013).

8

ANTIOXIDANTY V MEDU

Pojem „antioxidanty“ je poměrně široký a zahrnuje velkou škálu látek. Mezi antioxidanty řadíme některé vitaminy, minerální látky, karotenoidy, fytosteroly, fytoestrogeny, fenolové sloučeniny a dokonce i enzymy. V souvislosti s medem se pod tímto pojmem skrývají zejména flavonoidy a fenolové kyseliny. Antioxidanty jsou látky, které naše tělo chrání před škodlivými účinky volných radikálů. Volné radikály jsou jednak přirozeně vytvářené v organismu jako vedlejší produkty buněčného metabolismu a jednak přicházející zvenčí (kouření, nadměrné vystavování slunečnímu záření apod.) (Titěra, 2013). Volné radikály vznikají homolytickým štěpením kovalentní vazby (sdílení elektronového páru), po kterém má každý produkt jeden nepárový elektron (Komprda, 2003). A − B → A • +B •

Volné radikály mohou způsobit poškození genetického kódu buněk a ty se pak mohou zvrhnout v buňky rakovinné. Volným radikálům se také připisují nemoci jako

27

ateroskleróza, Alzheimerova choroba, Parkinsonova nemoc nebo revmatická artritida (Titěra, 2013). V medu bylo zjištěno několik desítek různých antioxidantů, z nichž nejdůležitější jsou flavonoidy a flavanony, ale také organické kyseliny a jejich estery. Obsah antioxidantů závisí na botanickém původu medu a na jeho barvě. Smíšené medy mají antioxidační účinek vyšší, jelikož pochází z více druhů rostlin nebo stromů (Titěra, 2013). Obecně jsou na antioxidanty bohatší tmavší druhy medů (Frank, 2010). Nejedna vědecká studie prokázala, že konzumace medu zvyšuje hladinu antioxidantů v krvi. Například studie, kde bylo 25 zdravých mužů rozděleno do dvou skupin. Jedna pila čistou vodu a druhá vodu slazenou pohankovým medem. Skupina, která pila vodu slazenou medem měla v krvi o 7 % více antioxidantů (Frank, 2010).

8.1 Polyfenoly Polyfenoly jsou jedny z nejvýznamnějších sloučenin vyskytujících se v rostlinách, ve kterých vznikají jako produkty sekundárního metabolismu. Mezi nejdůležitější třídy polyfenolů patří flavonoidy a fenolové kyseliny. Tyto látky vykazují široké spektrum biologických účinků a působí jako přírodní antioxidanty (Pyrzynska, Biesaga, 2009). 8.1.1

Flavonoidy

Flavonoidy jsou odvozeny z latinského slova flavus (žlutý). Dodávají rostlinám, popř. potravinám barvu (Frank, 2010). Mezi potravinářsky nejvýznamnější flavonoidy patří flavony, flavonoly, flavanony, izoflavony a anthokyanidiny. Vykazují širokou škálu biologických účinků včetně antibakteriálních, protizánětlivých, antialergických a antitrombotických. Epidemiologické studie také poukazují na jejich možnou roli v prevenci kardiovaskulárních onemocnění a rakoviny. Flavonoidy se chovají jako antioxidanty celou řadou způsobů včetně přímého zachycení reaktivních forem kyslíku, inhibice enzymů odpovědných za produkci superoxidových aniontů, chelatace kovů zapojených do tvorby radikálů a prevence peroxidačních procesů snižováním alkoxylových a peroxylových radikálů (Pyrzynska, Biesaga, 2009). Obsah flavonoidů v potravinách kolísá v závislosti na různých faktorech. Dostatek slunečního záření například ovlivňuje jejich syntézu v rostlinách. Ve skleníkové zelenině je proto jejich obsah nižší. Ke ztrátám dochází také při konzervaci ovoce a zeleniny (Kalač, 2003).

28

Základní struktura flavonoidů

Flavonoly (Quercetin, R=OH)

Flavony (Apigenin, R= H)

Flavanony (Naringenin, R=H)

Isoflavony (Genistein, R=H)

Anthokyanidiny (Pelargonidin, R=H)

Obr. 2 Flavonoidy a jejich struktura (Pyrzynska, Biesaga, 2009).

8.1.2

Fenolové kyseliny

Fenolové kyseliny mají protinádorové, antioxidační a antimikrobiální účinky. Jejich význam spočívá zejména ve schopnosti inhibice tvorby mutagenů, resp. karcinogenů v trávicím traktu. Inhibují iniciační (přeměna normální buňky na nádorovou) a promoční (dělení buňky po iniciaci) fázi karcinogeneze. Mechanizmy tohoto účinku jsou různé. Mohou inhibovat enzymy fáze I a tím zabránit aktivaci prokarcinogenů nebo aktivovat enzymy fáze II jako např. glutathion-S-trasferázu a aktivovat tak ochranný antioxidační

systém

těla.

Dalším

mechanizmem

je

interakce

s aktivovaným

karcinogenem (např. s polycyklickým aromatickým uhlovodíkem) nebo interakce s DNA, na kterou se váží a zabraňují tak navázání aktivovaného karcinogenu. Mají také antioxidativní potenciál, díky kterému zabraňují peroxidaci lipidů a inhibují tvorbu hydroxylových radikálů (Komprda, 2003). Z fenolových kyselin jsou významné zejména deriváty kyseliny skořicové (kyselina ferulová, sinapová, nebo kávová) a deriváty kyseliny hydroxybenzoové (kyselina gallová, protokatechová, syringová nebo vanilinová) (Komprda, 2003).

29

R

1

R

1

HO

HO

COOH

COOH R

2

R

Deriváty kyseliny skořicové

2

Deriváty kyseliny hydroxybenzoové

Obr. 3 Struktura derivátů kyseliny skořicové a hydroxybenzoové (Komprda, 2003). Deriváty kyseliny skořicové: Kyselina ferulová vykazuje celou řadu biologických účinků jako antioxidační, protizánětlivé,

antimikrobiální,

antialergické,

hepatoprotektivní,

protivirové,

antikarcinogenní, vasodilatační nebo antitrombotické. Zvyšuje také životaschopnost spermií, podílí se na modulaci aktivity enzymů, aktivaci transkripčních faktorů apod. Má také použití v konzervaci potravin nebo jako fotoprotektivní složka v opalovacích krémech a pleťových vodách (Kumar, Pružni, 2014). Jeho přidáním do roztoku kyseliny L-askorbové a α-tokoferolu se docílí zlepšení chemické stability vitamínů C a E a zdvojnásobí se tak fotoprotekce kůže proti slunečnímu záření. Tato kombinace čistých přírodních nízkomolekulárních antioxidantů poskytuje významnou synergickou ochranu proti oxidačnímu stresu v kůži a je tak účinná při ochraně proti stárnutí a rakovině kůže vlivem světla (Lin a kol., 2005). Kyselina kávová se přirozeně nachází v kávě, ovoci, zelenině a olivovém oleji. Vykazuje antioxidační, protizánětlivé a antiproliferační vlastnosti. Bylo zjištěno, že kyselina kávová má antioxidační účinky v normálních buňkách a prooxidační účinky v rakovinných buňkách. Toto prooxidačně zprostředkované poškození DNA indukuje apoptotickou smrt nádorových buněk a vykazuje tak antikarcinogenní účinky (Kanimozhi, Prasad, 2015). Dalším zajímavým derivátem kyseliny skořicové je kyselina p-kumarová. U kyseliny p-kumarové byla zjištěna antibakteriální aktivita proti řadě bakterií (Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Shigella dysenteriae a Salmonella typhimurium). Bylo zjištěno, že p-kumarová kyselina má dva mechanismy účinku: narušení bakteriální buněčné membrány, vazba na bakteriální genomovou DNA pro inhibici buněčné funkce, což nakonec vede k buněčné smrti (Lou, Wang a kol., 2012). Byl také zjištěn ochranný účinek kyseliny p-kumarové proti infarktu myokardu u krys. U infarktu myokardu hraje důležitou roli apoptóza. 30

Mezi ochranné mechanismy p-kumarové kyseliny patří jeho antilipidické, peroxidační, antioxidační a antiapoptotické vlastnosti (Prince, Roy, 2013). Deriváty kyseliny hydroxybenzoové: Kyselina protokatechová je látka přítomna v mnoha léčivých rostlinách. Nedávné studie ukazují, že tato látka může být ochranou proti rozvoji epiteliální malignity (zhoubnosti) v různých tkání a také proti rozvoji kardiovaskulárních chorob. Jeho mechanismus působení je většinou spojen s antioxidační aktivitou, kdy vychytává volné radikály. Má také vliv na fázi I a II v metabolismu některých karcinogenů. Blokuje také specifická vazebná místa konečných karcinogenů s molekulou DNA, čímž brání tvorbě aduktu, který může mít za následek mutaci a nádorovou transformaci. Výsledky ukazují, že kyselina protokatechová v dávkách 200 - 2000 ppm (0,02 – 0,2 %) v potravě účinně inhibuje vývoj většiny rakovin, zejména zažívacího ústrojí. Účinnost kyseliny protokatechové byla prokázána v prevenci rakoviny dutiny ústní v několika experimentálních modelech za použití krys a křečků. Vzhledem ke svým biologickým vlastnostem je kyselina protokatechová potenciální chemopreventivní látka proti rakovině. (Tanaka, 2011). Kyselina gallová je přírodní antioxidant, u kterého byly zjištěny mimo jiné také antialergické účinky. Objev léčiv pro léčbu zánětlivých alergických onemocnění jako je astma, alergická rýma nebo zánět vedlejších nosních dutin je velmi důležitý. U kyseliny gallové

(kyselina

3,4,5-trihydroxybenzoová)

je

známo,

že

má

antioxidační,

protizánětlivé a antimikrobiální účinky. Tato látka inhibuje žírné buňky odvozené od zánětlivé alergické reakce tím, že blokuje uvolňování histaminu a prozánětlivých cytokinů. In vivo a in vitro zkoumané antialergické účinky kyseliny gallové naznačují možnou terapeutickou aplikaci této látky u zánětlivých alergických onemocnění (Kim a kol., 2006). Kyselina gallová také prokázala významnou inhibici buněčné proliferace v řadě nádorových buněčných linií a indukovala apoptózu v rakovinných buňkách jícnu. Výsledky studií naznačují, že kyselina gallová může být potenciální protinádorová sloučenina. Nicméně je třeba ještě plně objasnit mechanismus jejího účinku (Faried a kol, 2007). Studie Kanga a kol. (2008) zkoumala schopnost methyl gallátu a kyseliny gallová inhibovat v ústech a in vitro bakteriální proliferaci (růst) Streptococcus mutans, který způsobuje zubní kaz. Obě látky vykazovaly inhibiční účinky na růst kariogenních (kaz vytvářející) a parodontopatických (způsobující parodontózu) bakterií. Kromě toho významně inhibují in vitro tvorbu S. mutans biofilmu. Methyl gallát a kyselina gallová 31

mohou inhibovat růst patogenů dutiny ústní a tvorbu biofilmu S. mutans a mohou být použity k zábraně tvorby zubního plaku a zubního kazu. U kyseliny vanilové a vanilinu byly zjišťovány antimikrobiální účinky a to proti bakteriím Listeria monocytogenes, Listeria innocua, Listeria grayi a Listeria seeligeri v laboratorním médiu s korekcí na hodnoty pH v rozmezí 5,0 až 8,0. Účinek pH byl sledován při inkubaci L. monocytogenes, L. innocua, a L. grayi v médiu obsahujícím 30 mM vanilinu nebo 60 mM kyseliny vanilové při pH 5,0, 6,0 a 7,0. Směsi vanilinu a kyseliny vanilové vykazovaly inhibiční účinky zejména při nižším pH. Výsledky ukazují, že tyto přírodní antimikrobiální sloučeniny by mohly být užitečné, a to buď samostatně nebo ve směsích, pro kontrolu Listeria spp. v potravinářských výrobcích (Delaquis a kol., 2005). Bylo zjištěno, že kyselina vanilová má, díky svým antioxidačním a protizánětlivým vlastnostem, ochranné účinky proti infarktu myokardu. Tento účinek byl ověřen u krys, které byly předem ošetřeny kyselinou vanilovou (5 mg a 10 mg⋅kg-1) denně po dobu 10 dnů. Účinné bylo předběžné ošetření v dávce 10 mg⋅kg-1 (Prince a kol., 2011). Kyselina syringová a kyselina vanilová mají antimikrobiální a protirakovinné účinky. U kyseliny syringové a kyseliny vanilové, které mají akceptorovou radikálovou aktivitu, byl zkoumán také jejich hepatoprotektivní účinek na vyvolané chronické poškození jater u myší. Injekce CCI4 do peritoneální dutiny způsobil nárůst aspartátaminotransferázy (AST) a hladiny alaninaminotransferázy (ALT). Nitrožilní podání kyseliny syringové a kyseliny vanilové výrazně snížil hladinu transamináz. Čtyři týdny pod CCI4 způsobily dostatečně nadměrné ukládání kolagenových vláken. Bylo zjištěno, že kyselina syringová a kyselina vanilová zřejmě potlačují akumulaci kolagenu a výrazně snižují obsah hydroxyprolinu v játrech, který je kvantitativním markerem fibrózy. Obě tyto sloučeniny také významně zachovávaly životaschopnost primární buněčné kultury hepatocytů. Zjištěné údaje naznačují, že podávání kyseliny syringové a kyseliny vanilové může potlačit jaterní fibrózu u chronického poškození jater (Itoh a kol., 2010). Med je na polyfenoly bohatý a bylo prokázáno, že jeho antioxidační kapacita je podobná mnoha druhům ovoce a zeleniny. Bylo také zjištěno, že medy s tmavší barvou mají vyšší fenolický obsah a v důsledku toho také vyšší antioxidační kapacitu (Pyrzynska, Biesaga, 2009).

32

Obsah polyfenolických sloučenin (flavonoidů a fenolových kyselin) v medu je silně ovlivněn rostlinným a zeměpisným původem, jakož i klimatem místa. Analýza fenolických látek je proto považována za velmi slibný způsob studia rostlinného a geografického původu medu. Například hesperetin typický pro citrusové medy, kaempferol pro rozmarýnový med, quercetin pro med slunečnicový, ellagová kyselina pro vřesový med nebo kávová, p-kumarová a ferulová kyselina pro kaštanový med (Pyrzynska, Biesaga, 2009). Výsledky studie analyzující medy z Argentiny ukazují, že právě přítomnost určitých flavonoidů by mohla být spojena s rostlinným a také geografickým původem medů. Ve výzkumu se sledovaly zejména flavonoidy myricetin, quvercetin a luteolin v medech ze tří geografických oblastí Argentiny. Medy byly klasifikovány podle obsahu pylu na jednodruhové nebo smíšené. Mezi sledovanými medy byl například med Eukalyptový nebo Lotosový. V Eukalyptovém medu byly převládajícími sloučeninami quercetin a luteolin, které činily 62 % a 26 % z celkového obsahu flavonoidů. Navíc byly tyto hodnoty přibližně o 50 % vyšší než u medů smíšených a v medu Lotusovém. Na druhé straně Lotusové medy obsahovaly významně vyšší podíl myricetinu než u smíšených medů nebo v medu Eukalyptovém. To znamená, že Eucalyptus přispívá k obsahu quercetinu a luteolinu, zatímco Lotus by mohl přispět k obsahu myricetinu. Obsahy těchto látek se také lišily podle geografické oblasti Argentiny (Iurlina a kol. 2009)

8.2 Polyfenoly v jednotlivích druzích medu Složení fytochemikálií má vliv na biologickou aktivitu medu. Jak již bylo zaznamenáno, složení medu závisí na rostlinném zdroji, zeměpisném původu, ale také na sezóně a životním prostředí. Avšak v určitých medech existuje převaha jednotlivých sloučenin, které byly díky tomu navrženy jako markery pro stanovení botanického původu medu. Například quercetin pro slunečnicový a řepkový med, 8-methoxykaempferol pro rozmarýnový med, flavanon hesperitin pro citrusové medy nebo naringenin a luteolin pro levandulový med (Kaškoniené, Venskutonis, 2010). Některé fenolové kyseliny jako ellagová, benzoová, fenyloctová nebo mandlová byly použity jako markery pro vřesový med a kávová, p-kumarová a ferulová kyselina pro kaštanový med. Myricetin, quercetin a luteolin jsou důležité v eucalyptovém medu (Bondurand, Bosch, 2012). Ve studii Bertoncelje (2011) bylo získáno čtyřicet vzorků medu přímo od včelařů a to z různých míst po celém Slovinsku. Botanický původ vzorků byl specifikován včelaři 33

v závislosti na umístění úlů, ročním období a dostupných rostlinných zdrojů. Vzorky medu byly rozděleny do sedmi skupin: akátový (Robinia pseudoacacia), lipový (Tilia spp.), Kaštanový (Castanea sativa), jedlový (Abies alba Mill.), smrkový (Picea abies (L.) Karst), květinový (nektarový med z různých květin) a lesní (medovicový med). Hlavní flavonoidy, detekované ve všech analyzovaných vzorcích medu, byly flavonoidy odvozené od propolisu: pinocembrin, pinobanksin, chrysinu a galangin. Nejvyšší hodnoty těchto flavonoidů byly stanoveny pro květinový a akátový med, nejnižší byly pak u kaštanového a jedlového medu. Ostatní flavonoidy zjištěné v těchto vzorcích byly: myricetin, luteolin, quercetin, naringenin, apigenin a kaempferol. Flavonoid kaempferol byl pozorován u všech vzorků medu s obsahem mezi 20 a 40 µg⋅100 g-1. Stejně tak apigenin byl zaznamenán u všech analyzovaných vzorků. Quercetin byl identifikován u většiny vzorků, kdy nejvyšší obsah quercetinu byl zjištěn u jedlového a smrkového medu (49,1 - 73,2 µg⋅100 g-1 a 29,2 - 67,9 µg⋅100 g-1). Úrovně quercetinu v akátovém, lipovém, květinovém a lesním medu byly velmi podobné, zatímco ve dvou vzorcích kaštanového medu byl jeho obsah pod detekčním limitem. Flavonoidy myricetin, luteolin a naringenin byly přítomny jen v některých vzorcích medu a jejich hladiny byly velmi nízké. Luteolin nebyl detekován v akátovém medu, myricetin nebyl zjištěn v akátovém a lipovém medu a naringenin nebyl detekován v kaštanovém a akátovém medu. Získané výsledky ukázaly, že většina medů měla podobné, ale kvantitativně odlišné fenolové profily. Rozdíly v obsahu flavonoidů byly pozorovány u různých druhů, stejně jako v rámci stejného typu medu. Ve studii provedené Marghitasem a kol. (2010) byly sledovány fenolové kyseliny a flavonoidy v akátovém medu. Analýze bylo podrobeno 10 vzorků, u kterých byly detekovány 3 fenolové kyseliny (p-hydroxybenzoová, ferulová a t-skořicová kyselina) a 5 flavonoidů (pinobanksin, apigenin, pinocembrin, chrysin a acacetin). Obsah identifikovaných fenolových kyseliny byl v těchto 10 vzorcích v součtu 12,11 mg medu. Z toho ferulová kyselina byla identifikována ve všech analyzovaných vzorcích (0,72 až 8,66 mg⋅kg-1) a představuje tak 29 % z celkového množství. V akátovém medu byly kvantifikovány v různém množství a ne u všech vzorků i kyseliny p-kumarová, p-hydroxybenzoová, t-skořicová a kyselina vanilová. Ve všech testovaných vzorcích byly identifikovány a kvantifikovány flavonoidy pinobanksin (0,64 až 2,28 mg⋅kg-1), pinocembrin (0,38 - 1,38mg⋅kg-1), chrysin (0,61 až

34

1,21 mg⋅kg-1) a acacin (0,15 a 1,2 mg⋅kg-1). Celkové množství zjištěných flavonoidů v akátovém medu bylo v 10 vzorcích 6.81 mg⋅kg-1 medu, z čehož 24 % zaujímá apigenin a 22 % pinobanksin. Ostatní flavonoidy jako crysin, kaemferol, acacetin a pinocembrin byly zjištěny v nižším množství a to do 12 % z celkového množství. Pozorování akátového medu v této studii poukázalo také na velké rozdíly mezi množstvím fenolických látek ve vzorcích pocházejících z různých zeměpisných oblastí. Například kyselina ferulová a kyselina p-kumarová byly kvantifikovány ve vzorcích pocházejících z Německa a Itálie. V jiné oblasti Itálie byla kromě nich zjištěna také kyselina vanilová, stejně jako ve vzorcích pocházejících z Rumunska. Ve studii Sabatiera a kol. (1992) byly izolovány flavonoidy slunečnicového medu. Bylo zde identifikováno pět hlavních sloučenin a to pinocembrin, pinobanksin, chrysin, galangin a quercetin. Kromě toho zde byly zjištěny také flavonoidy tectochrysin a kaempferol.

Kyselina kávová

Pinocembrin

Chrisin

Galangin

Quercetin

Kaempferol

Acacetin

Apigenin

Obr. 4 Hlavní polyfenoly v medu (Bondurand, Bosch, 2012).

35

9

VÝZNAM MEDU NA ZDRAVÍ ČLOVĚKA

Med je přírodní potravinový produkt dobře známý pro svoje cenné nutriční, hojivé a ochranné vlastnosti, které vyplývají z jeho chemického složení. Již staří Egypťané a Řekové používali med jako lék k léčbě onemocnění např. žaludečních vředů nebo kožních ran. Přírodní léčba za využití včelích produktů - apiterapie se v poslední době stala středem pozornosti jako lidová a preventivní léčba určitých stavů a nemocí a pro podporu celkového zdravotního stavu a pohody (Pyrzynska, Biesaga, 2009). Vzhledem ke své sladkosti, barvě a chuti se med také často používá jako náhražka cukru, ochucovadlo nebo přírodní konzervační prostředek v mnoha potravinářských výrobcích. Může totiž v potravinách zabránit oxidační reakci (např. oxidaci lipidů v mase nebo enzymatickému hnědnutí ovoce a zeleniny). Kromě cukru obsahuje med širokou škálu složek z nichž mnohé, zejména polyfenoly, mají antioxidační vlastnosti (Pyrzynska, Biesaga, 2009). Z polyfenolů mají pro svoje antioxidační účinky velký význam zejména flavonoidy. Například flavonoid quercetin se uplatňuje při ochraně vitaminu C před poškozením kyslíkem a prodlužuje tak jeho účinnost. Flavonoidy také chrání nenasycené mastné kyseliny a cholesterol před rozpadem a snižují agregaci krevních destiček, čímž snižují nebezpečí

trombózy.

U

flavonoidů

byly

také

prokázány

antibakteriální,

antiarteriosklerotické, protizánětlivé a protirakovinné účinky. Chrání také před srdečním infarktem (Frank, 2010).

9.1 Med a srdečně cévní onemocnění Med je bohatý na fenolické sloučeniny, které působí jako přírodní antioxidanty a díky jejich pozitivnímu vlivu na lidské zdraví se těší stále větší oblibě. Mnoho epidemiologických studií prokázalo, že pravidelný příjem fenolických látek je spojen se snížením rizika srdečních onemocnění.

Pozitivní účinky fenolických sloučenin na

ischemické choroby srdeční spočívají zejména v

jejich antitrombotickém,

antiischemickém, antioxidačním a vasorelaxačním účinkům. Předpokládá se, že flavonoidy snižují riziko koronárních srdečních onemocnění pomocí tří hlavních kroků: zlepšení koronární vasodilatace, snížení schopnosti krevních destiček srážet krev a ochrana LDL (lipoproteidy s nízkou hustotou) proti oxidaci. Jako slibné farmaceutické léky pro léčbu kardiovaskulárních onemocnění byly popsány také některé z polyfenolů

36

medu. Mezi nimi například quercetin, kyselina kávová, acacetin, kaempferol nebo galangin. Po prozkoumání těchto sloučenin in vitro a in vivo, by měly být zahájeny klinické studie na další jejich ověření pro lékařské aplikace (Khalil, Sulaiman, 2010).

9.2 Med a rakovina Med je pro různé účely používán v medicíně již dlouhou dobu. Jeho antioxidační vlastnosti a preventivní účinky proti různým chorobám, jako je rakovina, byly však objeveny teprve nedávno. Chrysin (5,7-dihydroxyflavon) je přírodní flavon běžně se vyskytující v akátovém medu. Již dříve bylo prokázáno, že působí jako protinádorové činidlo. V časopise International Journal of Oncology byla uvedena studie, ve které se zkoumala antiproliferační role medu nebo chrysinu na lidský (A375) a myší (B16-F1) melanom buněčných linií. Výsledky testů ukázaly, že obě testované sloučeniny byly schopné indukovat antiproliferační účinek na buňky melanomu v závislosti na dávce a čase. Analýza průtokovou cytometrií ukázala, že cytotoxicita vyvolaná medem nebo chrysinem byla zprostředkována pomocí G0/G1 buněčného cyklu zastavující a indukující hyperploidní postup. Výsledky této studie naznačují, že antiproliferační účinky medu jsou způsobeny zejména přítomností chrysinu. Chrysin tedy může být považován za možného kandidáta na prevenci i léčbu rakoviny. Je však potřeba ještě dalšího šetření k ověření účinku chrysinu na léčbu nádorů in vivo (Canini a kol., 2010).

9.3 Med a hojivé (antimikrobiální) účinky Med se již dlouhou dobu hojně používá při léčbě popálenin a širokého spektra poranění, zejména chronických ran. Za jeho léčivými účinky stojí jeho antibakteriální potenciál. Med a jeho složky jsou schopny buď stimulovat nebo inhibovat uvolňování určitých cytokinů (tumor nekrotizující faktor-α, interleukin-1β, interleukin-6) z lidských monocytů a makrofágů v závislosti na stavu rány. Podobně med buď sníží nebo aktivuje produkci reaktivních forem kyslíku z neutrofilů v závislosti na mikroprostředí rány. Medem indukovaná aktivace obou typů imunitních buněk by mohla podpořit očištění rány od nečistot a urychlit proces hojení. Podobně i lidské keratinocyty, fibroblasty a endoteliální buňky jsou přítomností medu pozitivně ovlivněny. Med tak může urychlit reepitelizaci a uzavření rány. Je však třeba ještě plně objasnit sloučeniny a mechanismy

37

odpovědné za imunomodulační a protizánětlivé účinky medu a podpořit tak pozitivní klinické výsledky použití medu při hojení ran (Majtan, 2014). Hlavními složkami antibakteriálního účinku medu jsou peroxid vodíku a peptid defenzin. Peroxid vodíku vzniká enzymatickou přeměnou glukózy na kyselinu glukonovou. Tuto reakci katalyzuje včelí enzym glukózooxidáza (GOX), který se do medu dostává zpracováváním nektaru na med. Hladina tohoto enzymu je ovlivněna jednak genetickými faktory a jednak také potravou, zejména pylem. Při konzumaci vícedruhového pylu u včel je aktivita GOX výraznější, zatímco konzumace pylu jednodruhového tuto aktivitu neovlivňuje. Bylo zjištěno, že čím více GOX med obsahuje, tím účinnější je v inhibici růstu bakterií. Vzhledem k tomu, že je GOX včelího původu, musí jej obsahovat každý pravý včelí med. V medicíně je pro léčbu chronických zranění nejpoužívanější manukový med, který má výrazné antibakteriální účinky. Manukový med sice GOX i defenzin obsahuje, ale obě složky podléhají strukturálním modifikacím a stávají se neaktivními. Bylo zjištěno, že za tyto modifikace je zodpovědná rostlinná složka metylglyoxal, která je také hlavní antibakteriální složkou tohoto medu (Majtan, Valachová, Bučeková, 2014). GOX má kromě antibakteriálního účinku také význam v ochraně včelstva. Podporuje imunitu kolonie a jeho přidáváním do larvální kašičky chrání larvy před různými nemocemi. (Majtan, Valachová, Bučeková, 2014). Ne všechny medy však vykazují stejnou antimikrobiální účinnost a jen málo z nich splňuje kritéria pro klinické použití. Časopis Journal of Tissue Viability uvedl studii, která zjišťovala klinickou účinnost sterilizovaného medovicového medu při léčbě bércových vředů dolních končetin u 25 pacientů. Dále se u pacientů hodnotila přijatelnost medu z hlediska bolesti a celkové spokojenosti. 100 % sterilní medovicový med, ošetřen γ-zářením, byl aplikován na vyčištěné rány. Každá rána byla hodnocena nejméně dvakrát po dobu 6 týdnů. V průběhu léčby se průměrná plocha rány všech pacientů významně snížila z 51 (3 - 150) do 22 (0 - 91) cm2. U osmnácti pacientů (72 %) došlo k poklesu úrovně bolesti, zatímco pět pacientů (20 %) mělo stejnou úroveň bolesti v průběhu studie. Celková spokojenost s léčbou medem byla pozitivní u 80 % pacientů. Pouze dva pacienti zažili špatnou toleranci vzhledem k problémům vztahujícím se k bolesti. Na základě této studie má medovicový med potenciál být jedním z lékařských přípravků (Mayer a kol, 2014).

38

9.4 Med a antivirové účinky Med má také antivirové účinky. Byl například testován proti viru zarděnek, a to na opičí ledvinové buněčné kultuře. Získané výsledky ukázaly, že med má proti tomuto viru dobrou aktivitu. Bylo také zjištěno, že v určitých případech má med lepší účinky než acyklovir krém– nejčastěji používaný lék proti herpes. Pacienti s orálním nebo genitálním oparem zaznamenali podstatně kratší trvání oparu a menší bolest při použití medu oproti použití acyklovir krému. Nedávná oblast výzkumu zjistila patrnou inhibiční aktivitu některých flavonoidů proti viru HIV. Flavonoidy v medu jako chrysin, acacetin a apigenin mají preventivní účinky proti HIV-1 aktivaci prostřednictvím mechanismu, který pravděpodobně zahrnuje inhibici virové transkripce. Flavonoidy mají také inhibiční schopnost vůči řadě dalších virů. Například quercetin a další flavonoidy působí proti až sedmi typům virů včetně viru herpes simplex (HSV), respiračnímu syncyciálnímu viru a polioviru. Dva další flavonoidy nalezené v medu a včelích produktech (chrysin a kaempferol) inhibují replikaci viru herpes simplex (HSV), lidského koronaviru a rotaviru. Některé studie se také zabývaly interakcí mezi různými sloučeninami: například, kaempferol a luteolin mají synergický účinek proti HSV v porovnání s jednotlivými sloučeninami (Bondurand, Bosch, 2012).

9.5 Další pozitivní účinky medu Med má výjimečné postavení zejména v tradiční čínské medicíně a to díky jeho široké škále biologicky aktivních látek. Má pozitivní vliv na činnost srdce a tvorbu krve. Zvlhčuje plíce, zastavuje kašel, působí proti únavě, nechutenství a zácpě. Při chronickém kašli, způsobeném nedostatečností plic, suchu v hrdle nebo suchému kašli se doporučuje lžíce medu dvakrát denně s teplou vodou. Med také posiluje imunitu organismu a podporuje regeneraci jaterní tkáně. Pro léčebné účely se doporučuje 15 30g medu denně (Valíček, 2014). V posledních letech se poukázalo na jednu z biologicky aktivních látek pinocembrin, u něhož byly zjištěny vysoké antioxidační účinky (Valíček, 2014). Pinocembrin je přírodní flavonoid nacházející se v medu, propolisu, kořenech zázvoru, divoké majoránce a dalších rostlinách. Předchozí studie ukázaly, že má protizánětlivé a

39

neuroprotektivní účinky, schopnost snižovat reaktivní kyslíkaté částice (ROS), chránit hematoencefalickou bariéru (BBB), modulovat mitochondriální funkce a regulovat apoptózu. Jeho vlastnosti by se také mohly využít při léčbě rakoviny a kardiovaskulárních chorob. In vitro a in vivo studie poskytly důkazy, že pinocembrin může chránit mozek před poškozením ischemické cévní mozkové příhody. Proto byl v roce 2008 schválen Státní správou pro potraviny a léčiva v Číně pro klinické studie u pacientů s ischemickou cévní mozkovou příhodou (Lan a kol., 2015).

10 PYL Pylová zrna se jeví jako malé bílé nebo zlaté tečky vyráběné v tisících uvnitř květiny (Bradbear, 2009). Jedná se o samčí pohlavní buňky uvolňující se ze samčího pohlavního orgánu rostliny. Tedy z horní části tyčinky – prašníku, který pukne, jakmile jsou pylová zrna zralá. Opylení zajišťuje buď vítr – u rostlin větrosnubných nebo hmyz – u rostlin hmyzosnubných (Cramp, 2011). Hmyzosnubné rostliny, které potřebují včely pro rozšíření pylu, musí včely nalákat. Mezi taková lákadla patří nektar a pyl. Nektar a pyl jsou pro včely zdrojem potravy. Nektar je především zdrojem sacharidů pro výrobu medu, zatímco pyl poskytuje všechny ostatní živiny nezbytné pro rozvoj včel (Bradbear, 2009). Pyl je jako dodavatel bílkovin nezastupitelná složka včelí stravy. Bez něj by včely nepřežily. Larvy jej potřebují pro růst, včely pro produkci jedu, mladušky pro vylučování potravy mladým larvám a zimní včely pro přežití zimy (Bienefeld, 2010). Anatomie včel je pro sběr pylu dobře přizpůsobena. Včely sbírají nektar a při tom se jim na těle zachytává pyl, který roznáší z květu na květ. Včely však pyl sbírají i cíleně právě kvůli jeho velkému výživnému významu. Sbírají ho do speciálních pylových košíčků umístěných na třetím páru nožiček z vnější straně holeně. V úlu pyl ukládají do plástů v plodišti (Cramp, 2011). Mnohé experimenty ukazují, že i když jednotlivé včely sbírají pyl z jediného druhu rostliny, včelí kolonie jako celek sbírá pyl z nejrůznějších zdrojů a zajišťuje tak, aby měla kolonie různorodou stravu. Konzumují ho zejména dělnice v prvních dnech života v dospělosti a je jimi používán k tvorbě mateří kašičky pro rozvoj larev (Bradbear, 2009). Někteří lidé považují pyl jako vysoce hodnotný doplněk stravy vzhledem k rozsahu složek, které obsahuje. Skládá se z asi 30 procent bílkovin včetně všech esenciálních aminokyselin, vitaminů a minerálů, tuků, stopových prvků, prekurzorů hormonů, 40

enzymů, sacharidů a mastných kyselin, flavonoidů a karotenoidů a mnoho dalších minoritních složek v závislosti na rostlinném zdroji (Bradbear, 2009). Pyl je také sbírán pro použití v chovných programech rostlin, pro opylování, pro skladování a následné podávání včelám v době nedostatku potravy, pro použití ve studii alergických reakcí jako je senná rýma a stále více pro monitorování znečištění životního prostředí a to především na přítomnost těžkých kovů (Bradbear, 2009). Pyl je na trhu stále žádanější a pro včelaře může být jeho prodej komerčně zajímavý. Sbírá se pomocí pylochytu, což je destička s otvory tak malými, že včela sice proleze, ale otře o její okraj pyl. Nesmí se však zapomínat na to, že je pyl pro včely nezbytně potřebný, pylochyt se proto nenechává na úlu déle než 2 dny (Cramp, 2011).

11 MATEŘÍ KAŠIČKA Včelí mateří kašička je bílá tekutina, která slouží jako potrava pro larvy včel (Bradbear, 2009). Mateří kašičku vylučují dělnice staré 5 - 15 dní hltanovými žlázami. Dělnicím a trubcům je podávána první tři dny, královně je k dispozici po celý její život. Obsahuje velké množství živin jako minerálních a tukových látek, cukrů, vitaminů, bílkovin (až 45 %), enzymů, aminokyselin a dalších (Zeintrich, 2003). Bylo zjištěno, že mateří kašička obsahuje všech dvacet základních aminokyselin (Cramp, 2011). Mateří kašička má protivirové a antibiotické účinky, které působí proti řadě mikrobů, ale i prvoků (např. proti bičíkovci způsobujícího spavou nemoc). Zlepšuje také činnost srdce, trávicího ústrojí, psychický stav a působí proti ateroskleróze. Má omlazující účinky, zejména na pokožku, a proto se využívá v kosmetice. Není však dosud jasné, zda má mateří kašička protinádorové účinky nebo naopak nádorový proces podporuje. Při podezření na nádorový proces by se tedy neměla používat. Taktéž by ji neměly používat těhotné ženy a malé děti (Zeintrich, 2003). V některých zemích, zejména v Číně, Tchajwanu a Thajsku, je mateří kašička komerční záležitostí. Včelstva jsou kvůli produkci mateří kašičky upravena tak, aby začala produkovat velké množství královen a to 50 i více. Dělnice tedy vytvářejí obrovské množství mateří kašičky (k dosažení tohoto cíle je potřeba přikrmování cukrem) a umisťují je do buněk pro královny. Avšak místo krmení larev se larvy odstraní a mateří kašička je sklizena. Včelí mateří kašička podléhá rychle zkáze. Proto a se musí uchovávat zmrazená nebo mraženo-sušená během manipulace, skladování, přepravy a uvádění na trh (Bradbear, 2009). 41

12 PROPOLIS Propolis je složitá směs přírodních pryskyřic sesbíraných z různých druhů rostlin. Včely jej získávají smícháním včelího vosku, slinných enzymů a pryskyřice. Standardizace jeho chemického složení je obtížná, protože závisí na rostlinném zdroji a na geografických a klimatických podmínkách v místě jeho sběru. Za použití různých analytických postupů bylo identifikováno více jak 300 sloučenin. Obecně se však skládá z pryskyřice, vosku, éterických olejů, pylu a dalších látek. Obsahuje minerály a organické sloučeniny jako jsou fenolové kyseliny nebo jejich estery, flavonoidy, terpeny, aromatické aldehydy a alkoholy, mastné kyseliny, stilbeny a β-steroidy. (SilvaCarvalho a kol., 2014). Včely propolis neuskladňují, ale využívají ho rovnou, a to zejména při stavbě nebo opravách úlu. Řídkým propolisem potahují jeho stěny a hustým vyplňují skuliny, praskliny apod. Včely používají propolis, aby udržely své domovy bezpečné, hygienické, odolné proti průvanu a suché. Když včely hnízdí ve volné přírodě, například v dutém stromě, vnitřní zdi stromu lakují propolisem. Tímto způsobem se propolis používá k utěsnění trhlin, kde by se mohly rozvíjet mikroorganismy a jeho těkavé látky slouží s největší pravděpodobností jako druh antiseptického osvěžovače vzduchu. Kromě toho používají včely propolis jako stavební materiál pro snížení velikosti hnízdních vstupů,v tenkých vrstvách uvnitř plodových buněk, kde poskytuje vodotěsné a hygienické prostředí pro vývoj larev. Propolis také používají na balzamování těl myší nebo jiných vetřelců, které nejsou pro jejich velikost schopné vynést z úlu. Zabraňují tím rozkladným procesům a šíření možné infekce (Bradbear, 2009). Někdy včely sbírají umělé materiály a používají je stejným způsobem jako propolis. Například nátěr, silniční dehet nebo lak. Lze předpokládat, že mají pro včely podobnou konzistenci a zápach jako rostlinné pryskyřice (Bradbear, 2009). Propolis je v teple velmi lepkavý, v chladu lesklý, tvrdý a křehký. Jeho fyzikální vlastnosti z něj dělají vynikající tmel pro utěsnění mezer a trhlin ve včelím hnízdišti. Obvykle je tmavě hnědé barvy, ale může být také žlutý, zelený nebo červený. Složky propolisu závisí na rostlinách, na které včely létaly a jsou tedy velmi různorodé. Obvykle obsahuje více než 300 složek, kde hlavní látky zahrnují flavonoidy, organické kyseliny a aldehydy, různé alkoholy a jiné organické molekuly, minerály, steroly a steroidy, cukry a aminokyseliny. Díky těmto složkám se propolis nerozpouští ve vodě

42

ale v rozpouštědlech jako je ethanol nebo jiné alkoholy a organická rozpouštědla (Bradbear, 2009). Propolis se vyznačuje protinádorovými a imunomodulačními účinky. Jeho protinádorové účinky jsou zprostředkovány prostřednictvím mechanismů, které zahrnují zástavu buněčného cyklu, indukci apoptózy a inhibici proliferace nádorových buněk a růstu tumoru (Novak a kol., 2014). Propolis se vyznačuje také silnými antimikrobiálními a dezinfekčními účinky, které znali již staří Egypťané (Cramp, 2011). Díky jeho antiseptickým a anestetickým vlastnostem se používá jako přísada do léků, zubních past, ústních sprejů, žvýkaček, v šamponech, mýdlech, kožních mastech a kosmetice (Bradbear, 2009). V kosmetice se využívá jeho schopnosti urychlovat regeneraci pleti a kůže (Cramp, 2011). Používá se také ve veterinárním lékařství a v lidové medicíně ve formě propolisové masti nebo lihového roztoku. Dřevořezbáři jej používají pro docílení zvláštní zářivě žluté barvy (Minedžajan, Richter, 2001). Potenciál má i v potravinářství jako konzervant. Pro medicínu, kosmetiku a potravinářství je však nevýhodou jeho nestálé složení, které je velmi proměnné a souvisí s ním možné alergické reakce (Cramp, 2011). Propolis je také dlouho používán pro výrobu laků. Jeden ze slavných použití byl lak na housle Stradivarius v Cremoně v severní Itálii (Bradbear, 2009).

13 VOSK Včelí vosk je krémová látka používaná včelami k vytvoření struktury svého hnízda. Velmi čistý včelí vosk je bílý, ale přítomnost pylu a dalších látek způsobí, že se změní na žlutou (Bradbear, 2009). Je produktem voskotvorných žláz včel, které k jeho tvorbě využívají med a pyl ( na výrobu 1kg vosku potřebují asi 3,5 kg medu a 50g pylu). Vzniká jejich přestavbou díky změnám v zažívacím ústrojí některých druhů včel. Včely sbírají tento sekret z povrchu vlastního těla, kusadly jej zpracovávají a obohacují dalšími látkami (Zeintrich, 2003). Jakmile má vosk správnou konzistenci je použit pro stavbu nebo slouží k utěsnění medových buněk. Včely jsou stimulovány k produkci vosku také při přebytku medu, který musí být skladován (Bradbear, 2009). Vosk vyrábí včely staré 10 - 17 dní (mladušky), jelikož je v tomto období činnost voskokotvorných žláz nejvýraznější. Hlavním úkolem těchto mladušek je proto stavební činnost (Cramp, 2011).

43

Vosk se využívá zejména ve farmaceutickém průmyslu a kosmetice. Je využíván také v přípravcích na impregnaci a leštění dřeva, v potravinářství jako leštící látka a v neposlední řadě na výrobu svíček (Cramp, 2011). Vosk je možné užívat i vnitřně, kdy při žvýkání působí proti chorobám dutiny ústní jako je parodontóza, afty, zánět jazyka apod. (Zeintrich, 2003).

14 VČELÍ JED Včelí jed apitoxin pochází z jedových žláz včel a jeho množství závisí na tom, kolik včela pozřela pylu bohatého na bílkoviny. Hlavní toxickou látkou je mellitin, skládající se z 12 aminokyselin a 26 aminokyselinových zbytků. Působí na bílé a červené krvinky, ze kterých uvolňuje biogenní aminy, zejména histamin a serotonin a tím je poškozuje. Dalšími jedovatými látkami je polypeptid apamin, skládající se z 18 aminokyselin a enzym fosfolipáza způsobující hemolýzu (rozpad) červených krvinek. Mimo ně byly ve včelím jedu zjištěny neurotransmitery dopamin a nonadrenalinu, histamin a jiné (Zeintrich, 2003). Včelí jed působí baktericidně, hemolyticky, neurotoxicky a má místně anestetické účinky. Snižuje krevní tlak a má ochranné účinky proti radioaktivnímu záření. U zdravého člověka je nebezpečná dávka 200 - 250 žihadel, smrtelný účinek má dávka cca 500 žihadel. Ovšem u jedince s alergií na včelí jed může být smrtelné i jedno jediné žihadlo (Zeintrich, 2003). Včelí jed se využívá při léčbě řady nemocí, a to zejména revmatickém onemocnění kloubů, svalů a šlach nebo artirických onemocněních. Dobré výsledky byly zaznamenány také při léčbě depresí, svalové dystrofie, astmatu, migrény, vysokého tlaku nebo přo léčbě některých kožních onemocnění. Včelí jed může být aplikován přímo ze žihadla, což je nejúčinnější, injekčně, inhalací, v tabletách nebo mastí (Cramp, 2011).

44

15 METODY SEPARACE A IDENTIFIKACE POLYFENOLŮ V MEDU 15.1 Extrakce Extrakce je jeden z nejdůležitějších kroků celé analýzy. Je to proces, kdy se složky směsi oddělují v rozpouštědle na základě jejich různé rozpustnosti. Extrahovaná složka se v rozpouštědle rozpustí a získá se jeho následným odpařením (Valentová, 2012). Konečným cílem extrakce je příprava extraktu vzorku obohaceného o všechny složky, které chceme zkoumat a prostého rušivých složek matrice. Obecně platí, že pro analýzu fenolických kyselin a flavonolů v medu musí být nejdříve odstraněny cukry (Pyrzynska, Biesaga, 2009). Pro extrakci flavonoidů se volí rozpouštědlo v závislosti na typu požadovaných flavonoidů. Důležitým aspektem je polarita. Méně polární flavonoidy (např. isoflavony, flavanony,

methylované

flavony

a

flavonoly)

se

extrahují

chloroformem,

dichlormethanem, diethyletherem nebo ethyl-acetátem, zatímco flavonoidní glykosidy a další polární aglykony se extrahují alkoholy nebo směsí alkoholu a vody. Glykosidy mají zvýšenou rozpustnost ve vodě, a proto jsou vhodné vodné alkoholické roztoky. Převážná část extrakce flavonoidů je stále prováděna jednoduchou přímou extrakcí rozpouštědlem. Extrakce se obvykle provádí za míchání magnetickým míchadlem nebo třepáním, ale nedávno byly zavedeny i jiné metody zvyšující účinnost a rychlost postupu extrakce (Andersen, Markham, 2006). V případě extrakce z kapaliny do kapaliny (LLE) se jako rozpouštědlo obvykle používá ethyl-acetát nebo ethanol. V posledních letech byly vyvinuty některé nové metody extrakce flavonoidů. Např. mikrovlnná extrakce (MAE) a ultrazvukové extrakce (UAE). Experimentální výsledky ukázaly, že čas extrakce se prudce snížil, a výtěžky flavonoidů se zlepšily. Nicméně MAE selektivita byla v přítomnosti většího množství non-fenolového materiálu nízká. Delší doba ozařování u UE mělo zase za následek snížení množství extrahovaných složek, pravděpodobně v důsledku rozkladných procesů. Proto získaly na popularitě alternativní metody extrakce pro izolaci polyfenolických kyseliny a flavonoidů, např. nadkritická fluidní extrakce (SFE) a tlaková kapalinová extrakce (PLE) a to kvůli zkrácení doby extrakce a snížení spotřeby rozpouštědel. Kvůli nepolárním vlastnostem CO2 v SFE se však musí pro vysoký 45

výtěžek extrakce přidávat významné množství polárních organických modifikátorů. To ale snižuje selektivitu. Pro odebrání složek matrice z medu se také často používá extrakce pevnou fází (SPE) (Pyrzynska, Biesaga, 2009). 15.1.1 Extrakce z kapaliny do kapaliny (LLE) Princip metody LLE (Liquid-Liquid Extraction) spočívá v přechodu extrahované složky z jedné kapalné fáze do druhé. Jedním rozpouštědlem bývá voda nebo vodný roztok a druhým je organické rozpouštědlo s vodou nemísitelné. Po protřepání těchto dvou kapalin v dělící nálevce se po čase ustaví rovnováha. Tu popisuje Nernstův rozdělovací zákon (Klouda, 2003).

ED =

Corg C aq

ED…..rozdělovací konstanta (Nernstův rozdělovací koeficient) Corg….rovnovážná látková koncentrace složky v org. rozpouštědle Caq…..rovnovážná látková koncentrace složky ve vodě Po extrakci zůstane část složky v původním rozpouštědle, a proto se extrakce provádí vícekrát po sobě. Účinnější je provést extrakci opakovaně s menšími dávkami rozpouštědla, než celým objemem najednou (Klouda, 2003). 15.1.2 Nadkritická fluidní extrakce (SFE) Princip metody SFE (Supercritical Fluid Extraction) spočívá v extrakci pevného vzorku nadkritickou (superkritickou) tekutinou (Klouda, 2003). Nadkritická tekutina má vlastnosti na rozhraní plynu a kapaliny, což ulehčuje její difúzi do matrice vzorku a umožňuje tak rychlou extrakci (Kirchner, Matisová, 2004). Snadné pronikání nadkritické tekutiny do pórů pevné matrice je umožněno díky jejich vysoké difuzivitě a nízkému povrchovému napětí (Shilpi a kol., 2013). Rychlost extrakce se tak oproti několikahodinovým až vícedenním extrakcím (např. v Soxhletově extraktoru) sníží na minuty až desítky minut (Klouda, 2003). U nadkritické tekutiny lze měnit fyzikálněchemické vlastnosti jako například hustotu, vodivost, dielektrickou konstantu nebo viskozitu a to změnou tlaku nebo teploty. Nadkritické tekutiny mají hustotu jako kapaliny (Shilpi a kol., 2013).

46

Nejpoužívanější nadkritickou tekutinou je oxid uhličitý, který má velmi nízkou viskozitu a rychle proniká přes vzorek. Aby se zabránilo vzniku emulzí, musí být vzorek suchý. Oxid uhličitý se snadno odpařuje, a proto se rozpuštěný analyt snadno jímá a koncentruje. Jeho kritická teplota je 31 °C a kritický tlak 7149 kPa. Prakticky se pracuje s teplotami 60 - 150 °C a tlaky 40 - 70 MPa (Klouda, 2003). CO2 je obecně považován za bezpečný (GRAS), netoxický, nehořlavý a levný. Jeho kritická teplota a tlak jsou relativně nízké, což pomáhá při prevenci tepelné degradace složek potravin. CO2 však rozpouští pouze nepolární nebo slabě polární sloučeniny. Pro polární látky je nutné

zvýšení

polarity

pomocí

modifikátorů

(voda,

methanol,

ethanol,

hexan,dichlormethan atd.) v koncentracích 1 - 20 % (Shilpi a kol., 2013). SFE má několik výhod. Nadkritické tekutiny mají vyšší difúzní koeficient a nižší viskozitu než kapaliny, což napomáhá k rychlejšímu převodu hmoty. Absence povrchového napětí umožňuje jejich rychlé pronikání do pórů pevných matric, což zvyšuje efektivitu těžby. Oxid uhličitý je plyn, který je možné recyklovat a znovu použít (Shilpi a kol., 2013). Získaný extrakt je relativně čistý a zkoncentrovaný. Používá jen malé množství organických rozpouštědel a je plně automatizována. Selektivita extrakce je závislá na hustotě, která může být ovlivněna tlakem a teplotou (Kirchner, Matisová, 2004). U SFE je potřeba optimalizovat parametry jako: tlak a teplotu v extrakční komoře, typ a množství modifikátoru, čas extrakce, průtok superkritické tekutiny, přídavek dehydratačního činidla, druh zachytávače analytů a desorpční činidlo (Kirchner, Matisová,

2004).

chromatografií

SFE

(GC),

lze

spojit

s analyzátorem

a

kombinovat

kapalinovou

chromatografií

(LC)

nebo

s plynovou

infračervenou

spektrometrií (FTIR) (Klouda, 2003). 15.1.3 Extrakce pevnou fází (SPE) Princip metody SPE (Solid Phase Extraction) spočívá v zachycení molekul látky na tuhém sorbetu, přes který protéká vzorek. Využívá se zde chemických vlastností molekul, ulpívajících díky mezimolekulovým interakcím na sorbetu (Klouda, 2003). Extrakční postupy na pevné fázi se používají nejen k extrakci stop organických látek ze vzorků životního prostředí, ale také k odstranění rušivých složek z komplexních matric (Zwir-Ferenc, Biziuk, 2006). Princip SPE je podobný jako extrakce kapalina-kapalina (LLE), zahrnující oddělování rozpuštěných látek mezi dvě fáze. Místo dělení mezi dvě nemísitelné 47

kapalné fáze, jako je v LLE, se v SPE dělí mezi kapalinu (vzorek matrice nebo rozpouštědla s analyty) a pevnou látku (sorbent). Obecný postup je aplikace roztoku na pevnou fázi SPE, odplavení nežádoucích složek a poté smytí požadovaných analytů jiným rozpouštědlem do sběrné zkumavky. Výběr vhodného sorbetu závisí na pochopení mechanismu

interakce mezi sorbentem a analytem. Mezi nejčastější

interakce patří van der Waalsovy síly („nepolární“ interakce), vodíkové vazby a dipóldipólové interakce („polární" interakce) a kation-aniontové interakce ("iontové" interakce). Každý sorbent nabízí jedinečnou kombinaci těchto vlastností (Zwir-Ferenc, Biziuk, 2006). Nejčastěji jsou sorbety v koloně SPE na bázi chemicky modifikovaných částic silikagelu. Na povrchové silanolové skupiny se navazují skupiny různých vlastností, rozhodující o vlastnostech sorbetu. Můžeme mít buď neuzavřený sorbent nebo uzavřený sorbent. Pokud zůstane část silanolových skupin volných, účastní se výsledných vlastnostech sorbentu a jedná se o neuzavřený sorbent. Pokud jsou silanolové skupiny zcela pokryté vázanou fází, uplatňují se jen vlastnosti vázané fáze a jedná se o uzavřený sorbent. Kromě sorbetů na bázi silikagelu se používají také sorbety na bázi aluminy (oxid hlinitý) nebo gel oxidu hořečnatého a křemičitého (Klouda, 2003). Postup SPE zahrnuje přípravu vzorku před extrakcí (převedení do roztoku, filtrace apod.), solvatace kolonky (promýváme methanolem, acetonitrilem nebo jiným organickým rozpouštědlem), předrovnovážná úprava kolonky (nasycení kolonky čistým rozpouštědlem analytu), aplikace vzorku, promývání kolonky (rozpouštědlem, ve kterém jsou analysy nerozpustné), eluce analysu z kolonky (rozpouštědlem, které eluuje analyty z vázaných fází) (Klouda, 2003). 15.1.4 Tlaková kapalinová extrakce (PLE) Princip metody PLE (Pressurized Liquid Extraction) zahrnuje extrakci analytu z pevné matrice za použití kapalných rozpouštědel při zvýšené teplotě a tlaku, což zvyšuje účinnost extrakce v porovnání s postupy prováděnými při pokojové teplotě a atmosférickém tlaku. Tato technika je také známa jako extrakce kapaliny pod tlakem, extrakce rozpouštědlem pod tlakem nebo extrakce urychleným tokem rozpouštědla. V případě použití vody jako extrakčního rozpouštědla se metoda označuje jako extrakce horkou vodou pod tlakem (PHWE) (Mustafa, Turner 2011). Použití vyšších teplot znamená snížení viskozity rozpouštědla, čímž se zvyšuje schopnost rozpouštědla zvlhčit matrici a rozpustit cílové analyty. Teplota také pomáhá rozrušit vazby analyt-matice a 48

vybízí analyty k difúzi na povrch matrice. PLE má výhody jako je úspora času, automatizace a účinnost. Tato technika zahrnuje extrakci rozpouštědly při vysokém tlaku a teplotě, aniž by bylo dosaženo jejich kritického bodu (Carabias-Martínez, 2005). Existují dvě hlavní nastavení PLE - statické a dynamické. V dynamickém nastavení je extrakční rozpouštědlo kontinuálně čerpáno přes nádoby se vzorkem. Dynamický systém vyžaduje vysokotlaká čerpadla. Ve statickém nastavení se extrakční proces skládá z jedné nebo několika extrakčních cyklů s výměnou rozpouštědla mezi cykly. V PLE lze aplikovat široký rozsah teplot. Obvykle se pohybuje v rozmezí od teploty místnosti do 200 °C a tlak je v rozsahu 35 až 200 bar. V závislosti na druhu vzorku matrice lze ke zlepšení účinnosti extrakce použít filtrační papír, disperzní nebo dehydratační činidla. Přítomnost vlhkosti ve vzorku matrice ovlivňuje účinnost extrakce. Disperzní činidla se také používají k vyplnění extrakční cely a ke snížení spotřeby rozpouštědel snížením objemu cely. Ve většině PLE zařízení se používá statický režim po předem stanovenou dobu a počet cyklů. Běžný rozsah je 5 až 15 minut. Nastavují se parametry jako teplota, tlak, počet cyklů a solvent (Mustafa, Turner 2011). 15.1.5 Mikrovlnná extrakce (MAE) Principem metody MAE (Microwave Assisted Extraction) je použití mikrovln pro ohřev rozpouštědla a vzorku, což zvyšuje kinetiku extrakce. Mikrovlnná extrakce (MAE) je relativně nová technologie extrakce, která má řadu výhod jako například kratší dobu extrakce, menší spotřebu rozpouštědla, vyšší rychlost extrakce a nižší náklady (Delazar a kol., 2012). Mikrovlnná energie je elektromagnetické neionizující záření, které spadá do frekvenčního pásma 300 MHz až 300 GHz, což odpovídá vlnovým délkám v rozmezí 1m–1mm. Průmyslová mikrovlnná zařízení se konstruují podobně jako domácí mikrovlnné trouby a obvykle pracují na frekvenci 2450 MHz. Tato frekvence odpovídá vlnové délce 12,2 cm a energii 0,94 J/mol. Princip ohřevu za použití mikrovlnné energie je založen na přímém účinku mikrovln na molekuly materiálu. K transformaci elektromagnetické energie v tepelnou energii dochází dvěma mechanismy: iontovou vodivostí a dipólovou rotací v rozpouštědle a vzorku. Migrace rozpuštěných iontů zvyšuje průnik rozpouštědla do matrice a tím usnadňuje rozpuštění cílových sloučenin.Vývin tepla ve vzorku v mikrovlnném poli vyžaduje přítomnost dielektrické sloučeniny s co největší dielektrickou konstantou. Dielektrická konstanta ukazuje míru 49

absorpce mikrovlnné energie. Polární rozpouštědla, jako je voda, mají vysokou dielektrickou konstantu a zahřívají se. Nepolární rozpouštědla, jako je hexan, se nezahřívají, když jsou vystaveny mikrovlnám a jsou označovány jako mikrovlnně transparentní rozpouštědla. Mikrovlnný ohřev je tedy selektivní, protože mohou být ohřívány pouze polární molekuly. Druhá specifita je, že na rozdíl od klasického ohřevu se u mikrovlnného ohřevu zahřívá celý vzorek ve stejnou dobu. Teplotní gradient je obrácený v porovnání s konvenčním ohřevem, protože ohřev u MAE probíhá v srdci matrice, zatímco v konvenčním ohřevu se nejprve zahřívá povrch. Komerční systémy jsou obvykle tvořeny magnetronem, cirkulátory a vlnovodem, který přivádí mikrovlnné záření do rezonanční dutiny. Magnetron generuje mikrovlnné záření o pevné frekvenci (2450 MHz) (Prado, 2013). 15.1.6 Ultrazvuková extrakce (UAE) Principem metody UAE (UltrasonicAssisted Extraction) je využití ultrazvukových vln, které účinně urychlují uvolňování cílových sloučenin do rozpouštědla. Ultrazvuková extrakce (UAE) je jednoduchý proces předčištění vzorku. Ve srovnání s běžnými technikami extrakce disponuje jednoduchou manipulací, významným snížením spotřeby energie, nižší teplotou a vyšší účinností (Lai a kol., 2014). Ultrazvuková extrakce umožňuje odstranění a využití organických analytů z pevné matrice pomocí rozpouštědla, na které působí zvuková energie při frekvencích vyšších než jsou slyšitelné pro lidský sluch. Energie může být zavedena do vzorku pomocí ultrazvukové sondy, která je vložena do vzorku nebo ultrazvukové lázně, do které je ponořen vzorek a rozpouštědlo. Ultrazvuková energie může narušit matrici, čímž se zvyšuje extrahovatelnost analytu. Extrakce ultrazvukem musí být prováděna za podmínek, které chrání sluch pracovníků laboratoře. Ultrazvukový generátor může generovat teplo, které může mít vliv na extrakční proces (Webster, 2000).

15.2 Chromatografie V dřívějších dobách patřily mezi hlavní separační techniky fenolických látek chromatografie na tenké vrstvě (TLC), polyamidová chromatografie a papírová elektroforéza. Z těchto metod je pro analýzu flavonoidů stále používaná TLC jako rychlá, jednoduchá a univerzální metoda. Nicméně většina publikovaných prací se za účelem analýzy odkazuje na kvalitativní a kvantitativní aplikaci vysokoúčinnou 50

kapalinovou

chromatografií

(HPLC).

Flavonoidy

zde

mohou

být

odděleny,

kvantifikovány a identifikovány v jedné operaci a to spojením HPLC s UV, hmotnostním nebo NMR detektorem. V poslední době si získala pozornost také technika kapilární elektroforézy (CE) (Andersen, Markham, 2006). Chromatografie je fyzikálně-chemická separační metoda, při které jsou složky vzorku rozdělovány mezi dvě vzájemně nemísitelné fáze. Jde především o metodu kvalitativní a kvantitativní analýzy vzorku. Vzorek je unášen pohyblivou mobilní fází přes nepohyblivou stacionární fázi, kde se mohou složky vzorku zachytávat a oproti ostatním se tak zdržet. Na konec stacionární fáze se tak dostanou rychleji složky méně zadržované. Tím se od sebe složky separují. Podle typu separace se chromatografie dělí na: • Rozdělovací chromatografii – separace podle rozdílné rozpustnosti složek vzorku ve stacionární a mobilní fázi. • Adsorpční chromatografii – separace podle rozdílné adsorpce (schopnosti poutat se) složek vzorku na povrch stacionární fáze, využívá mezimolekulových přitažlivých sil mezi stacionární fází a analytem • Iontově výměnnou chromatografii – separace na základě různě velké elektrostatické přitažlivé síly mezi ionty vzorku a funkčními skupinami stacionární fáze (měniče iontů) • Gelovou chromatografii – separace mechanickým dělením složek vzorku v pórech gelu na základě jejich velikosti, menší molekuly se v pórech gelu (stacionární fáze) zadržují déle. • Afinitní chromatografii – separace složek vzorku na základě afinity stacionární fáze k daným složkám (Klouda, 2003). Podle uspořádání stacionární fáze dělíme chromatografii na kolonovou (stacionární fáze v trubici), tenkovrstvou (stacionární fáze na pevném plochém podkladu) nebo papírovou (stacionární fáze jako součást chromatografického papíru) (Klouda, 2003). 15.2.1 Kapalinová chromatografie Principem kapalinové chromatografie je separace složek mezi stacionární a mobilní fázi, kde mobilní fází je kapalina. O separaci složek vzorku rozhodují nejen interakce se stacionární fází, ale také použitá mobilní fáze. Kapalinovou chromatografií lze separovat i netěkavé a tepelně nestabilní sloučeniny (Klouda, 2003). 51

V současné době je pro analýzu flavonoidních látek nejvíce používanou metodou vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) (Nollet, 2004). Mezi nejčastěji používané stacionární fáze patří oktadecyl (C18) chemicky vázaný na povrch silikagelu. V případě HPLC byly zaznamenány velmi dobré výsledky (oddělení 10 isoflavonů za 4 min.). Separace složitější směsi izoflavonů bylo možné za méně než 5 minut. Kromě klasického HPLC se v nových technologiích provádí separace ultra-kapalinovou chromatografií (U-HPLC) při zvýšených tlacích, zahřívání kolony a použití sorbentů o velikosti částic pod 2µm. Zejména velikost částic sorbetů hraje v separační účinnosti důležitou roli. U-HPLC za použití elektrosprejové hmotnostní detekce pro separaci isoflavonů a vybraných rostlinných metabolitů přináší výrazné snížení retenčních časů a poloviny šířky vrcholů píků (Klejdus a kol., 2008). Chromatograf se v případě kapalinové chromatografie skládá ze zásobníků mobilní fáze, vysokotlakého čerpadla, směšovacího zařízení, dávkovacího zařízení, kolony, detektoru a vyhodnocovacího zařízení. Zásobníky mobilní fáze jsou zpravidla skleněné láhve. Čerpadla mohou být buď membránová nebo pístová a zajišťují přívod kapaliny do kolony. Směšovací zařízení slouží k úpravě složení mobilní fáze. To může být po celou dobu separace stálé (izokratická eluce) nebo se může během separace měnit (gradientová eluce) (Klouda, 2003). Přídáním acetonitrilu do mobilní fáze dosáhneme ostřejších píků a v kvantitativní analýze vyšších hodnot než u přídavku methanolu. K redukci retenčního času a zaostření tvaru píků se proto v gradientové eluci často používá směs voda/acetonitril, která má účinek i na pozdě eluované flavonoidní látky. Tím se zlepšuje jejich kvantifikace i při nízkých koncentracích. Nevýhodou acetonitrilu oproti methanolu je jeho vyšší toxicita. Přítomnost organického rozpouštědla v mobilní fázi může navíc předcházet poškození kolony (Nollet, 2004). Dávkovacím zařízením může být injekční stříkačka nebo dávkovací obtokové kohouty. Kolony se u kapalinové chromatografie používají pouze náplňové. Jsou zhotoveny nejčastěji z nerezové oceli. Obvyklá délka je 10 - 25 cm, vnitřní průměr 4,6 mm a průtok eluentu 1 - 2 ml/min. Jako detektory

se

využívají

fotometrické,

refraktometrické,

fluorescenční,

FTIR,

elektrochemické detektory a hmotnostní spektrometr (Klouda, 2003). Malá zrníčka sorbetu kladou postupující kapalině velký odpor a je tedy potřeba pracovat při vysokém tlaku: 3 - 40 MPa, tj. 30 - 400 bar. Aby nedocházelo k zanášení kolony, musí být vzorek čistý. To lze docílit důkladnou důkladnou filtrací před nástřikem vzorku (Campbell-Platt, 2009). K nejběžněji používaným detektorům patří detektory fotometrické, které měří

absorbanci eluátu vycházejícího z kolony. Refraktometrický detektor měří rozdíl 52

v indexu lomu fluátu a čisté mobilní fáze. Fluorescenční detektor využívá schopnost látek absorbovat ultrafialové záření a vysílat pak záření o vyšší vlnové délce (fluorescence). FTIR detektor sleduje infračervená spektra složek mobilní fáze. Elektrochemické detektory (vodivostní nebo voltmetrické) je možné použít v roztocích obsahující ionty, tedy složky oxidovatelné nebo redukovatelné na polarizovatelné elektrodě. Hmotnostní detektor lze použít jak v plynové tak kapalinové chromatografii. Převádí vzorek na ionizovatelnou plynnou fázi a vzniklé ionty separuje na základě podílu hmotnosti a náboje m/z (Klouda, 2003).

15.3 Elektroforéza Elektroforéza patří mezi elektromigrační separační metody, které jsou založeny na dvou elektrokinetických jevech – elektroforéze a elektroosmóze. Elektroforéza je označení děje, kdy se po aplikaci napětí nabité částečky pohybují k opačně nabité elektrodě. Elektroosmóza označuje děj, kdy se po aplikaci napětí v křemenné nebo skleněné kapiláře pohybuje voda k záporné elektrodě. Složky vzorku se rozdělují podle rozdílné rychlosti migrace. Různě velké a různě nabité částice se pohybují různou rychlostí (Klouda, 2003). Elektroforéza využívá schopnosti nabitých částic pohybovat se v elektrickém poli. Separace probíhá na základně velikosti náboje a velikosti molekuly, kdy různě velké a různě nabité částice se budou pohybovat různou rychlostí. Elektrické pole je při této metodě vytvářeno vkládáním konstantního stejnosměrného napětí mezi elektrody. Tato metoda probíhá v prostředí elektrolytu, který zajišťuje elektrickou vodivost systému. Podle prostředí, ve kterém elektroforéza probíhá, ji dělíme na papírovou, gelovou a kapilární (Klouda, 2003).

53

EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST

54

16 MATERIÁL Analýze bylo podrobeno celkem 8 vzorků medu, z toho 6 vzorků květového a dva medovicového původu. Z květových vzorků se jednalo o med akátový, řepkový, lipový, slunečnicový a lesní květový. Z medovicových medů to byl med medovicový borovicový a medovicový smíšený. Dva vzorky květových medů pocházely ze stejného rostlinného zdroje. Byly to medy akátové, které byly v této práci označeny jako AK 1 (pro první vzorek) a AK 2 (pro druhý vzorek). Oba tyto medy pocházely přímo od včelařů z České republiky. Řepkový med (ŘEP) a med lesní květový (LK) pocházely taktéž z České republiky přímo od včelařů. Medovicový med smíšený (MED), lipový med (LIP) a slunečnicový med (SLUN) pocházely opět z České republiky a to ze specializované prodejny se včelími produkty. Med medovicový borovicový (BOR) pocházel od včelaře z Řecka.

17 CHEMIKÁLIE A STANDARDY Chemikálie: • Ethylacetát (ethylester kyseliny octové) • Síran sodný bezvodý • Methanol • Diethylether Standardy: Deriváty kyseliny skořicové:

Deriváty kyseliny hydroxybenzoové:

• kyselina kávová

• kyselina p-hydroxybenzoová

• kyselina chlorogenová

• 3,4-dihydroxybenzaldehyd

• kyselina ferulová

• p-hydroxybenzaldehyd

• kyselina sinapová

• kyselina protokatechová

• kyselina p-kumarová

• kyselina salicylová • kyselina gallová • kyselina syringová • kyselina vanilová • vanilin

55

18 PŘÍSTROJOVÉ VYBAVENÍ • Analytické váhy (Precisa 240A) • SPE kolonky (Waters Oasis HLB, 3cc, 60 mg, USA) • Vortex (Ika – Werke, Německo) • Rotační vakuová odparka (Ika – Werke HB4, Německo) • Kapalinový chromatograf (Agilent Technologies 1200) −

vakuový degasér

−

binární pumpa

−

autosampler

−

termostat kolon

−

detektor diodového pole

• Hmotnostní spektrometr (Agilent Technologies 6460, triple quad)

19 EXTRAKCE POLYFENOLŮ 19.1 Extrakce kapaliny do kapaliny (LLE) za použití etylacetátu Na analytických vahách se do malé kádinky navážil 1 g vzorku, který byl poté rozpuštěn v 10 ml vody pomocí míchání skleněnou tyčinkou. Jakmile byl všechen med zcela rozpuštěn, byl kvantitativně převeden do dělící nálevky spolu s 10 ml ethylacetátu (označován jako ETAC). Dělící nálevka se vytřepávala po dobu minimálně 1 minuty ručně. Při vytřepávání bylo třeba občasné uvolnění zátky od děličky, a to kvůli ethylacetátu, který by mohl způsobit přetlak. Po 1 minutě se nechala ustavit rovnováha mezi fázemi a poté se spodní vodná fáze odpustila a horní organická se přelila do čisté kádinky. Spodní odpuštěná fáze se opět převedla kvantitativně spolu s 10 ml ethylacetátu do dělící nálevky a dále se postupovalo stejným způsobem. To se opakovalo ještě jednou, tedy celkem se protřepávání provádělo 3x s každým vzorkem. U některých vzorků (MED, BOR a AK 2) zůstávala horní vrstva stále zakalená, a bylo proto třeba přidat malé množství síranu sodného bezvodého, který pohlcuje vodu. Takto vyextrahované vzorky se poté kvantitativně převedly do 50 ml baněk s plochým dnem a na rotační vakuové odparce se nechal ethylacetát zcela odpařit.

56

Odparek se poté rozpustil v 1 ml 80% methanolu, zvortexoval se a pomocí injekční stříkačky přenesl do vialek přes filtrační víčko.

19.2 Extrakce kapaliny do kapaliny (LLE) za použití diethyletheru Extrakce kapaliny do kapaliny za použití diethyletheru (označován jako ETHER) jako rozpouštědla se postupovalo stejným způsobem jako LLE extrakce za použití ethylacetátu, viz. výše. V tomto případě se však síran sodný bezvodý přidával do každého vzorku.

19.3 Extrakce pevnou fází (SPE) za použití ethylacetátu Na analytických vahách se do malé kádinky navážil 1 g vzorku, který byl poté rozpuštěn v 10 ml vody pomocí míchání skleněnou tyčinkou. Po úplném rozpuštění medu ve vodě se vzorek extrahoval pomocí SPE kolonek. Pro tuto metodu byly použity SPE kolonky, které byly promyty 3 ml methanolu a 3 ml vody. Poté se na kolonku aplikoval vzorek. Po aplikaci vzorku se kolonka promyla ethylacetátem a takto připravený vzorek se převedl do 50 ml baňky s plochým dnem a na rotační vakuové odparce se nechal ethylacetát odpařit. Odparek se dále rozpustil v 1 ml 80% methanolu, zvortexoval se a pomocí injekční stříkačky přenesl přes filtrační víčko do vialek.

19.4 Extrakce pevnou fází (SPE) za použití diethyletheru Extrakce pevnou fází za použití diethyletheru jako rozpouštědla se prováděla stejným způsobem jako SPE extrakce za použití ethylacetátu, viz. výše.

20 STANOVENÍ POLYFENOLŮ VE VZORCÍCH Fenolové sloučeniny se stanovovaly pomocí kapalinového chromatografu (Agilent Technologies 1200). Separace byla prováděna na chromatografické koloně Agilent Zorbax Poroshell 120, EC-C18 s rozměry 3x50 mm, velikost částic 2,7µm. Byl použit lineární gradient. Mobilní fáze byla složena z acetonitrilu (A) a 0,2 % kyseliny octové (v/v) (B). Průtoková rychlost byla 0,6 ml/min, teplota termostatu 45 °C. Lineární gradient byl: v čase 0 – 85 % B, v čase 0,17 – 80 % B, v čase 0,51 – 75 % B, v čase 1,7 – 70 % B, v čase 4,0 – 70 % B, v čase 6,0 85 % B. Hmotnostní detektor byl nastaven na 57

parametry: teplota sušícího plynu 300 °C, průtoková rychlost sušícího plynu 12 l/min, nebulizační tlak 45 psi, teplota zaostřovacího plynu 250 °C, průtok zaostřovacího plynu 11 l/min.

21 KALIBRACE Před vlastním stanovením polyfenolů (derivátů kyseliny skořicové a hydroxybenzoové) byly provedeny kalibrace na konkrétní koncentrace těchto látek metodou přímého stanovení. Koncentrační rozsah byl od 0,2 do 6 ng/ml. Údaje k provedeným kalibracím jsou uvedeny v tabulce č. 1. Tab. 1 Kalibrace na konkrétní koncentrace látek tr (min) Sloučenina 3,41,75 dihydroxybenzaldehyd

Kalibrační rovnice

(R2)

y = 1218,822x + 1678,798

0,9967

0,06

0,18

LOD [ng/ml] LOQ [ng/ml]

2,78

kys.kávová

y = 2700,894x - 263,439

0,9999

0,20

0,57

2,3

kys.chlorogenová

y = 263,337x + 36,553

0,9999

0,23

0,69

4,63

kys.ferulová

y = 937,133x - 71,713

0,9998

0,28

0,84

0,73

kys.gallová

y = 3308,948x - 254,800

0,9999

0,31

0,93

3,73

kys. p-kumarová

y = 3214,935x + 648,0878

0,9995

0,51

1,53

2,59

p-hydroxybenzaldehyd

y = 3259,649x + 4676,917

0,9917

0,24

0,72

2,01

kys.p-hydroxybenzoová y = 7527,499x + 479,917

0,9999

0,43

1,29

1,23

kys.protokatechová

y = 4484,690x - 544,818

0,9998

0,21

0,63

3,71

kys. salicylová

y = 19072,293x + 9098,324

0,9914

0,45

1,35

4,42

kys.sinapová

y = 49,434x - 10,260

0,9934

0,17

0,51

3,09

kys.syringová

y = 100,527x + 88,460

0,9944

0,21

0,63

2,71

kys.vanilová

y = 456,539x + 84,555

0,9986

0,31

0,93

3,17

vanilin

y = 2632,822x + 847,158

0,9954

0,43

1,29

22 VÝSLEDKY Pro separaci vybraných fenolových látek ze vzorků medu byly použity dvě metody extrakce (LLE, SPE) a dvě různá rozpouštědla (diethylether, ethylacetát). Pro analýzu těchto látek byla využita kapalinová chromatografie s hmotnostní detekcí. V medech byly

analyzovány

tyto

látky:

3,4-dihydroxybenzaldehyd,

kyselina

kávová,

chlorogenová, ferulová, gallová, p-kumarová, p-hydroxybenzaldehyd, kyselina phydroxybenzoová, protokatechová, salicylová, kyselina sinapová, syringová, vanilová a vanilin. Retenční časy, přechody, fragmentace a kolizní energie analyzovaných látek 58

jsou uvedeny v tabulce 2. Průměrné hodnoty (ze 3 měření) jednotlivých fenolových sloučenin naměřené v medech jsou uvedeny v tabulce č. 3 a v grafech č. 1 – 8, které jsou uvedeny v příloze. Statistické srovnání metod extrakce je uvedeno v tabulkách č. 4 - 11 v sekci: Statistické vyhodnocení. Tab. 2 Retenční časy, přechody, fragmentace a kolizní energie analyzovaných látek. Sloučenina

tr (min) 1,75 2,78 2,3 4,63 0,73 3,73 2,59 2,01 1,23 3,71 4,42 3,09 2,71 3,17

Přechod

Fragmentace [V]

Kolizní energie [V]

3,4-dihydroxybenzaldehyd

137→108

120

20

kys.kávová

179→135

100

10

kys.chlorogenová

353→191

100

10

kys.ferulová

193→134

100

10

kys.gallová

169→125

100

10

kys. p-kumarová

163→119

100

10

p-hydroxybenzaldehyd

121→92

120

20

kys.p-hydroxybenzoová

137→93

100

10

kys.protokatechová

153→109

100

10

kys. salicylová

137→93

100

10

kys.sinapová

223→208

100

10

kys.syringová

197→182

100

10

kys.vanilová

167→152

100

10

vanilin

151→136

100

10

59

Tab. 3 Průměrné hodnoty jednotlivých fenolových sloučenin v medech

LIP (LLE ETAC) LIP (LLE ETHER) LIP (SPE ETHER) LIP (SPE ETAC) SLUN (LLE ETAC) SLUN (LLE ETHER) SLUN (SPE ETHER) SLUN (SPE ETAC)

5

Průměry ze 3 měření

3

4,827 121,320 3,162 77,700 4,869 47,556 5,010 137,230

5,380 54,550 2,545 78,069 2,713 139,800 4,155 160,644

7,757 111,314 25,381 131,492 2,019 50,360 11,800 151,570 2,884 38,804 2,810 272,844 3,817 136,805 26,431 291,219

6

7

8

9

10

11

1,064 2,661 4,050 5,095

285,061 4,528 13,791 159,059 76,214 74,600 273,619 131,163 134,711 366,934 157,673 153,629

7,001 13,445 14,764 13,998

15,398 19,252 53,595 66,747

2,085 7,102 17,988 14,972 2,628 4,076 12,633 12,944 6,427 11,007 17,978 6,590 5,880 16,014 31,433 15,933

5,149 2,236 2,568 3,424

761,169 3,808 21,531 385,924 87,928 88,530 684,800 176,806 176,600 875,831 197,031 193,698

59,362 32,312 43,268 58,724

23,296 22,620 30,078 57,388

2,733 13,749 52,415 8,101 1,847 4,818 30,204 12,589 5,484 13,348 57,677 7,068 6,702 14,302 69,567 8,829

64,409 48,700 29,968 30,677 623,820 6,975 11,339 30,669 2,584 147,833 4,510 392,288 90,218 88,833 28,724 3,663 262,253 11,867 571,605 156,294 148,901 80,271 50,563 292,218 10,180 681,916 187,893 165,394

379,496 191,034 425,251 424,695

206,402 118,931 166,215 189,585

2,475 12,700 80,242 28,205 2,130 4,173 44,542 24,976 3,829 10,314 53,846 16,993 3,746 9,903 75,455 31,389

Průměry ze 3 měření

MED (LLE ETAC) MED (LLE ETHER) MED (SPE ETHER) MED (SPE ETAC)

2

10,122 3,883 5,208 9,936

Průměry ze 3 měření

ŘEP (LLE ETAC) ŘEP (LLE ETHER) ŘEP (SPE ETHER) ŘEP (SPE ETAC)

1

9,370 7,220 8,975 9,084

257,452 11,162 19,141 134,399 2,530 110,269 124,198 7,107 187,278 296,723 12,693 238,232

4,602 1,943 3,657 3,278

788,250 8,156 17,212 134,255 531,647 72,318 71,711 71,730 600,914 120,030 113,852 157,633 862,542 157,940 124,539 159,033

36,093 2,147 21,196 2,598 33,839 2,205 40,672 30,398

Průměry ze 3 měření

AK 1 (LLE ETAC) AK 1 (LLE ETHER) AK 1 (SPE ETHER) AK 1 (SPE ETAC)

4

Průměry ze 3 měření

Hodnoty jsou uvedeny v µg⋅100 g-1 medu

3,839 2,670 3,557 5,662

345,199 29,718 12,691 198,338 2,899 70,814 133,186 3,003 99,322 391,468 36,231 132,500

6,208 4,331 3,281 3,280

398,119 3,539 12,403 255,136 192,743 198,346 299,576 290,216 286,231 472,526 326,252 282,627

40,003 21,289 26,422 31,621

60

29,002 24,396 27,304 32,123

5,878 2,800 4,923 7,995

12

13

14

3,194 14,035 10,968 0,528 8,446 13,669 2,541 9,826 4,304 3,333 23,619 20,734 27,830 15,498 23,709 32,126

30,537 11,817 15,765 6,330 25,554 1,878 33,094 4,746

Průměry ze 3 měření

LK (LLE ETAC) LK (LLE ETHER) LK (SPE ETHER) LK (SPE ETAC)

Průměry ze 3 měření

AK 2 (LLE ETAC) AK 2 (LLE ETHER) AK 2 (SPE ETHER) AK 2 (SPE ETAC)

6,744 137,951 16,750 15,949 76,494 162,733 2,634 11,813 528,224 140,173 1,396 4,066 76,573 4,681 35,692 8,434 97,696 213,545 215,866 238,111 47,869 2,686 5,130 87,743 3,061 89,604 42,510 185,804 392,546 383,096 627,810 90,463 4,159 6,917 141,294 17,724 104,824 59,631 248,170 437,637 395,676 695,608 103,625 50,841 3,785 1,447 2,876 4,470

54,157 16,863 14,615 59,967

Průměry ze 3 měření

BOR (LLE ETAC) BOR (LLE ETHER) BOR (SPE ETHER) BOR (SPE ETAC)

7,162 4,852 7,047 9,015

45,087 11,358 16,770 10,135 20,617 5,683 47,970 12,843

1 - 3,4-dihydroxybenzaldehyd 2 - kys.kávová 3 - kys.chlorogenová 4 - kys.ferulová

8,712 12,933 5,113 48,348 2,687 90,789 8,701 121,297

193,031 2,091 124,444 37,981 196,780 84,692 273,833 108,961

27,313 9,985 15,701 56,943

4,064 12,234 19,055 9,254 2,300 3,593 8,440 13,199 5,730 12,723 20,299 3,207 7,999 14,066 20,943 4,604

39,519 26,994 158,648 3,532 16,943 254,177 28,536 3,685 97,097 70,425 70,680 80,695 44,291 14,031 138,552 132,089 131,624 274,347 69,978 29,318 198,172 124,598 112,945 302,008

509,585 236,224 324,159 520,080

1,402 18,997 21,130 15,928 2,698 3,862 8,890 10,510 2,403 18,761 19,657 9,422 1,951 20,449 25,236 16,075

9 - kys.protokatechová 10 - kys. salicylová 11 - kys.sinapová 12 - kys.syringová

61

5,954 38,646 82,794 76,385

46,598 10,081 29,359 11,538 60,369 4,222 81,810 3,101

5,354 4,829 9,371 8,299

5 - kys.gallová 6 - kys. p-kumarová 7 - p-hydroxybenzaldehyd 8 - kys.p-hydroxybenzoová

1,574 1,352 1,322 1,969

25,159 12,365 29,325 16,197

13 - kys.vanilová 14 – vanilin

23 STATISTICKÉ VYHODNOCENÍ Výsledky analýz (HPLC-MS) byly statisticky zpracovány a jsou uvedeny v příloze v tab. 1 - 14. Při analýze fenolových látek v medu byly použity dvě různé extrakční metody a dvě různá rozpouštědla. Byla využita extrakce z kapaliny do kapaliny (LLE) za použití diethyletheru (ETHER), extrakce z kapaliny do kapaliny (LLE) za použití ethylacetátu (ETAC), extrakce pevnou fází za použití diethyletheru (ETHER) a extrakce pevnou fází za použití ethylacetátu (ETAC). Výsledky byly statisticky zpracovány za použití metody ANOVA with post-hoc Tukey HSD Test. Data jsou vyjádřena průměrem ze tří měření ± směrodatná odchylka (sx). Hodnoty v řádcích následované stejnými písmeny (a,b,c,d) se signifikantně neliší dle Tukeyova testu (P < 0.05). Počet opakování n = 3. Výsledky jsou uvedeny v tabulkách č. 3 - 10.

23.1 Akátový med 1 (AK 1) Ze 14 sloučenin byla u 10 z nich (kyselina kávová, ferulová, gallová, p-kumarová, phydroxybenzaldehyd, kyselina p-hydroxybenzoová, salicylová, syringová, vanilová a vanilin) nejefektivnější metoda extrakce pevnou fází s rozpouštědlem ethylacetát (SPE ETAC). U kyseliny chlorogenová byla nejvyšší průměrná hodnota naměřena metodou LLE ETAC a u kyseliny sinapové metodou SPE ETHER. U 2 sloučenin (3,4dihydroxybenzaldehyd, kyselina protokatechová) nebylo možné určit nejefektivnější metodu. Hodnoty se statisticky významně nelišily. Nejvyšší průměrné hodnoty byly naměřeny u kyseliny p-kumarové (366,934 ± 14,112 µg⋅100 g-1) metodou SPE ETAC a kyseliny ferulové (160,644 ± 3,327 µg⋅100 g-1) taktéž metodou SPE ETAC viz. tabulka č. 3. Tab. 4 Statistické porovnání metod extrakce v akátovém medu 1 Hodnoty jsou uvedeny v µg⋅100 g-1 medu

AK 1 (LLE ETAC)

AK 1 (LLE ETHER)

AK 1 (SPE ETHER)

AK 1 (SPE ETAC)

3,4dihydroxybenzaldehyd

4,827 ± 0,232a

3,162 ± 0,128b

4,869 ± 0,112a

5,010 ± 0,147a

121,320 ± 2,843b

77,700 ± 1,557c

47,556 ± 1,801d

137,230 ± 2,665a

kys.chlorogenová

5,380 ± 0,121a

2,545 ± 0,044c

2,713 ± 0,141c

4,155 ± 0,172b

kys.ferulová

54,550 ± 1,037d

78,069 ± 1,594c

139,800 ± 2,969b

160,644 ± 3,327a

kys.gallová

1,064 ± 0,028d

2,661 ± 0,109c

4,050 ± 0,099b

5,095 ± 0,171a

kys.kávová

62

kys. p-kumarová

285,061 ± 6,467b

159,059 ± 3,487c

273,619 ± 6,896b

366,934 ± 14,112a

p-hydroxybenzaldehyd

4,528 ± 0,126d

76,214 ± 1,706c

131,163 ± 2,846b

157,673 ± 3,271a

kys.p-hydroxybenzoová

13,791 ± 0,277d

74,600 ± 1,600c

134,711 ± 3,021b

153,629 ± 3,262a

kys.protokatechová

7,001 ± 0,259b

13,445 ± 0,554a

14,764 ± 0,426a

13,998 ± 0,436a

kys. salicylová

15,398 ± 0,836c

19,252 ± 0,764c

53,595 ± 1,161b

66,747 ± 2,533a

kys.sinapová

2,085 ± 0,082d

2,628 ± 0,068c

6,427 ± 0,158a

5,880 ± 0,137b

kys.syringová

7,102 ± 0,156c

4,076 ± 0,097d

11,007 ± 0,260b

16,014 ± 0,339a

kys.vanilová

17,988 ± 0,372b

12,633 ± 0,483c

17,978 ± 0,424b

31,433 ± 0,674a

vanilin 14,972 ± 0,334b 12,944 ± 0,270c 6,590 ± 0,199d -1 Průměrný obsah polyfenolů v akátovém medu je 55,058 µg⋅100 g medu

15,933 ± 0,326a

Data jsou vyjádřena ± sx. Hodnoty v řádcích následované stejnými písmeny, se signifikantně neliší dle Tukeyova testu (P < 0.05). Počet opakování n = 3

23.2 Řepkový med (ŘEP) Ze 14 sloučenin byla u 6 z nich (kys. kávová, p-kumarová, p-hydroxybenzaldehyd, salicylová, sinapová,

vanilová) nejefektivnější metoda extrakce pevnou fází

s rozpouštědlem ethylacetát (SPE ETAC). U 3,4-dihydroxybenzaldehydu a kyseliny gallové byla nejvyšší průměrná hodnota naměřena metodou LLE ETAC. U 6 sloučenin (kyselina chlorogenová, ferulová, p-hydroxybenzoová, protokatechová, syringová a vanilin) nebylo možné určit nejefektivnější metodu. Hodnoty se statisticky významně nelišily. Nejvyšší průměrné hodnoty byly naměřeny u kyseliny p-kumarové (875,831 ± 18,626 µg⋅100 g-1) metodou SPE ETAC a kys. ferulové (291,219 ± 11,251 µg⋅100 g-1 a 272,844 ± 5,535 µg⋅100 g-1 – tyto hodnoty se statisticky významně nelišily ) metodou SPE ETAC a SPE ETHER viz. tabulka č. 4. Tab. 5 Statistické porovnání metod extrakce v řepkovém medu medu Hodnoty jsou uvedeny v µg⋅100 g-1 medu

ŘEP (LLE ETAC)

ŘEP (LLE ETHER)

ŘEP (SPE ETHER)

ŘEP (SPE ETAC)

3,4dihydroxybenzaldehyd

7,757 ± 0,255a

2,019 ± 0,078d

2,884 ± 0,090c

3,817 ± 0,092b

kys.kávová

111,314 ± 5,578b

50,36 ± 1,057c

38,804 ± 1,001d

136,805 ± 2,969a

kys.chlorogenová

25,381 ± 0,732a

11,8 ± 0,294b

2,81 ± 0,075c

26,431 ± 0,532a

kys.ferulová

131,492 ± 2,669b

151,57 ± 3,247b

272,844 ± 5,535a

291,219 ± 11,251a

kys.gallová

5,149 ± 0,084a

2,236 ± 0,081d

2,568 ± 0,112c

3,424 ± 0,083b

684,8 ± 20,785c

875,831 ± 18,626a

kys. p-kumarová

761,169 ± 15,839b 385,924 ± 12,439d

p-hydroxybenzaldehyd

3,808 ± 0,157d

87,928 ± 2,420c

176,806 ± 3,790b

197,031 ± 6,756a

kys.p-hydroxybenzoová

21,531 ± 0,778c

88,53 ± 1,827b

176,6 ± 2,984a

193,698 ± 10,438a

kys.protokatechová 6

59,362 ± 2,204a

32,312 ± 0,712c

43,268 ± 1,605b

58,724 ± 1,453a

63

kys. salicylová

23,296 ± 0,720c

22,62 ±0,490c

30,078 ± 1,359b

57,388 ± 2,022a

kys.sinapová

2,733 ± 0,076c

1,847 ± 0,038d

5,484 ± 0,126b

6,702 ± 0,168a

kys.syringová

13,749 ± 0,230ab

4,818 ± 0,167c

13,348 ± 0,278b

14,302 ± 0,350a

kys.vanilová

52,415 ± 1,060c

30,204 ± 0,818d

57,677 ± 1,810b

69,567 ± 1,395a

vanilin 8,101 ± 0,219a 12,589 ± 0,296b 7,068 ± 0,163c -1 Průměrný obsah polyfenolů v akátovém medu je 99,479 µg⋅100 g medu

8,829 ± 0,303a

Data jsou vyjádřena ± sx. Hodnoty v řádcích následované stejnými písmeny, se signifikantně neliší dle Tukeyova testu (P < 0.05). Počet opakování n = 3

23.3 Medovicový smíšený med (MED) Ze 14 sloučenin byla u 6 z nich (kyselina kávová, ferulová, p-kumarová, phydroxybenzaldehyd, kyselina p-hydroxybenzoová, vanilin) nejefektivnější metoda extrakce pevnou fází s rozpouštědlem ethylacetát (SPE ETAC). U kyseliny gallové a salicylové byla nejvyšší průměrná hodnota naměřena metodou LLE ETAC. U 6 sloučenin

(3,4-dihydroxybenzaldehyd,

kyselina

chlorogenová,

protokatechová,

sinapová, syringová, vanilová) nebylo možné určit nejefektivnější metodu. Hodnoty se statisticky významně nelišily. Nejvyšší průměrné hodnoty byly naměřeny u kyseliny pkumarové (681,916 ± 17,642 µg⋅100 g-1) metodou SPE ETAC a kyseliny protokatechové (425,251 ± 8,637 µg⋅100 g-1 a 424,695 ± 6,391 µg⋅100 g-1 – tyto hodnoty se statisticky významně nelišily ) metodami SPE ETHER a SPE ETAC viz. tabulka č. 5. Tab. 6 Statistické porovnání metod extrakce v medovicovém smíšeném medu Hodnoty jsou uvedeny v µg⋅100 g-1 medu

MED (LLE ETAC)

MED (LLE ETHER)

MED (SPE ETHER)

MED (SPE ETAC)

3,4dihydroxybenzaldehyd

10,122 ± 0,406a

3,883 ± 0,116c

5,208 ± 0,081b

9,936 ± 0,497a

kys.kávová

64,409 ± 2,988b

30,669 ± 0,688c

28,724 ± 1,412c

80,271 ± 1,626a

48,7 ± 1,007a

2,584 ± 1,101b

3,663 ± 0,097b

50,563 ± 1,013a

kys.ferulová

29,968 ± 0,684d

147,833 ± 3,188c

262,253 ± 5,952b

292,218 ± 12,168a

kys.gallová

30,677 ± 0,620a

4,51 ± 0,121d

11,867 ± 0,255b

10,18 ± 0,206c

kys. p-kumarová

623,82 ± 11,869b

392,288 ± 8,703d

571,605 ± 9,070c

681,916 ± 17,642a

p-hydroxybenzaldehyd

6,975 ± 0,171d

90,218 ± 1,828c

156,294 ± 9,089b

187,893 ± 3,919a

kys.p-hydroxybenzoová

11,339 ± 0,367d

88,833 ± 1,810c

148,901 ± 3,402b

165,394 ± 3,759a

kys.protokatechová

379,496 ± 15,086b

191,034 ± 7,286c

425,251 ± 8,637a

424,695 ± 6,391a

kys. salicylová

kys.chlorogenová

206,402 ± 3,837a

118,931 ± 4,827d

166,215 ± 3,119c

189,585 ± 4,074b

kys.sinapová

2,475 ± 0,052b

2,13 ± 0,065b

3,829 ± 0,169a

3,746 ± 0,186a

kys.syringová

12,7 ± 0,344b

4,173 ± 0,200c

10,314 ± 0,420a

9,903 ± 0,252a

64

kys.vanilová

80,242 ± 1,452a

44,542 ± 1,283c

53,846 ± 1,192b

75,455 ± 1,963a

vanilin 28,205 ± 1,437b 24,976 ± 0,463c 16,993 ± 0,378d Průměrný obsah polyfenolů v akátovém medu je 120,496 µg⋅100 g-1 medu

31,389 ± 0,655a

Data jsou vyjádřena ± sx. Hodnoty v řádcích následované stejnými písmeny, se signifikantně neliší dle Tukeyova testu (P < 0.05). Počet opakování n = 3

23.4 Lipový med (LIP) Ze 14 sloučenin byla u 10 z nich (kyselina kávová, chlorogenová, ferulová, pkumarová, p-hydroxybenzaldehyd, kyselina p-hydroxybenzoová, salicylová, sinapová, vanilová, vanilin) nejefektivnější metoda extrakce pevnou fází s rozpouštědlem ethylacetát (SPE ETAC). U kyseliny gallové byla nejvyšší průměrná hodnota naměřena metodou LLE ETAC. U 3 sloučenin (3,4-dihydroxybenzaldehyd, syringová) nebylo možné určit nejefektivnější metodu. Hodnoty se statisticky významně nelišily. Nejvyšší průměrné hodnoty byly naměřeny u kyseliny p-kumarové (862,542 ± 19,138 µg⋅100 g-1) metodou SPE ETAC a kyseliny kávové (296,723 ± 6,105 µg⋅100 g-1) taktéž metodou SPE ETAC viz. tabulka č. 6. Tab. 7 Statistické porovnání metod extrakce v lipovém medu medu Hodnoty jsou uvedeny v µg⋅100 g-1 medu

LIP (LLE ETAC)

LIP (LLE ETHER)

LIP (SPE ETHER)

LIP (SPE ETAC)

3,4dihydroxybenzaldehyd

9,37 ± 0,204a

7,22 ± 0,206b

8,975 ± 0,239a

9,084 ± 0,282a

kys.kávová

257,452 ± 5,331b

134,399 ± 4,065c

124,198 ± 3,994c

296,723 ± 6,105a

kys.chlorogenová

11,162 ± 0,210b

2,53 ± 0,051d

7,107 ± 0,155c

12,693 ± 0,495a

kys.ferulová

19,141 ± 0,416d

110,269 ± 2,465c

187,278 ± 6,231b

238,232 ± 4,824a

kys.gallová

4,602 ± 0,093a

1,943 ± 0,078d

3,657 ± 0,119b

3,278 ± 0,078c

600,914 ± 12,871c

862,542 ± 19,138a

kys. p-kumarová

788,25 ± 16,047b 531,647 ± 11,119d

p-hydroxybenzaldehyd

8,156 ± 0,171d

72,318 ± 1,538c

120,03 ± 3,649b

157,94 ± 3,290a

kys.p-hydroxybenzoová

17,212 ± 0,305d

71,711 ± 1,569c

113,852 ± 4,149b

124,539 ± 3,958a

kys.protokatechová

134,255 ± 2,907b

71,73 ± 2,478c

157,633 ± 3,428a

159,033 ± 3,413a

kys. salicylová

36,093 ± 1,241b

21,196 ± 0,537c

33,839 ± 1,710b

40,672 ± 1,396a

kys.sinapová

2,147 ± 0,098b

2,598 ± 0,048b

2,205 ± 0,047b

30,398 ± 0,613a

kys.syringová

3,194 ± 0,094a

0,528 ± 0,016c

2,541 ± 0,085b

3,333 ± 0,107a

kys.vanilová

14,035 ± 0,289b

8,446 ± 0,397d

9,826 ± 0,315c

23,619 ± 0,429a

vanilin 10,968 ± 0,223c 13,669 ± 0,432b 4,304 ± 0,190d -1 Průměrný obsah polyfenolů v akátovém medu je 102,240 µg⋅100 g medu

20,734 ± 0,487a

Data jsou vyjádřena ± sx. Hodnoty v řádcích následované stejnými písmeny, se signifikantně neliší dle Tukeyova testu (P < 0.05). Počet opakování n = 3

65

23.5 Slunečnicový med (SLUN) Ze 14 sloučenin byla u 9 z nich (3,4-dihydroxybenzaldehyd, kyselina kávová, chlorogenová, ferulová, p-kumarová, p-hydroxybenzaldehyd, sinapová, syringová, vanilová) nejefektivnější metoda extrakce pevnou fází s rozpouštědlem ethylacetát (SPE ETAC). U kyseliny gallové, salicylové a vanilinu byla nejvyšší průměrná hodnota naměřena metodou LLE ETAC. U 2 sloučenin (kyselina p-hydroxybenzoová, protokatechová) nebylo možné určit nejefektivnější metodu. Hodnoty se statisticky významně nelišily. Nejvyšší průměrné hodnoty byly naměřeny u kyseliny p-kumarové (472,526 ± 17,974 µg⋅100 g-1) metodou SPE ETAC a kyseliny kávové (391,468 ± 13,214 µg⋅100 g-1) taktéž metodou SPE ETAC viz. tabulka č. 7. Tab. 8 Statistické porovnání metod extrakce ve slunečnicovém medu medu Hodnoty jsou uvedeny v µg⋅100 g-1 medu

SLUN (LLE ETAC)

SLUN (LLE ETHER)

SLUN (SPE ETHER)

SLUN (SPE ETAC)

3,4dihydroxybenzaldehyd

3,839 ± 0,161b

2,67 ± 0,061c

3,557 ± 0,067b

5,662 ± 0,261a

kys.kávová

345,199 ± 8,558b

198,338 ± 5,224c

133,186 ± 4,079d

391,468 ± 13,214a

kys.chlorogenová

29,718 ± 1,234b

2,899 ± 0,089c

3,003 ± 0,072c

36,231 ± 0,738a

kys.ferulová

12,691 ± 0,539d

70,814 ± 2,160c

99,322 ± 2,144b

132,5 ± 2,897a

kys.gallová

6,208 ± 0,133a

4,331 ± 0,082b

3,281 ± 0,093c

3,28 ± 0,084c

398,119 ± 8,936b

255,136 ± 5,468d

299,576 ± 7,503c

472,526 ± 17,974a

p-hydroxybenzaldehyd

3,539 ± 0,091d

192,743 ± 9,777c

290,216 ± 8,756b

326,252 ± 6,709a

kys.p-hydroxybenzoová

12,403 ± 0,270c

198,346 ± 6,718b

286,231 ± 11,488a

282,627 ± 13,203a

kys.protokatechová

29,002 ± 1,431a

24,396 ± 0,507b

27,304 ± 1,290ab

32,123 ± 1,460a

kys. salicylová

40,003 ± 1,113a

21,289 ± 0,576d

26,422 ± 0,568c

31,621 ± 0,657b

kys.sinapová

5,878 ± 0,171b

2,8 ± 0,132d

4,923 ± 0,147c

7,995 ± 0,170a

kys.syringová

27,83 ± 1,142b

15,498 ± 0,326d

23,709 ± 0,486c

32,126 ± 0,899a

kys.vanilová

30,537 ± 0,759b

15,765 ± 0,555d

25,554 ± 0,624c

33,094 ± 0,663a

vanilin 11,817 ± 0,266a 6,33 ± 0,220b 1,878 ± 0,097d Průměrný obsah polyfenolů v akátovém medu je 89,081 µg⋅100 g-1 medu

4,746 ± 0,198c

kys. p-kumarová

Data jsou vyjádřena ± sx. Hodnoty v řádcích následované stejnými písmeny, se signifikantně neliší dle Tukeyova testu (P < 0.05). Počet opakování n = 3

23.6 Medovicový borovicový med (BOR) Ze 14 sloučenin byla u 7 z nich ( kyselina chlorogenová, ferulová, p-kumarová, phydroxybenzaldehyd, kyselina protokatechová, sinapová, vanilová) nejefektivnější

66

metoda extrakce pevnou fází s rozpouštědlem ethylacetát (SPE ETAC). U kyseliny gallové a salicylové byla nejvyšší průměrná hodnota naměřena metodou LLE ETAC, u kyseliny syringové metodou SPE ETHER a u vanilinu metodou LLE ETHER. U 3 sloučenin (3,4-dihydroxybenzaldehyd, kyselina kávová, p-hydroxybenzoová) nebylo možné určit nejefektivnější metodu. Hodnoty se statisticky významně nelišily. Nejvyšší průměrné hodnoty byly naměřeny u kyseliny protokatechové (695,608 ± 13,945 µg⋅100 g-1) metodou SPE ETAC a p-hydroxybenzaldehydu (437,637 ± 9,413 µg⋅100 g-1) taktéž metodou SPE ETAC viz. tabulka č. 8. Tab. 9 Statistické porovnání metod extrakce v medovicovém borovicovém medu Hodnoty jsou uvedeny v µg⋅100 g-1 medu

BOR (LLE ETAC)

BOR (LLE ETHER)

BOR (SPE ETHER)

BOR (SPE ETAC)

3,4dihydroxybenzaldehyd

6,744 ± 0,174a

4,066 ± 0,082c

5,13 ± 0,186b

6,917± 0,137a

137,951 ± 2,852a

76,573 ± 3,078c

87,743 ± 1,426b

141,294 ± 3,099a

kys.chlorogenová

16,75 ± 0,384b

4,681 ± 0,090c

3,061 ± 0,110d

17,724 ± 0,380a

kys.ferulová

15,949 ± 0,480d

35,692 ± 1,267c

89,604 ± 1,530b

104,824 ± 2,287a

kys.gallová

76,494 ± 2,116a

8,434 ± 0,182d

42,51 ± 1,130c

59,631 ± 1,876b

kys. p-kumarová

kys.kávová

162,733 ± 6,140c

97,696 ± 2,080d

185,804 ± 3,836b

248,17 ± 7,846a

p-hydroxybenzaldehyd

2,634 ± 0,060d

213,545 ± 5,070c

392,546 ± 6,546b

437,637 ± 9,413a

kys.p-hydroxybenzoová

11,813 ± 0,296c

215,866 ± 4,524b

383,096 ± 16,259a

395,676 ± 9,030a

kys.protokatechová

528,224 ± 8,712c

238,111 ± 4,747d

627,81 ± 12,088b

695,608 ± 13,945a

kys. salicylová

140,173 ± 2,948a

47,869 ± 1,558d

90,463 ± 1,917c

103,625 ± 2,521b

kys.sinapová

1,396 ± 0,028d

2,686 ± 0,129c

4,159 ± 0,157b

50,841 ± 1,025a

kys.syringová

25,159 ± 0,770b

12,365 ± 0,202d

29,325 ± 0,798a

16,197 ± 0,838c

kys.vanilová

46,598 ± 1,980c

29,359 ± 0,772d

60,369 ± 1,387b

81,81 ± 1,708a

vanilin 10,081 ± 0,344b 11,538 ± 0,392a 4,222 ± 0,167c Průměrný obsah polyfenolů v akátovém medu je 116,966 µg⋅100 g-1 medu

3,101 ± 0,103d

Data jsou vyjádřena ± sx. Hodnoty v řádcích následované stejnými písmeny, se signifikantně neliší dle Tukeyova testu (P < 0.05). Počet opakování n = 3

23.7 Akátový med 2 (AK 2) Ze 14 sloučenin byla u 9 z nich (3,4-dihydroxybenzaldehyd, kyselina kávová, ferulová, gallová,

p-kumarová,

p-hydroxybenzaldehyd,

salicylová,

sinapová,

syringová)

nejefektivnější metoda extrakce pevnou fází s rozpouštědlem ethylacetát (SPE ETAC). U kyseliny p-hydroxybenzoové a protokatechové byla nejvyšší průměrná hodnota naměřena metodou SPE ETHER a vanilinu metodou LLE ETHER. U 2 sloučenin

67

(kyselina chlorogenová, kyselina vanilová) nebylo možné určit nejefektivnější metodu. Hodnoty se statisticky významně nelišily. Nejvyšší průměrné hodnoty byly naměřeny u kyseliny p-kumarové (273,833 ± 7,715 µg⋅100 g-1) metodou SPE ETAC a kyseliny ferulové (121,297 ± 3,680 µg⋅100 g-1), taktéž metodou SPE ETAC viz. tabulka č. 9. Tab. 10 Statistické porovnání metod extrakce v akátovém medu 2 AK 2 (LLE ETAC)

AK 2 (LLE ETHER)

AK 2 (SPE ETHER)

AK 2 (SPE ETAC)

3,4dihydroxybenzaldehyd

3,785 ± 0,190b

1,447 ± 0,039d

2,876 ± 0,100c

4,47 ± 0,104a

kys.kávová

54,157 ± 0,813b

16,863 ± 0,520c

14,615 ± 0,338c

59,967 ± 1,382a

kys.chlorogenová

8,712 ± 0,290a

5,113 ± 0,123b

2,687 ± 0,062c

8,701 ± 0,439a

kys.ferulová

12,933 ± 0,371d

48,348 ± 1,446c

90,789 ± 2,036b

121,297 ± 3,680a

kys.gallová

1,574 ± 0,057b

1,352 ± 0,036c

1,322 ± 0,028c

1,969 ± 0,061a

193,031 ± 4,270b

124,444 ± 5,014c

196,78 ± 6,741b

273,833 ± 7,715a

p-hydroxybenzaldehyd

2,091 ± 0,074d

37,981 ± 1,728c

84,692 ± 2,660b

108,961 ± 4,240a

kys.p-hydroxybenzoová

5,954 ± 0,170d

38,646 ± 1,687c

82,794 ± 2,582a

76,385 ± 2,036b

kys.protokatechová

5,354 ± 0,276c

4,829 ± 0,213c

9,371 ± 0,504a

8,299 ± 0,209b

kys. salicylová

27,313 ± 0,799b

9,985 ± 0,386d

15,701 ± 0,571c

56,943 ± 2,345a

kys.sinapová

4,064 ± 0,096c

2,3 ± 0,128d

5,73 ± 0,228b

7,999 ± 0,406a

kys.syringová

12,234 ± 0,254b

3,593 ± 0,088c

12,723 ± 0,334b

14,066 ± 0,298a

kys.vanilová

19,055 ± 0,744a

8,44 ± 0,368b

20,299 ± 0,767a

20,943 ± 1,064a

vanilin 9,254 ± 0,261b 13,199 ± 0,269a 3,207 ± 0,146d -1 Průměrný obsah polyfenolů v akátovém medu je 36,095 µg⋅100 g medu

4,604 ± 0,108c

Hodnoty jsou uvedeny v µg⋅100 g-1 medu

kys. p-kumarová

Data jsou vyjádřena ± sx. Hodnoty v řádcích následované stejnými písmeny, se signifikantně neliší dle Tukeyova testu (P < 0.05). Počet opakování n = 3

23.8 Lesní květový med (LK) Ze 14 sloučenin byla u 7 (3,4-dihydroxybenzaldehyd, chlorogenová, ferulová, pkumarová, protokatechová, syringová) nejefektivnější metoda extrakce pevnou fází s rozpouštědlem ethylacetát (SPE ETAC). U p-hydroxybenzaldehydu a kyseliny phydroxybenzoové byla nejvyšší průměrná hodnota naměřena metodou SPE ETHER a u kyseliny sinapové metodou LLE ETHER. U 4 sloučenin (kyselina kávová, gallová, salicylová, vanilin) nebylo možné určit nejefektivnější metodu. Hodnoty se statisticky významně nelišily. Nejvyšší průměrné hodnoty byly naměřeny u kyseliny salicylové (520,08 ± 17,756 a 509,585 ± 10,251 µg⋅100 g-1 - tyto hodnoty se statisticky významně

68

nelišily) metodou SPE ETAC a LLE ETAC a kyseliny protokatechové (302,008 ± 6,411 µg⋅100 g-1) metodou SPE ETAC viz. tabulka č. 10. Tab. 11 Statistické porovnání metod extrakce v lesním květovém medu 2 Hodnoty jsou uvedeny v µg⋅100 g-1 medu

LK (LLE ETAC)

LK (LLE ETHER)

LK (SPE ETHER)

LK (SPE ETAC)

3,4dihydroxybenzaldehyd

7,162 ± 0,236b

4,852 ± 0,096c

7,047 ± 0,187b

9,015 ± 0,177a

kys.kávová

45,087 ± 1,354a

16,77 ± 0,391b

20,617 ± 0,539b

47,97 ± 1,927a

kys.chlorogenová

11,358 ± 0,231b

10,135 ± 0,279c

5,683 ± 0,120d

12,843 ±0,468a

kys.ferulová

39,519 ± 0,843b

28,536 ± 1,404c

44,291 ± 2,381b

69,978 ± 1,517a

kys.gallová

26,994 ± 0,820a

3,685 ± 0,080c

14,031 ± 0,289b

29,318 ± 1,270a

kys. p-kumarová

158,648 ± 3,252b

97,097 ± 2,323d

138,552 ± 2,950c

198,172 ± 6,139a

p-hydroxybenzaldehyd

3,532 ± 0,103d

70,425 ± 0,054c

132,089 ± 3,057a

124,598 ± 2,999b

kys.p-hydroxybenzoová

16,943 ± 0,365d

70,68 ± 1,426c

131,624 ± 2,772a

112,945 ± 3,223b

kys.protokatechová

254,177 ± 5,407c

80,695 ± 2,126d

274,347 ± 5,610b

302,008 ± 6,411a

kys. salicylová

509,585 ± 10,251a 236,224 ± 4,836c

324,159 ± 8,546b

520,08 ± 17,756a

kys.sinapová

1,402 ± 0,044d

2,698 ± 0,062a

2,403 ± 0,069b

1,951 ± 0,068c

kys.syringová

18,997 ± 0,382b

3,862 ± 0,126c

18,761 ± 0,426b

20,449 ± 0,534a

kys.vanilová

21,13 ± 0,762b

8,89 ± 0,163c

19,657 ± 0,988b

25,236 ± 0,763a

vanilin 15,928 ± 0,387a 10,51 ± 0,210b 9,422 ± 0,225c -1 Průměrný obsah polyfenolů v akátovém medu je 100,986 µg⋅100 g medu

16,075 ± 0,324a

Data jsou vyjádřena ± sx. Hodnoty v řádcích následované stejnými písmeny, se signifikantně neliší dle Tukeyova testu (P < 0.05). Počet opakování n = 3

69

24 DISKUZE Pro odebrání složek matrice z medu se často používá extrakce pevnou fází (SPE) (Pyrzynska, Biesaga, 2009). Pro analýzu fenolových sloučenin v medu byly v této práci použity celkem dvě extrakční metody a dva typy rozpouštědel. Jednalo se o metodu extrakce z kapaliny do kapaliny (LLE) za použití rozpouštědla ethylacetát, LLE za použití diethyletheru, extrakce pevnou fází (SPE) za použití rozpouštědla ethylacetát a SPE za použití diethyletheru. Tyto metody byly porovnány pomocí statistického zpracování, kdy bylo zjišťováno, zda se hodnoty signifikantně liší/neliší dle Tukeyova testu (P < 0.05). U 6 ze 14 sloučenin byla nejefektivnější metoda SPE ETAC. U kyseliny p-kumarové byla nejúčinnější ve všech 8 medech. U kyseliny ferulové a phydroxybenzaldehydu byla metoda SPE ETAc nejúčinnější u 7 z 8 medů. U kyseliny kávové a kyseliny vanilové byla tato metoda nejefektivnější u 6 z 8 medů a u kyseliny sinapové byla nejúčinnější u 5 z 8 medů. U kyseliny chlorovodíkové, salicylové a syringové byla tato metoda nejefektivnější u 4 z 8 medů. Z toho u kyseliny chlorovodíkové a syringové nebylo možné u 3 medů stanovit nejvyšší hodnotu (statisticky se průkazně nelišily). U kyseliny salicylové nebylo možné určit nejvyšší hodnotu u 1 medu. U všech případů, u kterých nebylo možné stanovit nejvyšší hodnotu, figurovala i metoda SPE ETAC. U kyseliny gallové byla nejefektivnější metodou metoda extrakce z kapaliny do kapaliny s využitím rozpouštědla ethylacetát. Nejvyšší hodnota byla touto metodou naměřena u 5 medů z 8. U 4 sloučenin ze 14 (3,4dihydroxybenzaldehyd, kyselina p-hydroxybenzoová, protokatechová a vanilin) nebylo možné stanovit nejefektivnější metodu. Bylo zde mnoho případů, kdy se nedala statisticky průkazně určit nejvyšší hodnota. Ve všech těchto případech se však opět vyskytovala u nejvyšších hodnot i metoda SPE ETAC. Jako nejefektivnější metoda se tedy zdá metoda extrakce pevnou fází s rozpouštědlem ethylacetát, nicméně pro potvrzení je třeba dalšího zkoumání. Obsah polyfenolických sloučenin (flavonoidů a fenolických kyselin) v medu je silně ovlivněn rostlinným a zeměpisným původem, jakož i klimatem místa (Pyrzynska, Biesaga, 2009). Obecně mají vyšší antioxidační účinek smíšené medy, jelikož pochází z více druhů rostlin nebo stromů (Titěra, 2013). Bylo také zjištěno, že medy s tmavší barvou mají vyšší fenolický obsah a v důsledku toho také vyšší antioxidační kapacitu (Pyrzynska, Biesaga, 2009). Tato skutečnost se potvrdila i při mé analýze celkového 70

obsahu fenolových sloučenin, kdy jsem zjistila, že nejvyšší průměrné hodnoty dosáhly vzorky medovicového smíšeného medu (120,496 µg⋅100 g-1) a medu medovicového borovicového (116,965 µg⋅100 g-1), které mají obecně tmavší barvu. Ve studii provedené Marghitasem a kol. (2010) byly sledovány fenolové kyseliny a flavonoidy v akátovém medu. Analýze bylo podrobeno 10 vzorků, u kterých byly detekovány kyseliny p-hydroxybenzoová, ferulová, p-kumarová, a kyselina vanilová. Z toho ferulová kyselina byla identifikována ve všech analyzovaných vzorcích (72 až 866 µg⋅100 g-1). Kyselina p-kumarová ve 3 z 10 vzorků v množství od 251 až 636 µg⋅100 g1

, kyselina p-hydroxybenzoová byla zjištěna v 5 případech z 10 vzorků v množství od

25 až 65 µg⋅100 g-1 a kyselina vanilová byla zjištěna ve 3 z 10 vzorů v množství 185 až 291 µg⋅100 g-1. Kyselina ferulová a kyselina p-kumarová byly kvantifikovány ve vzorcích pocházejících z Německa a Itálie. V jiné oblasti Itálie byla kromě nich zjištěna také kyselina vanilová, stejně jako ve vzorcích pocházejících z Rumunska (Marghitas a kol, 2010). V akátových medech, analyzovaných v této práci, se nacházely všechny tyto sloučeniny. V akátovém medu AK 1 byla naměřena nejvyšší hodnota kyseliny ferulové 160,644 ± 3,327 µg⋅100 g-1 medu metoou SPE ETAC, p-hydroxybenzoové 153,629 ± 3,262 µg⋅100 g-1 (SPE ETAC), p-kumarové 366,934 ± 14,112 µg⋅100 g-1 (SPE ETAC) a kyselina vanilová 31,433 ± 0,674 µg⋅100 g-1 (SPE ETAC). V akátovém medu AK 2 v průměrném množství: kyselina ferulová 121,297 µg⋅100 g-1 (SPE ETAC), phydroxybenzoová 82,794 ± 2,582 µg⋅100 g-1 (SPE ETHER) , p-kumarová 273,833 ± 7,715 µg⋅100 g-1 (SPE ETAC) a kyselina vanilová 20,943 ± 1,064, 20,299 ± 0,767 a 19,055 ± 0,744 µg⋅100 g-1 (žádná z těchto hodnot nebyla statisticky průkazně vyšší) . Akátový med AK 1 měl všechny hodnoty o něco vyšší než akátový med AK 2. Tyto rozdíly mohou být dány odlišnou polohou místa sběru. Naměřené hodnoty fenolových sloučenin v akátových medech jsou, kromě kyseliny p-hydroxybenzoové, výrazně nižsí než v předkládané studii. V porovnání se vzorky z Itálie a Německa by mohl být tento rozdíl dán geografickou polohou nebo metodou extrakce, kdy v předkládané studii byly látky extrahovány pomocí skleněné kolony naplněné pryskyřicí Amberlite. Ve studii Michalkiewiczové a kol. (2008) byly sledovány fenolové kyseliny a jejich deriváty v lipovém medu z Polska. Extrakce byla provedena pomocí SPE za využití Oasis HLB kolon. V tomto medu byla zjištěna kyselina gallová (0,9 ± 0,02 mg⋅kg-1), phydroxybenzoová (4,1 ± 0,03 mg⋅kg-1), kyselina vanilová (3,7 ± 0,03 mg⋅kg-1), kávová (3,6 ± 0,02 mg⋅kg-1) a kyselina syringová (2,7 ± 0,02 mg⋅kg-1). V lipovém medu, 71

analyzovaném v této práci, se nacházely všechny tyto sloučeniny. Kyselina gallová byla nalezena v nejvyšší hodnotě 0,046 ± 0,001 mg⋅kg-1 (LLE ETHER), kyselina phydroxybenzoová v nejvyšší hodnotě 1,245 ± 0,04 mg⋅kg-1 (SPE ETAC), u kyseliny vanilové byla naměřena nejvyšší hodnota 0,236 ± 0,0043 mg⋅kg-1 (SPE ETAC), kyselina kávová měla naměřenou nejvyšší hodnotu 2,967 ± 0,061 mg⋅kg-1 (SPE ETAC) a u kyseliny syringové byla nejvyšší naměřená hodnota 0,033 ± 0,001 mg⋅kg-1 a 0,032 ± 0,001 mg⋅kg-1 (LLE ETHER, SPE ETAC) – tyto hodnoty se statisticky významně nelišily. Zjištěné hodnoty jsou oproti studii mnohem nižší. Pouze u kyseliny kávové jsou hodnoty obdobné. Mohlo to být způsobeno více faktory (klima, domba sběru, geografická poloha apod.). Ve studii Biesagy a Pyrzynské (2009) byl analyzován medovicový med, u kterého byly sledovány fenolové kyseliny a jejich deriváty. V tomto medu byla stanovena kyselina gallová (30 ± 3,0 µg⋅100 g-1), kyselina p-hydroxybenzoová (160 ± 3,0 µg⋅100 g-1), kyselina chlorogenová (50 ± 3,0 µg⋅100 g-1), kyselina vanilová (40 ± 2,0 µg⋅100 g1

), kyselina kávová (70 ± 5,0 µg⋅100 g-1), kyselina syringová (70 ± 4,0 µg⋅100 g-1),

kyselina p-kumarová (270 ± 9,0 µg⋅100 g-1) a kyselina ferulová (17380 ± 850 µg⋅100 g1

) (Biesaga, Pyrzynska, 2009) V medovicovém medu smíšeném, analyzovaném v této

práci, se nacházely všechny tyto kyseliny, a to v nejvyšším naměřeném množství: kyselina gallová 30,677 ± 0,620 µg⋅100 g-1, kyselina p-hydroxybenzoová 165,394 ± 3,759 µg⋅100 g-1, kyselina chlorogenová 50,563 ± 1,013 µg⋅100 g-1 a 48,7 ± 1,007 µg⋅100 g-1 (tyto hodnoty se statisticky významně nelišily), kyselina vanilová 80,242 ± 1,452 µg⋅100 g-1 a 75,455 ± 1,963 µg⋅100 g-1 (tyto hodnoty se statisticky významně nelišily), kyselina kávová 80,271 ± 1,626 µg⋅100 g-1, kyselina syringová 10,314 ± 0,420 µg⋅100 g-1 a 9,903 ± 0,252 µg⋅100 g-1 (tyto hodnoty se statisticky významně nelišily), kyselina p-kumarová 681,916 ± 17,642 µg⋅100 g-1 a kyselina ferulová 292,218 ± 12,168 µg⋅100 g-1. U medovicového medu borovicového se jednalo o nejvyšší naměřené hodnoty: kyselina gallová 76,494 ± 2,116 µg⋅100 g-1, kyselina p-hydroxybenzoová 395,676 ± 9,030 µg⋅100 g-1 a 383,096 ± 16,259 µg⋅100 g-1 (tyto hodnoty se statisticky významně nelišily), kyselina chlorogenová 17,724 ± 0,380 µg⋅100 g-1, kyselina vanilová 81,81 ± 1,708 µg⋅100 g-1, kyselina kávová 141,294 ± 3,099 µg⋅100 g-1 a 137,951 ± 2,852 µg⋅100 g-1 (tyto hodnoty se statisticky významně nelišily), kyselina syringová 29,325 ± 0,798 µg⋅100 g-1, kyselina p-kumarová 248,17 ± 7,846 µg⋅100 g-1 a kyselina 72

ferulová 104,824 ± 2,287 µg⋅100 g-1. U medovicového borovicového medu, analyzovaného v této práci, byly naměřeny u kyseliny gallové, p-hydroxybenzoové, vanilové a kyseliny kávové vyšší hodnoty (2 - 2,5x vyšší). U kyseliny p-kumarové byly hodnoty podobné. Tyto rozdíné výsledky mohou být dány geografickou polohou a klimatem, kdy můj analyzovaný med pocházel z Řecka a med analyzovaný v dané studii z Polska. U medu medovicového smíšeného byly hodoty většinou podobné a nebo mírně vyšší, pouze u kyseliny kyseliny p-kumarové byl rozdíl výraznější a to ve prospěch medu analyzovaného v této práci. U obou medů byla hodnota kyseliny ferulové mnohonásobně nižší než v přikládané studii. Tyto rozdíly mohou být způsobeny kromě geografické polohy a klimatu také rostlinným původem jednotlivých medů. Ve studii Yao a kol. (2003) byl analyzován balmínový med (Leptospermum polygalifolium). Z fenolových kyselin a jejich derivátů u něj byla stanovovaná kyselina gallová, chlorogenová, kávová, ferulová a syringová. U všech vzorků byla nalezena kyselina gallová (80 – 4510 µg⋅100 g-1) a kyselina chlorogenová (50 – 1110 µg⋅100 g-1). U 12 ze 13 vzorků medu byla nalezena kyselina kávová (30 – 830 µg⋅100 g-1) a kyselina ferulová (40 – 590 µg⋅100 g-1). Kyselina syringová byla zjištěna pouze u 5 vzorků ze 13 a to v hodnotách 180 – 460 µg⋅100 g-1. V medech analyzovaných v této práci se nacházela kyselina gallová v nejvyšší hodnotě v medovicovém borovicovém medu (76,494 µg⋅100 g-1). U kyseliny chlorogenové byla naměřena nejvyšší hodnota 50,563 µg⋅100 g-1 (medovicový smíšený med). U kyseliny kávové byla naměřena nejvyšší hodnota 391,468 µg⋅100 g-1 (slunečnicový med). U kyseliny ferulové byla nejvyšší hodnota 292,218 µg⋅100 g-1 (medovicový med smíšený) Kyselina syringová byla naměřena v nejvyšší hodnotě 32,126 µg⋅100 g-1 (slunečnicový med). Všechny tyto hodnoty byly naměřeny metodou SPE ETAC. Výsledky z této práce jsou podstatně nižší, než v předkládané studii. Může to být dáno mnoha faktory (například metodou extrakce, kdy ve studii byly látky extrahovány pomocí skleněné kolony naplněné pryskyřicí Amberlite). Dalším faktorem je druh medu, kdy balmínový med může obsahovat obecně více polyfenolů, než analyzované medy v této práci. Roli mohla hrát také geografická poloha a klimatické podmínky místa sběru. Obecně obsahovaly analyzované medy nejvíce kyseliny p-kumarové. U 6 medů z 8 zaujímaly nejvyšší naměřenou hodnotu. U zbylých dvou medů zaujímala třetí nejvyšší hodnotu (Lesní květový med) a čtvrtou nejvyšší hodnotu (medovicový borovicový 73

med). Nejvyšší hodnota této kyseliny byla zaznamenána u medu řepkového (875,831 ± 18,626 µg⋅100 g-1), lipového (862,542 ± 19,138 µg⋅100 g-1) a medu medovicového smíšeného (681,916 ± 17,642 µg⋅100 g-1). Všechny tyto hodnoty byly naměřeny metodou SPE ETAC. U kyseliny p-kumarové byla zjištěna antibakteriální aktivita proti řadě bakterií (Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Shigella dysenteriae a Salmonella typhimurium). Výsledky ukázaly, že p-kumarová kyselina účinně inhibuje růst všech testovaných bakteriálních při hodnotách MIC (minimal inhibitory concentrations) od 10 do 80 µg⋅ml-1 roztoku pufru. Kyselina p-kumarová narušuje bakteriální buňěčné membrány a inhibuje buněčné funkce, což vede ke vzniku apoptózy (Lou a kol., 2012). Byl také zjištěn ochranný účinek kyseliny p-kumarové proti infarktu myokardu u krys. Mezi ochranné mechanismy p-kumarové kyseliny patří antilipidické, peroxidační, antioxidační a antiapoptotické vlastnosti. Krysy byly v této studii předem ošetřeny kyselinou p-kumarovou (8 mg⋅kg-1 tělesné hmotnosti) denně po dobu 7 dnů (Prince, Roy, 2013). Bylo tedy aplikováno mnohonásobně vyšší množství, než se nachází v medu. Krysy byly však této kyselině vystaveny pouze po dobu 7 dnů. Je tedy otázka, zda by dlouhodobější příjem nízkých dávek měl také pozitivní vliv. Další kyselinou, která se nacházela v medu ve vyšších hodnotách byla kyselina ferulová. U 6 z 8 medů se nacházela mezi 5 sloučeninami s nejvyššími hodnotami. Z toho u třech medů byla sloučeninou s druhou nejvyšší hodnotu (akátový med 1, řepkový med, akátový med 2). U medu medovicového smíšeného a lipového byla sloučeninou se třetí nejvyšší hodnotou. Nejvyšší hodnota byla naměřena u medu řepkového (291,219 ± 11,251 µg⋅100 g-1, SPE ETAC) a medu medovicového smíšeného (292,218 ± 12,168 µg⋅100 g-1, SPE ETAC). Kyselina ferulová vykazuje celou řadu biologických účinků jako antioxidační, protizánětlivé, antimikrobiální, antialergické, hepatoprotektivní, protivirové, antikarcinogenní, vasodilatační nebo antitrombotické. Zvyšuje také životaschopnost spermií, podílí se na modulaci aktivity enzymů, aktivaci transkripčních faktorů apod. Má také použití v konzervaci potravin nebo jako fotoprotektivní složka v opalovacích krémech a pleťových vodách (Kumar, Pruthi, 2014). Zlepšuje chemickou stabilitu vitamínů C a E, čímž se zdvojnásobí fotoprotekce kůže proti slunečnímu záření. Tvoří tak ochranu proti stárnutí a rakovině kůže vlivem světla (Lin a kol., 2005). Oproti ostatním potravinovým zdrojům je však její obsah

74

v medu zanedbatelný, např. cukrovarské řízky obsahují kyselinu ferulovou v množství 800 mg⋅100 g-1 (Kumar, Pruthi, 2014). Poměrně vysoký obsah byl zjištěn také u kyseliny protokatechové. U 4 z 8 medů se nacházela mezi 5 sloučeninami s nejvyššími hodnotami. U medu medovicového borovicového zaujímala nejvyšší hodnotu, u medu medovicového smíšeného a lesního květového zaujímala druhou nejvyšší hodnotu. Nejvyšší hodnota byla naměřena u medu medovicového borovicového 695,608 ± 13,945a µg⋅100 g-1 metodou SPE ETAC a medovicového smíšeného medu 425,251 ± 8,637 µg⋅100 g-1 (SPE ETHER) a 424,695 ± 6,391 µg⋅100 g-1 (SPE ETAC) – tyto hodnoty se statisticky průkazně nelišily. Nedávné studie ukazují, že kyselina protokatechová může mít ochranné účinky proti rozvoji epiteliální

malignity

(zhoubnosti)

v

různých

tkání

a

také

proti

rozvoji

kardiovaskulárních chorob. Výsledky ukazují, že kyselina protokatechová v dávkách 200 - 2000 ppm (0,02 – 0,2 %) v potravě účinně inhibuje vývoj většiny rakovin, zejména zažívacího ústrojí. Účinnost kyseliny protokatechové byla prokázána v prevenci rakoviny dutiny ústní v několika experimentálních modelech za použití krys a křečků. Vzhledem ke svým biologickým vlastnostem je kyselina protokatechová potenciální chemopreventivní látka proti rakovině. (Tanaka, 2011). Další zajímavou kyselinou zjištěnou v medu je kyselina kávová. Kyselina kávová vykazuje antioxidační, protizánětlivé a antiproliferační vlastnosti. Bylo zjištěno, že kyselina kávová má antioxidační účinky v normálních buňkách a prooxidační účinky v rakovinných buňkách. Indukuje apoptotickou smrt nádorových buněk a vykazuje tak antikarcinogenní účinky (Kanimozhi, Prasad, 2015). U kyseliny kávové byly také zjištěny antivirové účinky proti virové hepatitidě B (HBV), které byly studovány na modelech in vitro a in vivo. Mechanismus účinku kyseliny kávové spočívá zejména v inhibici replikace HBV. (Wang a kol., 2009). Nejvyšší obsah kyseliny kávové byl v rámci analýzy v této práci zaznamenán u medu slunečnicového (391,468 µg⋅100 g-1 medu) a lipového (296,723 µg⋅100 g-1 medu). Mezi hlavní polyfenoly medu se řadí zejména kyselina kávová, pinocembrin, chrisin, galangin, quercetin, kaempferol, acacetin nebo apigenin, které jsou předmětem mnoha studií. O fenolových kyselinách a jejich derivátech se v souvislosti s medem tolik nemluví. V porovnání s flavonoidy jsou však obsahy v medu velice podobné. Ve studii Bertoncelje a kol. (2011) byl v medu stanoven např. flavonoid kaempferol v obsahu mezi 20 a 40 µg⋅100 g-1 medu, quercetin 29,2 – 73,2 ug⋅100 g-1 medu. V jiné

75

studii byly identifikovány flavonoidy pinobanksin (64 až 228 µg⋅100 g-1), pinocembrin (38-138 µg⋅100 g-1), chrysin (61 až 121 µg⋅100 g-1) a acacin (15 a 120 µg⋅100 g-1) (Marghitas a kol, 2010). Fenolové kyseliny a jejich deriváty navíc vykazují, stejně jako flavonoidy, širokou škálu bilogických účinků a jsou ze zdravotního hlediska také velmi zajímavé.

76

25 ZÁVĚR Med obsahuje širokou škálu biologicky aktivních látek, díky kterým má pozitivní vliv na lidské zdraví. Pro své léčivé vlastnosti je znám již od pradávna. Má antibakteriální (hojivé) a antivirové účinky, posiluje imunitu organismu, zvlhčuje plíce, zastavuje kašel, působí proti únavě, nechutenství a zácpě. Má také pozitivní vliv na činnost srdce a tvorbu krve. Bylo zjištěno, že snižuje riziko srdečně cévních onemocnění a má preventivní účinky proti rakovině. S těmito účinky jsou spojovány zejména flavonoidy a fenolové kyseliny, které patří mezi nejdůležitější třídy polyfenolů. Z tohoto důvodu byly pro analýzu medu vybrány právě fenolové kyseliny a jejich deriváty. Sledovaly se zejména deriváty kyseliny skořicové a deriváty kyseliny hydroxybenzoové (3,4dihydroxybenzaldehyd, kyselina kávová, chlorogenová, ferulová, gallová, p-kumarová, p-hydroxybenzaldehyd, kyselina p-hydroxybenzoová, protokatechová, salicylová, sinapová, syringová, kyselina vanilová a vanilin). Analýza byla provedena pomocí kapalinové chromatografie s hmotnostní detekcí. Pro extrakci byly použity dvě metody a to extrakce z kapaliny do kapaliny (LLE) a extrakce pevnou fází (SPE) za použití dvou rozpouštědel diethylether a ethylacetát. Použité metody byly statisticky zhodnoceny za využití ANOVA s post-hoc Tukey HSD testu (P < 0.05). Jako nejefektivnější metoda se ukázala extrakce pevnou fází s rozpouštědlem ethylacetát, nicméně pro potvrzení by bylo třeba dalších analýz. Nejvyššího průměrného obsahu polyfenolů dosáhly vzorky medovicového smíšeného medu a medu medovicového borovicového. Medy obsahovaly obecně nejvíce kyseliny p-kumarové, která u 6 z 8 medů zaujímala nejvyšší naměřenou hodnotu (P < 0.05). Nejvyšší hodnoty této kyseliny byly zaznamenány u medu řepkového, lipového a medu medovicového smíšeného. Kyselina p-kumarová vykazuje antibakteriální aktivitu proti řadě bakterií (Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Shigella dysenteriae a Salmonella typhimurium). Má také antiapoptotické vlastnosti, díky ním vykazuje ochranný účinek proti infarktu myokardu (testováno u krys). Velice zajímavými kyselinami, zjištěnými v medu ve vyšších hodnotách (oproti ostatním látkám), jsou kyselina ferulová, kyselina protokatechová nebo kyselina kávová. Kyselina ferulová vykazuje celou řadu biologických účinků (antioxidační, protizánětlivé, antimikrobiální, antialergické, protivirové apod.). Zvyšuje chemickou stabilitu vitamínů C a E, čímž se zdvojnásobí 77

fotoprotekce kůže proti slunečnímu záření. Tvoří tak ochranu proti stárnutí a rakovině kůže vlivem světla. Nejvyšší hodnota byla naměřena u medu řepkového a medu medovicového smíšeného. Oproti ostatním potravinovým zdrojům je však její obsah v medu zanedbatelný, např. cukrovarnické řízky obsahují kyselinu ferulovou v množství mnohonásobně vyšším (800 mg⋅100 g-1 oproti hodnotě 292,218 µg⋅100 g-1 v medovicovém smíšeném medu). Nedávné studie ukazují, že kyselina protokatechová má ochranné účinky proti rozvoji epiteliální malignity (zhoubnosti) v různých tkání a také proti rozvoji kardiovaskulárních chorob. Nejvyšší hodnota byla naměřena u medu medovicového borovicového a medovicového smíšeného. Zajímavou kyselinou zjištěnou v medu je také kyselina kávová která vykazuje antioxidační, protizánětlivé a antiproliferační vlastnosti. Indukuje apoptotickou smrt nádorových buněk a vykazuje tak antikarcinogenní účinky. U kyseliny kávové byly také zjištěny antivirové účinky proti virové hepatitidě B. Nejvyšší obsah kyseliny kávové byl zjištěn u medu slunečnicového a lipového. Naměřené hodnoty byly porovnávány s jinými studiemi, přičemž byly zjištěny rozdíly v koncentracích, což mohlo být způsobeno mnoha faktory (metoda extrakce, geografická poloha a klima místa sběru nebo rostlinný původ medu). Mezi hlavní polyfenoly medu se řadí zejména kyselina kávová, pinocembrin, chrisin, galangin, quercetin, kaempferol, acacetin nebo apigenin. Jde tedy zejména o flavonoidy. Analyzované fenolové kyseliny nejsou, kromě kyseliny kávové, s medem tolik spojovány i když je jejich obsah v medu velice podobný. Přitom fenolové kyseliny a jejich deriváty mají také, stejně jako flavonoidy, významné účinky na lidské zdraví. Kromě výše zmíněných se v medu nachází i kyselina gallová, která má antioxidační, protizánětlivé a antimikrobiální účinky. Byly zjištěny také antialergické účinky, díky kterým je možnou terapeutickou látkou proti zánětlivým alergickým onemocněním jako je astma, alergická rýma nebo zánět nosních dutin. Má inhibiční účinky na růst kariogenních (kaz vytvářející) a parodontopatických (způsobující parodontózu) bakterií Streptococcus mutan. Kyselina gallová je také potenciální protinádorová sloučenina. V analyzovaných medech se však nacházela spíše v menším množství. Avšak v jiných studiích je tato látka zjištěna i ve vyšší koncentraci (např. u balmínového medu). V medech byla zjištěna také kyselina vanilová a vanilin, které vykazují antimikrobiální účinky, a to proti bakteriím Listeria monocytogenes, Listeria innocua, Listeria grayi a Listeria seeligeri. Tyto sloučeniny by proto mohly být užitečné pro kontrolu Listeria spp. v potravinářských výrobcích. Kyselina vanilová má, díky svým antioxidačním a 78

protizánětlivým vlastnostem, ochranné účinky proti infarktu myokardu. Tento účinek byl ověřen u krys. Kyselina syringová a kyselina vanilová mají antimikrobiální a protirakovinné účinky. Zjištěné údaje naznačují, že podávání kyseliny syringové a kyseliny vanilové může potlačit jaterní fibrózu u chronického poškození jater. Obsah fenolových kyselin záleží zejména na rostlinném zdroji, ze kterého med pochází. Bylo však prokázáno, že je ovlivňován také geografickou polohou a klimatem místa sběru. Fenolové kyseliny, zjištěné v medu, vykazují různé biologické účinky, které jsou významné pro naše zdraví. Nicméně v některých studiích jsou účinky testovány v mnohem vyšších koncentracích. Tyto studie byly však prováděny v řádech dnů, a je proto otázkou, zda by dlouhodobý příjem nízkých dávek byl také významný. V medu se většina analyzovaných látek nachází spíše v menším množství. I tak by neměl být, dle mého názoru, jejich význam opomíjen. Budeme-li konzumovat pestrou stravu bohatou na biologicky aktivní látky, můžeme docílit pozitivního ovlivnění našeho zdraví a k tomu by mohl med významně přispět.

79

26 POUŽITÁ LITERATURA ALTMAN, Nathaniel. Med jako lék: zázračné léčivé vlastnosti včelího produktu. Vyd. 1. Olomouc: Fontána, c2014, 264 s. ISBN 978-80-7336-754-1. ANDERSEN, Oyvind M a Kenneth R MARKHAM. Flavonoids: chemistry, biochemistry, and applications. Boca Raton: Taylor & Francis, 2006, 1237 s. ISBN 08493-2021-6. BIESAGA, Magdalena a Krystyna PYRZYNSKA. Liquid chromatography/tandem mass spectrometry studies of the phenolic compounds in honey. Journal of Chromatography

A.

2009,

vol.

1216,

issue

38,

s.

6620-6626.

DOI:

10.1016/j.chroma.2009.07.066. Dostupné z: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0021967309011510 BIENEFELD, Kaspar. Včelařství krok za krokem: pro milovníky krásného koníčka. Líbeznice: Víkend, 2006, 95 s. ISBN 80-86891-30-5. BERTONCELJ, Jasna, Tomaž POLAK, Urška KROPF, Mojca KOROŠEC a Terezija GOLOB. LC-DAD-ESI/MS analysis of flavonoids and abscisic acid with chemometric approach for the classification of Slovenian honey. Food Chemistry. 2011, vol. 127, issue

1,s.

296-302.

DOI:

10.1016/j.foodchem.2011.01.003.

Dostupné

z: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0308814611000203 BONDURAND, Gilles a Hernan BOSCH. Honey: production, consumption and health benefits. New York: Nova Science Publishers, 2012, 249 s. ISBN 978-1-62100-159-1. BRADBEAR, Nicola. Bees and their role in forest livelihoods: a guide to the services provided by bees and the sustainable harvesting, processing and marketing of their products. Rome: Food and Agriculture Organization of the United Nations, c2009, vii, 194 p. ISBN 978-92-5-106276-0. CAMPBELL-PLATT G., 2009: Food science and technology. Wiley-Blackwell, Chichester, West Sussex, 508 s. ISBN 978-063-2064-212.

80

CANINI, CICCONI, MATTEI a MUZI. Acacia honey and chrysin reduce proliferation of melanoma cells through alterations in cell cycle progression. International Journal of Oncology.

2010,

vol.

37,

issue

4.

DOI:

10.3892/ijo_00000748.

Dostupné

z: http://www.ingentaconnect.com/content/sp/ijo/2010/00000037/00000004/art00024 CARABIAS-MARTÍNEZ, R., E. RODRÍGUEZ-GONZALO, P. REVILLA-RUIZ a J. HERNÁNDEZ-MÉNDEZ. Pressurized liquid extraction in the analysis of food and biological samples. Journal of Chromatography A. 2005, vol. 1089, 1-2, s. 1-17. DOI: 10.1016/j.chroma.2005.06.072. Dostupné z: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0021967305013282 CRAMP, David. Včelařství: obrazový průvodce : od pořízení včelstev po medobraní : více než 400 návodných fotografií. 2. vyd. Čestlice: Rebo, 2014, 160 s. ISBN 978-80255-0831-2. DELAQUIS, Pascal, Kareen STANICH a Peter TOIVONEN. Effect of pH on the Inhibition of Listeria spp. by Vanillin and Vanillic Acid. Journal of food protection. Ames, Iowa: International Association of Milk, Food, and Environmental Sanitarians, 2005, roč. 68, č. 7. Dostupné z: http://www.ingentaconnect.com/content/iafp/jfp/2005/00000068/00000007/art00024 DELAZAR, Abbas, Lutfun NAHAR, Sanaz HAMEDEYAZDAN a Satyajit D. SARKER. Microwave-Assisted Extraction in Natural Products Isolation. Natural Products Isolation: Methods in Molecular Biology. 2012, roč. 864, s. 89. DOI: 10.1007/978-1-61779-624-1_5.

Dostupné

z: http://link.springer.com/10.1007/978-1-

61779-624-1_5 DUTAU, G. a F. RANCÉ. Allergies au miel et aux produits de la ruche. Revue Française

d'Allergologie.

2009,

vol.

49,

S16-S22.

DOI:

10.1016/S1877-

0320(09)72479-0. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S1877032009724790 FARIED, A., D. KURNIA, L. FARIED, N. USMAN, T. MIYAZAKI, H. KATO a H. KUWANO. Anticancer effects of gallic acid isolated from Indonesian herbal medicine, Phaleria macrocarpa (Scheff.) Boerl, on human cancer cell lines.International Journal of Oncology. 2007-03-01, s. -. DOI: 10.3892/ijo.30.3.605. Dostupné z: 81

http://www.spandidos-publications.com/10.3892/ijo.30.3.605 FENICIA, Lucia a Fabrizio ANNIBALLI. Infant botulism. Annali dell'Istituto Superiore di Sanita. 2009, roč. 45, č. 2, s. 134-146. Dostupné z: http://www.hepatitis.iss.it/binary/spva/cont/ANN_09_20_Fenicia.pdf FRANK, Renate. Zázračný med. Líbeznice: Víkend, 2010, 124 s. ISBN 978-80-7433024-7 HARAGSIM, Oldřich. Včelařské byliny. 1. vyd. Praha: Grada, 2008, 108 s., [16] s. barev. obr. příl. ISBN 978-80-247-2157-6. HARAGSIM, Oldřich a Ludmila HARAGSIMOVÁ. Včelařské dřeviny a byliny. 2., upr. vyd. Praha: Grada, 2013, 200 s. ISBN 978-80-247-4647-0. ITOH, Ayano, Katsuhiro ISODA, Masuo KONDOH, Masaya KAWASE, Akihiro WATARI, Masakazu KOBAYASHI, Makoto TAMESADA a Kiyohito YAGI. Hepatoprotective Effect of Syringic Acid and Vanillic Acid on CCl4-Induced Liver Injury. Biological. 2010, vol. 33, issue 6, s. 983-987. DOI: 10.1248/bpb.33.983. Dostupné z: http://joi.jlc.jst.go.jp/JST.JSTAGE/bpb/33.983?from=CrossRef IURLINA, Miriam O., Amelia I. SAIZ, Rosalía FRITZ a Guillermo D. MANRIQUE. Major flavonoids of Argentinean honeys. Optimisation of the extraction method and analysis of their content in relationship to the geographical source of honeys. Food Chemistry.

2009,

vol.

115,

issue

3,

s.

1141-1149.

DOI:10.1016/j.foodchem.2009.01.003. Dostupné z: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0308814609000272 ISLAM, Md. Nazmul, Md. Ibrahim KHALIL, Md. Asiful ISLAM a Siew Hua GAN. Toxic compounds in honey. Journal of Applied Toxicology. 2013, vol. 34, issue 7, s. 733-742.DOI: 10.1002/jat.2952. Dostupné z: http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/jat.2952/abstract KANG, Mi-Sun, Jong-Suk OH, In-Chol KANG, Suk-Jin HONG a Choong-Ho CHOI. Inhibitory effect of methyl gallate and gallic acid on oral bacteria. The Journal of Microbiology. 2008, vol. 46, issue 6, s. 744-750. DOI: 10.1007/s12275-008-0235-7. Dostupné z: http://link.springer.com/article/10.1007/s12275-008-0235-7 82

KANIMOZHI, G. a N.R. PRASAD. Anticancer Effect of Caffeic Acid on Human Cervical Cancer Cells. Coffee in health and disease prevention. PREDY, Victor. 2015, 655-661. ISBN 9780124167162. Dostupné z: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B9780124095175000735 KAŠKONIENĖ, Vilma a Petras R. VENSKUTONIS. Floral Markers in Honey of Various Botanical and Geographic Origins: A Review. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety. 2010, vol. 9, issue 6, s. 620-634. DOI: 10.1111/j.15414337.2010.00130.x. Dostupné z: http://doi.wiley.com/10.1111/j.1541-4337.2010.00130.x KIM, S.-H., Chang-Duk JUN, Kyongho SUK, Byung-Ju CHOI, Hyunjeung LIM, Seunja PARK, Seung HO LEE, Hye-Young SHINǁ, Dae-Keun KIMǁ a Tae-Yong SHINǁ. Gallic Acid Inhibits Histamine Release and Pro-inflammatory Cytokine Production in Mast Cells. Toxicological Sciences. 2006, vol. 91, issue 1, s. 123-131. DOI: 10.1093/toxsci/kfj063. Dostupné z: http://toxsci.oxfordjournals.org/content/91/1/123.short KIRCHNER, Michal a Eva MATISOVÁ. Present Methods and New Trends in Isolation of Pesticide Residues in Non-Fatty Foods. Chemické listy. 2004, roč. 98, č. 7. Dostupné z: http://www.chemicke-listy.cz/docs/full/2004_07_04.pdf KLEJDUS, B., J. VACEK, L. LOJKOVÁ, L. BENEŠOVÁ a V. KUBÁŇ. Ultrahighpressure liquid chromatography of isoflavones and phenolic acids on different stationary phases. Journal of Chromatography A. 2008, vol. 1195, 1-2, s. 52-59. DOI: 10.1016/j.chroma.2008.04.069. Dostupné z: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0021967308007528 KLOUDA, Pavel. Moderní analytické metody. 2., upr. a dopl. vyd. Ostrava: Pavel Klouda, 2003, 132 s. ISBN 80-86369-07-2 KOMPRDA, Tomáš. Základy výživy člověka. 1.vyd. Brno: Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, 2003, 162 s. ISBN 80-7157-655-7. KUMAR, Naresh a Vikas PRUTHI. Potential applications of ferulic acid from natural sources. Biotechnology

Reports.

2014,

10.1016/j.btre.2014.09.002. Dostupné z: 83

vol.

4,

s.

86-93.

DOI:

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2215017X14000368 LAI, Jixiang, Huifang WANG, Donghui WANG, Fang FANG, Fengzhong WANG a Tao WU. Ultrasonic Extraction of Antioxidants from Chinese Sumac (Rhus typhina L.) Fruit Using Response Surface Methodology and Their Characterization. Molecules. 2014, vol. 19, issue 7, s. 9019-9032. DOI: 10.3390/molecules19079019. Dostupné z: http://www.mdpi.com/1420-3049/19/7/9019/htm LAN, Xi, Wenzhu WANG, Qiang LI, Jian WANG a Shih-Shun CHEN. The Natural Flavonoid

Pinocembrin:

Applications. Molecular

Molecular

Neurobiology.

Targets 2015.

and

DOI:

Potential 10.5772/33274.

Therapeutic Dostupné

z:http://link.springer.com/article/10.1007/s12035-015-9125-2#page-1 LIN, Fu-Hsiung, Jing-Yi LIN, Ravindra D GUPTA, Joshua A TOURNAS, James A BURCH, M Angelica SELIM, Nancy A MONTEIRO-RIVIERE, James M GRICHNIK, Jan ZIELINSKI a Sheldon R PINNELL. Ferulic Acid Stabilizes a Solution of Vitamins C and E and Doubles its Photoprotection of Skin. Journal of Investigative Dermatology. 2005, vol. 125, issue 4, s. 826-832. DOI: 10.1111/j.0022-202X.2005.23768.x. Dostupné z: http://www.nature.com/doifinder/10.1111/j.0022-202X.2005.23768.x LOU, Zaixiang, Hongxin WANG, Shengqi RAO, Juntao SUN, Chaoyang MA a Jing LI. P-Coumaric acid kills bacteria through dual damage mechanisms. Food Control. 2012, vol. 25, issue 2, s. 550-554. DOI: 10.1016/j.foodcont.2011.11.022. Dostupné z: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0956713511005044 MADER, Eric. Attracting native pollinators: protecting North America's bees and butterflies : the Xerces Society guide. North Adams, MA: Storey Pub., c2011, 371 s. ISBN 978-1-60342-695-4. MAJTAN, Juraj. Honey: An immunomodulator in wound healing. Wound Repair and Regeneration. 2014, vol. 22, issue 2, s. 187-192. DOI: 10.1111/wrr.12117. Dostupné z: http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/wrr.12117/abstract MAJTAN, Juraj, Ivana VALACHOVÁ, Marcela BUČEKOVÁ. Nové vědecké poznatky o včelím enzymu glokozooxidáza. Včelařství. 7/2014, roč. 67, č. 148. MARGHITAS, Liviu Alexandru, Daniel Severus DEZMIREAN, Cristina Bianca POCOL, Marioara ILEA, Otilia BOBIS a Iosif GERGEN. The Development of a 84

Biochemical Profile of Acacia Honey by Identifying Biochemical Determinants of its Quality. Notulae botanicae Horti Agrobotanici Cluj-Napoca. 2010, roč. 38, č. 2. Dostupné z: http://www.notulaebotanicae.ro/index.php/nbha/article/viewFile/4780/4516 MAYER, Alexander, Viliam SLEZAK, Peter TAKAC, Juraj OLEJNIK a Juraj MAJTAN. Treatment of non-healing leg ulcers with honeydew honey. Journal of Tissue Viability. 2014, vol. 23, issue 3, s. 94-97. DOI: 10.1016/j.jtv.2014.08.001. Dostupné z: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0965206X14000606 Med. 1. vyd. Překlad Kateřina Blahová. Praha: Sun, 2010, 79 s. Užitečné rady. ISBN 978-80-7371-342-3. MICHALKIEWICZ, Anna, Magdalena BIESAGA a Krystyna PYRZYNSKA. Solidphase extraction procedure for determination of phenolic acids and some flavonols in honey. Journal of Chromatography A. 2008, vol. 1187, 1-2, s. 18-24. DOI: 10.1016/j.chroma.2008.02.001. Dostupné z: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0021967308002173 MINEDŽAJAN, G a J RICHTER. Zázrak jménem propolis: léčení propolisem a jinými včelými produkty. 1.vyd. Bratislava: Ekokonzult, 2001, 115 s. ISBN 80-88809-97-5. MUSTAFA, Arwa a Charlotta TURNER. Pressurized liquid extraction as a green approach in food and herbal plants extraction: A review. Analytica Chimica Acta. 2011, vol.

703,

issue

1,

s.

8-18.

DOI:

10.1016/j.aca.2011.07.018.

Dostupné

z: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0003267011009597 NOLLET L. M . L., 2004, Handbook of food analysis: Methods and instruments in applied food analysis, díl 3. Marcel Dekker, New York, 1721-2226 s. ISBN 08247503813. NOVAK, Estela Maria, Martha Silveira e Costa SILVA, Maria Cristina MARCUCCI, Alexandra Christine Helena Franklan SAWAYA, Begoña GIMÉNEZ-CASSINA LÓPEZ, Maria Angela Henriques Zanella FORTES, Ricardo Rodrigues GIORGI, Kamila Tamie MARUMO, Rosangela Felipe RODRIGUES a Durvanei Augusto MARIA. Antitumoural activity of Brazilian red propolis fraction enriched with xanthochymol and formononetin: An in vitro and in vivo study. Journal of Functional

85

Foods. 2014, vol. 11, s. 91-102. DOI: 10.1016/j.jff.2014.09.008. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S1756464614002928 OREY, Cal. Zázračná síla medu. Vyd. 1. Praha: Ikar, 2012, 343 s. ISBN 978-80-2491932-4. PRADO, Edited by Mauricio A. Rostagno and Juliana M. Natural product extraction: principles and applications [online]. Cambridge, UK: RSC Pub, 2013 [cit. 2015-03-16]. ISBN 978-184-9736-060. Dostupné z: https://www.google.cz/books?hl=cs&lr=&id=GKqfELA7Nk8C&oi=fnd&pg=PA113&d q=Microwave+Assisted+Extraction&ots=51PWsW0r2b&sig=cUWW0Pl0wSaVNnKU 199OwjMvpI0&redir_esc=y#v=onepage&q=Microwave%20Assisted%20Extraction&f =false PRINCE, P. Stanely Mainzen a Abhro Jyoti ROY. P-Coumaric acid attenuates apoptosis in isoproterenol-induced myocardial infarcted rats by inhibiting oxidative stress. International Journal of Cardiology. 2013, vol. 168, issue 4, s. 3259-3266. DOI: 10.1016/j.ijcard.2013.04.138. Dostupné z: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0167527313007857 PRINCE, Ponnian Stanely Mainzen, Sundaresan RAJAKUMAR a Koothan DHANASEKAR. Protective effects of vanillic acid on electrocardiogram, lipid peroxidation,

antioxidants,

proinflammatory

markers

and

histopathology

in

isoproterenol induced cardiotoxic rats. European Journal of Pharmacology. 2011, vol. 668,

1-2,

s.

233-240.

DOI:

10.1016/j.ejphar.2011.06.053.

Dostupné

z: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S001429991100762X PŘIDAL, A. Aktuální problematika hodnocení a jakosti medu. [CD-ROM]. In Sborník příspěvků XXXVIII. Semináře o jakosti potravin a potravinových surovin - Ingrovy dny. s. 47--55. ISBN 978-80-7375-601-7. PŘIDAL, Antonín. Včelí produkty. Vyd. 1. Brno: Mendelova zemědělská a lesnická univerzita, 2003, 95 s. ISBN 80-7157-717-0. PŘIDAL, Antonín a Květoslav ČERMÁK. Včelařství. 1. vyd. Brno: Mendelova zemědělská a lesnická univerzita, 2005, 92 s. ISBN 80-7157-850-9.

86

PŘIDAL, Antonín. Vznik, získávání, zpracování a kontrola medu: odborný kurz : další vzdělávání pedagogických pracovníků Středních odborných škol. Brno: Mendelova univerzita v Brně, 2013, 89 s. ISBN 978-80-7375-737-3. PYRZYNSKA, Krystyna a Magdalena BIESAGA. Analysis of phenolic acids and flavonoids in honey. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 2009, vol. 28, issue 7, s. 893-902. DOI: 10.1016/j.trac.2009.03.015. Dostupné z: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0165993609001216 SABATIER, S., M.J. AMIOT, M. TACCHINI, S. AUBERT. Identification of Flavonoids in Sunflower Honey. Journal of Food Science. 1992, vol. 57, issue 3, s. 252303. DOI: 10.1007/978-3-7091-6181-4_11. Dostupné z: http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1365-2621.1992.tb08094.x/abstract SHILPI, Ahluwalia, U S a Sixun ZHANG. Supercritical CO2 Extraction of Compounds with Antioxidant Activity from Fruits and Vegetables Waste -A Review. Focusing on modern food industry. 2013, roč. 2, č. 1. Dostupné z: file:///C:/Users/aneta/Downloads/FMFI10021.pdf SILVA-CARVALHO, Ricardo, Vera MIRANDA-GONÇALVES, Ana Margarida FERREIRA, Susana M. CARDOSO, Abílio J.F.N. SOBRAL, Cristina ALMEIDAAGUIAR a Fátima BALTAZAR. Antitumoural and antiangiogenic activity of Portuguese propolis in in vitro and in vivo models. Journal of Functional Foods. 2014, vol. 11, s. 160-171. DOI: 10.1016/j.jff.2014.09.009. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S175646461400293X ŠVAMBERK, Václav. Záhadné včely: tajemný svět včel. 2. vyd. /. Líbeznice?: Víkend, 2003, 96 s. ISBN 80-7222-285-6. TANAKA, Takuji, Takahiro TANAKA a Mayu TANAKA. Potential Cancer Chemopreventive Activity of Protocatechuic Acid. Journal of Experimental. 2011, vol. 3, issue 1, s. 27-33. DOI: 10.1016/j.jecm.2010.12.005. Dostupné z: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1878331710000513 TITĚRA, Dalibor. Včelí produkty mýtů zbavené: med, vosk, pyl, mateří kašička, propolis, včelí jed. Vyd. 2. Praha: Brázda, 2013, 175 s., [24] s. obr. příl. ISBN 978-80209-0398-3. 87

VALENTOVÁ, Eva. Moderní separační metody. 2012, online [cit.2015-1-21] Dostupné z: http://www.chempoint.cz/moderni-separacni-metody VALÍČEK, Pavel. Med v tradiční čínské medicíně. Včelařství. 2014, roč. 67, s. 137. VESELÝ, Vladimír. Včelařství. Vyd. 3. Praha: Brázda, 2013, 270 s., [16] s. obr. příl. ISBN 978-80-209-0399-0. Vyhláška č. 76/2003 Sb. ze dne 6. března 2003, která stanovuje požadavky pro přírodní sladidla, med, cukrovinky, kakaový prášek a směsi kakaa s cukrem, čokoládu a čokoládové bonbony, ve znění vyhlášky č. 43/2005 Sb. Vyhláška nabyla účinnosti dne 1.

května

2004.

http://eagri.cz/public/web/mze/legislativa/pravni-predpisy-

mze/tematicky-prehled/Legislativa-MZe_uplna-zneni_vyhlaska-2003-76-potraviny.html WANG, Gui-Feng, Li-Ping SHI, Yu-Dan REN, Qun-Fang LIU, Hou-Fu LIU, Ru-Jun ZHANG, Zhuang LI, Feng-Hua ZHU, Pei-Lan HE, Wei TANG, Pei-Zhen TAO, Chuan LI, Wei-Min ZHAO, Jian-Ping ZUO, Jianping ZUO, Wei TANG a Yibin XU. Antihepatitis B virus activity of chlorogenic acid, quinic acid and caffeic acid in vivo and in vitro. Antiviral Research. 2009, vol. 83, issue 2, s. 607-613. DOI: 10.1016/b978-0-12409517-5.00068-1. Dostupné z: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0166354209003258 WEIß, Karl. Víkendový včelař: škola včelaření s nástavkovými úly. 2. vyd. Líbeznice: Víkend, 2010, 247 s. ISBN 978-80-7222-682-5. WEBSTER, G.R. Barrie. Soxhlet and Ultrasonic Extraction of Organics in Solids. Encyclopedia of Analytical Chemistry. Chichester, UK: John Wiley, 2006-0915. DOI: 10.1002/9780470027318.a0864. Dostupné z: http://doi.wiley.com/10.1002/9780470027318.a0864 YAO, Lihu, Nivedita DATTA, Francisco A TOMÁS-BARBERÁN, Federico FERRERES, Isabel MARTOS a Riantong SINGANUSONG. Flavonoids, phenolic acids and abscisic acid in Australian and New Zealand Leptospermum honeys.Food Chemistry. 2003, vol. 81, issue 2, s. 159-168. DOI: 10.1016/s0308-8146(02)00388-6. Dostupné z: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0308814602003886

88

ZWIR-FERENC, A a M BIZIUK. Solid Phase Extraction Technique – Trends, Opportunities and Applications. Polish journal of environmental studies. Olsztyn, Poland: HARD, 2006, roč. 15, č. 5. Dostupné z: file:///C:/Users/aneta/Downloads/33.pdf

89

27 SEZNAM TABULEK Tab. 1 Kalibrace na konkrétní koncentrace látek........................................................... 58 Tab. 2 Retenční časy, přechody, fragmentace a kolizní energie analyzovaných látek. . 59 Tab. 3 Průměrné hodnoty jednotlivých fenolových sloučenin v medech ...................... 60 Tab. 4 Statistické porovnání metod extrakce v akátovém medu 1................................. 62 Tab. 5 Statistické porovnání metod extrakce v řepkovém medu medu ......................... 63 Tab. 6 Statistické porovnání metod extrakce v medovicovém smíšeném medu............ 64 Tab. 7 Statistické porovnání metod extrakce v lipovém medu medu ............................ 65 Tab. 8 Statistické porovnání metod extrakce ve slunečnicovém medu medu................ 66 Tab. 9 Statistické porovnání metod extrakce v medovicovém borovicovém medu ...... 67 Tab. 10 Statistické porovnání metod extrakce v akátovém medu 2............................... 68 Tab. 11 Statistické porovnání metod extrakce v lesním květovém medu 2................... 69

90

28 SEZNAM ZKRATEK BBB

hematoencefalická bariéra (Blood Brain Barier)

CE

kapilární elektroforéza (Capillary Electrophoresis)

CO2

oxid uhličitý

DNA

deoxyribonukleová kyselina (Deoxyribonucleic Acid)

FTIR

infračervená spektrometrie (Fourier Transform Infrared)

GC

plynová chromatografie (Gas Chromatography)

GOX

enzym glukózooxidáza

GTX

alkaloid gephyrotoxin

GRAS

nezávadné (Generally Recognized as Safe)

HMF

hydroxymethylfurfural

HPLC

vysokoúčinná kapalinová chromatografie (High Performance Liquid Chromatography)

HSV

herpes simplex virus

LC

kapalinová chromatografie (Liquid Chromatography)

LLE

extrakce z kapaliny do kapaliny (Liquid-Liquid Extraction)

MAE

mikrovlnná extrakce (Microwave Assisted Extraction)

PHWE

extrakce horkou vodou pod tlakem (Pressurised Hot Water Extraction)

PLE

tlaková kapalinová extrakce (Pressurized Liquid Extraction)

ROS

reaktivní kyslíkaté částice (Reactive Oxygen Species)

SFE

nadkritická fluidní extrakce (Supercritical Fluid Extraction)

SPE

extrakce pevnou fází (Solid Phase Extraction)

TLC

chromatografie na tenké vrstvě (Thin-Layer Chromatography)

UAE

ultrazvuková extrakce (Ultrasonic Assisted Extraction)

U-HPLC

ultra účinná kapalinová chromatografie (Ultra High Performance Liquid Chromatography) 91

PŘÍLOHY

92

Tab. 1 Obsah 3,4-dihydroxybenzaldehydu v medech c1 c2 c3 sx2 sx c̅x 2 [µg/100g] [µg/100g] [µg/100g] [µg/100g] [µg /100g2] [µg/100g]

RSD [%]

AK 1 (LLE ETAC)

4,615

4,716

5,150

4,827

0,054

0,232

4,810

ŘEP (LLE ETAC)

7,625

7,533

8,113

7,757

0,065

0,255

3,282

MED (LLE ETAC)

10,369

9,550

10,449

10,122

0,165

0,406

4,013

LIP (LLE ETAC)

9,263

9,655

9,192

9,370

0,042

0,204

2,176

SLUN (LLE ETAC)

3,654

4,046

3,816

3,839

0,026

0,161

4,183

BOR (LLE ETAC)

6,758

6,950

6,524

6,744

0,030

0,174

2,581

AK 2 (LLE ETAC)

3,651

4,054

3,650

3,785

0,036

0,190

5,024

LK (LLE ETAC)

7,329

6,829

7,329

7,162

0,056

0,236

3,290

AK 1 (SPE ETHER)

4,834

5,020

4,752

4,869

0,013

0,112

2,302

ŘEP (SPE ETHER)

2,827

3,010

2,815

2,884

0,008

0,090

3,105

MED (SPE ETHER)

5,204

5,309

5,110

5,208

0,007

0,081

1,557

LIP (SPE ETHER)

8,789

9,312

8,824

8,975

0,057

0,239

2,662

SLUN (SPE ETHER)

3,496

3,650

3,525

3,557

0,004

0,067

1,878

BOR (SPE ETHER)

5,146

4,894

5,350

5,130

0,035

0,186

3,635

AK (SPE ETHER)

2,810

3,017

2,801

2,876

0,010

0,100

3,466

LK (SPE ETHER)

6,917

6,913

7,312

7,047

0,035

0,187

2,659

AK 1 (LLE ETHER)

3,254

3,250

2,981

3,162

0,016

0,128

4,049

ŘEP (LLE ETHER)

2,016

2,116

1,926

2,019

0,006

0,078

3,844

MED (LLE ETHER)

3,922

3,725

4,003

3,883

0,014

0,116

2,995

LIP (LLE ETHER)

7,129

7,504

7,025

7,220

0,042

0,206

2,849

SLUN (LLE ETHER)

2,640

2,756

2,615

2,670

0,004

0,061

2,302

BOR (LLE ETHER)

4,118

3,951

4,130

4,066

0,007

0,082

2,005

AK 2 (LLE ETHER)

1,418

1,501

1,421

1,447

0,001

0,039

2,661

LK (LLE ETHER)

4,751

4,982

4,824

4,852

0,009

0,096

1,986

AK 1 (SPE ETAC)

5,103

5,124

4,803

5,010

0,022

0,147

2,928

ŘEP (SPE ETAC)

3,846

3,913

3,692

3,817

0,009

0,092

2,420

MED (SPE ETAC)

9,569

10,639

9,601

9,936

0,247

0,497

5,003

LIP(SPE ETAC)

8,857

8,913

9,481

9,084

0,080

0,282

3,106

SLUN (SPE ETAC)

5,850

5,843

5,293

5,662

0,068

0,261

4,604

BOR (SPE ETAC)

7,027

7,001

6,725

6,917

0,019

0,137

1,978

AK 2 (SPE ETAC)

4,412

4,383

4,616

4,470

0,011

0,104

2,318

LK (SPE ETAC)

9,225

9,026

8,792

9,015

0,031

0,177

1,962

93

Tab. 2 Obsah kyseliny kávové v medech c̅x c2 c3 sx2 sx c1 2 [µg/100g] [µg/100g] [µg/100g] [μg/100g] [µg /100g2] [µg/100g]

RSD [%]

AK 1 (LLE ETAC)

119,215

125,339

119,406

121,320

8,083

2,843

2,343

ŘEP (LLE ETAC)

115,258

103,425

115,258

111,314

31,117

5,578

5,011

MED (LLE ETAC)

62,619

61,990

68,618

64,409

8,925

2,988

4,638

LIP (LLE ETAC)

257,395

264,009

250,951

257,452

28,422

5,331

2,071

SLUN (LLE ETAC)

344,854

355,849

334,894

345,199

73,243

8,558

2,479

BOR (LLE ETAC)

135,824

141,982

136,047

137,951

8,132

2,852

2,067

AK 2 (LLE ETAC)

53,118

54,250

55,102

54,157

0,660

0,813

1,500

LK (LLE ETAC)

45,381

46,579

43,302

45,087

1,832

1,354

3,002

AK 1 (SPE ETHER)

46,166

46,402

50,100

47,556

3,245

1,801

3,788

ŘEP (SPE ETHER)

38,091

40,220

38,100

38,804

1,003

1,001

2,581

MED (SPE ETHER)

27,661

30,720

27,792

28,724

1,995

1,412

4,917

LIP (SPE ETHER)

122,443

129,725

120,426

124,198

15,955

3,994

3,216

SLUN (SPE ETHER)

131,829

129,010

138,720

133,186

16,636

4,079

3,062

BOR (SPE ETHER)

88,702

85,727

88,801

87,743

2,035

1,426

1,626

AK (SPE ETHER)

14,646

15,013

14,186

14,615

0,114

0,338

2,315

LK (SPE ETHER)

20,996

19,854

21,001

20,617

0,291

0,539

2,616

AK 1 (LLE ETHER)

76,595

79,901

76,602

77,700

2,423

1,557

2,003

ŘEP (LLE ETHER)

49,943

49,325

51,813

50,360

1,118

1,057

2,099

MED (LLE ETHER)

31,640

30,142

30,224

30,669

0,473

0,688

2,243

LIP (LLE ETHER)

133,229

139,859

130,110

134,399

16,524

4,065

3,025

SLUN (LLE ETHER)

194,588

205,725

194,700

198,338

27,289

5,224

2,634

BOR (LLE ETHER)

74,370

74,425

80,926

76,573

9,472

3,078

4,019

AK 2 (LLE ETHER)

17,456

16,943

16,190

16,863

0,270

0,520

3,082

LK (LLE ETHER)

16,529

17,322

16,459

16,770

0,153

0,391

2,334

AK 1 (SPE ETAC)

135,690

140,979

135,021

137,230

7,103

2,665

1,942

ŘEP (SPE ETAC)

136,903

133,121

140,392

136,805

8,817

2,969

2,171

MED (SPE ETAC)

82,365

80,046

78,401

80,271

2,644

1,626

2,026

LIP(SPE ETAC)

290,236

295,032

304,900

296,723

37,270

6,105

2,057

SLUN (SPE ETAC)

382,146

410,156

382,103

391,468

174,617

13,214

3,376

BOR (SPE ETAC)

140,215

145,512

138,155

141,294

9,604

3,099

2,193

AK 2 (SPE ETAC)

58,974

61,922

59,005

59,967

1,910

1,382

2,305

LK (SPE ETAC)

46,603

50,696

46,613

47,970

3,714

1,927

4,017

94

Tab. 3 Obsah kyseliny chlorogenová v medech c1 c2 c3 sx2 sx c̅x 2 [µg/100] [µg/100g] [µg/100g] [µg/100g] [µg /100g2] [µg/100g]

RSD [%]

AK 1 (LLE ETAC)

5,278

5,313

5,550

5,380

0,015

0,121

2,244

ŘEP (LLE ETAC)

25,347

24,501

26,294

25,381

0,536

0,732

2,886

MED (LLE ETAC)

48,059

50,122

47,920

48,700

1,014

1,007

2,068

LIP (LLE ETAC)

10,983

11,457

11,046

11,162

0,044

0,210

1,882

SLUN (LLE ETAC)

30,418

27,982

30,752

29,718

1,524

1,234

4,154

BOR (LLE ETAC)

17,158

16,236

16,857

16,750

0,147

0,384

2,290

AK 2 (LLE ETAC)

8,489

9,121

8,525

8,712

0,084

0,290

3,328

LK (LLE ETAC)

11,433

11,596

11,045

11,358

0,053

0,231

2,033

AK 1 (SPE ETHER)

2,633

2,911

2,594

2,713

0,020

0,141

5,204

ŘEP (SPE ETHER)

2,774

2,742

2,914

2,810

0,006

0,075

2,657

MED (SPE ETHER)

3,576

3,799

3,614

3,663

0,009

0,097

2,650

LIP (SPE ETHER)

7,100

6,921

7,300

7,107

0,024

0,155

2,178

SLUN (SPE ETHER)

2,988

2,923

3,098

3,003

0,005

0,072

2,410

BOR (SPE ETHER)

3,132

2,906

3,146

3,061

0,012

0,110

3,592

AK (SPE ETHER)

2,703

2,755

2,605

2,687

0,004

0,062

2,317

LK (SPE ETHER)

5,600

5,597

5,853

5,683

0,014

0,120

2,111

AK 1 (LLE ETHER)

2,490

2,598

2,546

2,545

0,002

0,044

1,741

ŘEP (LLE ETHER)

11,500

11,700

12,200

11,800

0,087

0,294

2,495

MED (LLE ETHER)

2,484

2,721

2,546

2,584

0,010

0,101

3,893

LIP (LLE ETHER)

2,490

2,497

2,602

2,530

0,003

0,051

2,031

SLUN (LLE ETHER)

2,831

3,024

2,841

2,899

0,008

0,089

3,070

BOR (LLE ETHER)

4,581

4,662

4,799

4,681

0,008

0,090

1,923

AK 2 (LLE ETHER)

5,200

5,200

4,940

5,113

0,015

0,123

2,397

LK (LLE ETHER)

9,800

10,122

10,484

10,135

0,078

0,279

2,757

AK 1 (SPE ETAC)

4,257

3,913

4,295

4,155

0,030

0,172

4,142

ŘEP (SPE ETAC)

25,690

26,912

26,692

26,431

0,283

0,532

2,013

MED (SPE ETAC)

49,902

51,994

49,792

50,563

1,026

1,013

2,003

LIP(SPE ETAC)

12,985

11,995

13,099

12,693

0,245

0,495

3,902

SLUN (SPE ETAC)

35,201

36,892

36,599

36,231

0,544

0,738

2,036

BOR (SPE ETAC)

18,055

17,925

17,191

17,724

0,145

0,380

2,146

AK 2 (SPE ETAC)

8,852

8,105

9,147

8,701

0,193

0,439

5,043

LK (SPE ETAC)

12,458

13,501

12,570

12,843

0,219

0,468

3,642

95

Tab. 4 Obsah kyseliny ferulové v medech c1 c2 c3 sx2 sx c̅x 2 [µg/100g] [µg/100g] [µg/100g] [µg/100g] [µg /100g2] [µg/100g]

RSD [%]

AK 1 (LLE ETAC)

54,897

55,610

53,142

54,550

1,075

1,037

1,901

ŘEP (LLE ETAC)

130,263

135,197

129,015

131,492

7,125

2,669

2,030

MED (LLE ETAC)

29,573

30,930

29,401

29,968

0,468

0,684

2,282

LIP (LLE ETAC)

18,700

19,025

19,699

19,141

0,173

0,416

2,172

SLUN (LLE ETAC)

12,275

12,346

13,452

12,691

0,290

0,539

4,244

BOR (LLE ETAC)

16,095

15,301

16,450

15,949

0,231

0,480

3,011

AK 2 (LLE ETAC)

13,362

12,456

12,982

12,933

0,138

0,371

2,870

LK (LLE ETAC)

38,925

38,921

40,712

39,519

0,711

0,843

2,134

AK 1 (SPE ETHER)

138,307

143,945

137,149

139,800

8,814

2,969

2,124

ŘEP (SPE ETHER)

280,671

269,050

268,812

272,844

30,637

5,535

2,029

MED (SPE ETHER)

261,894

269,716

255,150

262,253

35,425

5,952

2,270

LIP (SPE ETHER)

188,766

194,056

179,013

187,278

38,826

6,231

3,327

SLUN (SPE ETHER)

102,242

98,570

97,155

99,322

4,596

2,144

2,158

BOR (SPE ETHER)

91,212

87,546

90,055

89,604

2,341

1,530

1,708

AK (SPE ETHER)

91,123

88,146

93,098

90,789

4,144

2,036

2,242

LK (SPE ETHER)

46,178

40,932

45,762

44,291

5,669

2,381

5,376

AK 1 (LLE ETHER)

78,299

76,011

79,896

78,069

2,542

1,594

2,042

ŘEP (LLE ETHER)

150,758

148,063

155,890

151,570

10,540

3,247

2,142

MED (LLE ETHER)

152,051

147,102

144,345

147,833

10,164

3,188

2,157

LIP (LLE ETHER)

110,792

107,024

112,993

110,269

6,075

2,465

2,235

SLUN (LLE ETHER)

69,649

68,952

73,842

70,814

4,665

2,160

3,050

BOR (LLE ETHER)

36,232

33,942

36,901

35,692

1,605

1,267

3,549

AK 2 (LLE ETHER)

47,331

50,393

47,320

48,348

2,090

1,446

2,990

LK (LLE ETHER)

27,518

27,569

30,521

28,536

1,971

1,404

4,920

AK 1 (SPE ETAC)

160,590

156,597

164,746

160,644

11,069

3,327

2,071

ŘEP (SPE ETAC)

305,690

278,255

289,713

291,219

126,582

11,251

3,863

MED (SPE ETAC)

300,588

301,055

275,011

292,218

148,072

12,168

4,164

LIP(SPE ETAC)

242,507

240,698

231,489

238,232

23,274

4,824

2,025

SLUN (SPE ETAC)

132,568

136,014

128,919

132,500

8,391

2,897

2,186

BOR (SPE ETAC)

105,690

101,692

107,090

104,824

5,230

2,287

2,182

AK 2 (SPE ETAC)

123,698

124,096

116,098

121,297

13,541

3,680

3,034

LK (SPE ETAC)

68,925

72,123

68,884

69,978

2,302

1,517

2,168

96

Tab. 5 Obsah kyseliny gallové v medech c1 c2 c3 sx2 sx c̅x 2 [µg/100g] [µg/100g] [µg/100g] [µg/100g] [µg /100g2] [µg/100g]

RSD [%]

AK 1 (LLE ETAC)

1,054

1,037

1,102

1,064

0,001

0,028

2,610

ŘEP (LLE ETAC)

5,157

5,042

5,247

5,149

0,007

0,084

1,623

MED (LLE ETAC)

30,513

31,505

30,012

30,677

0,385

0,620

2,023

LIP (LLE ETAC)

4,592

4,721

4,494

4,602

0,009

0,093

2,025

SLUN (LLE ETAC)

6,104

6,125

6,395

6,208

0,018

0,133

2,136

BOR (LLE ETAC)

76,139

79,246

74,098

76,494

4,479

2,116

2,767

AK 2 (LLE ETAC)

1,632

1,594

1,497

1,574

0,003

0,057

3,616

LK (LLE ETAC)

26,783

28,087

26,112

26,994

0,672

0,820

3,036

AK 1 (SPE ETHER)

4,123

3,910

4,118

4,050

0,010

0,099

2,452

ŘEP (SPE ETHER)

2,414

2,676

2,615

2,568

0,012

0,112

4,349

MED (SPE ETHER)

12,045

11,506

12,050

11,867

0,065

0,255

2,151

LIP (SPE ETHER)

3,596

3,552

3,824

3,657

0,014

0,119

3,255

SLUN (SPE ETHER)

3,345

3,150

3,350

3,281

0,009

0,093

2,842

BOR (SPE ETHER)

43,216

43,399

40,916

42,510

1,276

1,130

2,657

AK (SPE ETHER)

1,333

1,350

1,285

1,322

0,001

0,028

2,085

LK (SPE ETHER)

14,380

13,674

14,039

14,031

0,083

0,289

2,056

AK 1 (LLE ETHER)

2,572

2,814

2,596

2,661

0,012

0,109

4,097

ŘEP (LLE ETHER)

2,169

2,190

2,350

2,236

0,007

0,081

3,619

MED (LLE ETHER)

4,622

4,342

4,566

4,510

0,015

0,121

2,685

LIP (LLE ETHER)

1,864

1,916

2,050

1,943

0,006

0,078

4,018

SLUN (LLE ETHER)

4,270

4,276

4,447

4,331

0,007

0,082

1,895

BOR (LLE ETHER)

8,325

8,690

8,285

8,434

0,033

0,182

2,158

AK 2 (LLE ETHER)

1,311

1,399

1,346

1,352

0,001

0,036

2,664

LK (LLE ETHER)

3,733

3,572

3,750

3,685

0,006

0,080

2,171

AK 1 (SPE ETAC)

5,237

4,854

5,194

5,095

0,029

0,171

3,364

ŘEP (SPE ETAC)

3,357

3,375

3,541

3,424

0,007

0,083

2,423

MED (SPE ETAC)

10,236

9,904

10,399

10,180

0,042

0,206

2,020

LIP(SPE ETAC)

3,256

3,382

3,195

3,278

0,006

0,078

2,381

SLUN (SPE ETAC)

3,226

3,217

3,399

3,280

0,007

0,084

2,551

BOR (SPE ETAC)

59,848

61,812

57,233

59,631

3,519

1,876

3,146

AK 2 (SPE ETAC)

1,956

1,902

2,050

1,969

0,004

0,061

3,091

LK (SPE ETAC)

29,598

30,715

27,642

29,318

1,613

1,270

4,332

97

Tab. 6 Obsah kyseliny p-kumarové v medech c1 sx2 c2 c3 sx c̅x 2 [µg/100g] [µg/100g] [µg/100g] [µg/100g] [µg /100g2] [µg/100g]

RSD [%]

AK 1 (LLE ETAC)

288,241

290,898

276,045

285,061

41,819

6,467

2,269

ŘEP (LLE ETAC)

760,065

781,096

742,346

761,169

250,870

15,839

2,081

MED (LLE ETAC)

630,710

633,631

607,120

623,820

140,878

11,869

1,903

LIP (LLE ETAC)

782,934

810,015

771,802

788,250

257,493

16,047

2,036

SLUN (LLE ETAC)

392,700

410,715

390,942

398,119

79,846

8,936

2,244

BOR (LLE ETAC)

158,411

158,372

171,416

162,733

37,697

6,140

3,773

AK 2 (LLE ETAC)

196,998

187,105

194,991

193,031

18,232

4,270

2,212

LK (LLE ETAC)

157,869

162,964

155,112

158,648

10,578

3,252

2,050

AK 1 (SPE ETHER)

275,411

281,025

264,422

273,619

47,549

6,896

2,520

ŘEP (SPE ETHER)

673,200

713,990

667,210

684,800

432,000

20,785

3,035

MED (SPE ETHER)

568,429

562,430

583,956

571,605

82,273

9,070

1,587

LIP (SPE ETHER)

591,288

619,106

592,350

600,914

165,650

12,871

2,142

SLUN (SPE ETHER)

292,443

309,945

296,341

299,576

56,288

7,503

2,504

BOR (SPE ETHER)

187,493

180,496

189,424

185,804

14,711

3,836

2,064

AK (SPE ETHER)

192,438

191,601

206,301

196,780

45,444

6,741

3,426

LK (SPE ETHER)

138,158

142,346

135,152

138,552

8,701

2,950

2,129

AK 1 (LLE ETHER)

160,331

154,298

162,549

159,059

12,157

3,487

2,192

ŘEP (LLE ETHER)

380,858

403,046

373,867

385,924

154,736

12,439

3,223

MED (LLE ETHER)

393,377

381,126

402,361

392,288

75,749

8,703

2,219

LIP (LLE ETHER)

526,425

547,102

521,412

531,647

123,630

11,119

2,091

SLUN (LLE ETHER)

253,522

249,393

262,492

255,136

29,902

5,468

2,143

BOR (LLE ETHER)

97,414

100,372

95,301

97,696

4,325

2,080

2,129

AK 2 (LLE ETHER)

121,449

120,376

131,508

124,444

25,138

5,014

4,029

LK (LLE ETHER)

98,716

93,812

98,764

97,097

5,397

2,323

2,393

AK 1 (SPE ETAC)

356,897

386,891

357,015

366,934

199,139

14,112

3,846

ŘEP (SPE ETAC)

865,498

860,015

901,981

875,831

346,915

18,626

2,127

MED (SPE ETAC)

702,346

684,105

659,298

681,916

311,256

17,642

2,587

LIP(SPE ETAC)

845,203

853,215

889,208

862,542

366,247

19,138

2,219

SLUN (SPE ETAC)

463,549

456,419

497,608

472,526

323,048

17,974

3,804

BOR (SPE ETAC)

256,795

237,812

249,902

248,170

61,558

7,846

3,162

AK 2 (SPE ETAC)

269,713

284,643

267,143

273,833

59,529

7,715

2,818

LK (SPE ETAC)

203,459

189,565

201,492

198,172

37,686

6,139

3,098

98

Tab. 7 Obsah p-hydroxybenzaldehydu v medech c1 c2 c3 sx2 sx c̅x 2 [µg/100g] [µg/100g] [µg/100g] [µg/100g] [µg /100g2] [µg/100g]

RSD [%]

AK 1 (LLE ETAC)

4,641

4,592

4,352

4,528

0,016

0,126

2,785

ŘEP (LLE ETAC)

3,702

3,692

4,030

3,808

0,025

0,157

4,117

MED (LLE ETAC)

7,037

7,147

6,742

6,975

0,029

0,171

2,449

LIP (LLE ETAC)

8,082

7,994

8,392

8,156

0,029

0,171

2,093

SLUN (LLE ETAC)

3,550

3,423

3,645

3,539

0,008

0,091

2,567

BOR (LLE ETAC)

2,671

2,550

2,682

2,634

0,004

0,060

2,275

AK 2 (LLE ETAC)

2,135

1,987

2,150

2,091

0,005

0,074

3,518

LK (LLE ETAC)

3,554

3,396

3,646

3,532

0,011

0,103

2,924

AK 1 (SPE ETHER)

134,690

127,720

131,079

131,163

8,099

2,846

2,170

ŘEP (SPE ETHER)

176,453

181,614

172,350

176,806

14,366

3,790

2,144

MED (SPE ETHER)

149,912

169,147

149,823

156,294

82,603

9,089

5,815

LIP (SPE ETHER)

119,661

115,756

124,672

120,030

13,316

3,649

3,040

SLUN (SPE ETHER)

284,073

302,598

283,976

290,216

76,668

8,756

3,017

BOR (SPE ETHER)

387,789

388,046

401,802

392,546

42,849

6,546

1,668

AK (SPE ETHER)

82,352

88,413

83,310

84,692

7,078

2,660

3,141

LK (SPE ETHER)

131,620

136,046

128,602

132,089

9,345

3,057

2,314

AK 1 (LLE ETHER)

75,024

78,627

74,992

76,214

2,910

1,706

2,238

ŘEP (LLE ETHER)

87,157

85,427

91,201

87,928

5,855

2,420

2,752

MED (LLE ETHER)

88,840

89,011

92,801

90,218

3,342

1,828

2,026

LIP (LLE ETHER)

73,412

70,143

73,398

72,318

2,365

1,538

2,127

SLUN (LLE ETHER)

201,480

197,655

179,093

192,743

95,593

9,777

5,073

BOR (LLE ETHER)

214,819

219,019

206,797

213,545

25,707

5,070

2,374

AK 2 (LLE ETHER)

37,292

40,356

36,295

37,981

2,987

1,728

4,551

LK (LLE ETHER)

70,365

70,413

70,496

70,425

0,003

0,054

0,077

AK 1 (SPE ETAC)

156,897

162,011

154,112

157,673

10,698

3,271

2,074

ŘEP (SPE ETAC)

202,350

187,499

201,246

197,031

45,641

6,756

3,429

MED (SPE ETAC)

189,475

191,702

182,502

187,893

15,358

3,919

2,086

LIP(SPE ETAC)

153,620

161,598

158,602

157,940

10,826

3,290

2,083

SLUN (SPE ETAC)

323,459

319,795

335,501

326,252

45,015

6,709

2,056

BOR (SPE ETAC)

433,558

450,650

428,702

437,637

88,601

9,413

2,151

AK 2 (SPE ETAC)

104,590

114,702

107,592

108,961

17,981

4,240

3,892

LK (SPE ETAC)

123,559

128,679

121,556

124,598

8,995

2,999

2,407

99

Tab. 8 Obsah kyseliny p-hydroxybenzoové c1 sx2 c2 c3 sx c̅x 2 [µg/100g] [µg/100g] [µg/100g] [µg/100g] [µg /100g2] [µg/100g]

RSD [%]

AK 1 (LLE ETAC)

13,473

14,148

13,751

13,791

0,077

0,277

2,009

ŘEP (LLE ETAC)

22,180

21,975

20,436

21,531

0,606

0,778

3,615

MED (LLE ETAC)

11,258

11,824

10,934

11,339

0,135

0,367

3,241

LIP (LLE ETAC)

16,888

17,126

17,622

17,212

0,093

0,305

1,775

SLUN (LLE ETAC)

12,351

12,757

12,103

12,403

0,073

0,270

2,175

BOR (LLE ETAC)

11,537

12,223

11,678

11,813

0,088

0,296

2,505

AK 2 (LLE ETAC)

6,016

5,721

6,125

5,954

0,029

0,170

2,862

LK (LLE ETAC)

16,894

17,413

16,523

16,943

0,133

0,365

2,153

AK 1 (SPE ETHER)

134,690

138,421

131,021

134,711

9,127

3,021

2,243

ŘEP (SPE ETHER)

176,453

180,326

173,021

176,600

8,903

2,984

1,690

MED (SPE ETHER)

149,912

152,470

144,322

148,901

11,577

3,402

2,285

LIP (SPE ETHER)

119,661

110,236

111,658

113,852

17,212

4,149

3,644

SLUN (SPE ETHER)

284,073

301,255

273,365

286,231

131,971

11,488

4,014

BOR (SPE ETHER)

387,789

361,255

400,242

383,096

264,353

16,259

4,244

AK (SPE ETHER)

82,352

86,154

79,875

82,794

6,669

2,582

3,119

LK (SPE ETHER)

131,620

128,232

135,022

131,624

7,684

2,772

2,106

AK 1 (LLE ETHER)

75,024

72,462

76,313

74,600

2,561

1,600

2,145

ŘEP (LLE ETHER)

87,157

87,322

91,113

88,530

3,338

1,827

2,064

MED (LLE ETHER)

88,840

91,045

86,613

88,833

3,275

1,810

2,037

LIP (LLE ETHER)

73,412

72,096

69,627

71,711

2,462

1,569

2,188

SLUN (LLE ETHER)

201,480

189,012

204,546

198,346

45,125

6,718

3,387

BOR (LLE ETHER)

214,819

210,923

221,856

215,866

20,469

4,524

2,096

AK 2 (LLE ETHER)

37,292

37,621

41,024

38,646

2,845

1,687

4,365

LK (LLE ETHER)

70,365

72,562

69,112

70,680

2,033

1,426

2,017

AK 1 (SPE ETAC)

152,649

150,215

158,024

153,629

10,642

3,262

2,123

ŘEP (SPE ETAC)

203,565

198,272

179,256

193,698

108,944

10,438

5,389

MED (SPE ETAC)

164,578

170,352

161,253

165,394

14,131

3,759

2,273

LIP(SPE ETAC)

123,459

120,322

129,836

124,539

15,668

3,958

3,178

SLUN (SPE ETAC)

279,521

300,125

268,235

282,627

174,322

13,203

4,672

BOR (SPE ETAC)

394,528

407,265

385,235

395,676

81,546

9,030

2,282

AK 2 (SPE ETAC)

75,148

74,752

79,255

76,385

4,144

2,036

2,665

LK (SPE ETAC)

112,355

109,326

117,155

112,945

10,390

3,223

2,854

100

Tab. 9 Obsah kyseliny protokatechové c1 c2 c3 sx2 sx c̅x 2 [µg/100g] [µg/100g] [µg/100g] [µg/100g] [µg /100g2] [µg/100g]

RSD [%]

AK 1 (LLE ETAC)

6,937

7,345

6,721

7,001

0,067

0,259

3,695

ŘEP (LLE ETAC)

58,764

57,013

62,311

59,362

4,857

2,204

3,713

MED (LLE ETAC)

379,031

398,201

361,256

379,496

227,595

15,086

3,975

LIP (LLE ETAC)

138,190

133,320

131,255

134,255

8,452

2,907

2,165

SLUN (LLE ETAC)

28,166

27,823

31,015

29,002

2,048

1,431

4,934

BOR (LLE ETAC)

525,747

539,915

519,010

528,224

75,907

8,712

1,649

AK 2 (LLE ETAC)

5,339

5,024

5,699

5,354

0,076

0,276

5,151

LK (LLE ETAC)

261,184

253,327

248,021

254,177

29,240

5,407

2,127

AK 1 (SPE ETHER)

14,859

15,231

14,202

14,764

0,181

0,426

2,884

ŘEP (SPE ETHER)

43,696

44,985

41,124

43,268

2,577

1,605

3,710

MED (SPE ETHER)

431,403

431,313

413,036

425,251

74,601

8,637

2,031

LIP (SPE ETHER)

158,650

161,230

153,020

157,633

11,751

3,428

2,175

SLUN (SPE ETHER)

26,466

29,125

26,320

27,304

1,663

1,290

4,723

BOR (SPE ETHER)

644,870

620,235

618,326

627,810

146,125

12,088

1,925

AK (SPE ETHER)

9,007

9,022

10,083

9,371

0,254

0,504

5,378

LK (SPE ETHER)

268,782

272,232

282,026

274,347

31,469

5,610

2,045

AK 1 (LLE ETHER)

13,237

14,203

12,895

13,445

0,307

0,554

4,119

ŘEP (LLE ETHER)

32,984

32,626

31,326

32,312

0,507

0,712

2,203

MED (LLE ETHER)

185,455

201,326

186,322

191,034

53,085

7,286

3,814

LIP (LLE ETHER)

69,651

70,326

75,213

71,730

6,142

2,478

3,455

SLUN (LLE ETHER)

24,925

23,712

24,549

24,396

0,257

0,507

2,078

BOR (LLE ETHER)

244,794

235,325

234,214

238,111

22,535

4,747

1,994

AK 2 (LLE ETHER)

4,749

5,120

4,619

4,829

0,045

0,213

4,401

LK (LLE ETHER)

83,506

80,215

78,365

80,695

4,519

2,126

2,634

AK 1 (SPE ETAC)

14,524

14,013

13,457

13,998

0,190

0,436

3,112

ŘEP (SPE ETAC)

56,722

60,125

59,325

58,724

2,110

1,453

2,474

MED (SPE ETAC)

433,649

419,149

421,286

424,695

40,851

6,391

1,505

LIP(SPE ETAC)

162,315

160,459

154,327

159,033

11,652

3,413

2,146

SLUN (SPE ETAC)

32,690

33,560

30,120

32,123

2,133

1,460

4,546

BOR (SPE ETAC)

687,457

684,132

715,236

695,608

194,459

13,945

2,005

AK 2 (SPE ETAC) LK (SPE ETAC)

8,525

8,021

8,352

8,299

0,044

0,209

2,516

301,246

294,565

310,214

302,008

41,102

6,411

2,123

101

Tab. 10 Obsah kyseliny salicylové v medech c1 c2 c3 c̅x [µg/100g] [µg/100g] [µg/100g] [µg/100g]

sx2 sx µg /100g2] [µg/100g] 2

RSD [%]

AK 1 (LLE ETAC)

15,991

14,215

15,986

15,398

0,699

0,836

5,429

ŘEP (LLE ETAC)

24,023

22,315

23,549

23,296

0,518

0,720

3,090

MED (LLE ETAC)

207,785

201,166

210,255

206,402

14,726

3,837

1,859

LIP (LLE ETAC)

37,848

35,216

35,216

36,093

1,539

1,241

3,437

SLUN (LLE ETAC)

41,578

39,215

39,215

40,003

1,240

1,113

2,784

BOR (LLE ETAC)

137,038

139,360

144,121

140,173

8,691

2,948

2,103

AK 2 (LLE ETAC)

27,382

28,255

26,301

27,313

0,638

0,799

2,925

LK (LLE ETAC)

495,197

515,236

518,321

509,585

105,086

10,251

2,012

AK 1 (SPE ETHER)

52,549

53,022

55,213

53,595

1,347

1,161

2,165

ŘEP (SPE ETHER)

31,999

29,133

29,101

30,078

1,846

1,359

4,518

MED (SPE ETHER)

161,963

169,356

167,326

166,215

9,727

3,119

1,876

LIP (SPE ETHER)

33,378

32,013

36,125

33,839

2,925

1,710

5,054

SLUN (SPE ETHER)

25,918

27,215

26,133

26,422

0,322

0,568

2,148

BOR (SPE ETHER)

92,911

90,246

88,232

90,463

3,673

1,917

2,119

AK (SPE ETHER)

14,910

16,235

15,956

15,701

0,326

0,571

3,635

LK (SPE ETHER)

329,145

331,201

312,132

324,159

73,034

8,546

2,636

AK 1 (LLE ETHER)

18,289

20,156

19,310

19,252

0,583

0,764

3,967

ŘEP (LLE ETHER)

23,026

21,932

22,902

22,620

0,240

0,490

2,164

MED (LLE ETHER)

117,007

114,222

125,566

118,931

23,300

4,827

4,059

LIP (LLE ETHER)

20,443

21,659

21,486

21,196

0,288

0,537

2,533

SLUN (LLE ETHER)

20,613

21,232

22,022

21,289

0,332

0,576

2,707

BOR (LLE ETHER)

46,384

50,021

47,202

47,869

2,428

1,558

3,255

AK 2 (LLE ETHER)

10,475

9,947

9,533

9,985

0,149

0,386

3,862

LK (LLE ETHER)

231,717

242,932

234,022

236,224

23,390

4,836

2,047

AK 1 (SPE ETAC)

65,795

70,214

64,232

66,747

6,417

2,533

3,795

ŘEP (SPE ETAC)

56,324

60,218

55,621

57,388

4,088

2,022

3,523

MED (SPE ETAC)

188,521

195,021

185,213

189,585

16,599

4,074

2,149

LIP(SPE ETAC)

42,565

39,239

40,213

40,672

1,949

1,396

3,432

SLUN (SPE ETAC)

32,548

31,215

31,101

31,621

0,431

0,657

2,076

BOR (SPE ETAC)

102,469

101,282

107,123

103,625

6,354

2,521

2,433

AK 2 (SPE ETAC)

56,490

60,014

54,325

56,943

5,497

2,345

4,117

LK (SPE ETAC)

521,224

541,231

497,785

520,080

315,258

17,756

3,414

102

Tab. 11 Obsah kyseliny sinapové v medech c1 c2 c3 sx2 sx c̅x 2 [µg/100g] [µg/100g] [µg/100g] [µg/100g] [µg /100g2] [µg/100g]

RSD [%]

AK 1 (LLE ETAC)

2,186

1,985

2,085

2,085

0,007

0,082

3,943

ŘEP (LLE ETAC)

2,631

2,813

2,756

2,733

0,006

0,076

2,780

MED (LLE ETAC)

2,532

2,487

2,406

2,475

0,003

0,052

2,105

LIP (LLE ETAC)

2,243

2,185

2,012

2,147

0,010

0,098

4,562

SLUN (LLE ETAC)

5,638

5,985

6,012

5,878

0,029

0,171

2,903

BOR (LLE ETAC)

1,409

1,421

1,357

1,396

0,001

0,028

2,003

AK 2 (LLE ETAC)

4,005

4,198

3,988

4,064

0,009

0,096

2,352

LK (LLE ETAC)

1,441

1,423

1,340

1,402

0,002

0,044

3,136

AK 1 (SPE ETHER)

6,605

6,456

6,222

6,427

0,025

0,158

2,454

ŘEP (SPE ETHER)

5,528

5,612

5,313

5,484

0,016

0,126

2,301

MED (SPE ETHER)

3,610

3,856

4,021

3,829

0,029

0,169

4,419

LIP (SPE ETHER)

2,150

2,266

2,199

2,205

0,002

0,047

2,152

SLUN (SPE ETHER)

5,066

4,985

4,720

4,923

0,022

0,147

2,994

BOR (SPE ETHER)

4,127

4,366

3,985

4,159

0,025

0,157

3,775

AK (SPE ETHER)

5,804

5,422

5,965

5,730

0,052

0,228

3,974

LK (SPE ETHER)

2,490

2,321

2,398

2,403

0,005

0,069

2,866

AK 1 (LLE ETHER)

2,535

2,655

2,695

2,628

0,005

0,068

2,593

ŘEP (LLE ETHER)

1,800

1,850

1,892

1,847

0,001

0,038

2,036

MED (LLE ETHER)

2,100

2,220

2,070

2,130

0,004

0,065

3,043

LIP (LLE ETHER)

2,538

2,655

2,601

2,598

0,002

0,048

1,840

SLUN (LLE ETHER)

2,955

2,633

2,812

2,800

0,017

0,132

4,709

BOR (LLE ETHER)

2,864

2,632

2,562

2,686

0,017

0,129

4,795

AK 2 (LLE ETHER)

2,379

2,401

2,120

2,300

0,016

0,128

5,546

LK (LLE ETHER)

2,725

2,756

2,613

2,698

0,004

0,062

2,289

AK 1 (SPE ETAC)

5,692

5,937

6,013

5,880

0,019

0,137

2,323

ŘEP (SPE ETAC)

6,548

6,936

6,623

6,702

0,028

0,168

2,505

MED (SPE ETAC)

3,664

3,570

4,002

3,746

0,034

0,186

4,956

LIP(SPE ETAC)

30,215

31,225

29,756

30,398

0,376

0,613

2,018

SLUN (SPE ETAC)

7,841

7,912

8,232

7,995

0,029

0,170

2,123

BOR (SPE ETAC)

50,215

50,022

52,286

50,841

1,050

1,025

2,015

AK 2 (SPE ETAC)

7,812

7,623

8,562

7,999

0,164

0,406

5,070

LK (SPE ETAC)

1,984

2,012

1,856

1,951

0,005

0,068

3,483

103

Tab. 12 Obsah kyseliny syringové v medech c1 sx2 c2 c3 sx c̅x 2 [µg/100g] [µg/100g] [µg/100g] [µg/100g] [µg /100g2] [µg/100g]

RSD [%]

AK 1 (LLE ETAC)

6,973

7,012

7,322

7,102

0,024

0,156

2,201

ŘEP (LLE ETAC)

13,781

13,452

14,013

13,749

0,053

0,230

1,673

MED (LLE ETAC)

12,857

13,022

12,223

12,700

0,118

0,344

2,710

LIP (LLE ETAC)

3,307

3,201

3,075

3,194

0,009

0,094

2,957

SLUN (LLE ETAC)

26,346

29,124

28,022

27,830

1,304

1,142

4,104

BOR (LLE ETAC)

24,791

24,456

26,231

25,159

0,593

0,770

3,061

AK 2 (LLE ETAC)

12,407

12,421

11,875

12,234

0,065

0,254

2,079

LK (LLE ETAC)

18,699

19,535

18,756

18,997

0,146

0,382

2,008

AK 1 (SPE ETHER)

11,014

11,322

10,685

11,007

0,067

0,260

2,360

ŘEP (SPE ETHER)

13,018

13,699

13,325

13,348

0,077

0,278

2,085

MED (SPE ETHER)

9,746

10,746

10,451

10,314

0,176

0,420

4,068

LIP (SPE ETHER)

2,449

2,520

2,654

2,541

0,007

0,085

3,354

SLUN (SPE ETHER)

24,039

24,065

23,021

23,709

0,236

0,486

2,050

BOR (SPE ETHER)

29,614

30,125

28,237

29,325

0,636

0,798

2,720

AK (SPE ETHER)

12,900

13,013

12,255

12,723

0,112

0,334

2,625

LK (SPE ETHER)

18,845

19,235

18,203

18,761

0,181

0,426

2,268

AK 1 (LLE ETHER)

4,031

4,210

3,985

4,076

0,009

0,097

2,383

ŘEP (LLE ETHER)

4,800

4,623

5,030

4,818

0,028

0,167

3,459

MED (LLE ETHER)

4,438

4,126

3,956

4,173

0,040

0,200

4,781

LIP (LLE ETHER)

0,549

0,512

0,523

0,528

0,000

0,016

2,935

SLUN (LLE ETHER)

15,037

15,727

15,732

15,498

0,107

0,326

2,106

BOR (LLE ETHER)

12,617

12,124

12,355

12,365

0,041

0,202

1,632

AK 2 (LLE ETHER)

3,717

3,536

3,525

3,593

0,008

0,088

2,449

LK (LLE ETHER)

3,853

4,021

3,713

3,862

0,016

0,126

3,268

AK 1 (SPE ETAC)

15,694

16,483

15,865

16,014

0,115

0,339

2,114

ŘEP (SPE ETAC)

14,426

14,655

13,825

14,302

0,123

0,350

2,448

MED (SPE ETAC)

10,235

9,848

9,625

9,903

0,063

0,252

2,542

LIP(SPE ETAC)

3,332

3,203

3,465

3,333

0,011

0,107

3,217

SLUN (SPE ETAC)

32,150

33,215

31,012

32,126

0,809

0,899

2,799

BOR (SPE ETAC)

16,823

15,012

16,755

16,197

0,703

0,838

5,175

AK 2 (SPE ETAC)

14,023

14,451

13,725

14,066

0,089

0,298

2,120

LK (SPE ETAC)

20,123

21,201

20,021

20,449

0,285

0,534

2,611

104

Tab. 13 Obsah kyseliny vanilové v medech c1 c2 c3 sx2 sx c̅x 2 [µg/100g] [µg/100g] [µg/100g] [µg/100g] [µg /100g2] [µg/100g]

RSD [%]

AK 1 (LLE ETAC)

17,696

18,513

17,755

17,988

0,138

0,372

2,069

ŘEP (LLE ETAC)

51,708

53,912

51,623

52,415

1,123

1,060

2,022

MED (LLE ETAC)

80,236

78,466

82,023

80,242

2,109

1,452

1,810

LIP (LLE ETAC)

14,337

14,123

13,646

14,035

0,084

0,289

2,060

SLUN (LLE ETAC)

29,886

30,125

31,601

30,537

0,576

0,759

2,485

BOR (LLE ETAC)

49,149

46,322

44,322

46,598

3,922

1,980

4,250

AK 2 (LLE ETAC)

18,069

19,230

19,865

19,055

0,553

0,744

3,903

LK (LLE ETAC)

21,965

21,302

20,122

21,130

0,581

0,762

3,608

AK 1 (SPE ETHER)

17,963

18,503

17,466

17,978

0,179

0,424

2,356

ŘEP (SPE ETHER)

56,536

60,232

56,264

57,677

3,274

1,810

3,137

MED (SPE ETHER)

52,973

53,032

55,532

53,846

1,422

1,192

2,214

LIP (SPE ETHER)

10,270

9,565

9,643

9,826

0,099

0,315

3,208

SLUN (SPE ETHER)

25,040

26,432

25,190

25,554

0,389

0,624

2,442

BOR (SPE ETHER)

62,328

59,457

59,322

60,369

1,923

1,387

2,297

AK (SPE ETHER)

19,454

20,133

21,310

20,299

0,588

0,767

3,778

LK (SPE ETHER)

19,182

18,756

21,032

19,657

0,976

0,988

5,026

AK 1 (LLE ETHER)

12,677

13,201

12,021

12,633

0,233

0,483

3,821

ŘEP (LLE ETHER)

29,197

30,213

31,202

30,204

0,670

0,818

2,710

MED (LLE ETHER)

43,090

44,327

46,210

44,542

1,645

1,283

2,880

LIP (LLE ETHER)

8,820

8,621

7,895

8,446

0,158

0,397

4,705

SLUN (LLE ETHER)

16,075

16,235

14,985

15,765

0,308

0,555

3,521

BOR (LLE ETHER)

29,609

30,155

28,314

29,359

0,596

0,772

2,630

AK 2 (LLE ETHER)

8,396

8,012

8,911

8,440

0,136

0,368

4,364

LK (LLE ETHER)

9,120

8,785

8,765

8,890

0,027

0,163

1,832

AK 1 (SPE ETAC)

32,246

30,595

31,457

31,433

0,454

0,674

2,144

ŘEP (SPE ETAC)

67,595

70,547

70,561

69,567

1,946

1,395

2,005

MED (SPE ETAC)

74,122

74,012

78,230

75,455

3,853

1,963

2,601

LIP(SPE ETAC)

23,017

23,855

23,987

23,619

0,184

0,429

1,817

SLUN (SPE ETAC)

32,156

33,557

33,569

33,094

0,440

0,663

2,004

BOR (SPE ETAC)

84,127

80,059

81,246

81,810

2,917

1,708

2,088

AK 2 (SPE ETAC)

20,146

20,237

22,446

20,943

1,131

1,064

5,078

LK (SPE ETAC)

25,648

25,895

24,166

25,236

0,583

0,763

3,025

105

Tab. 14 Obsah vanilinu v medech c1 sx2 c2 c3 sx c̅x 2 [µg/100g] [µg/100g] [µg/100g] [µg/100g] [µg /100g2] [µg/100g]

RSD [%]

AK 1 (LLE ETAC)

14,871

15,423

14,623

14,972

0,112

0,334

2,233

ŘEP (LLE ETAC)

7,823

8,123

8,356

8,101

0,048

0,219

2,697

MED (LLE ETAC)

27,452

30,215

26,947

28,205

2,064

1,437

5,094

LIP (LLE ETAC)

11,274

10,885

10,747

10,968

0,050

0,223

2,034

SLUN (LLE ETAC)

12,022

11,987

11,442

11,817

0,071

0,266

2,250

BOR (LLE ETAC)

10,109

10,488

9,647

10,081

0,118

0,344

3,413

AK 2 (LLE ETAC)

9,617

9,012

9,132

9,254

0,068

0,261

2,825

LK (LLE ETAC)

15,907

15,466

16,412

15,928

0,150

0,387

2,428

AK 1 (SPE ETHER)

6,796

6,655

6,320

6,590

0,040

0,199

3,026

ŘEP (SPE ETHER)

7,287

7,021

6,897

7,068

0,026

0,163

2,301

MED (SPE ETHER)

16,671

16,785

17,523

16,993

0,143

0,378

2,223

LIP (SPE ETHER)

4,227

4,120

4,565

4,304

0,036

0,190

4,406

SLUN (SPE ETHER)

1,742

1,956

1,936

1,878

0,009

0,097

5,146

BOR (SPE ETHER)

4,421

4,231

4,012

4,222

0,028

0,167

3,960

AK (SPE ETHER)

3,247

3,012

3,362

3,207

0,021

0,146

4,540

LK (SPE ETHER)

9,108

9,537

9,621

9,422

0,050

0,225

2,384

AK 1 (LLE ETHER)

12,673

12,847

13,313

12,944

0,073

0,270

2,089

ŘEP (LLE ETHER)

12,310

12,457

12,999

12,589

0,088

0,296

2,352

MED (LLE ETHER)

25,284

25,322

24,322

24,976

0,214

0,463

1,853

LIP (LLE ETHER)

13,485

13,256

14,265

13,669

0,187

0,432

3,160

SLUN (LLE ETHER)

6,635

6,231

6,123

6,330

0,048

0,220

3,479

BOR (LLE ETHER)

11,873

11,755

10,988

11,538

0,154

0,392

3,400

AK 2 (LLE ETHER)

13,579

13,005

13,013

13,199

0,072

0,269

2,036

LK (LLE ETHER)

10,807

10,357

10,365

10,510

0,044

0,210

2,002

AK 1 (SPE ETAC)

15,792

16,383

15,624

15,933

0,106

0,326

2,045

ŘEP (SPE ETAC)

8,951

9,123

8,412

8,829

0,092

0,303

3,431

MED (SPE ETAC)

32,156

30,557

31,454

31,389

0,428

0,655

2,085

LIP(SPE ETAC)

20,322

21,417

20,462

20,734

0,237

0,487

2,347

SLUN (SPE ETAC)

4,563

5,021

4,653

4,746

0,039

0,198

4,176

BOR (SPE ETAC)

3,215

3,121

2,965

3,101

0,011

0,103

3,319

AK 2 (SPE ETAC)

4,520

4,756

4,537

4,604

0,012

0,108

2,340

LK (SPE ETAC)

15,618

16,326

16,281

16,075

0,105

0,324

2,013

106

Průměrný obsah fenolových sloučenin v akátovém medu 1

AK 1 (LLE ETAC) AK 1 (LLE ETHER) AK 1 (SPE ETHER) AK 1 (SPE ETAC)

ox yb en za ld e ky kys hyd s.c .ká v hl or ov og á ky eno s.f vá er u ky lov p- kys s.g á hy . p all o d ky rox kum vá s.p yb ar o e -h yd nza vá ld ro ky xy ehy s.p be d ro nzo to o ka vá ky tec h s. sa ová lic ky yl s .s o v á i ky nap o s .s yr vá ky ingo s.v vá an ilo vá va ni lin

µg/100g

400,000 350,000 300,000 250,000 200,000 150,000 100,000 50,000 0,000

3, 4di hy dr

LLE - extrakce z kapaliny do kapaliny SPE - extrakce pevnou fází ETAC - rozpouštědlo ethylacetát ETHER - rozpouštědlo diethylether

Graf. 1 Průměrné zastoupení fenolových sloučenin v akátovém medu 1

1000,000 900,000 800,000 700,000 600,000 500,000 400,000 300,000 200,000 100,000 0,000

ld ky ehy ky d s s.c .ká vo hl v or og á en ky o s.f vá er u ky lov á k s p- ys. .gal hy plo v k d ky rox um á ar s.p yb ov e -h á yd nza ld ro e ky xyb hy d s.p e r o n zo to ov ka á ky tech ov s. sa á lic ky ylo s.s vá i ky nap s.s ov á yr i ky ngo s.v vá an ilo vá va ni lin

ŘEP (LLE ETAC) ŘEP (LLE ETHER) ŘEP (SPE ETHER) ŘEP (SPE ETAC)

3, 4di hy dr

ox yb e

nz a

µg/100g

Průměrný obsah fenolových sloučenin v řepkovém medu

LLE - extrakce z kapaliny do kapaliny SPE - extrakce pevnou fází ETAC - rozpouštědlo ethylacetát ETHER - rozpouštědlo diethylether

Graf. 2 Průměrné zastoupení fenolových sloučenin v řepkovém medu

107

Průměrný obsah fenolových sloučenin v medovicovém medu

MED (LLE ETAC) MED (LLE ETHER) MED (SPE ETHER) MED (SPE ETAC)

ox yb en za ld eh k ky ys. yd k s.c hl ávo v or og á en ky o s.f vá er ul ov k ky ys.g á ps hy . p- allo v ku dr o m á ky ar s.p xyb ov e -h yd nzal á de ro ky xyb hy d s .p e ro nzo to ov ka á ky tech s. ov sa á lic ky ylo s .s v in á ky ap s .s o v á yr i ky ngo s.v vá an ilo vá va ni lin

µg/100g

800,000 700,000 600,000 500,000 400,000 300,000 200,000 100,000 0,000

3, 4di hy dr

LLE - extrakce z kapaliny do kapaliny SPE - extrakce pevnou fází ETAC - rozpouštědlo ethylacetát ETHER - rozpouštědlo diethylether

Graf. 3 Průměrné zastoupení fenolových sloučenin v medovicovém medu

LIP LIP LIP LIP

ox yb en za ld e ky hyd ky s.k s.c áv hl ov or og á e ky nov á s.f er ul ky ová s.g ky al s. plo p hy vá dr -ku m o ky xy ar ov s.p be á nz -h a yd ld ro e hy ky xyb d en s.p zo ro ov to ka á te ch ky ov s. á sa lic y ky lo vá s.s in a p ky s.s ová yr in go ky s.v vá an ilo vá va ni lin

µg/100g

Průměrný obsah fenolových sloučenin v lipovém medu 1000,000 900,000 800,000 700,000 600,000 500,000 400,000 300,000 200,000 100,000 0,000

(LLE ETAC) (LLE ETHER) (SPE ETHER) (SPE ETAC)

3, 4di hy dr

LLE - extrakce z kapaliny do kapaliny SPE - extrakce pevnou fází ETAC - rozpouštědlo ethylacetát ETHER - rozpouštědlo diethylether

Graf. 4 Průměrné zastoupení fenolových sloučenin v lipovém medu

108

Průměrný obsah fenolových sloučenin ve slunečnicovém medu

ky

ov á

ro g

s.c h

lo

áv

hy

s.k

al de

ky

be nz ox y hy dr

LLE - extrakce z kapaliny do kapaliny SPE - extrakce pevnou fází ETAC - rozpouštědlo ethylacetát ETHER - rozpouštědlo diethylether

3,

4di

e ky nov s.f á er ul o ky v s.g á ky al ps. lo hy pvá ku dr o ky xy m a ro s.p be v n -h yd zal á de ro ky xyb hyd s.p e ro nzo to ka ová t k y ec h ov s. sa á lic y ky l s.s ová in ky apo s.s vá yr in g ky o s.v vá an ilo vá va ni lin

SLUN (LLE ETAC) SLUN (LLE ETHER) SLUN (SPE ETHER) SLUN (SPE ETAC)

d

µg/100g

500,000 450,000 400,000 350,000 300,000 250,000 200,000 150,000 100,000 50,000 0,000

Graf. 5 Průměrné zastoupení fenolových sloučenin ve slunečnicovém medu

800,000 700,000 600,000 500,000 400,000 300,000 200,000 100,000 0,000

BOR (LLE ETAC) BOR (LLE ETHER) BOR (SPE ETHER) BOR (SPE ETAC)

3, 4di hy dr ox yb en za ld eh k ky ys. yd k s .c áv hl or ová og e ky nov s .f á er ul ov k ky ys.g á ps hy . p- allo vá k dr ky ox uma y s .p ro be v -h n yd zal á de ro ky xyb hyd s .p e ro nzo ov to ka á t e ky ch s. ov sa á lic ky ylo s.s v in á ky apo s.s vá yr in g ky s.v ová an ilo vá va ni lin

µg/100g

Průměrný obsah fenolových sloučenin v borovicovém medu

LLE - extrakce z kapaliny do kapaliny SPE - extrakce pevnou fází ETAC - rozpouštědlo ethylacetát ETHER - rozpouštědlo diethylether

Graf. 6 Průměrné zastoupení fenolových sloučenin v borovicovém medu

109

Průměrný obsah fenolových sloučenin v akátovém medu 2 300,000 250,000 µg/100g

200,000

AK 2 (LLE ETAC) AK 2 (LLE ETHER) AK 2 (SPE ETHER) AK 2 (SPE ETAC)

150,000 100,000 50,000

ox yb en za ld e ky hyd ky s.k s.c áv hl or ová og e ky nov s.f á er ul ov k ky ys.g á s al plo hy . p vá ku dr m ky ox a y ro s.p be vá -h nz yd al de ro ky xyb hyd en s.p z ro to oov ka á t ky e ch ov s. sa á lic y ky l s.s ová in ky apo s.s vá yr in go ky s.v vá an ilo vá va ni lin

0,000

3, 4di hy dr

LLE - extrakce z kapaliny do kapaliny SPE - extrakce pevnou fází ETAC - rozpouštědlo ethylacetát ETHER - rozpouštědlo diethylether

Graf. 7 Průměrné zastoupení fenolových sloučenin v akátovém medu 2

Průměrný obsah fenolových sloučenin v lesním květovém medu 600,000

µg/100g

500,000 400,000

LK (LLE ETAC) LK (LLE ETHER) LK (SPE ETHER) LK (SPE ETAC)

300,000 200,000 100,000

3, 4di hy dr

ox yb e

nz a

ld e ky hyd ky s.k s.c áv hl ov or og á e ky nov á s.f er ul ky ová s.g ky al s plo h y . pvá ku dr m ox ky a y ro s.p be vá nz -h yd al de ro hy ky xyb en d s.p z ro to oov ka á t ky e ch ov s. á sa lic y ky lo vá s.s in ky apo s.s vá yr in go ky s.v vá an ilo vá va ni lin

0,000

LLE - extrakce z kapaliny do kapaliny SPE - extrakce pevnou fází ETAC - rozpouštědlo ethylacetát ETHER - rozpouštědlo diethylether

Graf. 8 Průměrné zastoupení fenolových sloučenin v lesním květovém medu

110

29 SEZNAM PŘÍLOH Tab. 1 Obsah 3,4-dihydroxybenzaldehydu v medech .................................................... 93 Tab. 2 Obsah kyseliny kávové v medech...................................................................... 94 Tab. 3 Obsah kyseliny chlorogenová v medech............................................................. 95 Tab. 4 Obsah kyseliny ferulové v medech ..................................................................... 96 Tab. 5 Obsah kyseliny gallové v medech....................................................................... 97 Tab. 6 Obsah kyseliny p-kumarové v medech .............................................................. 98 Tab. 7 Obsah p-hydroxybenzaldehydu v medech .......................................................... 99 Tab. 8 Obsah kyseliny p-hydroxybenzoové................................................................. 100 Tab. 9 Obsah kyseliny protokatechové ........................................................................ 101 Tab. 10 Obsah kyseliny salicylové v medech .............................................................. 102 Tab. 11 Obsah kyseliny sinapové v medech ................................................................ 103 Tab. 12 Obsah kyseliny syringové v medech............................................................... 104 Tab. 13 Obsah kyseliny vanilové v medech................................................................. 105 Tab. 14 Obsah vanilinu v medech................................................................................ 106 Graf. 1 Průměrné zastoupení fenolových sloučenin v akátovém medu 1.................... 107 Graf. 2 Průměrné zastoupení fenolových sloučenin v řepkovém medu ...................... 107 Graf. 3 Průměrné zastoupení fenolových sloučenin v medovicovém medu................ 108 Graf. 4 Průměrné zastoupení fenolových sloučenin v lipovém medu ......................... 108 Graf. 5 Průměrné zastoupení fenolových sloučenin ve slunečnicovém medu............. 109 Graf. 6 Průměrné zastoupení fenolových sloučenin v borovicovém medu ................. 109 Graf. 7 Průměrné zastoupení fenolových sloučenin v akátovém medu 2.................... 110 Graf. 8 Průměrné zastoupení fenolových sloučenin v lesním květovém medu ........... 110

111