Museums, Monuments and Conservation 2008
STUDIUM DEGRADACE KOSTERNÍCH POZŮSTATKŮ POMOCÍ INFRAČERVENÉ SPEKTROMETRIE STUDY OF SKELETAL RESIDUES DEGRADATION USING INFRARED SPEKTROSCOPY Anna Vitešníková1, Lubomír Prokeš1, Miriam Nývltová Fišáková2, Eva Drozdová1, Pavel Kouřil2, Pavel Stabrava2, Jana Gryc2 1) Masarykova univerzita v Brně / Masaryk University in Brno 2) Archeologický ústav Akademie věd ČR v Brně / Istitute of Archaeology of the Academy of Sciences ČR in Brno
Úvod Přestože je infračervená spektrometrie metoda užívaná převážně k identifikaci struktury chemických látek, lze ji úspěšně využít i v celé řadě vědních disciplín, mimo jiné také v oblasti antropologie a archeometrie. Z dosud publikovaných studií vyplývá, že pomocí infračervené spektrometrie lze s úspěchem charakterizovat projevy postdepozičních degradačních procesů na kosterních pozůstatcích. Transformace a destrukce kostní tkáně začíná okamžitě po smrti jedince, přičemž míra a charakter destrukce kosti jsou dány zejména působením vnějších faktorů (např. pH, vlhkost a chemické složení půdy, přítomnost mikroorganismů apod.) [HERRMANN – NEWESELY 1982]. Interakce kostní tkáně s okolním prostředím se může projevit změnou jejího chemického složení (např. rekrystalizace a rozpuštění hlavní minerální složky kosti tj. hydroxyapatitu (Ca5(PO4)3(OH)) a následnou mechanickou destrukcí kostní matrice. Specifickým faktorem působícím na kosterní pozůstatky je vysoká teplota, jejímž účinkům je tělo vystaveno při uhoření či cíleném spalování (kremaci). V této práci byla experimentálně ověřena možnost použití infračervené spektrometrie pro studium spálených kosterních pozůstatků, zejména pro rozlišení spálených a nespálených kostí a také odhad teploty a podmínek spalování. Dále byla studována degradace kalcifikované tkáně novověkých kosterních pozůstatků z kovových rakví.
Metoda Pro analýzu vzorků kosterních pozůstatků byla použita metoda FTIR (Infračervená spektrometrie s Fourierovou transformací), jejímž základním principem je absorpce infračerveného záření při průchodu vzorkem, kdy je pohlcená energie využita ke změnám rotačně-vibračních energetických stavů molekuly, v závislosti na změnách jejího dipólového momentu [KLOUDA 2003]. Různé druhy kovalentních vazeb absorbují záření různé vlnové délky. Analytickým výstupem je infračervené spektrum – závislost množství absorbovaného infračerveného záření (vyjadřovaného např. jako absorbance) na jeho vlnové délce (vyjadřované zpravidla jako vlnočet, v cm-1).
24
Přítomnost spektrálního pásu pro určitý vlnočet svědčí o přítomnosti určitého typu vazby, a tím pádem i o přítomnosti určitých funkčních skupin. Vzorek pro analýzu byl vždy odebrán z kompaktní části kosti. Vzorky byly sušeny při teplotě 85 °C po dobu 150 minut. Po vysušení bylo vždy 10 mg smícháno s 100 mg vysušeného bromidu draselného (KBr) a po homogenizaci směsi (třením v achátové misce) z ní byla vylisována tableta. Takto upravený vzorek byl analyzován spektrometrem ATI Mattson (Genesis Series FTIR).
Výsledky Degradace kalcifikované tkáně v kovových rakvích • Analyzovány byly kosterní pozůstatky příslušníků rodu Dietrichsteinů, které byly vyzvednuty z rodinné hrobky Dietrichsteinů v Mikulově při průzkumu v letech 2001–2003 [DROZDOVÁ 2006]. Jednalo se o fragment blíže neurčené dlouhé kosti knížete Leopolda Ignáce (Vzorek LI, Obr. 1), dále fragment dlouhé kosti knížete Ferdinanda Josefa (Vzorek FJ, Obr. 1) a fragment obratle knížete Waltera Xavera (Vzorek WX, Obr. 1, Obr. 2). Tyto ostatky dietrichsteinských knížat byly velmi špatně zachované, bylo na nich patrné narušení histologické struktury kostní matrice v důsledku transformace její minerální složky – hydroxyapatitu. Na povrchu fragmentů kostí byly makroskopicky pozorovatelné výkvěty bílých krystalů. Analýzou metodou FTIR se podařilo prokázat, že se jedná o krystaly brushitu (CaHPO4 . 2 H2O), viz infračervené spektrum Obr. 2 (Tab. 1), který vzniká rekrystalizací hydroxyapatitu (v sekvenci hydroxyapatit → oktakalciumfosfát → brushit, Tab. 2) vlivem nízké hodnoty pH a vysoké vlhkosti prostředí. Kyselé prostředí vzniká při hnití měkkých tkání, proto lze brushit nalézt už v raném stádiu rozkladu kostí [HERRMANN – NEWESELY 1982]. Výskyt brushitu byl v minulosti pozorován na kosterních pozůstatcích z chladných, nevětraných krypt s podlahou pod úrovní spodní vody [PROKEŠ 2007]. Brushit tvoří objemné krystaly, které zapříčiňují rozpraskávání kostní tkáně a rozpad osteonů. Tento minerál je také na rozdíl od hydroxyapatitu rozpustný ve vodě, což opět podstatně usnadňuje destrukci kostní tkáně.
Muzea, památky a konzervace 2008
Obr. 1: Fragmenty kostí dietrichsteinských knížat s výskytem brushitu
Obr. 2: Výskyt brushitu na fragmentu obratle knížete Waltera Xavera Dietrichsteina (Foto: L. Prokeš, Masarykova univerzita)
Obr. 3: FTIR spektrum – vzorek LI (kn. Leopold Ignác)
25
Museums, Monuments and Conservation 2008 Vlnočet (cm-1)
Stanovení
3545 cm-1 + 3490 cm-1 + 3284 cm-1 + 3168 cm-1 + 2955 cm-1 valenční vibrace O–H skupin vody (hydrát), případně HPO422375 cm-1 + 1722 cm-1
valenční vibrace PO–H
1651 cm
deformační vibrace O–H vody
1217 cm-1
valenční vibrace P–O
1137 cm-1 + 1061 cm-1
asymetrická valenční vibrace P–O
987 cm
symetrické valenční vibrace P–O
-1
-1
874 cm + 794 cm -1
asymetrické valenční vibrace P–O–P
-1
665 cm + 577 cm +525 cm -1
-1
deformační vibrace O–P–O
-1
Tab. 1: FTIR pásy brushitu (JOSHI – JOSHI 2003, KUMAR – KALAINATHAN 2008) pH Minerál Chemický vzorec Součin rozpustnosti
7,0–7,5 (fyziologické) hydroxyapatit Ca5(PO4)3OH 5 . 10-6
6,0–7,0 oktakalciumfosfát Ca4H(PO4) . 2 H2O 8 . 10-4
4,5–6,0 brushit CaHPO4 . 2 H2O 7.10-4
Tab. 2: Transformace hydroxyapatitu v kyselém prostředí (PROKEŠ 2007) • Na kosterních pozůstatcích může být pozorován také výskyt jiného minerálu, vzniklého rekrystalizací hydroxyapatitu, vivianitu (Fe3(PO4)2 . 8 H2O). Vivianit vzniká v anaerobním a kyselém prostředí (hlavně v podmáčených půdách), v přítomnosti zdroje železa, což mohou být železné předměty nebo půda samotná [PROKEŠ 2007]. Je to bezbarvý průsvitný minerál tvořící tabulovité krystaly, který se na vzduchu (oxidací Fe2+ na Fe3+) zbarvuje světle modře, případně do temných odstínů modré. Tento minerál byl identifikován na fragmentu subrecentního kravského zubu (Obr. 4, spektrum Obr. 5, Tab. 1), který byl získán při archeologickém výzkumu v Třebíči.
Obr. 4: Výskyt vivianitu na úlomku kravského zubu
Obr. 5: FTIR spektrum – kravský zub - vivianit 26
Studium termicky podmíněných změn v kostní tkáni Nálezy spálených nebo ohořelých kosterních pozůstatků jsou v archeologických výzkumech poměrně časté. Z antropologického hlediska je u takových kosterních pozůstatků žádoucí sledovat termicky podmíněné morfologické změny (změny velikosti, tvaru, histologické struktury a chemického složení kosti a s tím spojenou změnu zbarvení a mechanických vlastností) [THOMPSON 2004]. Při hodnocení kosterních pozůstatků ze žárových hrobů lze na základě charakteru morfologických změn určit míru poškození ohněm neboli stupeň spálení kosti [viz. např. DOKLÁDAL 1999; HOLCK 1997] a přibližně odhadnout teplotu kremace. Pro přesnější charakterizaci stupně spálení byla v minulosti použita řada fyzikálně-chemických metod, např. termická analýza [LOZANO et al. 2003], FTIR analýza (LEBON et al. 2008, MUNRO et al. 2007] nebo rentgenostrukturní analýza [THOMPSON et al. 2008]. • První skupinou vzorků, u nichž byly studovány změny v chemickém složení metodou FTIR, byl soubor kosterních pozůstatků pocházejících z archeologického výzkumu hradiště Chotěbuz-Podobora, které je ve starší fázi své slovanské existence datováno do 2. pol. 8. až po přelom 9.–10. století [KOUŘIL 2007]. Z tohoto závěrečného stádia pochází i spálený objekt, v němž byly nalezeny pozůstatky uhořelých hospodářských zvířat: prasete, tří ovcí/koz, březí krávy a psa (Obr. 6) [M. NÝVLTOVÁ-FIŠÁKOVÁ – ústní sdělení]. V případě krávy byly k analýze vybrány vzorky z hnědě (kráva H), černě (kráva Č) a bíle (kráva B) zbarvené kostní tkáně. Všechny kosterní pozůstatky ostatních zvířat byly zbarveny bíle. Stupeň spálení kosti byl nejprve určen makroskopicky (podle morfologických vlastností a zbarvení kostní tkáně) s využitím stupnic spálení kosti [DOKLÁDAL 1999; HOLCK 1997; MUNRO et al. 2007; WALKER et al. 2007], viz. Tab. 3 a Tab. 4.
Muzea, památky a konzervace 2008
Kráva H Kráva Č Kráva B, prase, ovce/koza
Dokládal 1999 stupeň II (± 300 °C) stupeň II (± 400 °C) stupeň V (nad 750 °C)
Holck 1997 Grade 1 (cca 300 °C) Grade 2 (cca 400 °C) Grade 3, resp. 4 (nad 800 °C)
Tab. 3: Stupeň spálení a odhad kremační teploty kosterních pozůstatků na základě teploty a morfologických změn
Kráva H Kráva Č Kráva B, prase, ovce/koza
Munro et al. 2007 250–300 °C cca 350 °C cca 700 °C
Walker et al. 2007 cca 250 °C 350–400 °C cca 900 °C
Tab. 4: Odhad teploty spálení kosterních pozůstatků na základě zbarvení Následně byla interpretována infračervená spektra, v nichž byla, za účelem studia termicky podmíněných změn v chemickém složení kostí, sledována přítomnost charakteristických absorbčních pásů anorganické i organické složky kosti (Tab. 5, Tab. 6). FTIR indikuje přítomnost vody (postupná redukce –OH pásů vody, kolem 400 °C zcela vymizí), redukci a posun pásu karbonátu (pás 1400–1500 cm-1, významná redukce kolem 700–800 °C), redukci organické složky kosti (zejm. kolagenu) (kolem 300–400 °C) [MUNRO et al. 2007]. U dokonale spálených kostí (neobsahujících organickou složku a vodu) dochází při teplotě cca 900 °C k rekrystalizačním změnám fosfátu na whitlockit (β-trikalciumfosfát; pás kolem 655 cm-1) [LOZANO 2003; THOMPSON 2004]. Z výsledků analýz vyplývá, že teploty spalování zhruba odpovídají teplotám zjištěným odhadem ze zbarvení a stupně přepálení. U kostí, které nebyly dokonale spáleny, tedy hnědé a černé (Obr. 7, Obr. 8) kosti krávy, se vyskytují pásy typické pro organickou složku a vodu. Z charakteru anorganické složky spekter těchto kostí lze usoudit, že černá kost byla vystavena působení vyšší teploty (cca 400 °C) než kost hnědá (200–250 °C). V černé kosti byl však zjištěn oproti hnědé kosti větší podíl organické složky (organická složka v hnědé kosti byla pravděpodobně redukována postdepozičními procesy, v černé kosti byla naopak stabilizována karbonizací). Na základě rozdílného zbarvení i odlišností v infračervených spektrech jednotlivých vzorků pocházejících z různých částí skeletu krávy bylo možné usoudit, že jednotlivé části těla nehořely rovnoměrně. Nedokonalé spálení kosterních pozůstatků a zachování karbonizovaných zbytků měkkých tkání je obecně důsledkem omezeného přístupu kyslíku ke kosti během kremace díky specifickému uložení pozůstatků [FAIRGRIEVE 2008]. Důvodem, proč byly některé části skeletu uhořelé krávy spáleny méně než ostatní, je zřejmě velký podíl měkkých tkání bránících přístupu kyslíku a přítomnost velkého množství plodové vody (jednalo se o březí krávu). Intenzita pásu uhličitanu a index krystalinity neboli splitting factor (vypočítaný jako podíl sumy výšek fosfátových píků (603 a 563 cm-1) a výšky mezi nimi; rostoucí úměrně s teplotou) ukazuje, že teplota působící na bílé pozůstatky krávy (Obr. 9) byla o něco nižší ve srovnání s pozůstatky ostatních zvířat. Teplota tedy dosahovala cca 800–900 °C v případě krávy, u ostatních spíše 900–1000 °C (všechny odhady jsou učiněny pouze na základě údajů z literatury, detailnější
odhad by vyžadoval provedení experimentů). Analýza tedy potvrdila nerovnoměrné hoření těl v objektu vlivem rozdílného fyzického stavu zvířat a ukázala, že teplota v objektu během požáru dosahovala až na 1000 °C.
Obr. 6: Pohled na spáleniště chléva (hradisko Chotěbuz– Podobora). Jsou zde vyznačeny pozůstatky březí krávy, prasete, tří ovcí a psa. Kráva je v červeném oválu, ovce jsou v oranžových oválech, prase ve žlutém a pes v modrém oválu (Foto: M. Nývltová Fišáková – Archeologický ústav AV Brno)
Obr. 7: FTIR spektrum vzorku z hnědé kosti krávy
27
Museums, Monuments and Conservation 2008
Obr. 8: FTIR spektrum vzorku z černé kosti krávy Vlnočet (cm-1) 564, 578, 604 945, 982, 1120 710, 874 1452–1456, 1495–1501, 1547–1451 1412–1414, 1469–1472 1650 3570, 3498 3570
Obr. 9: FTIR spektrum vzorku z bílé kosti Krávy Stanovení pásy valenční vibrace O–P–O fosfátové skupiny trikalciumfosfátu pásy valenční vibrace P–O fosfátové skupiny trikalciumfosfátu pásy vibrace O–C–O karbonátu pásy asymetrické vibrace O–C–O karbonátu pásy asymetrické vibrace O–C–O karbonátu pás deformační vibrace H–O–H vody pásy deformační vibrace O–H vody pás valenční vibrace O–H hydroxyapatitu
Tab. 5: Infračervené pásy stanovované v kosterních pozůstatcích [SHI et al. 2005; LOZANO 2003] Vlnočet (cm-1) 1200–1000 1450 1450 1550 1580 1650 3100–2800 2928, 2857 3600–3000
Stanovení pásy deformační vibrace C–H v aromátech pás deformační vibrace C–H amidů III pásy skeletální vibrace C=C v aromátech kombinace valenční vibrace C–N a deformační vibrace N–H amidů II (proteiny, peptidy) pás Ar–H šestičlenného aromatického kruhu pás valenční vibrace C=O amidů I (proteiny, peptidy) pásy valenční vibrace C–H pásy valenční vibrace C–H methylenu pásy valenční vibrace O–H a/nebo N–H
Tab. 6: Infračervené pásy organických skupin [OUDEMANS et al. 2007; STUART 2004] • Analyzován byl také soubor vzorků spálených kostí pocházejících z žárového pohřebiště kultury lužických popelnicových polí (KLPP) nacházejícího se na katastru města Příbor. Během archeologického výzkumu bylo prozkoumáno 89 samostatných hrobů [STABRAVA, rkp. nálezové zprávy]. Pro účely zkoumání spálených kosterních pozůstatků pomocí FTIR byly vybrány následující hrobové celky: H37, H40, H44, H53, H57, H58 a H67. Popelnice byly ve většině případů velmi špatně zachované, kremační pozůstatky byly v ideálním případě zachyceny na dně popelnice, kde často tvořily s uhlíky a hlínou kompaktní krustu (Obr. 10) [STABRAVA, rkp. nálezové zprávy]. Vlastní kosterní
28
pozůstatky byly nalezeny ve fragmentárním stavu, byly zbarveny bíle a jejich povrch byl rozpraskaný (Obr. 11). Infračervená spektra analyzovaných kosterních pozůstatků, pocházejících ze sedmi popelnicových hrobů, vykazují řadu shodných rysů: u všech je pozorovatelná významná redukce pásu vody, zůstal pouze pás –OH skupin (3570 cm-1) hydroxyapatitu, a významná redukce pásů uhličitanů (Obr. 12). Určující pro odhad kremační teploty je přítomnost pásu β-trikalciumfosfátu (cca 638 cm-1), který se objevuje při teplotách nad 800 °C [MUNRO et al.]. Teplota zjištěná pro kremace lidí lužické kultury odpovídá 800–900 °C, což souhlasí s odhadem J. Wahla (1981), který uvádí pro pravěké
Muzea, památky a konzervace 2008 kremace teplotu cca 800–850 °C, maximálně 900 °C. Takto vysoké hodnoty svědčí o použití značného množství paliva a dokonalém přístupu vzdušného kyslíku, případně o dobře organizované technické stránce kremace. V případě pohřebiště KLPP v Příboře byl prokázán jednotný pohřební ritus a bylo zjištěno, že lidská těla byla spalována při 800–900 °C na otevřeném prostranství s dobrým přístupem vzduchu.
Závěr Na základě provedených experimentů lze konstatovat, že infračervená spektrometrie je metodou vhodnou pro charakterizaci postmortálních degradačních procesů u kosterních pozůstatků, odrážející charakter prostředí, v němž byly pozůstatky uloženy. Zejména jde o rekrystalizační změny kostní matrice – transformaci kostního minerálu na brushit a vivianit. Odraz termicky podmíněných změn kosterních pozůstatků v infračerveném spektru a také přesnější odhad teploty spalování (ve srovnání s dosud užívanými morfologickými postupy) umožňuje nejen detailněji charakterizovat pozůstatky dávných požárů, ale také lépe porozumět technologii kremace pravěkých populací.
Literatura
Obr. 10: Hrob č. 40 (H40) (Foto: P. Stabrava – Společné pracoviště AÚ AV ČR v Brně a SZM v Opavě)
Obr. 11: Fragmenty spálených kosterních pozůstatků z hrobu č. 67
Obr. 12: FTIR spektrum spálených kosterních pozůstatků z hrobu č. 37
DOKLÁDAL, M.: Morfologie spálených kostí. Význam pro identifikaci osob. Sborník prací lékařské fakulty 113. Brno 1999. DROZDOVÁ, E.: Dietrichsteinové z Mikulova. Brno 2006. FAIRGRIEVE, S. I.: Forensic cremation, Recovery and Analysis. London – New York 2008. JOSHI, V. S. – JOSHI, M. J.: FTIR spectroscopic, thermal and growth morphological studies of calcium hydrogen phosphate dihydrate crystals. Crystal Research and Technology 3, 2003, p. 817–821. KLOUDA, P.: Moderní analytické metody. Ostrava 2003. KOUŘIL, P.: Jezdecká elita na hradisku v Chotěbuzi-Podoboře. Těšínsko 50, 2007, č. 1, 5–8. KUMAR, R. A. – KALAINATHAN, S.: Growth and characterization of nano-crystalline hydroxyapatite at physiological conditions. Crystal Research and Technology 43, 2008, p. 640–644. HERRMANN, B. – NEWESELY, H.: Dekompositionsvorgange Knochens unter langer Liegezeit.1. Die mineralische Phase. Antropologischer Anzeiger 40, 1982, p. 19–31. HOLCK, P.: Cremated Bones. A Medical-Anthropological Study of An Archaeological Material on Cremation Burials. Oslo 1997. LEBON, M. – REICHE, I. – FRÖHLICH, F. – BAHAIN, J. J. – FALGUÈRES, C.: Characterization of archaeological burnt bones: contribution of a new analytical protocol based on derivative FTIR spectroscopy and curve fitting of the ν1ν3 PO4 domain. Analytical and Bioanalytical Chemistry 392, 2008, p. 1479–1488. LOZANO, L. F. – PEÑA-RICO, M. A. – HEREDIA, A. – OCOTLÁN-FLORES, J. – GÓMEZ-CORTÉS, A. – VELÁZQUEZ , R. – BELÍO, I. A. – BUCIO, L.: Thermal analysis study of human bone. Journal of Materials Science 38, 2003, p. 4777–4782. MUNRO, L. E. et al.: Burning and boiling of modern deer bone: Effects on crystallinity and oxygen isotope composition of bioapatite phosphate Palaeogeography, Palaeoclimatology. Palaeoecology 249, 2007, p. 90–102. PROKEŠ, L.: Posmrtné změny a jejich význam při interpretaci pohřebního ritu. Brno 2007. SHI, J.– KLOCKE, A.– ZHANG, M.– BISMAYER, U.: Thermally-induced structural modification of dental enamel apatite: decomposition and transformation of carbonate groups.
29
Museums, Monuments and Conservation 2008 European Journal of Mineralogy 17, 2005, p. 769–775. THOMPSON, T. J. U.: Recent advances in the study of burned bone and their implications for forensic anthropology. Forensic Science International 146, 2004, p. 203–205. WAHL, J.: Beobachtungen zur Verbrennung menslicher Leichname. Über die Vergleichbarkeit moderner Kremationen mit prähistorischen Leichenbränden. Archäologisches Korrespondenzblatt 11, 1981. p. 271–279. WALKER, P. L. – MILLER, K. W. P. – RIHMAN, R.: Time, temperature, and oxygen availibility: an experimental study of the effects of environmental conditions on the color and organic content of cremated bone. The Analysis of Burned Human Remains. Burned Bone 2007, p. 129–135.
Summary Infrared spectroscopy is one of the most frequent method used for identification of various materials. This method was used in this study for characterisation of
30
postmortal degradation of skeletal residues. An essential importance for preservation or degradation of bone tissue have the qualities of surrounding soil – mainly pH level and humidity. In acidic surroundings the mineral composition of bone – hydroxyapatite Ca5(PO4)3OH is gradually melt, which can finally eventuate in decalcification of bone tissue. Another result of the acidic environment is recrystalization of hydroxyapatite into the other mineral called brushit (CaHPO4 . 2 H2O). Brushit occurence was approved in bones of Dietrichstein family members, who were buried in a family crypt in Mikulov. A specific factor influencing degradation of bones is high temperature. FTIR spectroscopy can be used to differentiate between burnt or unburnt bones and thanks to this method the temperature of cremation and the burning conditions can be successfully estimated. Bone residues coming from the necropolis in Příbor (the Bronz Age, the Iron Age) and also animal residues from Chotěbuz-Podobora were analysed.
