Hmotnostní spektrometrie Miroslav Polášek Ústav fyzikální chemie J. Heyrovského Akademie věd České republiky Dolejškova 3, 182 23 Praha 8
Co je hmotnostní spektrometrie? Fyzikálně chemická metoda pro: ¾ identifikaci neznámých sloučenin, ¾ kvantifikaci známých sloučenin, ¾ objasňování struktury iontů v plynné fázi, ¾ stanovení fyzikálních a chemických vlastností iontů a molekul prostřednictvím měření hmotnosti a četnosti (eventuálně také rychlosti vzniku) iontů v plyné fázi, obvykle s vysokou citlivostí, specificitou a rychlostí, často i ve velmi složiých směsích.
Hlavní procesy v hmotnostní spektrometrii ¾ Příprava vzorku ¾ Převod vzorku do plynné fáze ¾ “Ionizace” vzorku
někdy probíhá současně nebo v opačném pořadí
¾ Analýza iontů ¾ Detekce iontů ¾ Zpracování dat ¾ Interpretace spekter
Hmotnostní spektrometr
Co je hmotnostní spektrometr? Přístroj pro přípravu, analýzu a detekci iontů v plynné fázi Základní součásti: ¾ vstupní systém ¾ iontový zdroj ¾ iontová optika ¾ analyzátor(y) ¾ detektor(y) ¾ vakuový systém ¾ výkonová elektronika ¾ řídící elektronika (data systém)
Iontový zdroj je zařízení pro přípravu iontů, zpravidla zde také dochází k převodu vzorku do plynné fáze. Existuje mnoho způsobů přípravy iontů v MS: Elektrický výboj, elektronová ionizace, Penningova ionizace, ionizace přenosem náboje, electron attachment, chemická ionizace (pozitivní i negativní), FAB (fast atom bombardment), FIB (fast ion bombardment), MCI (massive cluster impact), PD (plasma desorption), ionizace polem, fotoionizace, REMPI (resonance-enhanced multiphoton ionization), termosprej, elektrosprej, APCI (atmospheric pressure chemical ionization) a její varianty (APPI, a pod.), MALDI (matrix-assisted laser desorption ionization) a její varianty (SELDI, tj. surface-enhanced laser desorption and ionization, a pod.), ICP (inductively coupled plasma), atd......
Analyzátory jsou zařízení schopná rozlišovat ionty v plynné fázi na základě měření jejich fyzikálních vlastností ¾ mv
(magnet)
¾ ½ m v2 (elektrostatický analyzátor) ¾ m/q
(kvadrupól)
¾ f
(iontová cyklotronová rezonance, ICR)
¾ t
(„time of flight“, TOF)
Co je hmotnostní spektrum ? graf závislosti iontového proudu dopadajícího na detektor na “hmotnosti” iontů; m/z (Th)
Není fyzikální konstantou, závisí na způsobu ionizace a konstrukci hmotnostního spektrometru
Hmotnostní spektrum je obrazem chemické reaktivity iontů v plynné fázi (tj. mechanizmů a kinetiky monomolekulárních i bimolekulárních reakcí), případně také transportních a elektrochemických procesů v kondenzované fázi
O H 3C
N
+
-
O
+ e-
H 3C
N
+
O m /z 61
O
+ CH 5 +
H 3C
N
m /z 62
H 3C
N
m /z 62
H
+
O
O
+ H3+
MH+.
O
CH5+ H
+
O
30
CH3NO+
NO+ M+.
relative intensity
CH3+ NO2+
15
20
30
m/z
40
50
NO+
61
CH3+
46
10
NO2+
60
MH+.
Malá exkurze do historie I. Joseph J. Thomson (1856-1940) On the Masses of the Ions in Gases at Low Pressures Philosophical Magazine, 1899, 48:295, p.547-567 Rays of Positive Electricity and their Application to Chemical Analysis, Longmans, Green and Co. Ltd., London, 1913
Malá exkurze do historie II. Francis W. Aston (1877-1945, Nobelova cena 1922) Isotopes and Atomic Weights. Nature, 1920, 105, p. 617 The Mass-Spectra of Chemical Elements. Phil. Mag., 1920, 39, p. 611
Organická hmotnostní spektrometrie benzen
R.Conrad, 1930
ethylen
H. R. Steward, A. R Olson, 1931
40. – 70. léta 20. století ¾
intenzivní studium vztahu struktury organických sloučenin a jejich hmotnostních spekter
¾
teorie monomolekulárních reakcí (kvazirovnovážná teorie, RRKM)
¾
aktivace iontů, tandemová hmotnostní spektrometrie, vysoké rozlišení
¾
chemická ionizace, studium reakcí iontů s molekulami
¾
vývoj instrumentace (analyzátory: kvadrupól, ICR, TOF)
¾
spojení plynové chromatografie a hmotnostní spektrometrie (GCMS)
¾
omezení: tenze par alespoň 10-3 Pa, malý hmotnostní rozsah analyzátorů
Organická hmotnostní spektrometrie Klasický příklad: vznik tropyliových iontů z toluenu
91
H 91
92
CH3
relative intensity
P.N. Rylander, S. Meyerson H.M. Grubb, J. Am. Chem. Soc.79 (1957) 842
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
m/z (Th) 95
15
50
49 45
+
H2C
39
H
33
10
28
+
H2C
+
H
+
20
30
40
50
60
70
80
90
100
m/z (Th)
H
91
23 H
H
17 H
CH3
H
+ +
0
relative intensity
+
CD3
relative intensity
77
92
+
Hyperplocha potenciální energie C7H8+. energie v kcal/mol
10
20
30
40
50
60
m/z (Th)
70
80
90
100
Malá exkurze do historie III. V. Čermák, V. Hanuš, Č. Jech, J. Cabicar, 1953
Ionizace netěkavých sloučenin FAB (fast atom bombardment) Barber M., Bordoli R.S., Sedgwick R.D., Tyler, A.N.Nature, 1981, 293, p.270-275
FIB (fast ion bombardment) Liquid SIMS (secondary ion mass spectrometry) Pevná látka (polární) rozpuštěná v kapalné matrici je bombardována rychlými (1030keV) atomy nebo ionty (Xe, Cs+). Při tom dochází k rozprašování (sputtering) iontů do plynné fáze.
Cyklosporin A V. Havlíček, A. Jegorov, P. Sedmera, M. Ryska, Org. Mass Spectrom., 28 (1993) 1440
MALDI Matrix Assisted Laser Desorption and Ionization M. Karas, F. Hillenkamp Anal. Chem., 1988, 60, p.2299-2301 Tanaka K., Waki H., Ido Y., Akita S., Yoshida Y., Yoshida T. Rapid Commun. Mass Spectrom., 1988, 2, p.151
K. Tanaka, (*1959) Nobelova cena 2002
F. Hillenkamp (*1936)
http://nobelprize.org/chemistry/laureates/2002/chemadv02.pdf
Elektrosprej (ESI)
J.B.Fenn (*1917) Nobelova cena 2002
Yamashita, M.; Fenn, J.B.; Journal of Physical Chemistry, 88, 1984, p 4451-4459, Fenn, J.B.; Mann, M.; Meng, C.K.; Wong, S.F.; Whitehouse, G.M.; Science, 246, 1989, p 64-71
Hemoglobin
http://nobelprize.org/chemistry/laureates/2002/chemadv02.pdf
Vícenásobně nabité ionty: m1 = (M + n1M(H+)/n1 m2 = (M + n2M(H+)/n2
M(α-chain) = 15126.7 Da n2 = n1 + 1 (2,3,…)
M(β-chain) = 15860.5 Da
Sekvenování proteinů
R
NH R
J.R. Yates, III, J. Mass Spectrom., 33 (1998) 1-19
O
n
xn
¾ zpracování dat
+
OH
NH H 2N
¾ Enzymatické stěpení ¾ LC MS analýza
nH
R
O
O
např. Trypsinem (C-konec argininu a lysinu)
cn
bn
an
yn
Aminokyselina
Glycine Alanine Serine Proline Valine Threonine Cysteine Isoleucine Leucine Asparagine Aspartic acid Glutamine Lysine Glutamic acid Methionine Histidine Phenylalanine Arginine Tyrosine Tryptophan
Gly Ala Ser Pro Val Thr Cys Ile Leu Asn Asp Gln Lys Glu Met His Phe Arg Tyr Trp
zn
monoizotopická hmotnost
G A S P V T C I L N D Q K E M H F R Y W
57.02147 71.03712 87.03203 97.05277 99.06842 101.04768 103.00919 113.08407 113.08407 114.04293 115.02695 128.05858 128.09497 129.0426 131.04049 137.05891 147.06842 156.10112 163.06333 186.07932
„Neomezený“ hmotnostní rozsah TOF analyzátoru
MALDI MS imaging Mikroskopie poskytující ionformace o chemickém složení povrchu zobrazovaného vzorku
„Soft-landing“ phenomena ¾ „Preparativní“ hmotnostní spektrometrie ¾
Modifikace povrchů
