Základy hmotnostní spektrometrie Lenka Hernychová e-mail:
[email protected]
Ústav molekulární patologie, Fakulta vojenského zdravotnictví, Universita obrany Hradec Králové
Historie Koichi Tanaka vyvinul MALDI techniku Tanaka K., Waki H., Ido Y., Akita S., Yoshida T.: Rapid Commun. Mass Spectrom. 1988. 2, 151 Tanaka K.
JB Fenn vyvinul ionizaci elektrosprejem Fenn JB., Mann M., Meng CK., Wong SF., Whitehouse CM.: Science 1989, 246, 64
Oba získali Nobelovu cenu v roce 2002 v oboru chemie Fenn J.B.
Princip Hmotnostní spektrometrie (MS) je fyzikálně-chemická metoda, která určuje hmotnosti atomů, molekul a molekulových fragmentů po jejich převedení na ionty. Přístroj se nazývá hmotnostní spektrometr.
Princip 9 MS vypovídá o primární struktuře analyzované látky 9 Neposkytuje informace o sekundární či terciální struktuře proteinu 9 Odhaluje posttranslační a chemické modifikace proteinů (fosforylace, glykosylace, oxidace….) a může určit i místo modifikace 9 Může určit izotopový poměr prvků ve vzorku např. 13C/12C, 34S/32S, 18O/16O - kvantifikace
Princip 9 Umožňuje analýzu komplexních směsí 9 Změření molekulové hmotnosti, kontrola kvality 9 Identifikaci proteinů 9Odhaluje mutace a DNA sekvenační chyby 9Možnost analýzy nekovalentních komplexů
Vlastnosti hmotnostní spektrometrie 9Citlivá 9Specifická 9Rychlá 9Jednoduchá interpretace dat
Popis přístroje Experimentální uspořádání 1. Iontový zdroj 2. Hmotnostní analyzátor 3. Detektor 4. Řídící počítač
Součásti MS systému Vacuum System
Atmosphere Sample Inlet
Ionisation Method
Mass Analyser
Detector
Data System
MALDI-TOF hmotnostní spektrometry MA L (A DI-T pp O lie d B F Vo ya io s yst ger em s)
4800 MALDI TOF/TOF (Applied Biosystems)
Ultraflex III MALDI TOF/TOF (Bruker)
Princip Ionizace 1.Měkké techniky ionizace Energetický přebytek dodaný molekule je malý a fragmentace primárně vzniklého iontu je malá.
2. Tvrdé techniky ionizace Dodaná energie postačuje k rozsáhlejší fragmentaci primárně vzniklého iontu.
Typy ionizace - nárazem elektronů (EI) - působením elektrostatického pole (FI, FD) - chemickou ionizací (CI) - nárazem rychlými atomy nebo ionty (FAB) - ionizací fotony - ionizací
252Cf
- elektrosprejem, termosprejem (ESI) - ionizace laserem za přítomnosti matrice (MALDI)
Hmotnostní analyzátory Umožňují rozdělit v čase nebo prostoru směs iontů o různých hmotnostech.
Typy analyzátorů 9 Kvadrupolový analyzátor (jednoduché, trojnásobné) 9 Iontová past 9 Průletový analyzátor (TOF) 9 Hybridní (Q-TOF, Q-trap, TOF-TOF, trap-TOF, trap-ICR, …) 9 FT-MS (ICR-MS)
Detektor Poskytuje analogový signál úměrný počtu dopadajících iontů. Dělí se do dvou skupin 1. Detektory pro přímá měření detekují el. proud vznikající přímým dopadem stanovovaných iontů (měření izotopového zastoupení prvků při zjišťování stáří hornin)
2. Násobičové detektory využívají efekt násobení elektronů uvolněných z první konverzní dynody po dopadu iontů (nejčastěji používané detektory v MS, poskytují měřitelný signál pro jednotlivé ionty)
MALDI
Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Metoda využívá ionizace laserem pulsní technika -------- UV (N2) IR (CO2)
9zkoumaná látka je kokrystalyzována v pevné matrici, která je ozářena krátkým laserovým pulsem (3 ns) 9dojde ke vzniku iontů (neutrálních, kladně i záporně nabitých) 9jejich proud je usměrněn do analyzátoru z doby letu (TOF)
MALDI-TOF MS - ionizace Laser
MALDI destička
1.Vzorek (A) je smíchán s matricí (M) a usušen (vykrystalizován) na MALDI destičce 2. Laserový výstřel ionizuje molekuly matrice.
AH+ +
3. Molekuly vzorku jsou ionizovány přenosem protonu z matrice: MH+ + A Æ M + AH+
+20 kV
Ground Grid
Variable Grid
Proces MALDI ionizace 9 Měkká ionizace 9 Malá nebo žádná fragmentace 9 Jednou nabité ionty [M+H]+; [M-H]9 Lze měřit proteiny, peptidy, oligosacharidy, nukleotidy, syntetické polymery … 9 Analýza komplexních sloučenin 9 Rychlá příprava vzorku & analýza 9 Tolerantní k detergentům a solím 9 Jednoduchá interpretace dat 9 Spojený s TOF analyzátorem
TOF analyzátor Ionty o stejné energii nebo o stejném impulsu mají rychlosti závislé na hodnotách efektivní hmotnosti m/z Ionty jsou vypuštěny do urychlovacího pole a se získanou energií postupují analyzátorem rychlostí v, takže dráhu d proletí za dobu t Mezi dvěma ionty rozdílných hmotností je tedy diference v dobách letu t = k ( m1/z - m2/z)
TOF analyzátor Umožňuje měřit v lineárním, reflektronovém a PSD módu Lineární mód – měření proteinů (přímá dráha letu, cca 1m) Reflektronový mód – měření peptidů (dráha letu je prodloužena pomocí reflektronového iontového zrcadla, cca 2-3m) Post-Source Decay (PSD) – kombinace reflektronového módu s fragmentací mateřských iontů (informace o sekvenci peptidů)
Průletový analyzátor (TOF) Letová trubice
15-25 kV
Zdroj iontů
Detektor
Průletový analyzátor (TOF) Letová trubice
15-25 kV
Detektor
Zdroj iontů
Lehčí ionty doletí k detektoru rychleji než ionty těžší.
Lineární mód
Reflektronový mód
Charakteristika – reflektronový mód 9Vysoké rozlišení (až 20 000) a přesnost (10-100 ppm) 9Vysoká citlivost (fmol = 10-15 mol) 9Teoreticky neomezené rozmezí m/z 9Téměř současná detekce všech iontů: zisk úplného spektra v jednom ionizačním pulsu
Příprava vzorků pro MS Předseparační techniky rozdělení analyzované látky (1D, 2D ELFO,HPLC, capLC, MudPIT HPLC ….) Dělení jak proteinových tak i peptidových směsí
Separace proteinů 1D elektroforézou
2-Dimensionální PolyAkrylamidová Gelová Elektroforéza 2D-PAGE _
+
První dimenze
++
pI 3
-+- - --
-
- - - --- -
- --
+
+
-
-
--
-
++ -
+ -
-
+
+ + + + +-
-
+ ++
+
+ -- +
++++ + - ++ --
+
++
Druhá dimenze
--
Polyakrylamidový gel ++
+
+
-
-
-
+
pI 10
Separace proteinů 2D elektroforézou pH 3-10
Separace proteinů 2D elektroforézou pH 6-11
Chromatogram separace acetonitrilového extraktu (proteiny) Brucella melitensis získaný z HPLC Alliance. ACN extrakt Brucella melitensis
Modrými šipkami je označena oblast, ve které byly jímány frakce, a šipky zelené označují konkrétně najímané frakce.
Iontový záznam v podobě BPI (base peak intensity) tryptického digestu acetonitrilového extraktu Francisella tularensis LVS separovaný na CapLC a detekovaný na hmotnostním spektrometru Q-TOF Ultima API.
ACN_FT_101204_2MS 34.78
100
TOF MS ES+ BPI 3.28e3
23.76 26.16 22.09
18.82
28.95
19.89
18.99
%
25.21 21.58 18.65
21.28 28.08 23.43 20.31 24.17 18.40
30.92 27.57
22.47
27.33 34.07
13.86
0
Time 14.00
16.00
18.00
20.00
22.00
24.00
26.00
28.00
30.00
32.00
34.00
36.00
2D-PAGE a MALDI-TOF Postup přípravy vzorků
Proteasa Separovaný Protein
Proteolytické peptidy
MALDI-TOF
MS spektrum
proteolyt. peptidů
Enzymatické štěpení vzorku Trávicí enzym trypsin umožňuje specifické štěpení peptidové vazby u kladně nabitých zbytků. Trypsin štěpí peptidové vazby na C-konci kladně nabitých zbytků argininu a lysinu, není-li následující zbytek prolin.
- Phe - Trp - Met - Gly - Ala - Lys - Leu - Pro - Met - Asp - Gly - Arg -- Cys -
Trypsin
Matrice Matrice slouží jako rozpouštědlo analytu, takže jeho molekuly jsou dostatečně zájemně separovány a jejich intermolekulární působení je redukováno na minimum Matrice musí absorbovat v UV oblasti (pokud používáme N2 laser) a musí být málo těkavá (to souvisí s čerpací rychlostí vakuového systému) Matrice musí vytvořit co nejjemnější směsné krystaly U matric je důležitá přítomnost -OH skupin, které zajišťují ionizaci analytů. Pokud jsou -OH skupiny nahrazeny za CH3CO- skupiny, matrice ztrácí svou funkci
MALDI-TOF MS Výběr matrice α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA)
Peptidy < 10kDa
Sinapinic Acid
Proteiny > 10kDa
2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB)
Neutrální karbohydráty, Syntetické polymery
“Super DHB”
Proteiny,
3-Hydroxypicolinic acid
Glycosylované proteiny Oligonukleotidy
HABA
Proteiny, Oligosaccharidy
Krystalizace matrice
α cyano Zakulacené
Sinapinic acid Kosodélníky
Krystaly vzorku a matrice SA na MALDI destičce
Brucella melitensis CAPM 6374
Burkholderie pseudomallei CAPM 3462 Francisella tularensis CAPM 5541
Interpretace spekter Metoda peptidového mapování (PMF) Voyager Spec #1 MC[BP = 1112.6, 39593] 1112.57
100
4.0E+
90 80 1508.83
% Intensity
70 60 1337.66
50
1806.97 40 30
721.40 1032.59
20 1278.70 10 0 700
874.52
1718.91
1204.64 1381.70 1530.83 1095.54 1260
2007.11 1851.91 1820
2299.22 2310.25 2380
Mass (m/z)
2940
0 3500
Selekce monoizotopického píku Pro přesnost měření je důležitá kalibrace přístroje Voyager Spec #1 MC[BP = 1112.6, 39593] 1032.59
100
1.0E+
90 80
% Intensity
70 1033.59
60 50 40 30
1034.59 20 10 0 1025.0
1028.8
1032.6
1036.4 Mass (m/z)
1040.2
0 1044.0
Voyager Spec #1 MC=>DI[BP = 1112.6, 325717] 1032.59
100
7.7E
90 80
% Intensity
70 60 50 40 30 20 10 0 1025.0
1028.8
1032.6
1036.4 Mass (m/z)
1040.2
0 1044.0
MALDI-TOF http://prospector.ucsf.edu/
Voyager Spec #1 MC=>DI[BP = 1112.6, 325717] 100
721.404125 3.3E+ 1032.590346 1112.570270 1113.045597 1134.559599 1154.533896 1204.639320 1278.698938 1337.658894 1381.701498 1507.822994 1635.907888 1702.911439 1718.915257 1806.968592 1829.902719 1851.915847 1869.037522 2006.110677 2298.243916 2301.201154
1112.57 1508.83
90 80
1806.97
% Intensity
70 60
1337.66
50 40 30
1718.91 1032.59
20 721.40 10 0 699.0
1702.91 2006.11
2298.25
1278.70 1154.53 1851.91 1381.70 2211.11 1134.56 1530.83 1707.80 1979.99 1359.2
2019.4
2679.6 Mass (m/z)
3339.8
0 4000.0
Hodnocení spekter pomocí databáze - identifikace proteinu Primární struktura DNA
Primární struktura proteinu Spektrum z MS
Štěpící místa proteinu (Arg, Lys)
Experimentálně zjištěné m/z proteolytických peptidů
vs.
Teoreticky vypočtené m/z proteolytických peptidů
Metoda peptidového mapování - Peptide Mass Fingerprinting
Interpretace spekter
Databáze přístupné na Internetu
Interpretace spekter Hodnocení v databázích
Interpretace spekter Výsledek
Anotace 2D-PAGE proteinové mapy
http://web.mpiib-berlin.mpg.de/cgi-bin/pdbs/2d-page/extern/menu_frame.cgi
Kalibrace přístroje
Voyager Spec #1[BP = 1298.0, 17155] 100
1298.0050
1.7E
90 80
1047.6398
% Intensity
70 60 1674.5700 50 2096.0804 40 30 20
2468.4231 1771.6809
10
1312.0479 1678.6340 1069.6449 0 699.0
1359.4
2112.0808 2482.4645
2019.8
2680.2 Mass (m/z)
3340.6
0 4001.0
Voyager Spec #1=>AdvBC(32,0.5,0.1)=>NF0.7[BP = 1298.0, 16995] 100
1298.0050
1.7E
90 80
1047.6397
% Intensity
70 60 1674.5696 50 2096.0800
40 30 20
2468.4233 1771.6816
10
1302.0003 1678.6244 1069.6447 0 699.0
1359.4
2112.0699 2482.4588
2019.8
2680.2 Mass (m/z)
3340.6
0 4001.0
Voyager Spec #1=>AdvBC(32,0.5,0.1)=>NF0.7=>MC[BP = 1296.7, 16 100
1296.6862
Angiotensin I Angiotensin II Neurotensin ACTH (1-17) ACTH (18-39)
90 80
1046.5400
70
% Intensity
1.7E
60 1672.9278 50 2094.0833
40 30 20
2466.1173 1769.9575
10
1300.6780 1676.9791 1068.5256 0 699.0
1359.4
2110.0598 2480.1411
2019.8
2680.2 Mass (m/z)
3340.6
0 4001.0
MS/MS spektra
Schéma fragmentace
Schéma fragmentace b1
b2
b3
R1
R3 R4 R2 NH2-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO2H N-terminus
C-terminus
y3
y2
y1
Hmotnosti aminokyselin
Hledání y-iontové série Jr_74 #888-890 RT: 22.70-22.74 AV:2 NL: 4.66E5 T: + c d Full ms2
[email protected] [ 150.00-1200.00]
968.2
100 95 90
584.9
85 80
T
X
E
75
X
D
S
A
F
70
Relative Abundance
65 60 55 50
969.2
45
653.2
40
∆113
35
∆71
30 25 766.2 20 15
∆115
218.8 190.9
10
310.1 220.0 305.9 261.1 292.0
5 200
300
∆129 341.1
439.1 420.9
403.1 385.7 400
∆113
475.9
654.1
∆101
534.0 552.1 516.0
881.2
585.8 635.1
748.1 767.2 730.3
617.1 462.9
694.1 714.2 500
600
700 m/z
877.2 859.0
822.3 841.1 800
∆87 970.2
882.2 894.1 900
950.2
1039.2 1021.1 1042.2 1000
1100
Hledání y-iontové série Jr_74 #888-890 RT: 22.70-22.74 AV:2 NL: 4.66E5 T: + c d Full ms2
[email protected] [ 150.00-1200.00]
968.2
100 95 90
584.9
85 80
E
K, Y
75
X
T
X
D
S
A
F
70
Relative Abundance
65 60 55 50
969.2
45
653.2
40 35 30 25 766.2 20 15
218.8 654.1 190.9
10
439.1 420.9
310.1 220.0 305.9 261.1 292.0
5 200
300
341.1
403.1 385.7 400
475.9
534.0 552.1 516.0
881.2
585.8 635.1
748.1 767.2 730.3
617.1 462.9
694.1 714.2 500
600
700 m/z
877.2 859.0
822.3 841.1 800
970.2 882.2 894.1 900
950.2
1039.2 1021.1 1042.2 1000
1100
Hledání b-iontové série Jr_74 #888-890 RT: 22.70-22.74 AV:2 NL: 4.66E5 T: + c d Full ms2
[email protected] [ 150.00-1200.00]
968.2
100 95 90
584.9
85 80
E
K, Y
75
X
T
X
D
S
A
F
70
Relative Abundance
65 60 55 50 45
FA
S
D
X
T
653.2
X
E
Y
969.2
K
40 35 30 25 766.2 20 15
218.8 654.1 190.9
10
439.1 420.9
310.1 220.0 305.9 261.1 292.0
5 200
300
341.1
403.1 385.7 400
475.9
534.0 552.1 516.0
881.2
585.8 635.1
748.1 767.2 730.3
617.1 462.9
694.1 714.2 500
600
700 m/z
877.2 859.0
822.3 841.1 800
970.2 882.2 894.1 900
950.2
1039.2 1021.1 1042.2 1000
1100
Kontrola hmotnosti prekurzorového píku (součet hmotností všech aminokyselin)
Jr_74 #888-890 RT: 22.70-22.74 AV:2 NL: 4.66E5 T: + c d Full ms2
[email protected] [ 150.00-1200.00] 100
968.2
1186.6
95 90
584.9
85 80 75 70
Relative Abundance
E
K, Y
65
X
T
X
D
S
A
F
60 55 50 45
FA
S
D
X
T
653.2
X
E
Y
969.2
K
40 35 30 25 766.2 20 15
218.8 654.1 190.9
10
439.1 420.9
310.1 220.0 305.9 261.1 292.0
5 200
300
341.1
403.1 385.7 400
475.9
534.0 552.1 516.0
881.2
585.8 635.1
748.1 767.2 730.3
617.1 462.9
694.1 714.2 500
600
700 m/z
877.2 859.0
822.3 841.1 800
970.2 882.2 894.1 900
950.2
1039.2 1021.1 1042.2 1000
1100
