Hmotnostní spektrometrie
MS - ÚVOD
Základní pojmy v hmotnostní sp. ▫ Hmotnostní spektrometrie = Mass Spectrometry = MS - analytická metoda, která slouží k převedení molekul na ionty, rozlišení těchto iontů podle poměru hmotnosti a náboje (m/z) a následnému záznamu relativních intenzit jednotlivých iontů - vysoce citlivá, univerzální, selektivní a destruktivní metoda s min. spotřebou vz. - k určení molekulové hmotnosti a jiných strukturních informací - je řazena mezi spektrální techniky, ale podle definice by tam patřit neměla, protože spektrální techniky využívají interakce elektromag. záření a hmoty při nichž dochází k výměně energie (UV/VIS, IR, Raman, NMR aj.) - mezi spektrální techniky je MS řazena pouze pro formální podobnost záznamů (hmotnostních spekter) a pro podobné využití techniky (strukturní analýza)
▫ Hmotnostní spektrometr = Mass Spectrometer = MS - iontově-optické zařízení, které separuje a detekuje ionty podle jejich m/z
▫ Hmotnostní spektrum = Mass Spectrum = MS - závislost relativních intenzit signálů iontů na jejich m/z
MS - ÚVOD
Základní části MS spektrometru ▫ IONTOVÝ ZDROJ- slouží k převedení neutrálních molekul analytu na nabité částice (ionty) procesem, který se nazývá ionizace
▫ HMOTNOSTNÍ ANALYZÁTOR - slouží k rozdělení iontů v plynné fázi za vakua podle poměru hmotnosti a náboje (m/z) ▫ DETEKTOR IONTŮ - slouží k detekci iontů po jejich separaci dle m/z ▫ Další části hmotnostního spektrometru: - zařízení pro zavádění vzorku (přímo nebo z jiného přístroje – GC, LC, CZE aj.) - vakuový systém - iontová optika (k urychlení a fokusaci iontů) - počítač (na ovládání přístroje a sběr, ukládání a vyhodnocování naměřených dat)
MS - ÚVOD
Hmotnostní spektrometr - schema
Vše je ovládáno pomocí software řídící jednotkou
MS - ÚVOD
Hmotnostní spektrometr - schema
Základní schéma konstrukce prvních hmotnostních spektrometrů
MS - ÚVOD
Hmotnostní spektrometry - realita ← Plynový chromatograf s hmotnostním detektorem (GC-MS)
↑ kapalinový chromatograf s hmotnostním detektorem (LC-MS)
↑ Hmotnostní detektor (MS)
MS - ÚVOD
Hmotnostní spektrum
MS – IONIZAČNÍ TECHNIKY
I. IONIZACE ▫ probíhá v iontovém zdroji ▫ slouží k převedení neutrálních molekul na nabité částice (ionty) ▫ existuje mnoho technik
▫ volba ionizační techniky závisí na mnoha faktorech: - těkavost (polarita) … pro těkavé látky (za podmínek měření) volit např. EI, CI, FI - tepelná stabilita látky … pro termolabilní volit šetrné techniky např. ESI - molekulová hmotnost (souvisí s těkavostí) … cca do 1000 g/mol … EI, CI … cca asi tisíce g/mol … APCI … nad stovky tisíc g/mol … ESI, MALDI - volba polarity … záporné ionty … pro látky snadno podléhající deprotonaci např. sulfonové a karboxylové kyseliny, polyhydroxylované látky apod. - studium nekovalentních interakcí či prostorového uspořádání biomolekul … ESI
MS – IONIZAČNÍ TECHNIKY
Přehled základních ionizačních technik ▫ ionizace za sníženého tlaku - elektronová ionizace (EI) - chemická ionizace (CI) ▫ ionizace za atmosférického tlaku (tzv. API techniky) - ionizace elektrosprejem (ESI) - chemická ionizace za atmosférického tlaku (APCI) - fotoionizace za atmosférického tlaku (APPI)
▫ desorpční ionizační techniky - ionizace laserem za účasti matrice(MALDI) - desorpční ionizace elektrosprejem (DESI) - přímá analýza v reálném čase (DART) ▫ ionizační techniky pro anorganickou analýzu - indukčně vázaná plazma (ICP)
MS – IONIZAČNÍ TECHNIKY – ZA SNÍŽENÉHOTLAKU – EI
ELEKTRONOVÁ IONIZACE (EI) ▫ nejstarší ionizační technika (popsáno již v roce 1913) ▫ „nejtvrdší“ (nejméně šetrná) ionizační technika ▫ existují rozsáhlé knihovny spekter (desítky stovky tisíc spekter
▫ podmínky použití EI ionizace: - probíhá v plynné fázi - dostat. těkavost látky za podmínek ionizace- teplota 150 – 400 °C - vakuum 10-3 – 10-5 Pa - dostatečná tepelná stabilita látky za podmínek ionizace ▫ nepoužívat zastaralý a nepřesný název „ionizace nárazem elektronů“ (Electron Impact)
MS – IONIZAČNÍ TECHNIKY – ZA SNÍŽENÉHOTLAKU – EI
ELEKTRONOVÁ IONIZACE (EI) ▫ nejstarší ionizační technika (popsáno již v roce 1913) ▫ používané ve spojení plynovým chromatografem (GC-MS) Iontový zdroj
Separace a detekce iontů
MS – IONIZAČNÍ TECHNIKY – ZA SNÍŽENÉHOTLAKU – EI
ELEKTRONOVÁ IONIZACE (EI) ▫ žhavená katoda (W nebo Re vlákno) emituje elektrony, které jsou po průchodu iontovým zdrojem zachyceny na anodě (lapač elektronů) ▫ ionizační (urychlující) potenciál mezi elektrodami určuje energii elektronů a vyjadřuje se v elektronvoltech (1 eV = 1,602 x 10-19 J) ▫ přiblížením emitovaného elektronu k valenčním elektronům molekuly analytu dojde k ovlivnění jejich magnetických polí, což může vést k uvolnění valenčního elektronu za vzniku radikálkationtu M+· (obecně ionty s lichým počtem e-).
M + e- → M+· + 2e▫ účinnost EI je cca 0,001 %
▫ vzniklé ionty jsou z iontového zdroje vypuzeny vytěsňovací elektrodou, proud iontů je následně zaostřen a urychlen dalšími elektrodami do analyzátoru iontů
MS – IONIZAČNÍ TECHNIKY – ZA SNÍŽENÉHOTLAKU – EI
ELEKTRONOVÁ IONIZACE (EI) ▫ FRAGMENTACE - v případě, že molekula získá velký přebytek energie - dojde k rozpadu nabité molekuly na menší nabité a nenabité části - při rozsáhlé fragmentaci chybí molekulární iont nenabitá částice molekulární iont ionizace
molekulární iont
fragmentový iont
MS – IONIZAČNÍ TECHNIKY – ZA SNÍŽENÉHOTLAKU – EI
ELEKTRONOVÁ IONIZACE (EI)
MS – IONIZAČNÍ TECHNIKY – ZA SNÍŽENÉHOTLAKU – EI
ELEKTRONOVÁ IONIZACE (EI) ▫ Vliv energie ionizujících elektronů na fragmentaci - čím vyšší energie, tím bohatší EI hmotnostní spektrum - čím vyšší energie, tím méně intenzivní molekulární iont
- nižší energie se používají ke relativní zvýšení intenzity molekulárního iontu, čímž ale dochází ke snížení citlivosti - obvykle v rozmezí 5 – 100 eV - v případě použití příliš velké energie dochází k rozsáhlé fragmentaci a vzniká tzv. „molekulární šrot“
MS – IONIZAČNÍ TECHNIKY – ZA SNÍŽENÉHOTLAKU – CI
CHEMICKÁ IONIZACE (CI) ▫ konstrukce iontového zdroje i princip analogické jako u EI ▫ v iontovém zdroji je navíc přítomen tzv. reakční plyn o tlaku 100 Pa ▫ reakční plyn je přítomen v nadbytku (10 000 x více než vzorku) ▫ princip ionizace: - nejdříve jsou ionizujícími e- ionizovány molekuly reakčního plynu, které poté ion-molekulárními interakcemi ionizují molekuly analytu - použití tlak 100 Pa zaručuje uskutečnění dostatečného počtu inter. - probíhá zde řada konkurenčních reakcí ▫ běžné reakční plyny jsou methan, isobutan a amoniak
▫ CI patří mezi „měkké“ ionizační techniky ▫ vznikají převážně ionty [M+H]+ nebo [M-H]- a jiné podle v závislosti na použitém reakčním plynu (obecně ionty se sudým počtem e- )
MS – IONIZAČNÍ TECHNIKY – ZA SNÍŽENÉHOTLAKU – EI vs. CI
Porovnání „tvrdosti“ technik EI a CI Mass spectra of PFBHA-derivatized 6-hydroxy-6-methyl-2-heptanone using acetonitrile as chemical ionization reagent.
EI
CI
MS – IONIZAČNÍ TECHNIKY – API TECHNIKY
API techniky (ESI, APCI, APPI) ▫ API = atmospheric pressure ionization = ionizace za atm. tlaku ▫ jiným názvem „sprejové techniky“ ▫ průlom v řešení spojení HPLC s MS detektorem (ESI - nobelova cena) ▫ ESI a APCI v současnosti standardem pro spojení s HPLC systémy ▫ APPI méně časté použití, zejména na nepolární a velmi labilní látky
▫ vznikají převážně ionty [M+H]+, [M+Na]+, [M+NH4]+, [M-H]- a jiné (obecně ionty se sudým počtem e- ) ▫ chybějící strukturní informace, které lze získat z fragmentačních iontů vznikajících při EI, lze u těchto (a i dalších) měkkých technik získat tandemovou hmotnostní spektrometrii (MS/MS)
MS – IONIZAČNÍ TECHNIKY – API TECHNIKY
API techniky (ESI, APCI, APPI) Volba techniky se řídí podle fyzikálně-chemickými vlastnostmi analytu a kompatibilitou s použitým eparačním systémem (GC, LC, CZE aj.)
MS – IONIZAČNÍ TECHNIKY – API TECHNIKY – ESI
IONIZACE ELEKTROSPREJEM (ESI) ▫ analyt je rozpuštěn ve vhodném eluentu a přiveden kovovou kapilárou s napětím 3 – 5 kV ▫ kapalina je rozprášena pomocí zmlžujícího plynu na kapičky, které nesou množství nábojů ▫ odpařováním rozpouštědla dochází ke zvyšování hustoty povrchového náboje kapičky ▫ po překročení kritické hodnoty povrchového náboje dojde k tzv. Coulombické explozi, tj. k rozpadu na ještě menší kapičky s rozdělením původních nábojů ▫ opakování tohoto procesu vede až ke vzniku kvazimolekulárních iontů vstup do IZ
výstup z IZ
MS – IONIZAČNÍ TECHNIKY – API TECHNIKY – APCI
CHEMICKÁ IONIZACE ZA ATMOSFÉRICKÉHO TLAKU (APCI) ▫ princip je podobný jako u klasické CI, ale ionizace probíhá: - za atmosférického tlaku - za průtoku mobilní fáze HPLC (0,1 – 1 ml/min) ▫ na výbojovou elektrodu je vloženo napětí 3 – 4 kV
▫ vzniká koronární výboj ▫ nejprve jsou ionizovány molekuly mobilní fáze (jsou v obrovském přebytku) ▫ následnými ion-molekulárními interakcemi reakčního plynu (tj. ionizovaných molekul MF) s molekulami analytu dochází k ionizaci molekul analytu ▫ vzniklé ionty jsou vytěsňovány elektrodami do analyzátoru iontů ▫ protiproud sušícího plynu (N2) slouží k destrukci případných nekovalentních klastrů
vstup do IZ
MS – IONIZAČNÍ TECHNIKY – API TECHNIKY – APPI
FOTOIONIZACE ZA ATMOSFÉRICKÉHO TLAKU (APPI) ▫ princip je podobný jako u APCI, ale lze ji použít pro nepolární, konjugované či labilní slouč. ▫ zdrojem UV záření je kryptonová výbojka s energií fotonů 10 eV
▫ tato energie je větší než ionizační energie nepolárních organických molekul (analytu), ale mešní než ionizační energie složek mobilní fáze ▫ nedochází k ionizaci molekul mobilní fáze (ačkoliv jsou v obrovském přebytku) ▫ vznikají ionty s lichým počtem elektronů (na rozdíl od ESI a APCI) ▫ pro zvýšení účinnosti ionizace se používá tzv. dopant (benzen, toluen, obecně IE < 10eV), který poté reaguje ion-molekulárními interakcemi s molekulami analytu a nikoliv s MF ▫ protiproud sušícího plynu (N2) slouží k destrukci případných nekovalentních klastrů
vstup do IZ
MS – IONIZAČNÍ TECHNIKY – API TECHNIKY – porovnání technik
API techniky - porovnání ▫ ESI - pro středně polární až iontové sloučeniny a biopolymery (mnohonásobně nabité) - nejšetrnější ionizační technika - méně vhodné pro bezvodé mobilní fáze a NP-HPLC - optimální průtok MF je jednotky až desítky µl/min, max. do 1 ml/min
▫ APCI - pro málo až středně polární sloučeniny s Mr do cca 1500 g/mol - vetší tolerance k obsahu solí v MF - menší tvorba adutkových iontů - optimální průtok MF stovky µl/min, max. do 1 ml/min
▫ APPI - pro zcela nepolární, konjugované či labilní sloučeniny - přídavek vhodného dopantu umožní selektivní analýzu - vhodné pro RP-HPLC - optimální průtok MF desítky až stovky µl/min, max. do 1 ml/min
MS – IONIZAČNÍ TECHNIKY – DESORPČNÍ TECHNIKY – MALDI
MALDI ▫ MALDI = matrix assisted laser desorption ionization = ionizace laserem za účasti matrice ▫ MALDI a ESI jsou nejvhodnější ionizační techniky pro analýzu biopolymerů (lze i 1MDa molekuly) ▫ výhradně se spojení s TOF analyzátorem ▫ vznikají převážně ionty [M+H]+, [M+2H]2+ [M+Na]+, [M+K]+, [M-H]- a jiné… (obecně ionty se sudým počtem e- )
MS – IONIZAČNÍ TECHNIKY – DESORPČNÍ TECHNIKY – MALDI
MALDI ▫ princip - vzorek je rozpuštěn, smísen s vhodnou matricí a nadávkován na pozice terčíku - rozpouštědlo se odpaří - aplikace krátkého (ns) a intenzivního pulsu laserového paprsku (ionizační energie) - laserový puls je absorbován matricí - dochází k přenosu absorbované energie z matrice na analyty ze vzorku, což má za následek ionizaci a desorpci iontů analytu ze vzorku
▫ vhodná matrice - musí absorbovat UV nebo IČ laserový paprsek o konkrétní vlnové délce - nejčastěji aromatické karboxylové kyseliny (kyselina dihydroxybenzoová, kyselina chlorsalicylová, skořicová aj.)
▫ lasery - UV (dusíkový laser, λ = 337 nm) - IR (OPO laser, λ = 2940 nm) … dražší ale citlivější
MS – IONIZAČNÍ TECHNIKY – DESORPČNÍ TECHNIKY – MALDI
MALDI
Pozice na MALDI terčíku jsou určeny a definovány
MS – IONIZAČNÍ TECHNIKY – DESORPČNÍ TECHNIKY – MALDI
MALDI
Dávkování manuální (na obrázku) nebo automatické z HPLC
MS – IONIZAČNÍ TECHNIKY – DESORPČNÍ TECHNIKY – MALDI
MALDI
Odpařování rozpouštědla a krystalizace matrice (zde 2,5-DHBA)
MS – IONIZAČNÍ TECHNIKY – DESORPČNÍ TECHNIKY – MALDI
MALDI
MALDI-TOF přístroje pro MALDI IMAGING techniku
MS – IONIZAČNÍ TECHNIKY – DESORPČNÍ TECHNIKY – MALDI
MALDI
MALDI-TOF přístroje pro MALDI IMAGING techniku
MS – IONIZAČNÍ TECHNIKY – DESORPČNÍ TECHNIKY – DESI
DESI ▫ DESI = desorption electrospray ionization = desorpční ionizace elektrosprejem ▫ princip - kapilárou je přiváděno, zmlžováno a ionizováno pouze rozpouštědlo - vzorek je umístěn před špičkou DESI ▫ použití - pro přímou analýzu povrchů pevných vzorků - vzorek lze použít bez jakékoliv úpravy, např. rostlinná nebo živočišná tkáň - pro rychlý monitoring výbušnin, drog, MS imaging…
MS – IONIZAČNÍ TECHNIKY – DESORPČNÍ TECHNIKY – DESI
DESI prst
bankovky
rajče
výbušniny
MS – IONIZAČNÍ TECHNIKY – DESORPČNÍ TECHNIKY – DART
DART ▫ DART = direct analysis in real time = přímá analýza v reálném čase ▫ princip - reakční plyn (He nebo N2) jsou excitovány výbojem - vznikají ionty, neutrální částice a metastabilní částice reakčního plynu - ionty, neutrální částice jsou odseparovány - ionizace molekul analytu se účastní jen metastabilní částice reak. plynu ▫ použití - analýza všech skupenství (plyn, kapalina, pevná látka) bez úpravy vzorku - technika i použití podobné DESI
MS – IONIZAČNÍ TECHNIKY – DESORPČNÍ TECHNIKY – DART
DART
list
tableta inkoust
MS – IONIZAČNÍ TECHNIKY –TECHNIKY PRO ANORGANICKOU ANALÝZU – ICP
ICP ▫ ICP = inductively coupled plasma = indukčně vázaná plazma ▫ princip - vznik, vlastnosti i způsob ionizace stejný jako v ICP-OES (viz. přednášky) - vzniklé ionty nejsou detekovány spektrálně dle λ (ICP-OES), ale dle m/z ▫ použití - pro anorganickou elementární analýzu (téměř všechny prvky) - lze i pro izotopickou elementární analýzu
Iontový zdroj
Separace a detekce iontů
MS – HMOTNOSTNÍ ANALYZÁTORY
II. HMOTNOSTNÍ ANALYZÁTORY ▫ slouží k rozdělení iontů podle jejich m/z ▫ míra kvality rozdělení jednotlivých m/z určuje kvalitu detektoru ▫ je umístěn mezi iontovým zdrojem a detektorem ▫ principy separace iontů podle jejich m/z: - zakřivení dráhy letu iontů v magnetickém (nebo elektrickém) poli … magnetické analyzátory
- stabilita oscilace iontů v 2D nebo 3D stejnosměrného a vysokofrekvenčního střídavého napětí … kvadrupóly (Q) a iontové pasti (ITD, LTD) - různá doba letu iontů v oblasti bez magnetického nebo elektrického pole … analyzátory doby letu (TOF) - různá absorpce energie při cykloidálním pohybu iontů v kombinovaném magnetickém a elektrickém poli … iontová cyklotronová rezonance (ICR)
MS – HMOTNOSTNÍ ANALYZÁTORY
ROZLIŠOVACÍ SCHOPNOST (RESOLVING POWER, RP) ▫ slouží k číselnému vyjádření kvality rozdělení iontů podle jejich m/z
▫ FWHM (full width at half maximmum = šířka píku v polovině výšky) - univerzální parametr
RP
M M
▫ Na základě překryvu 2 píků - používá se hlavně u magnetických analyzátorů - poměr hmotnosti iontu M1 a rozdílu hmotností iontů ∆M (tj. M2 – M1) za splnění podmínek: ▪ ionty M1 a M2 mají jednotkový náboj ▪ píky jsou stejně vysoké ▪ údolí mezi píky je v 1/10 výšky píků RP
M1 M 2 M1
MS – HMOTNOSTNÍ ANALYZÁTORY
SPRÁVNOST URČENÍ HMOTY (MASS ACCURACY) ▫ slouží k číselnému vyjádření správnosti určení m/z iontu přístrojem ▫ relativní rozdíl mezi experimentálně zjištěnou hodnotou m/z (naměřená přístrojem) a teoreticky vypočtenou hmotností iontu (správná hodnota) vztaženou k teoreticky vypočtené hmotnosti iontu (m / z ) EXP (m / z )TEOR MASS ACCURACY 10 6 (m / z )TEOR
▫ bezrozměrná veličina vyjadřovaná v jednotkách ppm ▫ vždy uvádět i znaménko (pozitivní nebo negativní odchylka) ▫ vysoká správnost určení hmoty (< 5 ppm) umožňuje určení elementárního složení molekuly
MS – HMOTNOSTNÍ ANALYZÁTORY
MAGNETICKÝ ANALYZÁTOR S JEDNODUCHOU FOKUSACÍ IONTŮ ▫ princip - při průchodu magnetickým polem dochází k zakřivení dráhy iontu - čím nižší hodnota m/z, tím větší zakřivení dráhy, protože ionty s nižší m/z vykazují menší odstředivou sílu než ionty s větší m/z
Plynulou změnou magnetické indukce (B) nebo urychlovacího potenciálu (V) při konstantním poloměru (r = konst.; dáno přístrojem) projdou výstupní štěrbinou (mezi magnetem a detektorem) postupně všechny ionty. Ionty dopadnou na detektor a zaznamená se jejich intenzita podle jejich m/z.
MS – HMOTNOSTNÍ ANALYZÁTORY
MAGNETICKÝ ANALYZÁTOR S DVOJÍ FOKUSACÍ IONTŮ ▫ princip - při průchodu magnetickým polem dochází k zakřivení dráhy iontu v závislosti na m/z - při průchodu elektrickým polem dochází k zakřivení dráhy iontu v závislosti na Ekin bez ohledu na jeho m/z Ionty vznikající v iontovém zdroji mají určitou distribuci energií, což negativně přispívá k větší šířce píků jejich m/z. Pokud jsou tyto ionty po průchodu elektrickým polem (v elektrostatickém analyzátoru) energeticky sjednoceny , dojde k výraznému zvýšení RP
MS – HMOTNOSTNÍ ANALYZÁTORY
KVADRUPÓLOVÝ ANALYZÁTOR (Q) ▫ princip - ionty o různé m/z jsou z iontového zdroje přivedeny do středu osy kvadrupólu a začnou oscilovat - oscilace jsou vždy stabilní pouze pro určitou hodnotu m/z a pouze ionty o této hodnotě m/z projdou analyzátorem a dopadnou na detektor - oscilace iontů o jiné hodnotě m/z jsou nestabilní a tyto ionty jsou zachyceny na tyčích kvadrupólu
Plynulou změnou hodnot stejnosměrného napětí (U) a střídavého napětí (V), která jsou vložena na tyče kvadrupólu, jsou postupně kvadrupólem propouštěny ionty podle jejich m/z Poměr U a V je vždy konstantní
MS – HMOTNOSTNÍ ANALYZÁTORY
IONTOVÁ PAST (IT) ▫ princip - ionty o různé m/z jsou z iontového zdroje krátkým napěťovým pulzem přivedeny do iontové pasti - na kruhovou a 2 koncové elektrody je aplikován vhodný poměr napětí, čímž jsou ionty uvedeny do stabilních oscilací a udržovány v pasti - plynulou změnou těchto napětí dojde k vypuzování iontů podle jejich m/z na detektor K ionizaci může docházet buď - v iontovém zdroji - nebo přímo v iontové pasti Přidává se tlumící plyn (He; 0,005 Pa) - tlumí oscilace iontů - zvyšuje RP a záchyt iontů
MS – HMOTNOSTNÍ ANALYZÁTORY
ANALYZÁTOR DOBY LETU (TOF) ▫ princip - ionty o různé m/z jsou z iontového zdroje (zpravidla MALDI) krátkým napěťovým pulzem urychleny na vstupu do analyzátorové trubice - měří se čas (ns až µs), za který ionty prolétnou trubicí (0,5 – 2 m) na detektor - doba letu je závislá na m/z Ionty s menší hodnotou m/z o stejné EKIN se v oblasti bez pole pohybují rychleji, takže se rychleji dostanou k detektoru. Skenování je velice rychlé Hmotnostní rozsah teoreticky není omezen Poměrně nízké rozlišení lze zvýšit: - opožděnou extrakcí iontů - použitím reflektronu (iontového zrcadla)
MS – HMOTNOSTNÍ ANALYZÁTORY
ANALYZÁTOR DOBY LETU (TOF)
MS – HMOTNOSTNÍ ANALYZÁTORY
ANALYZÁTOR DOBY LETU (TOF)
MS – HMOTNOSTNÍ ANALYZÁTORY
ORBITRAP ▫ princip - úzký svazek iontů o různých m/z je přiveden do analyzátoru, který je tvořen centrální elektrodou a vnějšími elektrodami - současně se vstupem iontů do analyzátoru je na centrální elektrodu aplikováno rostoucí napětí, čímž jsou ionty přinuceny k oscilacím v podélném směru (zprava doleva) kolem této elektrody - poté se hodnota napětí na centrální elektrodě stabilizuje na konstantní hodnotě, čímž dojde ke stabilizaci trajektorií iontů - frekvence axiálních (podélných) oscilací každého prstence iontů indukuje proudový obraz na vnějších elektrodách - paralelní záznam všech iontů generuje složitý signál, který je pomocí Fourierovy transformace, převeden na frekvenční závislost a následně konvertován do závislosti na m/z - každé hodnotě m/z náleží určitá hodnota frekvence axiální oscilace Výhody - současná detekce všech iontů - vysoká přesnost určení hmoty (< 1 ppm) a vysoké rozlišení (RP > 100 000)
MS – HMOTNOSTNÍ ANALYZÁTORY
ORBITRAP
Charakteristické frekvence ▫ frekvence rotace ωϕ ▫ frekvence radiální oscilace ωr ▫ frekvence axiální oscilace ωz ̴ m/z
MS – HMOTNOSTNÍ ANALYZÁTORY
ORBITRAP
animace
MS – HMOTNOSTNÍ ANALYZÁTORY
IONTOVÁ CYKLOTRONOVÁ REZONANCE S FOURIEROVOU TRANSFORMACÍ (FT-ICR) ▫ princip - v silném magnetickém poli (cca 7 Tesla)se iont pohybuje po cykloidální trajektorii s cyklotronovou frekvencí - rychlý sken (cca 1 µs) vysokofrekvenčních energií přes velký rozsah frekvencí způsobí excitaci všech iontů přítomných v cele - každé hodnotě m/z náleží určitá hodnota charakteristické cyklotronové frekvence Výhody - současná detekce všech iontů - snadná změna polarity Naprosto mimořádný MS detektor - vysoká cena (cca milion Euro) - nejlepší RP a správnost určení hmoty - nutné nejnižší vakuum (až 10-10Pa)
MS – DETEKTORY IONTŮ
III. DETEKTORY IONTŮ ▫ slouží k - detekci iontů po jejich předchozí separaci podle m/z v hmot. analyzátoru - k určení relativní intenzity těchto jednotlivých iontů
▫ elektronový násobič - nejběžnější - ionty dopadají na povrch elektrody, ze které vyrazí elektrony a tyto elektrony jsou dále zesíleny systémem dynod (zesílení až 100 000 000x) - životnost je 1 až 2 roky
▫ fotonásobič - ionty dopadají na povrch konverzní dynody, uvolní se elektrony, které dopadem na fosforovou destičku uvolní foton, který je registrován (zesíl. až 10 000 000x) - životnost je delší než u elektronového násobiče
▫ Faradayova klec - ionty dopadají na sběrnou elektr. → vybití kondenzátoru je úměrné počtu iontů - velmi přesné, používá se na izotopická měření
MS – TANDEMOVÁ MS
TANDEMOVÁ MS = tandem mass spectrometry; ve zkratce jako MS/MS nebo MSn ▫ jedná se o provedení několika (cca 2 – 5) následných MS analýz ▫ výhody - možnost selektivního výběru zkoumaných iontů - možnost fragmentace těchto iontů a analýza jejich fragmentů - významné pro strukturní analýzu sloučenin - výrazně vyšší vypovídací hodnota výsledků při kvantitativní analýze
MS – TANDEMOVÁ MS
TANDEMOVÁ MS = tandem mass spectrometry; ve zkratce jako MS/MS nebo MSn Podle způsobu provedení existují 2 varianty: ▫ MS/MS - toto provedení obsahuje 2 (a někdy i více ) hmotnostních analyzátorů, které jsou spojeny kolizní celou - vybraný iont (prekurzor) je vyseparovnán v 1. MS analyzárotu - v kolizní cele je tento iont podroben kolizní aktivaci, čímž dojde k jeho rozpadu a vzniklé fragmentové ionty (produktové ionty) jsou měřeny v 2. MS analyzátoru - v tomto případě jsou měřeny pouze ionty z vybraného prekurzoru ▫ v iontové zdroji (in source CID) - ionty přítomné v daný okamžik v iontovém zdroji jsou podrobeny kolizní aktivaci - není možnost výběru iontu prekurzoru! - pokud budou přítomny i další sloučeniny, budou analyzovány také - vznikají tedy fragmentové ionty nejen z požadovaného prekurzoru, ale i z nežádoucích nečistot
MS – TANDEMOVÁ MS
TANDEMOVÁ MS MS/MS
MS – TANDEMOVÁ MS
animace
TANDEMOVÁ MS ▫ trojitý kvadrupól = triple quadrupol = triplequad = QqQ
Iontový zdroj Kolizní cela První ion selektivní kvadrupólový filtr
(zde probíhá fragmentace zvoleného iontu)
Druhý selektivní kvadrupól pro výběr fragmentů
MS – TANDEMOVÁ MS
animace
TANDEMOVÁ MS ▫ kvadrupól s analyzátorem doby letu = quadrupol – time of flight = Q-TOF
MS – TANDEMOVÁ MS
TANDEMOVÁ MS Existuje velmi mnoho kombinací hmotnostních analyzátorů…
FT-ICR
TOF/TOF QqLIT QqQ
QqQqQ BqQ
Orbitrap BEBE
Iontová past qTRAP
Q-TOF
Qq-TOF Triple TOF
… mnoho dalších ještě existuje … a bude jich přibývat.
MS – POROVNÁNÍ PŘÍSTROJŮ
POROVNÁNÍ HMOTNOSTNÍCH DETEKTORŮ Analyzer
Q QqQ IT LIT Orbitrap oa-TOF QqTOF Double focusing magnetic sector FT-ICR
Mass range Resolution Resolving Mass MS/MS Scan rate Vacuum -3 [m/z *10 ] [Δm/z] power, FWHM accuracy [scans/s] [Pa] [*10-3] [ppm]
Price [Euro]
3 3 4 - 20 4 - 20 6 20 - 40 10 - 40
0.1 - 0.7 0.1 - 0.7 0.1 - 0.7 0.1 - 0.7 -
50 - 100 15 - 20 15 - 25
low low low low <5 <5 <5
MS/MS MSn MSn MSn MS/MS
0.5 - 4 10-3-10-4 0.5 - 4 10-3-10-4 5 - 10 10-3-10-4 1 - 4 10-3-10-4 0.5 - 2 10-7 - 10-8 20 10-5 20 10-5
70 000 – 100 000 130 000 – 200 000 100 000 – 150 000 200 000 – 250 000 450 000 – 500 000 200 000 – 250 000 300 000 – 400 000
5 - 15
-
30 - 80
<5
MS/MS 0.1 - 0.5 10-5-10-6
400 000 – 600 000
5 - 15
-
100 - 1500
<2
MSn
0.3 - 1 10-9-10-10
700 000 – 1 500 000
This table summarizes typical values of operating parameters valid in February 2007. Reported values may not cover all instrument variants on the market, especially prices are subject to changes, but other parameters may change quickly as well due to the fast development in MS instrumentation. The comparison should serve as a first rough guide for newcomers in the field. Zdroj: http://www.chromedia.org
MS – TYPY SKENŮ V MS
TYPY SKENŮ MS ▫ základní sken – změření celého spektra m/z ve sledovaném rozsahu
▫ sken produktových iontů – změření MS/MS nebo MSn spektra z vybraného prekurzoru ▫ sken iontů prekurzoru – pro vybraný fragmentový iont je zjištěn původní iont prekurzoru ▫ selektivní záznam jednoho nebo více iontů = selected ion monitoring = SIM - měření intenzity signálu vybraného iontů (nebo více iontů) na čase) ▫ selektivní záznam jedné nebo více iontových reakcí = selected reaction monitoring = SRM - v prvním hmotnostním analyzátoru je vybrán iont prekurzoru o určité m/z - tento iont prekurzoru je poté v kolizní cele podroben fragmentaci - ze vzniklých produktových iontů je vybrán jeden charakteristický produktový iont o určité m/z, který je sledován
MS – HMOTNOSTNÍ SPEKTRUM
HMOTNOSTNÍ SPEKTRUM ▫ záznam odezvy hmotnostního detektoru ▫ v praxi ve formě tzv. normalizovaných spekter = nejintenzivnějšímu píku je přiřazena relativní intenzita 100 % a relativní intenzity ostatních píků jsou dopočítány ▫ osa x = poměr hmotnosti a náboje iontu [m/z] ▫ osa y = relativní intenzita [%] ▫ ve spektru je obvykle pozorován pík molekulárního iontu a dále píky fragmentových iontů ▫ spektra mají čárový charakter (1 čára = 1 hodnota m/z)
MS – HMOTNOSTNÍ SPEKTRUM
HMOTNOSTNÍ SPEKTRUM ▫ lze měřit hmotnostní spektra i velkých biomolekul (proteiny, DNA aj.)
MS – HMOTNOSTNÍ SPEKTRUM
HMOTNOSTNÍ SPEKTRUM MOLEKULÁRNÍ IONT - iont s nejvyšší hodnotou m/z v hmotnostním spektru (nesmí ovšem jít o izotopické píky molekulárního iontu) - jedná se o ionizovanou formu molekuly zkoumané látky - intenzita molekulárního píku má přímý vztah ke struktuře látky - u některých sloučenin je velmi intenzivní, i některých chybí
MS – HMOTNOSTNÍ SPEKTRUM
HMOTNOSTNÍ SPEKTRUM MOLEKULÁRNÍ IONT – u některých sloučenin je velmi výrazný
MS – HMOTNOSTNÍ SPEKTRUM
HMOTNOSTNÍ SPEKTRUM MOLEKULÁRNÍ IONT – u některých sloučenin je méně výrazný
MS – HMOTNOSTNÍ SPEKTRUM
HMOTNOSTNÍ SPEKTRUM MOLEKULÁRNÍ IONT – u některých sloučenin chybí
MS – FRAGMENTACE
FRAGMENTACE FRAGMENTACE ▫ fragmentace iontu prekurzoru na produktové ionty může probíhat spontánně nebo cíleně ▫ rozsah fragmentace, počet produktových iontů a jejich relativní intenzity úzce souvisí se strukturou iontu prekurzoru ▫ interpretace hmotnostních spekter bere v úvahu např.: - hodnota m/z molekulárního iontu - hodnoty neutrálních ztrát a zakázaných ztrát - přítomnost izotopických prvků pro určení přítomnosti heteroatomů - přítomnost dusíku podle m/z iontu (sudé či liché číslo → tzv. dusíkové pravidlo) - poměr izotopických prvků 13C/12C pro určení počtu uhlíků - hodnotu m/z typický ztrát pro aromatickou a alifatickou sérii - hodnoty m/z typické pro různé funkční skupiny a molekulární struktury
▫ fragmentace i pravidla pro interpretaci závisí na způsobu ionizace
MS – FRAGMENTACE
FRAGMENTACE FRAGMENTACE ▫ existuje mnoho druhů štěpení vazeb, např.
MS – FRAGMENTACE
FRAGMENTACE Např.: fragmentace dodekanu
▫ molekulární iont dodekanu (m/z = 170) ▫ fragmentace C-C vazeb je častější než vazeb C-H (množství energie potřebné k narušení C-C vazby je nižší) ▫ vzniká tak směs iontů hexylu (m/z = 85), pentylu (m/z = 71), butylu (m/z = 57), propylu (m/z = 43), ethylu (m/z = 29) a methylu (m/z = 15) ▫ doprovázená vznikem alkenyl karbokationtů (např. m/z = 55, 41 a 27) po ztrátě dvou vodíků
MS – FRAGMENTACE
FRAGMENTACE Např.: fragmentace propanu
Např.: fragmentace cyklopropanu
MS – PROTEOMIKA
PROTEOMIKA Způsoby identifikace proteinů pomocí hmotnostní spektrometrie Bottom up Protein je štěpen (enzymaticky nebo chemicky) na peptidy a vzniklá směs peptidů je analyzována pomocí MS
Top down Protein analyzován pomocí MS bez předchozího štěpení na peptidy. Iont proteinu jsou fragmentován v plynné fázi
MS – PROTEOMIKA
PROTEOMIKA Identifikace proteinů způsobem „bottom up“ - izolace proteinu (chromatograficky nebo v gelu) - enzymatické štěpení (např. trypsinem) proteinu na peptidy (8 – 15 aminokyselin)
- čištění přes C18 ve špičce - eluce peptidu cca 50 % acetonitrilem do vialky nebo na MALDI terčík - separace peptidů pomocí HPLC (neprovádí se při použití MALDI terčíku!)
- MS analýzou se určí hodnoty m/z jednotlivých peptidů - MS/MS analýza vybraného peptidu způsobí fragmentaci tohoto peptidu - na základě hodnot m/z jednotlivých fragmentů je získáno pořadí aminokyselin v peptidovém řetězci (každá aminokyselina je charakterizována určitou hodnotou m/z) - porovnání s teoretickým spektrem z databází
MS – PROTEOMIKA
PROTEOMIKA Identifikace proteinů způsobem „bottom up“ peptidy
protein
MS
MS/MS
MS/MS
MS/MS
MS/MS
MS/MS
MS – PROTEOMIKA
PROTEOMIKA Identifikace proteinů způsobem „bottom up“ Obecný vzorec peptidu:
Příklad MS/MS peptidu:
Děkuji za pozornost