Studie van licht geïnduceerde eiwitoxidatie in olie in water emulsies

Lori T’Jaeckx

Studie van licht‐geïnduceerde eiwitoxidatie in olie‐in‐water emulsies

Studente: Lori T’Jaeckx Stageplaats: Labo voor levensmiddelenchemie en humane voeding Universiteit Gent Coupure links 653 – 9000 Gent Stagegever: Prof. Dr. Ir. Bruno De Meulenaer Stagementor: Dr. Ir. Frédéric Mestdagh Stagebegeleider: Apr. Bart Quartier Academiejaar: 2008 ‐ 2009

Lori T’Jaeeckx Studie vaan licht‐geïnd duceerde eiw witoxidatie in o olie‐in‐waterr emulsies

Voorw woord Dit eindw werk vormt de kroon op p de drie jaar opleiding ttot biomedische laborato oriumtechno oloog, die ik aan De Hogeschoo ol West‐Vlaaanderen heb doorlopen. Dit eindwerk werd geko oppeld aan een stage, t mei 2009 heb gelop pen in het laabo voor levvensmiddelenchemie en humane die ik vaan februari tot voeding van de Universiteit Gentt. Vooreerst wil ik Pro of. Dr. Ir. Bru uno De Meu ulenaer bedaanken voor de d geboden stage‐ervaring in dit labo. Oo ok mijn stagementor, Drr. Ir. Frédériic Mestdagh, vormde eeen belangrijkke schakel in n het tot stand ko omen van dit eindwerk.. Dankzij zijn n deskundigge begeleidin ng, zowel in het labo als bij het schrijven n van dit rap pport, heb ikk de vele Exccel‐bestande en kunnen saamenvoegen n tot dit eind dproduct. Bedankt hiervoor! Sofie, M Michael, Heidi, Laurent en n alle andere studenten en werknem mers in het labo ben ik ook zeer dankbaaar voor de to offe sfeer in het labo. Ik mag hierbij zzeker mijn collega‐stagiaair, met wie ik samen het ondeerzoek heb u uitgevoerd, n niet vergeten. Bedankt vvoor de aanggename en vvlotte samen nwerking, Virginie. Daarnaaast wens ik d de lectoren vvan de hogeschool te be edanken voo or de leerrijkke jaren, waaarbij mijn bijzondeere dank uitggaat naar Aprr. Bart Quarttier, mijn stagebegeleideer. Tot slot bedank ik mijn familie en n vrienden, vvoor de steun en het luissterende oorr. Dank u aallen, Lori Juni 2009 J


Samen nvatting Het onderzoek voorr dit rapportt werd gevoeerd in het laabo voor levvensmiddelenchemie en humane voeding aan de Universiteit Gent. De studie kadert in een projectt dat oxidatie in zuivelproducten onderzoekt. In dit on nderzoek weerd specifiek licht‐geïnduceerde oxidaatie bestudeerd. Melk diee aan licht wordt w blootggesteld krijgt een zwave elige geur. Die D geur worrdt veroorzaaakt door oxidatierreacties. Rib boflavine, een geel gekleurd vitamine e, dat in melk aanwezig is, zet onde er invloed van lichtt zuurstof om m in een acttieve vorm m met een hogger energieniiveau. Ribofllavine wordtt omwille van dezze eigenschaap een foto osensitizer genoemd. Het H geactiveeerde zuursstof (singletzuurstof) oxideertt de melkcom mponenten. Vooral de vetbestandd v elen en de eiwitfractie e vvan de melkk worden aangetasst. Om de effecten van licht en de aanwezigheiid van een fotosensitize f r op melkeiw witten te bestuderen, werd voor v deze studie s gebru uik gemaakt van olie‐in n‐water emu ulsies als matrix. De emulsiess bevatten één é van de twee t types melkeiwitten m n, namelijk wei. w Daarnaaast bevatten n ze oliën met verrschillende onverzadigd dheidsgraad. Aan de emulsies werrd een hoeeveelheid riboflavine toegevoegd, vergelijjkbaar met d de concentraatie in melk. De vergelijkking werd geemaakt met emulsies die geen n fotosensitizer bevatteen. De emullsies werden n zowel ond der belichtin ng als in het donker bewaard d en op verrschillende punten p in de d bewaartijd werden een e reeks teests op de emulsies uitgevoeerd. In het hoofdstuk ‘Reesultaat en discussie’ vaan dit rappo ort wordt eeerst een optimalisatiestu udie voor n afbraakpro oduct N‐formylkynureniine via fluorrometrie, tryptofaanbepaling en de bepaaling van zijn die werd gevvoerd aan de d hand van n caseïne‐ en e wei‐oplosssingen. De optimale besprokeen. De stud excitatieegolflengte voor v het bep palen van trryptofaan we erd op 280n nm vastgeleggd en de bijjhorende emissieggolflengte bedraagt 330 0nm. Voor de bepaling van N‐formylkynuren nine is de optimale excitatieegolflengte 330nm 3 en de emissiego olflengte bed draagt hierbij 420nm. Er werd een duidelijk verband vastgesteld tussen de affbraak van trryptofaan en n de vormingg van N‐form mylkynurenine. In een eeerste bewaarstudie werd den de oxidaatieve effecte en ten gevolge van licht en een fotossensitizer nagegaan in emulsiees van wei‐eeiwit met so ojaolie of visolie. Versch hillende emulsies werde en onder belichtin ng en in het donker bew waard en zow wel emulsies met als zo onder riboflaavine werden bereid. Aan de emulsies e weerd dimethyldicarbonaatt als antimicrobieel agen ns toegevoeggd. De oxidaatie werd aan de h hand van verschillende paarameters nagegaan. De afbraaak van ribofflavine werd d in functie vvan de tijd o opgevolgd met een RP‐H HPLC method de. Reeds na enkeele dagen bleek het ribo oflavine te zijn z weggere eageerd. Tryyptofaan en N‐formylkynurenine werden bepaald aan de hand van de geo optimaliseerd de procedurre. In de beelichte emullsies met n daling van de tryptofaaan‐inhoud waargenomen n in functie vvan de tijd en n parallel riboflavine werd een daarmeee een verhogging van de h hoeveelheid NFK. Ook daaalt in deze emulsies de hoeveelheid d vrije en totale thiolgroepen n door oxxidatie van n de cyste eïne residu u’s. Beide werden met m een paald. Door oxidatie van n het aminozuur histidine e worden spectroffotometrische analyse met DTNB bep carbonylgroepen geevormd in de belichte emulsies e me et riboflavinee, wat specctrofotometrrisch met w bepaald d. Het effect is telkens groter voorr de emulsiees met visollie dan met sojaolie. DNPH werd Doordatt er ook oxidatie optrad in de belichtte visolie‐em mulsies zondeer riboflavinee, werd verm moed dat de visoliie uit zichzelf al een fottosensitizer bevat. Bovendien komt de reactie ttrager op gaang in de emulsiess met visoliee, wat kan verklaard v wo orden door de d aanweziggheid van eeen anti‐oxidaans in de visolie.


Daaropvvolgend werrd een tweeede bewaarrstudie opge ezet met geebruik van emulsies met m meer verschillende oliën, n namelijk olijffolie, sojaoliee, algenolie e en een andeere visolie dan in de eerstte studie. De bewaaarcondities en de sameenstelling vaan de emulsies is gelijkaaardig aan d de eerste stu udie, met enig verrschil dat geeen antimicrrobieel agen ns werd toegevoegd, om m eventuelee interferenttie uit te schakeleen. Dezelfde oxidatieparaameters als iin de eerste studie werdeen gecontroleerd en enkkele extra parametters werden uitgetest. Alle belichte emulsiees met ribofflavine verto oonden terugg een dalingg van de hoeeveelheid tryyptofaan, n totale th hiolgroepen en een stijgende s ho oeveelheid NFK en caarbonylgroepen. De vrije en waarnem mingen in dee eerste stud die werden h hiermee beve estigd. De riboflavine‐an nalyse wees uit dat al na zeven dagen al het riboflavvine was weeggereageerrd. Dit was ook merkbaaar aan de oxidatie‐ eikt. Ook meet gebruik van deze ande ere visolie parametters, waar naa zeven dageen een plateaau werd bere werd teerug een oxidatie‐effe o ct waargen nomen in de d belichte emulsie zzonder toeggevoegde fotosenssitizer. Ook d deze visolie b bevat dus mo ogelijk een se ensitizer. Naast dee gebruikelijjke spectrofotometrische methode voor het meten van caarbonylgroep pen werd een fluorometrischee methode geetest. De ressultaten die hiermee bekkomen werd den, lagen in dezelfde lijn van de spectroffotometrisch he methode.. De fluorescentiemetho ode is dus eeen goed altternatief, maar heet nadeel ervvan is dat de carbonylgrroepen niet kunnen worden gekwantificeerd. Daarnaast D zijn de ffluorescentieemeting op lysine, de sp pectrofotome etrische bep paling van vrije aminogro oepen en de aminozuuranalyse met HPLC geen goedee methoden gebleken om m lichtoxidatie in emulssies op te doordat wein nig verschil te bemerken valt tussen d de belichte een onbelichtee emulsies. sporen d Daarnaaast werd de hoeveelheid d geconjugeerde diënen n en triënen n en het p‐aanisidinegetaal van de oliën in d de emulsies spectrofotometrisch opggevolgd in fu unctie van dee tijd. Voor aalle belichte emulsies met riboflavine en de belichtte visolie‐em mulsie zond der riboflavine werd eeen sterk ve erhoogde heid geconju ugeerde diën nen aangetro offen. Bij de e geconjugeeerde triënen was hetzelffde beeld hoeveelh te zien, met algenollie als uitzon ndering, waaar de hoevee elheid niet steeg, s maar zelfs daalde e omwille hoge hoeveelheden geco onjudeerde trriënen in de algenolie zeelf. Ook het p p‐anisidinege etal steeg van de h voor allee belichte em mulsies met riboflavine in functie van n de tijd. Een n belangrijkee vaststellingg bij deze drie parrameters is dat de veteextractie uitt de emulsie es waarschijjnlijk niet volledig is en n dat de efficiëntie in functiee van de bew waartijd nieet hetzelfde blijft. Daard door zijn de bekomen re esultaten slechts rrelatief, maar kunnen tocch een trend aantonen. Het oxid datie‐effect w was het klein nst in de emulsies met o olijfolie, gevo olgd door de sojaolie‐em mulsies. In de emulsies met alggenolie en visolie was heet effect het grootst. Dezze bevindingg werd bevestigd aan oly‐onverzad digde bindinggen bleek de hand van een vettzuurprofiel, waarbij algeenolie en visolie meer po te hebbeen dan sojao olie en dan ollijfolie. Tot slot werd in dezze tweede bewaarstudie b e de microbiiologische sttabiliteit van n de emulsie es zonder mulsies ware en bacterieeel gecontamineerd na tie en dagen antimicrrobieel agens gecontroleeerd. Alle em bewaring, wat de reesultaten van n de studie zzou kunnen beïnvloed h hebben. Enkeele pasteurissatietests werden reeds uitgevoerd en lijken in eerste e instan ntie een affdoende maaatregel te zijn om mulsies op ssteriele wijzee te kunnen voeren voor een period de van ongeveer drie bewaarsstudies op em weken.


Verkla arende w woordenllijst Allylisch

Bind ding aan een verzadigd koolstofato oom naast eeen dubbele e binding (IUP PAC).

Anthocyyaan

Paarrs plantenpiggment dat be ehoort tot dee flavonoïdeen (IUPAC).

Autoxidaatie

Een vorm van oxidatie die sspontaan plaaatsgrijpt in d de aanweziggheid van zuurrstof of straling.

Biologiscche energie

Kan in twee vormen vo oorkomen: als chemiscche energie e in de energierijke verbinding ATP en als elekttrochemischee energie in de vorm van de protonen n drijvende kkracht (Konin ngs, 2002).

Chlorofyyl

Blad dgroen

Colloïdale suspensie

Vloeeistof waarin n grotere, vasste deeltjes zzijn gedisperrgeerd (IUPA AC).

Diradicaal

Molecule met twee ongep paarde elekktronen, waarin minste ens twee e oestanden kunnen k geïd dentificeerd worden versschillende elektronento (IUP PAC).

Emulsie

Men ngsel van tw wee vloeibare e fasen, die onder norm male omstand digheden niet mengbaar zijn, maar door toevo oegen van een emulgator wel mogeen verdeeld zijn. hom

Ene‐reacctie

De aadditie van eeen compone ent met een dubbele bin nding en een n allylisch waterstofatoom m (de ‘ene’) aan een component met een mee ervoudige ding (de ‘enofiel’), waaarbij het allylisch a waterstofatoom m wordt bind overrgedragen en n een reorgaanisatie van d de binding plaatsvindt (IUPAC).

Fluoresccentie

Spontane emissie van straling, door een n geëxciteerrde molecule e die niet wicht, als gevolg van v een in evenwicht is met zijn evenw UPAC) elekktromagnetissche bestraling ervan. (IU

Fosforesscentie

Spontane emissie van strraling als gevolg van een verand dering in nmultipliciteit bij de overrgang van eeen triplet‐ naaar singlettoe estand of spin vice versa (IUPA AC).

Fotomultipliertube

Een detector diee kleine hoevveelheden liccht in een diggitaal signaal omzet.

Fotosenssitizer

Een chemische stof die nodig n is voo or fotodynamische reaccties. De foto osensitizer transfereert d de energie vaan het licht o om reactieve e zuurstof soorrten te genereren.

Interne cconversie

Foto ofysisch procces waarbij een isoenerrgetische, sttralingsloze overgang o plaaatsvindt tusssen twee ele ektronentoesstanden mett dezelfde spinmulti‐ pliciteit. (IUPAC))

Intersystteem crossin ng

Foto ofysisch procces waarbij een isoenerrgetische, sttralingsloze overgang o plaaatsvindt tusssen twee elektronentoestanden met verschillende spin nmultipliciteit (IUPAC).


Maillard‐reactie

Com mplexe serie van reactiess tussen amin nozuren en ggereduceerd de suikers die meestal plaaatsgrijpen bij verhooggde temperaaturen (Waggeningen Univversity).

Micel

Aggregatie van o oppervlakte actieve stofffen die in evvenwicht besstaat met moleculen en n ionen waarrmee ze zijn opgebouwd (IUPAC). de m

Olfactorisch

Mett betrekking tot het reukvvermogen.

Organoleeptisch

Mett betrekking tot de senso oriële eigenschappen zoaals smaak, ge eur, kleur en m mondgevoel..

Paramaggnetisme

Subsstanties meet een magn netische sussceptibiliteit groter dan n nul. Ze worrden naar een magnetisch veld toegeetrokken (IUP PAC).

Peroxideegetal

Het milli‐equivaalent peroxiide per kg staal dat ttitrimetrisch bepaald worrdt.

Porfyrinee

Natu uurlijk pigmeent met een fundamenteeel skelet van vier pyrroo ol kernen verb bonden via de α‐positties door vier v methinee groepen tot een maccrocyclic stru uctuur (IUPAC C).

Quencheer

Een molecule dat d de geëxcciteerde toestand van eeen andere molecule deacctiveert door energie‐ off elektroneno overdracht o of chemisch. (IUPAC)

Riboflavine

Vitamine B2

Singletto oestand

Toesstand waarvan het totale e spinkwantu umgetal nul bedraagt (IU UPAC).

SN1 positie

Vetzzuur op de eerste possitie van eeen glycerolru uggengraat aan een triglyceride.

SN3 positie

Vetzzuur op de derde possitie van eeen glycerolru uggengraat aan een triglyceride.

Spinkwantumgetal

Het vierde kwaantumgetal dat het inttrinsieke ho oekmoment van een parttikel karakterriseert.

Spinmulttipliciteit

Het aantal moggelijke oriënttaties van een spin hoeekmoment, berekend b nkwantumgeetal plus één (IUPAC). als ttwee maal heet totale spin

Tocofero ol

Vitamine E

Tripletto oestand

Toesstand waarvan het totale e spinkwantu umgetal één bedraagt (IU UPAC).

Triplet‐triplet‐annihilatie

Tweee atomen of o moleculaire entiteiteen, beide in n de tripletttoestand, interageren om één atoom of moleculaaire entiteit in een geëxxciteerde ere in de gro ondtoestand te vormen (IUPAC). singglettoestand,, en een ande

Vial

Reciipiënt voor een e te analyyseren staal om bijvoorb beeld in een n HPLC of GC ttoestel te plaaatsen

β‐caroteeen

Oran nje kleurstoff, precursor vvan vitaminee A


Afkortingen 1

O2 Sen 1 Sen* 3 O2 3 Sen* ADH C‐18 kolom DATEM DHA DMDC DNPH DTNB EDTA EPA FMOC g GC h HPLC kcal NaAc NFK OPA p‐anisidiine PAV PBS PET RF rpm SDS TCA TNB TNBS Trp UV 1

singletzuurstof singlet fotosensittizer geëxxciteerde singglet fotosenssitizer tripleetzuurstof geëxxciteerde trip plet fotosenssitizer aanb bevolen dageelijkse hoeveeelheid kolom gemodificceerd met occtadecyl‐groe epen n monoglyce eriden; emulgator diaceetyl tartaarzuur ester van doco osahexaeenzzuur; omega‐‐3‐vetzuur dimeethyldicarbonaat 2,4‐d dinitrofenylh hydrazine 5,5’‐‐dithiobis‐2‐n nitrobenzoëzzuur ethyyleendiamineetetra‐azijnzu uur eicossapentaeenzzuur; omega‐‐3‐vetzuur 9‐flu uorenylmethyyl chloroform maat zwaaartekrachtsversnelling gaschromatograffie uur high pressure liquid chromattography of h hoge druk vlo oeistof chrom matografie kiloccalorie natriiumacetaat N‐formylkynuren nine ortho‐ftaalaldehyde para‐anisidine para‐anisidine vaalue of para‐‐anisidine getal phossphate buffeered saline polyethyleentereeftalaat of omgekeerrde fase reversed phase o roun nds per minu ute of toeren per minuut sodiu um dodecyl sulfaat of naatrium dodeccyl sulfaat trich hloorazijnzuu ur 5‐thiio‐2‐nitroben nzoëzuur 2,4,6 6‐trinitroben nzeen sulfonzzuur trypttofaan ultraaviolet


Inhou udsopgav ve Voorwoo ord ................................................................................................................................................. 2 Samenvaatting .............................................................................................................................................. 3 Verklareende woordeenlijst .......................................................................................................................... 5 Afkortinggen ................................................................................................................................................. 7 Lijst van de figuren ................................................................................................................................... 12 . ............................................................................................................. 13 Lijst van de tabellen .................... 1.

probleemsteelling ................................................................................. 14 Inleeiding, situattieschets en p

2.

Liteeratuurstudiee ............................................................................................................................... 15 2.1.

Samenstelling van melk ........................................................................................................... 15

2.1.1.

Eiwittten ............................................................................................................................ 15

2.1.2.

Vetten .............................................................................................................................. 16

2.1.3.

delen ..................................................................................................... 17 Overigge bestandd

2 2.1.3.1. 2.2.

Lichtoxidattie in melk................................................................................................................ 18

2.2.1.

Wat iss zuurstof – ttriplet en sin nglet toestan nden .............................................................. 18

2.2.2.

Vorming van singlletzuurstof ........................................................................................... 20

2.2.3.

met lipiden en proteïnen .................... . Reactties van singletzuurstof m ............................. 21

2 2.2.3.1.

O Oxidatiereac cties van vettten .................................................................................... 21

2 2.2.3.2.

O Oxidatiereac cties van eiwitten ................................................................................. 22

2.2.4.

Gevollgen voor dee kwaliteit van de levensm middelen ...................................................... 25

2 2.2.4.1.

O Organoleptis sche gevolgen ...................................................................................... 25

2 2.2.4.2.

V Verteerbaarh heid, allergeniciteit en to oxiciteit ......................................................... 25

2 2.2.4.3.

N Nutritionele waarde en kkwaliteit ........................................................................... 25

2.2.5.

3.

R Riboflavine ............................................................................................................... 17

Besch hermende maatregelen tegen lichtoxxidatie ........................................................... 26

2 2.2.5.1.

V Verpakking e en bewaring .................... . ..................................................................... 26

2 2.2.5.2.

Q Quenching .. ............................................................................................................. 26

Materiaal en methoden .................................................................................................................. 28 3.1.

Bereiden vvan emulsies ............................................................................................................ 28

3.1.1.

Materiaal ......................................................................................................................... 28

3.1.2.

Protocol ........................................................................................................................... 28

3.2.

3 3.1.2.1.

B Bewaarstudi e 1: emulsies met dimethyldicarbonaaat ............................................ 28

3 3.1.2.2.

B Bewaarstudi erschillende oliën ........................................ 29 e 2: emulsies met vier ve

Extraheren n van eiwitteen uit emulsies en Kjeldahlbepaling .................................................... 29


3.2.1.

Principe ............................................................................................................................ 29

3.2.2.

Materiaal ......................................................................................................................... 29

3.2.3.

Protocol ........................................................................................................................... 30

3.3.

3 3.2.3.1.

E Extractie van n eiwitten .............................................................................................. 30

3 3.2.3.2.

S Stikstofbepa ling met Kjelldahl ................................................................................. 30

Riboflavineebepaling ................................................................................................................. 31

3.3.1.

Principe ............................................................................................................................ 31

3.3.2.

Materiaal ......................................................................................................................... 31

3.3.3.

Protocol ........................................................................................................................... 31

3.4.

ntiemeting vaan tryptofaan en N‐form mylkynurenine .............................................. 32 Fluorescen

3.4.1.

Principe ............................................................................................................................ 32

3.4.2.

Materiaal ......................................................................................................................... 32

3.4.3.

Protocol ........................................................................................................................... 33

3.5.

3 3.4.3.1.

T Tryptofaan e en N‐formylkynurenine in n waterige eiiwitoplossinggen ....................... 33

3 3.4.3.2.

T Tryptofaan e en N‐formylkynurenine in n emulsies ..................................................... 33

Bepalen vaan de carbon nylgroepen vvia spectrofottometrie ....................................................... 33

3.5.1.

Principe ............................................................................................................................ 33

3.5.2.

Materiaal ......................................................................................................................... 35

3.5.3.

Protocol ........................................................................................................................... 35

3.6.

n de totale th hiolgroepen via spectroffotometrie ................................ 35 Bepalen vaan de vrije en

3.6.1.

Principe ............................................................................................................................ 35

3.6.2.

Materiaal ......................................................................................................................... 36

3.6.3.

Protocol ........................................................................................................................... 36

3.7.

3 3.6.3.1.

V Vrije thiol be epaling .................................................................................................. 36

3 3.6.3.2.

T Totale thiol b bepaling ................................................................................................ 36

Vrije amino ogroepen ................................................................................................................. 37

3.7.1.

Principe ............................................................................................................................ 37

3.7.2.

Materiaal ......................................................................................................................... 37

3.7.3.

Protocol ........................................................................................................................... 37

3.8.

Beschikbaaar lysine ................................................................................................................... 38

3.8.1.

Principe ............................................................................................................................ 38

3.8.2.

Materiaal ......................................................................................................................... 38

3.8.3.

Protocol ........................................................................................................................... 38

3.9.

e .................................................................... 38 Bepaling van carbonylggroepen via ffluorometrie


3.9.1.

Principe ............................................................................................................................ 38

3.9.2.

Materiaal ......................................................................................................................... 38

3.9.3.

Protocol ........................................................................................................................... 38 onjugeerde d diënen en triënen ............................................................ 39 Bepalingg van de geco

3.10.

0.1. Principe ............................................................................................................................ 39 3.10 3.10 0.2. Materiaal ......................................................................................................................... 39 3.10 0.3. Protocol ........................................................................................................................... 39 3.11.

Bepalingg van het p‐aanisidinegetaal ...................................................................................... 39

3.11.1. Principe ............................................................................................................................ 39 3.11.2. Materiaal ......................................................................................................................... 39 3.11.3. Protocol ........................................................................................................................... 39 3 3.11.3.1.

B Bepaling op e emulsies ............................................................................................... 39

3 3.11.3.2.

B Bepaling op v verse oliën ........................................................................................... 39

3.12.

Bepalingg van het vettzuurprofiel vvan de oliën ..................................................................... 40

2.1. Principe ............................................................................................................................ 40 3.12 3.12 2.2. Materiaal ......................................................................................................................... 40 3.12 2.3. Protocol ........................................................................................................................... 40 3.13.

uuranalyse ............................................................................................................... 41 Aminozu

3.13 3.1. Principe ............................................................................................................................ 41 3.13 3.2. Materiaal ......................................................................................................................... 41 3.13 3.3. Protocol ........................................................................................................................... 41 Microbiëële uitplatingg ........................................................................................................... 42

3.14.

4.1. Principe ............................................................................................................................ 42 3.14 3.14 4.2. Materiaal ......................................................................................................................... 42 3.14 4.3. Methode .......................................................................................................................... 42 4.

Ressultaten en d discussie ................................................................................................................... 43 4.1.

Bepaling van tryptofaaan en N‐form mylkynurenine in eiwitopllossingen ................................. 43

4.1.1.

en .................................................................. 43 Keuzee van de optiimale excitattiegolflengte

4.1.2.

Optim malisatie van de standaarrdcurve voorr tryptofaan .................................................. 43

4.1.3.

Metin ngen bij het b beginpunt ............................................................................................. 44

4 4.1.3.1.

T Tryptofaan .. ............................................................................................................. 44

4 4.1.3.2.

N N‐formylkyn urenine ................................................................................................ 46

4.1.4.

Metin ngen in functtie van de tijd d ...................................................................................... 46

4 4.1.4.1.

T Tryptofaan .. ............................................................................................................. 46


4 4.1.4.2. 4.2.

N N‐formylkyn urenine ................................................................................................ 48

Bewaarstu udie 1: emulssies met dimethyldicarbo onaat ............................................................. 49

4.2.1.

Bereid den van emu ulsies..................................................................................................... 49

4.2.2.

Extrah heren van eiwitten uit em mulsies en Kjjeldahlbepaling ........................................... 49

4.2.3.

Ribofllavinebepalin ng ......................................................................................................... 49

4.2.4.

Fluoreescentiemeting van trypttofaan en N‐‐formylkynurrenine ...................................... 50

4.2.5.

Bepaling van carb bonylgroepen n via spectro ofotometrie ..................... . ............................. 52

4.2.6.

oepen via speectrofotometrie ....................... 53 Bepaling van de vrije en de totale thiolgro

4.3.

Bewaarstu udie 2: emulssies met vier verschillend de oliën ......................................................... 55

4.3.1.

Bereid den van emu ulsies..................................................................................................... 55

4.3.2.

Extrah heren van eiwitten uit em mulsies en Kjjeldahlbepaling ........................................... 55

4.3.3.

Ribofllavinebepalin ng ......................................................................................................... 55

4.3.4.

Fluoreescentiemeting van trypttofaan en N‐‐formylkynurrenine ...................................... 56

4.3.5.

Bepaling van carb bonylgroepen n via spectro ofotometrie ..................... . ............................. 59

4.3.6.

oepen via speectrofotometrie ....................... 60 Bepaling van de vrije en de totale thiolgro

4.3.7.

Bepaling van de vrije aminogrroepen .............................................................................. 62

4.3.8.

beschikbare lysine .............................................................................. 63 Bepaling van het b

4.3.9.

n .................................................................... 64 Fluoreescentiemeting van carbonylgroepen

4.3.10. Bepaling van de geconjugeerd de diënen en n triënen ........................................................ 65 p‐anisidinegeetal .................................................................................. 68 4.3.11. Bepaling van het p 4.3.12. Bepaling van het vvetzuurprofiel ..................................................................................... 69 4.3.13. Amino ozuuranalysee ........................................................................................................... 71 obiologische uitplating ............................................................................................. 71 4.3.14. Micro 5.

Bessluit ............................................................................................................................................... 72

6.

Bibliografie ....................................................................................................................................... 74

Bijlagen ..................................................................................................................................................... 77 Bijlagee I: Gebruikte producten met leveran ncier en vesttigingsplaats .................... . ............................. 77 Bijlagee II: Resultaten aminozuu uranalyse ............................................................................................. 78 Colofon ..................................................................................................................................................... 79 Voor akkkoord verklaring .......................................................................................................................... 80


Lijst v van de fig guren Figuur 2‐1: 2 Caseïne submicellen n model van n Schmidt (1982). Schematische weeergave van n (A) een submiceel en (B) een caseïnemiceel opgebouwd uit submiccellen (Phadu ungath, 2005 5) ........................... 16 Figuur 2‐‐2: Structuurr riboflavine (Wikipedia) .................... . ..................................................................... 17 Figuur 2‐‐3: Het moleeculaire orbittaal van tripletzuurstof (M Min et al, 20 002) ........................................... 19 Figuur 2‐‐4: Het moleeculaire orbittaal van singletzuurstof (Min et al, 20 002) .......................................... 19 Figuur 2‐5: 2 Het meechanisme vo oor de vorm ming van sin ngletzuursto of in de aan nwezigheid van v licht, tripletzu uurstof en eeen fotosensittizer (Choe ett al., 2006) ....................................................................... 20 Figuur 2‐‐6: Ene‐reacttie van linoleeenzuur mett singletzuursstof (Choe ett al., 2006) ............................... 21 Figuur 2‐‐7: Oxidatierreactie van cholesterol (C Choe et al., 2 2005) ............................................................. 22 Figuur 2‐‐8: Oxidatie van tryptofaaan (Reubsaeet et al., 1998 8) .................................................................. 22 Figuur 2‐‐9: Oxidatie van tyrosinee tot di‐tyrosine (Reubsae et et al., 1998) ............................................. 23 Figuur 2‐‐10: Oxidatieereactie van histidine (Ch hoe et al., 20 006) ............................................................... 23 Figuur 2‐‐11: Oxidatiee van cysteïn ne met vorming van wate erstofsulfide (Choe et al.,, 2006) .................. 24 Figuur 2‐‐12: Oxidatiee van methio onine met vo orming van d dimethyldisulfide (Min ett al., 2002) ............. 24 Figuur 2‐‐13: Quenching mechaniismen (Min eet al., 2002) ...................................................................... 27 Figuur 3‐‐1: Principe ffluorometer ............................................................................................................. 32 Figuur 3‐‐2: Traject vaan de lichtstrraal in een sp pectrofotom meter (Ysenbaaert, 2008) ............................... 33 Figuur 3‐‐3: Reactie vvan carbonylggroepen mett DNPH ............................................................................. 34 Figuur 3‐‐4: Reactie vvan thiolgroeepen met DTNB .................................................................................... 36 Figuur 3‐‐5: Reactie vvan vrije amin nogroepen m met TNBS ......................................................................... 37 Figuur 4‐1: 4 Emissieespectrum van v tryptofaan in een concentratiee van 100µ µg/µL en 10 000µg/µL gemeten n met HPLC ..................... . ............................................................................................................. 44 Figuur 4‐2: Fluoresceentie van tryyptofaan bij excitatiegolfflengte van 2 280nm en emissie tusse en 300 en 400nm o op dag 0, voo or eiwitoplosssingen met (A) wei‐eiwit en (B) caseeïne ........................................... 45 Figuur 4‐3: Fluoresceentie van tryyptofaan bij excitatiegolfflengte van 2 280nm en emissie tusse en 300 en 400nm o op dag 0, voo or eiwitoplosssingen met ureum voor (A) wei‐eiwiit en (B) caseeïne ....................... 45 Figuur 4‐4: 4 Fluoresccentie van N‐formylkyn nurenine bij excitatiegolflengte van n 330nm en n emissie tussen 4 400 en 500nm m op dag 0, vvoor eiwitop plossingen met (A) wei‐eiwit en (B) caaseïne ................... 46 Figuur 4‐5: µg trypto ofaan per mgg eiwit in functie van de e tijd voor eiw witoplossinggen met (A) w wei‐eiwit en (B) caaseïne ........................................................................................................................................... 47 Figuur 4‐6: 4 Verschil in fluoresceentie van tryyptofaan tusssen eiwitop plossingen m met ureum en zonder ureum in n functie van n de tijd voorr (A) wei‐eiw wit en (B) caseïne .............................................................. 47 Figuur 4‐7: Fluoreescentie vaan N‐formyylkynurenine bij excitaatiegolflengtte van 330 0nm en n functie van n de tijd voo or eiwitoplosssingen mett (A) wei‐eiw wit en (B) emissieggolflengte vaan 420nm in caseïne ...................................................................................................................................................... 48 Figuur 4‐8: µg riboflaavine per mLL emulsie in functie van d de tijd voor emulsies meet (z) sojaoliie en (▲) visolie ........................................................................................................................................................ 50 ofaan per mLL eiwitextracct in functie van de tijd vvoor emulsiees met (A) so ojaolie en Figuur 4‐9: µg trypto (B) visoliie .................................................................................................................................................. 51 Figuur 4‐10: Fluo orescentie van N‐forrmylkynuren nine bij excitatiegolfl e lengte 330 0nm en 20nm in funcctie van de tijjd voor emulsies met (A)) sojaolie en (B) visolie ............. 52 emissieggolflengte 42 Figuur 4‐11: 4 µmol carbonylgroe c epen per grram eiwit in functie van n de tijd voor emulsies met (A) sojaolie en (B) visoliee ............................................................................................................................... 53


Figuur 4‐12: 4 µmol vrije v thiolgro oepen per gram eiwit in n functie van de tijd vo oor emulsiess met (A) sojaolie en (B) visoliee ............................................................................................................................... 54 Figuur 4‐13: 4 µmol to otale thiolgrroepen per gram g eiwit in i functie vaan de tijd vo oor emulsiess met (A) sojaolie en (B) visoliee ............................................................................................................................... 54 Figuur 4‐14: µg ribofflavine per m mL emulsie in functie van de tijd voo or emulsies m met () olijffolie, (▲) olie ....................................................................................................... 56 sojaolie, (z) visolie een () algeno 4‐15: µg tryptofaan per m mL eiwitextrract in functiie van de tijd d voor emulsies met (A)) olijfolie, Figuur 4 (B) sojao olie, (C) visolie en (D) algeenolie ................................................................................................... 57 Figuur 4‐16: 4 Verschiil tussen de fluorescentiewaarden van het staal met ureum m en het staaal zonder ureum in n functie van n de tijd voorr emulsies m met (A) olijfolie, (B) sojaollie, (C) visoliee en (D) algenolie . 58 Figuur 4‐17: Fluo orescentie van N‐forrmylkynuren nine bij excitatiegolfl e lengte 330 0nm en 20nm in funcctie van de ttijd voor emu ulsies met (A A) olijfolie, (B B) sojaolie, (C) visolie emissieggolflengte 42 en (D) algenolie ........................................................................................................................................ 59 Figuur 4‐18: 4 µmol carbonylgroe c epen per grram eiwit in functie van n de tijd voor emulsies met (A) olijfolie, (B) sojaolie, (C) visolie en (D) algenolie .................................................................................... 60 Figuur 4‐19: 4 µmol vrije v thiolgro oepen per gram eiwit in n functie van de tijd vo oor emulsiess met (A) olijfolie, (B) sojaolie, (C) visolie en (D) algenolie .................................................................................... 61 4 µmol to otale thiolgrroepen per gram g eiwit in i functie vaan de tijd vo oor emulsiess met (A) Figuur 4‐20: olijfolie, (B) sojaolie, (C) visolie en (D) algenolie .................................................................................... 62 4 µmol vrije v aminogrroepen per gram g eiwit in i functie vaan de tijd vo oor emulsiess met (A) Figuur 4‐21: olijfolie, (B) sojaolie, (C) visolie en (D) algenolie .................................................................................... 63 Figuur 4‐22: 4 mg beschikbaar lyysine per graam eiwit in functie van n de tijd voor emulsies met (A) olijfolie, (B) sojaolie, (C) visolie en (D) algenolie .................................................................................... 64 4 Fluoresscentie van carbonylgroe c epen bij exccitatiegolflen ngte 360nm en emissieggolflengte Figuur 4‐23: 455nm in functie van n de tijd voor emulsies m met (A) olijfollie, (B) sojaolie, (C) visolie en (D) alge enolie . 65 4‐24: mmol ggeconjugeerd de diënen peer gram vet in functie van de tijd vo oor emulsiess met (A) Figuur 4 olijfolie, (B) sojaolie, (C) visolie en (D) algenolie .................................................................................... 67 4‐25: µmol geconjugeerd de triënen peer gram vet in functie van de tijd vo oor emulsiess met (A) Figuur 4 olijfolie, (B) sojaolie, (C) visolie en (D) algenolie .................................................................................... 68 Figuur 4‐26: Absoluu ut p‐anisidineegetal in fun nctie van de tijd voor vettten uit emulsies met (A)) olijfolie, olie, (C) visolie en (D) algeenolie ................................................................................................... 69 (B) sojao

Lijst v van de tab bellen Tabel 2‐1: Samenstelling melk (n naar University of Guelph h) ................................................................... 15 2: Vetzuursaamenstelling van triglyceriden (naar U University off Guelph) .................................. 17 Tabel 2‐2 Tabel 2‐3 3: Hoeveelheeid riboflavin ne in een aan ntal voedingsmiddelen (n naar Voedinggscentrum) ........... 18 Tabel 3‐1: Samenstelling emulsiees voor bewaaarstudie 1 ....................................................................... 28 2: Samenstelling emulsiees voor bewaaarstudie 2 ....................................................................... 29 Tabel 3‐2 Tabel 4‐1: Geconjugeeerde diënen n en triënen en het p‐anisidinegetal vvan de versee oliën ................... 66 2: Vetzuurprrofiel van de gebruikte olliën ................................................................................... 70 Tabel 4‐2

14 4

Inleiding, siituatieschets en probleem mstelling Lori T’Jaeeckx Studie vaan licht‐geïnd duceerde eiw witoxidatie in o olie‐in‐waterr emulsies

1. Inle eiding, siituatieschets en p probleem mstelling Het lab bo voor levvensmiddelenchemie en n humane voeding vaan de Facu ulteit Bio‐inggenieurs‐ wetenscchappen aan de Universiteit Gent, oo ok nutriFOODchem geno oemd, onderrzoekt de im mpact van eiwitoxid datie op de kwaliteit en n veiligheid van zuivelp producten. Gedurende G d de verwerkin ng en de bewaring van melkk en zuivelp producten ondergaat de e eiwitfractiie een variëëteit aan ch hemische unnen een b belangrijke im mpact hebbeen op de kw waliteit en transformaties, waaronder oxidaatie. Deze ku de veiliggheid van deeze levensmiiddelen. Het doel van de e onderzoekken, die in dit project kaaderen, is een fund damenteel inzicht i te krrijgen in hett verloop en de gevolgeen van deze oxidatiereacties. De studie w waarover dit rrapport hand delt, kadert iin dit geheel. Melk diee aan licht wordt w blootggesteld krijgt een zwave elige geur. Die D geur worrdt veroorzaaakt door oxidatierreacties. Rib boflavine, een geel gekleurd vitamine e, dat in melk aanwezig is, zet onde er invloed van lichtt zuurstof om m in een acttieve vorm m met een hogger energieniiveau. Ribofllavine wordtt omwille van dezze eigenschaap een foto osensitizer genoemd. Het H geactiveeerde zuursstof (singletzuurstof) oxideertt de melkcom mponenten. Vooral de vetbestandd v elen en de eiwitfractie e vvan de melkk worden aangetasst. Om de eeffecten van licht en de aanwezigheiid van een fo otosensitizerr op melkeiw witten te besstuderen, werd voor deze stud die gebruik ggemaakt van n olie‐in‐wate er emulsies als matrix. D De emulsies bevatten witten, nameelijk wei. Daarnaast bevatten ze oliëën met verschillende één van de twee types melkeiw digdheidsgraaad. Aan de eemulsies werd een hoeveelheid riboflavine toegeevoegd, verggelijkbaar onverzad met de concentratiee in melk. De D vergelijkin ng werd gem maakt met emulsies e diee geen fotossensitizer n. De emulsies werden zowel onder belichting alls in het don nker bewaard d en op verschillende bevatten punten in de bewaarrtijd werden een reeks teests op de em mulsies uitgeevoerd. De aminozuren in eiwitten kunnen via diversse reactiewe egen oxidereen. Belangrijkke paramete ers om de lichtoxid datie op te volgen zijn dee vorming vaan carbonylggroepen en h het verdwijnen van thiolgroepen. Beide parameters worden w mett spectrofottometrische technieken bepaald. D De oxidatie van het aminozu uur tryptofaaan kan met flluorometrie worden aan ngetoond. Dee methoden voor de bep paling van deze en andere oxidatieparametters werden tijdens deze studie geop ptimaliseerd. Naast dee invloeden op de melkeiwitten werd ook nage egaan welke effecten in de vetfractie van de emulsie optreden. De D oxidatie van de vettten, die de vorming van n peroxiden n induceert, kan met behulp vvan verschillende metho oden aangeto oond worden. Het peroxxidegetal wo ordt op titrim metrische wijze aangetoond. In n dit onderzzoek werd dee verhoging van de geco onjugeerde d diënen en trriënen en den. het paraa‐anisidinegeetal opgevolggd met specttrofotometrische method Naast heet ontstaan vvan de zwavvelgeuren, brrengt oxidatiie ook mindeer direct waaarneembare effecten teweeg. De nutrition nele waarde van het zuivvelproduct ggaat achteruiit ten gevolgge van het ve erlies aan essentiële aminozuren en vitaaminen. Bovvendien verrhoogt moggelijk de allergeniciteit van de witten. Maatregelen om levensmidd delen te besschermen teegen lichtoxidatie worden in de melkeiw literatuu urstudie besp proken.


15

Literatuu urstudie

2. Lite eratuursstudie 2.1.Samensttelling van n melk De natuu urlijke rol van melk is, do oor zijn hogee voedingswaaarde, het vo oeden van zo oogdierjonge en en het bieden van v immuno ologische besscherming. De D samenste elling van meelk is zeer vvariabel van soort tot soort, m maar ook binn nen eenzelfd de soort zijn er veel variaaties. De perccentages diee in tabel 2‐1 1 vermeld staan, zijjn gemiddeld den voor meelk van verschillende zoogdiersoorten n. (Universityy of Guelph) Melk kan worden beeschouwd als een olie‐in n‐water emu ulsie, waarin n oliedruppels verdeeld zzijn in de continuee waterige faase. Bovendien is melk een colloïdaale suspensiee van caseïnemicellen, globulaire g eiwitten en lipopro oteïne partikels. Het iss ook een oplossing vaan lactose, oplosbare eiwitten, h) mineraleen, vitaminen en andere componenteen. (University of Guelph Tabel 2 2‐1: Samenstellling melk (naarr University of G Guelph)

WA ATER VETT Trigglyceriden Fossfolipiden Cho olesterol And dere EIW WITTEN Casseïnes Alfaa(s1)‐caseïnee Alfaa(s2)‐caseïnee Betta‐caseïne Kap ppa‐caseïne We ei‐eiwitten Alfaa‐lactalbumine Betta‐lactoglobu uline Serrum albumine Imm munoglobulines And dere LAC CTOSE MIN NERALEN RIB BOFLAVINE ANDERE TOTTAAL

Perccentage 87.3 3 3.9 3.3 4.6 0.65 5 1.75 5x10‐4 0.25 5 100

Subp percentage 100 98.3 0.8 0.3 0.6 100 77.1 30.6 8.0 28.4 10.1 16.8 3.7 9.8 1.2 2.1 6.1

2.1.1. Eiwiitten 2 De tweee belangrijkstte eiwitgroeepen in melkk zijn de case eïnes en de wei‐eiwitten n. Ongeveer 80% van de eiwittten behoren n tot de caseeïnegroep. Daartoe beho oren de alfa(ss1)‐ en alfa(ss2)‐caseïnes en bèta‐ en kappaa‐caseïnes. ZZe zijn slechtt oplosbaar b bij een hoge zuurtegraad d. Hun gemeeenschappelijjke factor is dat zee geconjugeeerde eiwitten n zijn, meesttal met fosfaaatgroepen d die geësterifiiceerd zijn aaan serine residu’s.. Door het hoge aantaal proline reesidu’s, worrdt de eiwittketen op eeen bijzonde ere wijze afgebogeen en word dt verhindeerd dat caseïne een gesloten g stru uctuur heefft, het lijkt op een

16

Literatuu urstudie


gedenatureerd globulair eiwit. D Doordat hierrdoor vele hydrofobe groepen aan d de omgevingg worden plosbaar in w water. blootgessteld, is caseïïne slecht op De fosfaaatgroepen dragen bij tot de speecifieke structuur van caseïnemole c culen, deze vormen namelijkk micellen. Caseïne C micellen zijn co olloïdale parrtikels die grote hoeveeelheden ono oplosbaar calciumffosfaat draggen. Over de werkelijjke structuu ur van de micel is n nog onduidelijkheid. Verschilllende modellen worden n hieromtren nt aangenom men. Een schematische voorstellingg van het submiceellen model iss gegeven in figuur 2‐1.

Figuur 2‐1: Caseïne su ubmicellen mod del van Schmid dt (1982). Schem matische weerggave van (A) eeen submicel en n (B) een caseïnem micel opgebouw wd uit submice ellen (Phadungaath, 2005)

De proteeïnen die ach hterblijven in het supern natans wann neer de caseïïnes worden n neergeslagen bij pH 4.6, worrden samen de wei‐eiwiitten genoem md. Het zijn globulaire eiwitten e die beter oplossbaar zijn dan de ccaseïnes. De grootste soorten zijn beeta‐lactoglob buline, alfa‐laactalbuminee, serum albu umine en immuno oglobuline. Een E kleine restfractie r van eiwitten zijn enzym men, zoals de lipasen, plasmine, p alkalisch he fosfatase, etc. (University of Guelp ph) 2.1.2. Vettten 2 De meeeste melkvettten zijn triglyceriden, die bestaan n uit een gllycerol rugggengraat en tot drie verschillende vetzuren. De meesst voorkomende vetzuurketens word den in tabel 2 2‐2 vermeld met hun procentu uele voorkomen. Verzad digde vetzuren maken twee derdee uit van dee totale hoe eveelheid vetzuren n in melk. Oliezuur O is heet meest vo oorkomende onverzadigd de vetzuur. De verdeling van de vetzuren n op de glyceerol ruggenggraat is niet w willekeurig. LLange vetzurren hebben d de voorkeur zich vast te zetten op de SN1 positie, teerwijl korte of onverzadigde vetzureen zich lieveer op de SN3 positie n. plaatsen De triglyyceriden maken 98.3% van v de vetteen in melk uit. u De klein ne rest bestaaat uit mono‐ en di‐ glycerideen, vrije verrzadigde en onverzadigd de vetzuren,, fosfolipiden en steroleen, zoals ch holesterol (Malacarrne et al., 2002). 2 Meerr dan 95% van v de vette en in melk komen k in gllobulaire vorm voor, waarbij d de grootte van de globulles varieert vvan 0.1 tot 15µm diameter.


17

Literatuu urstudie

Taabel 2‐2: Vetzuu ursamenstellin ng van triglyceriiden (naar Univversity of Guelp ph)

Vetzuur V Laange keten vvetzuren C14 Myristinezuur C16 Palm mitinezuur C18 Steaarinezuur C18:1 Oliezuur Ko orte keten vetzuren C4 4 Boteerzuur C6 Caprronzuur C8 Caprrylzuur C10 Caprrinezuur

Percentage e 67 11 26 10 20 11

Als men n rauwe meelk laat staaan, gaat dee melk sche eiden, wat met m de term m ‘oproming’ wordt aangedu uid. Dit is hett gevolg van een verschil in dichtheid d tussen de vetfase en d de plasmafasse van de melk. Do oor melk te homogeniseren worden de vetglob bules verkleind, waardo oor opromingg minder snel plaaatsgrijpt. (Un niversity of G Guelph) 2.1.3. Overige bestan 2 nddelen Verder b bevat melk n nog lactose, vvitaminen en n mineralen. De belangrijjkste rol van lactose in m melk is als fermentatie substraaat. Melkzuurrbacteriën zeetten lactose e om in melkzuur, wat aaan de basis liggt van de den van andere koolhydraten, zoals glucose, bereiding van kaas en yoghurt. Ook kleine hoeveelhed galactose en oligosaccchariden, ziijn aanwezig in melk. Melk bevvat de vetop plosbare vitaaminen A, D, E en K, en d de wateroplo osbare vitam minen van de B‐groep, met als belangrijk lid d het vitamine B2 of riboflavine. De e hoeveelheid d vitamine C C is verwaarloosbaar. Alle 22 essentiële e m mineralen, zo oals Na, K, Cl, C Ca, Mg, P, P I, Zn, … zijn ook in m melk terug te e vinden. (Universsity of Guelph h) Riboflavvine 2.1.3.1. Riboflavine (figuur 2‐2) of vittamine B2 is een acttief deel vaan de co‐en nzymen van n flavine ucleotide (FM MN) en flavine adenine dinucleotid de (FAD), diee vele oxidaatie‐reductie e reacties mononu katalyseren. Het sp peelt een essentiële e r in oxidaasen en deehydrogenasen. Riboflavvine kan rol oxideerd worrden, door w waterstof of elektronen o op te nemen n of af te gemakkeelijk gereducceerd of geo staan (Huang et al., 2004). De moleccule wordt geactiveerd d en vorm mt de triggger voor processen in n de melk. oxidatiep

Figuur 2‐2: Stru uctuur riboflavvine (Wikipediaa)


18

Literatuu urstudie

Riboflavine is als vittamine esseentieel voor de normale e groei en ontwikkeling van het lich haam, de nen en de aaanmaak van rode bloedccellen. Het sp peelt een productiie en regulattie van bepaalde hormon belangrijjke rol in de metabolisattieprocessen n van koolhyd draten, vetteen en eiwitteen en is crucciaal voor de prod ductie van biologische energie in n het elektrronentransportsysteem. Riboflavine e is ook noodzakkelijk voor het onderhou uden van heet zicht, de huid, het haar h en de n nagels. Teko orten aan riboflavine manifestteren zich vo ooral in de huid h en mucceuze memb branen, als b barsten en zweren in oeken, lippen n, tong. Ookk verschillende visuele afwijkingen a k kunnen op eeen riboflavinetekort mondho wijzen. H Het vitaminee B2 moet via de voedingg opgenome en worden. G Goede bronn nen zijn melkk, eieren, bladgroeenten en so ojabonen (Ch hoe et al, 2005). 2 De hoeveelheid riboflavine die met de voeding dagelijkss zou moeten opgenomeen worden o of de aanbevvolen dagelijkse hoeveelh heid (ADH), bedraagt 1.1mg. De D hoeveelh heid riboflaviine in een aantal voedin ngmiddelen wordt weergegeven in tabel t 2‐3 (Voedinggscentrum). Tabel 2‐3: Hoeveelheid riboflavine in e een aantal voed dingsmiddelen (naar Voedinggscentrum)

Voedin ngsmiddel Glas haalfvolle melk Portie b broccoli Biefstuk Portie aaardappelen Appel Snede kkaas Twee vvolkoren boteerhammen

Hoeveelheid riboflavine (mg) 0.5 0.5 0.15 0.1 0.05 0.05 0.05

2.2.Lichtoxid datie in m melk 2.2.1. Watt is zuurstoff – triplet en singlet to 2 oestanden 3 Tripletzu uurstof ( O2) is de meest stabiele en d daardoor oo ok de meest vvoorkomend de vorm van zuurstof. Diatomissch zuurstof,, zuurstofgass, heeft paraamagnetische eigenschappen. Dit paaramagnetism me is het gevolg vvan de parallelle spins vaan de twee b buitenste elektronen van de zuurstoffmolecule. In n ieder π‐ antibindend orbitaaal (π*) bevin nd zich één elektron (zie figuur 2‐3 3). De tweee elektronen n hebben oor het totale spinkwan ntumgetal ééén bedraagt.. De spin hetzelfde spinkwanttumgetal (+ ½ ), waardo maal het totaale spinkwantumgetal plus p één. multiplicciteit bedraaagt daardoor drie, namelijk tweem Zuurstoff is dus een p paramagnetiische molecu ule met dirad dicale eigensschappen. Heet tripletzuurstof kan direct reeageren met radicale com mponenten in voeding, m maar daar de meeste vo oedingscomp ponenten niet radiicaal zijn, treeedt een reacctie met tripletzuurstof in voeding niet vaak op.

19

Literatuu urstudie


Figuur 2‐3: He et moleculaire o orbitaal van tripletzuurstof (M Min et al, 2002))

Naast tripletzuurstoff bestaat er nog een tweeede vorm van zuurstof, dat een hoggere energie etoestand 3 1 heeft daan het O2, naamelijk het ssingletzuursttof ( O2). Hett verschil tusssen triplet‐ en singletzuurstof zit hem in d de moleculaire orbitalen n. Daar waarr tripletzuursstof twee on ngebonden eelektronen h heeft met gelijke spin, s heeft singletzuurst s of in het π**‐orbitaal tw wee gebondeen elektroneen met antiparallelle spins (zie figuur 2‐4 4). Het tweed de π*‐orbitaaal is bijgevo olg leeg. Dezze configuraatie is in tegenspraak und. Singletzzuurstof is bijgevolg een n hoogenergeetische moleecule en bevvindt zich met de regel van Hu g nd. Singletzu uurstof is ge een radicale componentt en kan gem makkelijk 22.5kcal boven de grondtoestan n met niet‐raadicale, singlet en elektrronenrijke co omponenten n met dubbeele bindingen n. Tijdens reageren de reactie worden geeen vrije rad dicalen als inttermediair gevormd (Min n et al, 2002).

Figuur 2‐4: Het moleculaire o orbitaal van sin ngletzuurstof (M Min et al, 2002)


20

Literatuu urstudie

2.2.2. Vorm 2 ming van siingletzuursstof Singletzu uurstof kan op chemissche, enzym matische en fotochemissche wijze ggevormd wo orden in voeding.. De fotochemische manier is de meeest voorkomende. Fotosenssitizers, zoaals riboflaviine, chloroffyl, porfyrin nes, …, ko omen in vo oeding voor in de 1 singletto oestand ( Seen). Het zijjn veelal moleculen m die d over veerschillende dubbele bindingen b beschikkken (figuur 2‐2) 2 en ze ku unnen bijgevvolg gemakkkelijk energiee uit ultravio olet of zichtb baar licht 1 absorberen. De senssitizer moleccule komt in n een aangeslagen singleettoestand ( Sen*) tereccht. Deze geëxciteeerde singlet fotosensitizer kan zijn energie op drie manieren kwijtraken ((figuur 2‐5).

Figuur 2 2‐5: Het mechaanisme voor de e vorming van ssingletzuurstof in de aanweziggheid van licht,, tripletzuursto of en een fotosenssitizer (Choe et al., 2006)

De geëxxciteerde mo olecule kan terugvallen naar zijn grrondtoestand d 1Sen, waaarbij fluoresccent licht wordt uitgestraald. O Ook kan de sensitizer eeen interne co onversie ond dergaan, waarbij het zijn n energie onder de vorrm van warm mte. Tot slot kan de geëxxciteerde mo olecule een intersysteem m crossing verliest o 1 ondergaan, waarbij de sensitizeer overgaat van de sin nglettoestand d Sen* naaar de tripletttoestand 3 Sen*. Fosforescent F tie kan dezee aangeslageen triplet fo otosensitizerr terug naarr de oorsprronkelijke 1 grondtoeestand Sen brengen, m maar ook kan n vanuit deze e molecule ssingletzuursttof gevormd worden. Met beh hulp van het triplet‐tripleet annihilatiee mechanism me reageert 3Sen* met 3O2 en wordt er 1O2 en 1 Sen gevvormd. De seensitizer in d de grondtoeestand kan te erug eenzelffde cyclus on ndergaan (M Min et al., 2002). Er kunneen twee typ pes van oxideerende reaccties ondersccheiden worrden. Bij hett type II mecchanisme draagt de hoog enerrgetische foto osensitizer zijn energie o over aan een laag energeetische tripletzuurstof w het ho oog energetissche singletzzuurstof en een laag en nergetische sensitizer s moleculee. Daarbij wordt 1 gevormd d. O2 is dan verantwoord delijk voor de oxidatiereaacties met de voedingsco omponenten n. Bij een tekort t een atmosferisch a h zuurstof wordt w een tyype I mechanisme geacttiveerd. Bij dit d type I mechaniisme reageeert de geëxxciteerde tripletsensitize er direct meet voedingsscomponente en. Door watersto ofionen of ellektronen op p te nemen vvan of af te staan aan deeze componenten, ontsttaan vrije radicalen n of vrij‐radiicale ionen. Deze radicallen kunnen o op hun beurrt waterstofio onen wegne emen van andere componente c en en zetten n daarmee een e radicale en kettingreaactie in gangg. Volgens de d type I 3 3 reactiew weg kan Sen n* ook reageeren met O2 om via ele ektronentran nsfer superoxxide anionen n (O2‐) te vormen. Het voorkomen van dit reactietype is betrekkeliijk laag (Min et al., 2002)).


21

Literatuu urstudie

2 2.2.3. Reaccties van siingletzuursstof met lipiiden en pro oteïnen 2.2.3.1.

Oxidatieereacties va an vetten

3.1.1. O Onverzadigd de vetzuren 2.2.3 Een beelangrijke component c van vele voedingsmiddelen zijn n de onveerzadigde vetzuren. v Singletzu uurstof kan rechtstreekss de dubbele binding van v onverzad digde vetzurren aanvalle en via de ene–reactie (figuur 2‐6), waarb bij allylischee hydroperoxiden gevorrmd worden n. De plaatss van de dubbele binding veerandert ged durende dee ene‐reactie e en het tyype dubbelee binding verandert v eveneen ns van cis naaar trans (Cho oe et al, 2006 6).

Figguur 2‐6: Ene‐re eactie van linoleenzuur met singletzuurstof (Choe et al., 20 006)

De snelh heid van dezee reactie is n niet afhankellijk van het aaantal dubbeele bindingen n in het onve erzadigde vetzuur, terwijl bij oxidatie o met tripletzuursstof, dat well het geval iss. Ook de reeactiesnelheiid en het v geeconjugeerde of niet‐ge econjugeerdee diënen of triënen, is niet van type onvverzadigde vetzuren, belang. D Dit is het gevvolg van de lage activerin ngsenergie van singletzuurstof (Choee et al, 2006). Naast dee ene‐reactie kan singleetzuurstof no og deelneme en aan 1,4‐ en 1,2‐cyclo oadditie reaccties. Het gemeensschappelijkee kenmerk vaan deze reaccties is dat err telkens een n rechtstreekkse interactie met de dubbele binding op ptreedt. Bij de oxidatieereactie me et linoleenzu uur (figuur 2‐6) worde en zowel ugeerde diëne watersto ofperoxiden gevormd. Bij de reaccties met geconjuggeerde als niet‐geconju tripletzu uurstof zijn dit enkel geco onjugeerde p producten (M Min et al., 20 002). De gevormde waterstofperoxideen worden vverder gedeggradeerd doo or homolytissche splitsingg. Daarbij md, die nog verder weggreageren to ot oxo‐componenten, ald dehyden, worden alkoxy radiccalen gevorm zuren, alcoholen en kortketten koolwaaterstoffen. Één van die reactieproducten is het D reactieprroduct is eeen zeer belangrijke meerker van veetoxidatie en e wordt malondialdehyde. Dit d in voeding om de graad d van vetoxid datie te meteen. kwantitaatief bepaald


22

Literatuu urstudie

2.2.3 3.1.2. C Cholesterol Een tweeede belanggrijke vorm van licht‐geeïnduceerde vetoxidatiee is de reacctie met cho olesterol. Hoewel de reactiesn nelheid vrij laag l is, heefft de reactie niet te ond derschatten gevolgen. De reactie tussen cholesterol c e singletzuurstof produ en uceert een hele reeks hydroperoxid h den (figuur 2‐7), die verder degraderen d n en alcohollen. Sommigge van dezee oxidatiepro oducten zijn n toxisch, tot ketonen carcinoggeen of mutaageen (Sieber et al., 2004 4; Choe et al.., 2005).

Figuur 2‐‐7: Oxidatiereactie van cholessterol (Choe et al., 2005)

2.2.3.2. Oxidatieereacties va an eiwitten In eiwittten reageerrt singletzuu urstof vooraal met vijf aminozuren, a , namelijk ttryptofaan, histidine, tyrosine,, methioninee en cysteïnee om verschillende oxidatieproducten te vormen. Andere am minozuren reageren n 100 tot 1000 1 maal minder snel. Tryptofaaan, histidine en tyrosine bevatten dubbele bindingeen die kunnen reageren n met het elektrofiele e singletzuurst s tof. Methion nine en cystteïne zijn reactief doordat ze eeen zwavelattoom met vrrije elektrone en bezitten (Min et al., 2002). De reaacties van ozuren met ssingletzuursttof worden w weergegeven n in figuren 2 2‐8 tot 2‐12. de indiviiduele amino 2.2.3 3.2.1. T Tryptofaan 1 De oxidaatieve aanval van O2 op tryptofaan residu’s gebeurt eerst in n de pyrroolrring (figuur 2 2‐8, links) met de vorming vaan oxindolyllalanine (Oiaa) en dioxin ndolylalaninee (DiOia). D De fenylgroe ep wordt 5‐OH‐Trp) en 3‐hydroxy‐ttryptofaan (3 3‐OH‐trp) geoxideeerd met de vvorming van 5‐hydroxy‐tryptofaan (5 (figuur 2 2‐8, rechts). Ook kan de pyrroolring gesplitst wo orden (figuurr 2‐8, middeen), met vorm ming van N‐formyylkynurenine (NFK) en kyynurenine (kyyn) tot gevolg (Salminen n et al., 2008 8). Tryptofaan en NFK gehaltess kunnen fluo orometrisch worden aangetoond.

Figuur 2‐8: Oxidatie vvan tryptofaan (Reubsaet et al., 1998)

23

Literatuu urstudie


2.2.3 3.2.2. T Tyrosine Ook hett aminozuur tyrosine kan geoxideerrd worden (ffiguur 2‐9), waarbij di‐tyyrosine verb bindingen kunnen ontstaan. Dee verbindingg tussen de ttwee tyrosine e moleculen n bevindt zich h op de orth ho‐plaats. Dit is heet gevolg vaan de ortho o‐para‐richteende eigenscchappen van n de hydroxxylgroep op tyrosine (Reubsaeet et al., 199 98).

Figuur 2‐9: Oxxidatie van tyro osine tot di‐tyrrosine (Reubsae et et al., 1998)

2.2.3 3.2.3. H Histidine ding bevat die geactiveerd wordt Het aminozuur histidine, die eeen elektronengevende dubbele bind door de aanwezigheeid van amin no‐ of alkoxyygroepen, wo ordt door sin ngletzuursto of geoxideerd d met de 2‐10). Deze d dioxetanen zijn onstabiell bij kamerteemperatuur en vallen vorming van dioxetaaan (figuur 2 d C‐C sp plitsing, waaarbij carbonyylgroepen worden w gevo ormd (Choe et al., 200 06). Deze uiteen door carbonylgroepen zijn n belangrijkee indicatoren n voor eiwitoxidatie en kunnen worrden bepaald d volgens 992). de methode van Levine et al. (19

Figuur 2‐10: Oxidatie ereactie van hiistidine (Choe eet al., 2006)

2.2.3 3.2.4. C Cysteïne In figuurr 2‐11 is de oxidatiereacctie met cystteïne te zien, waarbij peroxy radicaleen gevormd worden, die verder vrije thiolradicalen vo ormen. De th hiolradicalen n reageren ssamen tot waterstofsulfide (Choe 006). Het veerlies aan dee vrij voorko omende thio olgroepen op p cysteïnemoleculen op eiwitten et al., 20 worden gemeten meet de Ellman‐‐methode als oxidatieve merker.


24 4

Literatuu urstudie

Figuur 2 2‐11: Oxidatie van cysteïne m met vorming van waterstofsulffide (Choe et a al., 2006)

2.2.3 3.2.5. M Methionine datie van methionine door singletzuurstof (figuur 2‐1 12) vormt in eerste instantie De oxid hydropeeroxiden. Deze ontbindeen verder to ot methional en thiometthyl radicaleen. Door de radicaal‐ radicaal reactie tusseen verschilleende thiometthyl radicalen wordt dim methyldisulfid de gevormd. (Choe et al, 2005))

Figuur 2‐‐12: Oxidatie vaan methionine met vorming vvan dimethyldissulfide (Min et al., 2002)


25

Literatuu urstudie

2 2.2.4. Gevo olgen voor de kwalite eit van de le evensmidde elen 2.2.4.1. Organolleptische geevolgen De reacttie van zwaveelbevattende eiwitten en aminozure en met singleetzuurstof geeeft aanleiding tot de vorming van verschiillende vluch htige componenten. De studie van Jung J et al. u uit 1998 wee es uit dat melk, na vijftien minuten m blo ootstelling aan licht, all een zwavelachtige geeur vertoon nt. Naast afbraakp producten vaan lactose, werd w via gaschromatogrrafie de aan nwezigheid vvan dimethyldisulfide aangetoond. Olfacttorische tessts hebben daarbij uitgewezen u dat dit heet product is, dat verantwoordelijk is vvoor de slech hte smaak en n geurverand deringen in d de belichte m melk. De hoe eveelheid dimethyyldisulfide die d werd teruggevond den, vertoo onde een evenredig verband met de blootstellingstijd aan n licht. (Jung et al.,1998) Dimethyyldisulfide iss het oxidattieve afbraakproduct vaan methionine, maar het is niet het h enige product dat de slecchte smaak en e geur vero oorzaakt. Oo ok waterstoffsulfide, hett afbraakpro oduct van ële eigensch happen. Daaarnaast zijn ook de cysteïne‐oxidatie, veroorzaakt de gewijziggde sensorië zwavelbevattende tu ussenproduccten van de m methionine‐ en cysteïne‐‐oxidatie de b boosdoenerss. Vetoxidaatie kan eveneens de organoleptische kwaliteit van de geoxideerde voedingsm middelen verminderen. Door d de oxidatie vvan onverzad digde vetzure en worden vverschillendee vluchtige alldehyden d en verhooggt het peroxidegetal. gevormd Verteerb 2.2.4.2. baarheid, a allergenicite eit en toxiciiteit De Maillard‐reactie, die plaatsggrijpt tijdens voedsel verwerking, zo orgt voor dee vorming vaan onder andere eeiwit gebond den carbonylgroepen. Deeze gemodificeerde resid duen kunnen aanleiding ggeven tot nieuwe immunologgisch actievee structuren n. Ook de vorming van v vernettee producten n tussen geoxideeerde vetten en eiwitten,, kan aanleid ding geven tot de vorming van mind der goed verrteerbare aggregatten (Wal, 2003; Fenaillle et al., 20 005). Door de conform mationele veeranderingen n van de eiwitten, die gebeuren bij de oxidatie, o zijn n de eiwitte en minder to oegankelijk vvoor proteasen, wat aanleidin ng geeft tot een vermind derde verteeerbaarheid (D Dalsgaard ett al., 2007). A Astwood et a al. (1996) rapporteeerde het reechtlijnige verband v tusssen vermind derde verteeerbaarheid een allergenicciteit van voedingssbestanddeleen. Naast de allergie‐ en e verteerbaarheidsproblemen, mo oet ook gew wezen worden op de eventuele e gevaren,, die schuilgaan in geoxiideerde melkcomponentten. Een voo orbeeld hierbij is de oxid datie van cholesteerol, waarbij toxische, cyytotoxische, mutagene en e carcinogeene productten worden gevormd (Sieber et al., 200 04). Ook heet tryptofaaan‐oxidatieproduct kynu urenine wordt als carcinogeen uwd (Kanner et al., 1987). 1 Ook andere oxidatieprodu ucten kunnen nog on ngekende beschou gezondh heidsrisico’s iinhouden. Nutritio 2.2.4.3. onele waard de en kwalitteit Vele voedingscomponenten in melk en zuivel z zijn gevoelig g aan n de invloed den van licht, zoals verschillende vitamiinen, amino ozuren en onverzadigde vetzuren. Van V de vitaminegroep is vooral riboflavine uiterst geevoelig aan licht, maar o ook de kwan ntiteit aan viitamines A, B6, C, D en E en ook andere, vermindert ssterk onder belichting. Foto‐oxidatie e van melkeiw witten, kan leiden tot de e vorming van weiaaggregaten. Ook kunnen n de peptideenbindingen gehydrolyseeerd worden n door belich hting. De aminozu uren die het gevoeligste zijn aan lich htoxidatie, m methionine, ttryptofaan, ccysteïne, histidine en tyrosine,, worden afggebroken, en n vermindereen ook snel in hoeveelheid (Bosset ett al., 1992).


26

Literatuu urstudie

De aanvoer van deze nutriënten n, de vitamin nes en amino ozuren, is esssentieel. Dee nutritionele e waarde het voorkom men van alle e essentiële am minozuren en n de beschikkbaarheid van een eiwit is afhaankelijk van h ervan (V Van Camp et al., 1998). Melk is een belangrijkke bron van de aminozu uren cysteïne, lysine, methion nine en tryptofaan. In Weesterse landen staat melk in voor 50 0% van de daagelijkse aan nvoer van vitaminee B2 (Allen eet al., 1979).. Geoxideerd de melk bevaat minder vaan deze com mponenten d dan verse melk, en n heeft hierdoor een nutrritioneel verminderde waaarde. (Bosset et al., 199 92). 2 2.2.5. Bescchermende e maatregellen tegen liichtoxidatie e 2.2.5.1. Verpakk king en bew waring Verpakking speelt een belangrijke rol bij dee bewaring van v voeding.. Als voor dee bewaring van v melk odzakelijke faactoren voor lichtoxidattie uitsluiten n, kan de verpakkiingen wordeen gebruikt, die de noo melk ged durende lageere tijd bewaaard worden n. Een studie van Mestdaagh et al. (2005) wees uitt dat PET‐ flessen m met drie polyymeerlagen wit‐zwart‐w wit, hun inhoud afscherm men van alle golflengten vvan licht. De facto or licht word dt volledig uiitgeschakeld, waardoor lichtoxidatiee niet kan plaaatsgrijpen. Dit soort PET‐flesssen is dus een zeer gepast verpakkingsmateriaaal voor zuiveelproducten. Lichtdoorlatend PET met een n zuurstofbin ndende binn nenlaag, kan n niet alle zu uurstof aan de inhoud o onttrekken en e is dus geen afd doende maatregel. Eveneens kunnen n PET‐flessen, voorzien vvan een UV‐‐filter niet vo oldoende bescherm ming bieden n. De volled dige afweziggheid van liccht is een must om de licht‐geïnd duceerde oxidatie van melk en n andere voeedingsmiddeelen te vermiijden (Mestd dagh et al., 2 2005). Het be elang van v materiaal en het zoveel mogelijk uittsluiten van zuurstof, wordt w ook de opaaakheid van verpakkingsm door Borle et al. (20 001) bevestiigd. Door dee kopruimte boven het melkoppervl m lak te minim maliseren, n zuurstof beeperkt en vermindert de oxidatie. Vaacuümverpakkking van wordt dee hoeveelheid ingesloten bepaaldee zuivelprod ducten is een e zeer effficiënte, maaar soms moeilijk m realiseerbare maatregel m (Mortensen et al., 20 004). De keuze van de licchtbron, in de d melkverw werkingsindustrie en in opslagruimte o en van handelaars, is eveneen ns een belanggrijk aspect o om de invloeed van licht tte beperken.. Lampen diee vooral groe en, blauw en violett licht geven n, de “koudee lampen”, zijn schadelijkker voor oxid datieve afbrraak van voe eding dan de “warrme lampen””, die geel, oranje en ro ood licht afggeven. Voorral de blauw wgroene regio (420 – 460nm) is schadelijk, omdat die overeenkkomt met een absorptieemaximum van riboflavvine. Ten laatste sspelen ook belichtingsduur, afstand ttot de lichtbrron en opslagtemperatuur een rol, w waarbij ze allen zo laag mogelijk moeten geehouden worrden. (Borle et al., 2001) 2.2.5.2. Quenchiing oferolen, carotenoïden en ascorbineezuur, zijn effectieve e Natuurlijjke voedselccomponenteen, zoals toco quencheers van singleet zuurstof. Quenchers kkunnen op d drie verschilleende punten n actief zijn ((figuur 2‐ 3 13). Ten n eerste kun nnen ze de geëxciteerde g e triplet sen nsitizer ( Sen n*) inactiverren. De twee e andere 1 mechaniismen werkeen op chemissche of fysiscche manier in op het O2. Het chemissche quenchen houdt in dat de d quencherr (Q) met het h 1O2 reaggeert en een geoxideerrd product Q QO2 vormt. Fysische 1 quenchin ng resulteertt in een enerrgie‐ of ladin ngsoverdrach ht van O2 naaar Q, waarbij 1O2 terugkeert naar zijn gron ndtoestand 3O2. (Min et a al., 2002)


27

Literatuu urstudie

Figuur 2‐13: Quench hing mechanism men (Min et al.,, 2002)

Het β‐caaroteen word dt als de meeest actieve fysische que encher besch houwd. Één molecule β‐‐caroteen kan tot 1000 moleculen 1O2 inactiveren n door energieoverdraccht. Ook to ocoferolen zijn veel voorkom mende antioxxidanten, en zijn in staat de vetperoxxidatie te verrhinderen. (M Min et al., 20 002) Viljanen et al. (200 05) rapporteeerde dat de anthocyanen en and dere fenoliscche compon nenten is n duidelijke antioxidante e werking veertonen tegeen oxidatie vvan zowel aardbeieen en zwartee bessen een vetten als a eiwitten. Salminen et e al. (2008)) bevestigen n dit en schrijven de po olyfenolen rutine r en 3 catechin ne eveneens antioxidantee eigenschap ppen toe, doordat ze de Sen* toestaand inactiveren.


28

Materiaal en me ethoden

3. Ma ateriaal en method den In bijlagee I is een oveerzicht te vin nden van de ggebruikte producten met hun leverancier.

3.1.Bereiden n van emu ulsies 3.1.1. Materiaal W Wei‐poeder PBS‐buffer o op pH 6.8 o 0.13 35M NaCl o 1.5m mM KH2PO4 o 8mM M Na2HPO4 o 2.7m mM KCl O Oliën o Sojaolie olie uit pillen o Viso o Viso olie (ruw extrract) o Geraaffineerde ollijfolie o Geraaffineerde algenolie Riboflavine MDC) Dimethyldicaarbonaat (DM Hoge druk homogenisaator (APV Lab L 2000 Two‐Stage T H Homogenizer r, SPX Corp porations, C Charlotte, U SA) mixer (IKA, Staufen, Duitsland) Ultraturrax m S Schudder (Ed dmund Bühler GmbH, Heechingen, Du uitsland)

‐ ‐

‐

‐ ‐ ‐ ‐ ‐

3.1.2. Prottocol Bewaarrstudie 1: em 3.1.2.1. mulsies mett dimethyld dicarbonaatt In een eerste e belich htingsstudie werden vieer verschille ende emulsiees aangemaakt met al dan niet riboflavine en verscchillende oliën, namelijkk sojaolie en visolie uitt pillen. Daaarnaast bevvatten de eergegeven in tabel 3‐1. emulsiess wei‐eiwitteen. De exactee samenstelling wordt we Tabell 3‐1: Samenste elling emulsies voor bewaarsttudie 1

Eiwitt

(A)

O Olie 1% ssojaolie

0.6% w wei (B)

1% visolie

Riboflavine (µg/mL) 0 2 0 2

Antimicrobieel agens

Bewaar o omstandighe eden

0.015% % DMDC

4°C belicht & & donker

De bestaanddelen wo orden eerst gemixt mett een Ultraturrax mixer en daarna worden de emulsies twee maaal gehomoggeniseerd on nder hoge drruk van 300b bar. De emulsies worden n per 200mL verdeeld over drie steriele flessen en daaaraan word dt 0.015% dimethyldicarrbonaat (DM MDC) toegevvoegd als ulsies langerre tijd te kun nnen bewareen. Van de drrie flessen w worden er antimicrrobieel agenss om de emu


29


twee on nder belichtting (±1000 lux) op een schudde er bewaard, de derde wordt ter controle afgescheermd van lich ht bewaard, telkens bij 4 4°C. Bewaarrstudie 2: em 3.1.2.2. mulsies mett vier versch hillende oliëën In een tweede belichtingseexperiment wordt he et effect van v oliën met verschillende onverzad digdheidsgraaad nagegaaan. Er wordeen emulsiess met sojaollie, visolie, o olijfolie en algenolie aangemaaakt. Voor de d exacte samenstelling,, zie tabel 3‐2. De emulsies worden n op dezelfde manier bereid als in 3.1.2.1.,, met als enige verschil d dat geen antiimicrobieel aagens wordt toegevoegd. Tabell 3‐2: Samenste elling emulsies voor bewaarsttudie 2

Eiwitt

O Olie

(A))

1% o olijfolie

(B))

1% ssojaolie wei 0.6% w

(C))

1% vvisolie

(D))

1% allgenolie

Riboflavine R (µg/mL) 0 2 0 2 0 2 0 2

Antimicro obieel agen ns

Bewaar om mstandighed den

Geen n

4°C belicht & donker

3.2.Extraherren van eiiwitten uiit emulsie es en Kjeld dahlbepa aling 3.2.1. Prin ncipe Om analyses uit te voeren op de d eiwitten van v de emulsies, moeteen de vetten n worden verwijderd. Spectroffotometrisch he analyses kkunnen niet worden uitggevoerd op de emulsie zzelf omdat d de vetten teveel tu urbiditeit verroorzaken, w wat de metingen verstoorrt. Op de extracties e wo ordt telkens een stiksto ofbepaling met m Kjeldahl uitgevoerd, om het geh halte aan eiwitten in het extract te bepalen. Dit is nodig omdat bij het extraheren een gedeelte van de e eiwitten verloren n gaat. De meethode beru ust op de desstructie van het organiscch materiaal met geconccentreerd zwavelzu uur in de aaanwezigheid van een kattalysator. He et koolstof en e waterstoff dat hierbij ontstaat wordt geeoxideerd to ot koolstofdioxide en waater. Het stikstof wordt als ammoniak gebonde en in een overmaaat zwavelzu uur. Na neeutralisatie met natriumhydroxide wordt h het vrij am mmoniak overgedistilleerd, opgevangen en getitreerd met zou utzuur. Het bekomen ttitratievolum me wordt omgerekkend naar grram eiwit peer liter extraact, met geb bruik van de conversiefactor 6.38 grram eiwit per gram m stikstof. Met deze resultaten r w wordt rekeniing gehoudeen bij de berekeningen n van de analyserresultaten.

‐ ‐ ‐ ‐ ‐

3.2.2. Materiaal 20% TCA 2% SDS 10M NaOH Hexaan Z Zwavelzuur


‐ ‐ ‐ ‐ ‐

30


Kjeltabs CX dicator (2% boorzuur en 0 0.75% Minsh h indicator) Boorzuurind Destructieblok (2020 Diggestor, Foss TTecator, Ame ersfoort, Nederland) nit (2200 Auto Distillation n Unit, Foss TTecator, Ameersfoort, Ned derland) Distillatie un C Centrifuge (S Sigma 4K15, Buckingham mshire, UK) 3.2.3. Prottocol

‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐

‐

‐

‐

Extractiie van eiwittten 3.2.3.1. V Voeg aan 10 0mL emulsie 10mL 20% TTCA toe in een 50mL falco onbuis C Centrifugeer r 15 minuten n op 9000g Neem het su upernatans n nauwkeurig aaf Los de resterende pellet op in 20mL 2% SDS, geb bruik magneeetjes en de vvortex Breng op pH H 8 – 9 V Voeg 10mL h hexaan toe een vortex, om m de vetten u uit de emulsie te extraheeren C Centrifugeer r opnieuw 15 5 minuten op p 9000g Nu zijn drie lagen te zien n: een boven nste hexaanlaaag, een dun nnere gelachtige laag en beneden d de eiwitoplo ossing Neem de hexaanlaag af Doorprik de gellaag met een Pasteurrpipet en zuigg de ondersttaande oplosssing op V Veeg de pip nieuw recipiënt over te brengen, etpunt af alvvorens de exxtractievloeistof in een n hiermee worrdt iedere vo orm van turb biditeit voorkkomen 3.2.3.2. Stikstofb fbepaling m met Kjeldahll Destrueer dee eiwitextraccten o Bren ng 5mL van h het eiwitextract in een de estructiebuiss o Voegg hieraan een Kjeldahltablet toe, die 5g K2SO4 en 0.5g CuSO4..5H2O bevat o Voegg 10mL zwavvelzuur toe o Plaats in het desstructieblok een zet het affzuigsysteem m erop o Verw warm ongeveeer 1h op 42 20°C, of totdaat de inhoud d van de buiss felgroen is o Laatt afkoelen tott kamertemp peratuur Distilleer de gedestrueerrde extracten n o Plaats de destructiebuis in het distille eerapparaat en plaats eeen lege erlenmeyer ondeer de afvoerbuis o Stel het program mma in werkiing oe aan het staal en breengt de indicatorvloeisttof in de o Het toestel voeegt NaOH to nmeyer erlen o Het gevormde ammoniak wo ordt overged distilleerd in de erlenmeyyer T Titreer het d distillaat o Titreeer de inhoud van de erleenmeyer me et 0.05N HCl o Het omslagpunt is bereikt alss de kleur vaan de vloeisto of van groen n omslaat naaar paars


31


3.3.Riboflaviinebepaliing 3.3.1. Prin ncipe Met beh hulp van eeen zure en enzymatiscche hydrolysse wordt eiwitgebonden en gefosfforyleerd riboflavine omgezet in vrij ribofflavine in op pgeloste vorm. De eiwitten worden neergeslage en en de riboflavine‐oplossingg wordt geffiltreerd. Hieerna volgt een e directe bepaling vaan riboflavin ne in het filtraat via v HPLC en n een omgeekeerde fasee C‐18 kolom m. Het ribofflavine word dt met fluorescentie gedetectteerd.

‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐

‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐

‐

3.3.2. Materiaal 0 0.2N H 2SO4 2.5N NaAc 2.5M H2SO4 Riboflavine‐sstandaardop plossing: 10m mg/L riboflavvine in 0.2N H H2SO4 C Claradiastas e‐oplossing 1 10% Mobiele fasee HPLC: acetonitril /ultrapuur water iin 20/80‐verhouding Plooifilters (SSchleicher & & Schuell, Dasssel, Duitslan nd) Membraanfiilters van 0.4 45 µm (Alltecch associatess, Lokeren, B België) HPLC toestel met fluoresscentiedetecctor (Agilent 1100 series, Santa Clara,, USA) 3.3.3. Prottocol G Gedurende d de ganse pro ocedure word de alle stalen n afgescherm md van licht W Weeg 2.5g e emulsie af in een 25mL ko olf V Voeg 12.5mL L 0.2N H2SO4 toe en verw warm 15 min nuten in een kokend wateerbad Koel af tot kaamertemperratuur en breeng op pH 4..5 met 2.5N NaAc V Voeg 1.25m mL claradiastase‐oplosssing toe en n incubeer 60 tot 90 minuten in een w warmwaterb bad op 45°C Z Zuur aan me et 1mL 2.5M H2SO4 en veerwarm 15 m minuten in eeen kokend waaterbad Koel af tot kaamertemperratuur en len ng aan met ggedestilleerd water tot dee maatstreep p Filtreer overr een bevoch htigde plooiffilter tot een n helder filtraaat wordt beekomen en vverwijder d de eerste 10 0mL van het ffiltraat Filtreer nogm maals over een 0.45µm m membraanfilter en brengg over in een n HPLC vial Dit filtraat w wordt geanalyyseerd via HPLC met volggende procesvoorwaardeen: o Debiet mobiele ffase: 1.7mL//min o Injecctievolume: 20µL o HPLC C kolom: Chrrompack 250 0 x 4.6mm x ¼” Lichrosorrb 10 RF C‐18 8 o Deteectie: fluoresscentie, excitatie:: 450nm emissie: 530nm Kwantificeerr de hoeveelheid riboflaavine aan de e hand van een e standaardreeks (tusssen 0 en 0 0.6µg/mL), d dezelfdee procedure heeft doorrlopen en drruk uit in µgg riboflavine dat e per mL e emulsie


32


3.4.Fluoresccentiemetting van trryptofaan n en Nforrmylkynurrenine Naar Dalsgaard et al. (2007) en EEstévez et al.. (2008). 3.4.1. Prin ncipe ptreedt als een moleccule met Fluoresccentie is eeen vorm van luminesscentie die slechts op elektrom magnetische straling worrdt geactiveeerd. Als deze e geëxciteerde moleculee niet in evenwicht is met zijn n omgeving gaat g het spo ontaan stralen van een langere gollflengte uitzeenden. Deze e straling wordt flu uorescentie genoemd (IU UPAC). In een flluorometer ((figuur 3‐1) wordt een liichtstaal doo or een mono ochromator gefilterd en licht van de geweenste golflen ngte, de excitatiegolflengte, wordt via v een spiegelsysteem op het staal gericht. Indien flluorescent materiaal m in het staal aaanwezig is, zal het op zijjn beurt lich ht uitzenden van een andere ggolflengte, de emissiegolflengte. Dit licht gaat do oor een tweede filter en n wordt terug via een spiegel o op een fotom multipliertub be gekaatst. D Deze multiplicator verho oogt het signaal en geeft het door aan de elektronica e e de softwaare. Het sign en naal wordt door d de inteegrator in eeen datapunt omgezet (Molecular Devices)..

Figuur 3‐‐1: Principe fluo orometer

Door lichtoxidatie vermindert v d hoeveelh de heid aan tryptofaan (Trp p) in voedin ngsmiddelen.. Tegelijk neemt de d hoeveelheeid aan afbrraakproducteen, onder an ndere NFK, toe. t Trp en N NFK zijn fluo orescente moleculeen en kunnen fluorometrisch bepaald worden.

‐ ‐ ‐ ‐ ‐

3.4.2. Materiaal 6 6M ureum in n PBS buffer PBS buffer T Tryptofaan s stockoplossin ng van 0.01µ µg/µL in PBS buffer Z Zwarte micro otiterplaten (Greiner Bio o‐one, Frickenhausen, Du uitsland) Fluorometerr (Spectramaax Gemini XS, Molecular Devices, Caliifornia, USA))


33


3.4.3. Prottocol Tryptofa 3.4.3.1. faan en Nfo ormylkynurrenine in wa aterige eiwiitoplossinge en Naast dee emulsies vvan beide stu udiën, wordeen ook eiwitoplossingen getest op h hun Trp‐inhoud en de afbraakp producten. Als A stalen vo oor deze flu uorescentiem metingen wo orden 0.6% weioplossin ngen met 1.8mg/m mL, 3.6mg/m mL of zonderr riboflavine gebruikt. Ook worden 0.6% 0 caseïneeoplossingen n met en zonder riboflavine getest. g De oplossingen o ngemaakt in n een PBS‐buffer op pH H 6.8. De werden aan ht als onbeliccht bewaard. oplossingen werden zowel belich ‐ ‐ ‐

‐ ‐ ‐

Breng 50µL sstaal in een w well van de m microtiterplaaat V Verdun met 250µL PBS b buffer V Verdun paraallel ook 50µL staal meet 250µL 6M M ureum in PBS buffer, waardoor het h eiwit d denatureert n binnenin de d eiwitstrucctuur naar h het oppervlaak wordt en ook hett tryptofaan g gebracht 280nm en m meet de emisssie tussen 3 300 en 400n nm met stapgrootte van 5nm om Exciteer bij 2 het Trp te m meten rve tussen 0 en 3µg per Kwantificeerr het Trp aan de hand d van een standaardcu s p well, a aangemaakt t vanuit de trryptofaan sto ockoplossingg Exciteer bij 3 330nm en m meet de emisssie tussen 3 300 en 400n nm met stapgrootte van 5nm om het NFK te m meten

Tryptofa 3.4.3.2. faan en Nfo ormylkynurrenine in em mulsies Het metten van trypttofaan en NFFK in emulsiees verloopt identiek als bij eiwitoplo ossingen (zie e 3.4.3.1). Naast dee emulsie zellf wordt ook de fluoresceentie van hett eiwitextracct gemeten.

3.5.Bepalen van de ca arbonylgrroepen via a spectroffotometriie Naar Fen naille et al. (2 2005) en Levvine et al. (19 992). 3.5.1. Prin ncipe De lichtb bron van eeen spectrofo otometer straalt polychrromatisch liccht uit, dat met behulp van een monochromator gessplitst wordtt in bundels licht van verschillende ggolflengtes. Vaak wordt hiervoor een prissma gebruikt. De gewen nste golflenggte wordt door d een filtter doorgelaaten en op het staal gestraald d. Het licht dat word dt doorgelaten, wordt door een detector o opgevangen, die de stralingssenergie om mzet in meetbare stroom. Het traject van de lichtstraal wordt in figuur 3‐2 weergeggeven.

Figuur 3‐2: Trajectt van de lichtsttraal in een spe ectrofotometerr (Ysenbaert, 20 008)


34 4


Het principe van speectrofotomettrie is gebaseeerd op de selectieve ab bsorptie van bepaalde go olflengten el van het uit het eelektromagneetisch spectrrum. Als het staal in de lichtweg worrdt gebrachtt zal een dee invallend de licht word den geabsorrbeerd, waarrdoor de inte ensiteit van het uittredeen licht klein ner is dan die van h het invallend de licht (Ysen nbaert, 2008). De absorb bantie wordt bepaald volggens vergelijjking 3‐1. met

vergeelijking 3‐1

A: absorbanttie A IO: intensiteitt van het invvallende lichtt I I: intensiteit van het uittrredende licht

Aan de h hand van dee bekomen aabsorbantiew waarde kan d de concentraatie aan abssorberende sstof in de oplossing worden beepaald met d de wet van Laambert‐Beerr (vergelijking 3‐2). . . met

vergeelijking 3‐2

A: absorbanttie A ε ε: molaire ex xtinctiecoëfficiënt (in M‐11 . cm‐1) c c: concentra tie (in M) l l: afgelegde w weglengte (in cm)

Carbonyylgroepen wo orden gevormd bij de oxxidatiereactie van bepaaalde aminozu uren. Het meten van de hoeveelheid carb bonylgroepen n aanwezig in een voedingsstaal geeeft de oxidattiegraad ervvan weer. bonylgroepen en de stijgging ervan, w wordt in dit eexperiment b bepaald aan de hand De hoevveelheid carb van de DNPH methode, beschrreven door Levine et all. (1992). DN NPH of 2,4‐d dinitrofenylh hydrazine olstofatoom van de reageertt met de –NH2‐groep van zijn hydrazineverbinding met het koo carbonylgroepen (figguur 3‐3). Ten T gevolge van deze nu ucleofiele ad dditie wordtt een watermolecule afgesplittst. Het gevo ormde eindprroduct is een n dinitrofenyylhydrazoned derivaat, datt spectrofoto ometrisch kan gem meten worden bij 370nm..

Figu uur 3‐3: Reactie e van carbonylggroepen met D DNPH

De beko omen absorb bantie wordtt verminderd d met de blaancowaarde. De concen ntratie aan gebonden g carbonylgroepen wo ordt bepaald via de wet vvan Lambertt‐Beer, waarb bij de absorb bantie wordtt gedeeld ‐1 ‐1 0.93 cm. De b bekomen door hett molaire exttinctiecoëfficciënt van 22000 M cm en de weglengte van 0 molariteeit wordt verrmenigvuldiggd met het resultaat van de Kjeldah hlmeting en finaal uitge edrukt als µmol carrbonyl per grram eiwit.


‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐

‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐

35


3.5.2. Materiaal 2M HCl NPH) in 2M H HCl 10mM 2,4‐dinitrofenylhyydrazine (DN 20% TCA Ethanol:ethyylacetaat (50 0:50) 20mM KH2PO O4 op pH 2.3 3 gebracht m met TFA 6 6M ureum in n KH2PO4 Eppendorf centrifuge (Laabnet Spectrrafuge 16M, Woodbridgee, USA) Microtiterplaaten (Greineer Bio‐one, Frickenhausen, Duitsland)) Plate readerr (BioRad Ben nchmark Pluss, Hercules, USA) 3.5.3. Prottocol Breng 300µLL extract in eeen eppendorf van 1.5mLL (in triplicaaat) V Voeg 400µL 10mM DNPH H toe A Als blanco w wordt bij het staal 400µL 2M HCl toeggevoegd Plaats de staalen geduren nde 1h op een rotor, afge eschermd van licht met aaluminiumfolie Precipiteer d de eiwitten m met 700µL 20 0% TCA Incubeer 10 minuten op ijs C Centrifugeer r 3 minuten o op 10000g V Verwijder he et supernataans en vervan ng door 1mLL ethanol:eth hylacetaat (50:50) om de e pellet te w wassen Breng terug in suspensiee C Centrifugeer r 3 minuten b bij 10000g Herhaal de w wasstap totd dat het superrnatans na ce entrifugeren helder is Neem het su upernatans aaf Los de pellett op in 500µLL 6M ureum in 20mM fossfaatbuffer C Centrifugeer r een laatste maal om dee onzuiverheden neer te slaan Breng 300µLL over in een multiwellplaaat Meet de abssorbantie van n de stalen b bij 370nm

3.6.Bepalen van de vrrije en de totale thiiolgroepe en via spectrofotom metrie Naar Bevveridge et all. (1974). 3.6.1. Prin ncipe Door oxxidatie van het zwaveelbevattend aminozuur cysteïne veermindert d de hoeveelh heid aan thiolgroeepen, die enerzijds e vrijj kunnen vo oorkomen, maar m ook gebonden g alls cystine. Om O deze thiolgroeepen te kwantificeren en n de vermind dering aan te tonen worrdt op versch hillende punten in de bewaarttijd een specttrofotometrische bepalin ng uitgevoerrd. De thiolggroepen worden gedeteecteerd met DTNB volgens de metho ode van Ellm man. Als thio olgroepen reageren n met DTN NB of 5,5’‐d dithiobis‐2‐nitrobenzoëzuur wordt 5‐thio‐2‐nitrobenzoëzuu ur (TNB) gevormd d (figuur 3‐4 4). Dit product kan gemeeten worden n bij 412nm en heeft een extinctieco oëfficiënt ‐1 ‐1 van 1360 00 M cm . Het resultaaat wordt uitggedrukt als µmol thiolgroepen per graam eiwit.


36


Fiiguur 3‐4: Reacctie van thiolgro oepen met DTN NB

Naast dee vrij voorko omende thiolgroepen komen in eiwittten ook zwaavelbruggen n voor. Om h het totale thiolgehalte te kwantificeren worden w deze zwavelbrugggen gebroken met β‐m mercapto‐eth hanol. Dit bevat zelf ook thiolgroepen, de overm maat moet dus verwijderrd worden. laatste b

‐

‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐

3.6.2. Materiaal H 8.0 T Tris buffer p 4g tris HCl o 10.4 o 6.9gg glycine o 1.2gg EDTA in 1L ggedestilleerd d water 15% TCA β‐mercapto‐‐ethanol 8 8M ureum in n Tris 10M ureum in Tris dithiobis‐2‐nitrobenzoëzuur (DTNB) 10mM 5,5’‐d C Centrifuge (S Sigma 4K15, Buckingham mshire, UK) S Spectrofotom meter (Variaan Cary 50 Bio, Palo Alto, USA) 3.6.3. Prottocol

‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐

Vrije thiiol bepaling 3.6.3.1. g Breng 500µLL eiwitextract in een cuveet Neem telken ns enkele blaanco’s mee in de analyse, dus 500µL oplosmidd del van het staal, hier 2% SDS, in plaats van exttract V Voeg 2.5mL 8M ureum toe Laat 15’ incu uberen op kaamertemperaatuur Meet de abssorbantie van n de stalen b bij 412nm V Voeg 20µL D DTNB toe Mix m.b.v. eeen pipet Incubeer 5’ o op kamertem mperatuur Meet opnieu uw de absorb banties bij 412nm

‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐

3.6.3.2. Totale tthiol bepalin ng Breng 200µLL eiwitextract in een falco onbuis van 1 15mL V Voeg 1mL 10 0M ureum in n Tris toe V Voeg 20µL β β‐mercapto‐eethanol toe Incubeer 1h op kamertemperatuur V Voeg 10mL 1 15% TCA toee Incubeer 15’’ op ijs

‐ ‐


‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐

37


Centrifugeerr 15’ bij 7500 C 0g Neem het su upernatans aaf Los de pellett opnieuw op p in 5mL 15% % TCA C Centrifugeer r Neem het su upernatans aaf Los de pellett opnieuw op p in 5mL 15% % TCA C Centrifugeer r Neem het su upernatans n nauwkeurig aaf Los de pellett opnieuw op p in 3mL 8M ureum in Trris Breng op pH H hoger dan 8 8 met 5M NaaOH Breng de staalen over in ccuvetten Meet de abssorbanties bij 412nm V Voeg 20µL D DTNB toe Mix m.b.v. eeen pipet Incubeer 5’ o op kamertem mperatuur Meet opnieu uw de absorb banties bij 412nm

3.7.Vrije aminogroepen Naar Fields (1971). 3.7.1. Prin ncipe Vrije am minogroepen n reageren met trinitro obenzeensulfonzuur (TN NBS) met de vorming van een gekleurd d complex daat spectrofo otometrisch kkan worden gemeten bij 420nm. Dee vrije amino ogroepen ‐1 worden gekwantificeeerd aan de hand van h het molaire e extinctie coëëfficiënt van 22000 M ccm‐1. Het resultaatt wordt omggerekend naaar µmol vrijee aminogroep pen per mg eeiwit.

Figuu ur 3‐5: Reactie van vrije aminogroepen met TNBS

‐ ‐ ‐ ‐ ‐

3.7.2. Materiaal Boraatbuffer (20.12g Na2B4O7 in 0.1M M NaOH) ng vers aan tte maken (1..5mL 0.1M N S Stop oplossi Na2SO3 en 98.5mL 0.1M N NaH2PO4) 0 0.5% TNBS PBS buffer S Spectrofotom meter (Variaan Cary 50 Bio, Palo Alto, USA)

‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐

3.7.3. Prottocol Breng 500µLL boraatbuffeer in een pro oefbuis V Voeg 250µL eiwitextract en 250µL P PBS buffer toe V Voeg 20µL T TNBS toe en vvortex (met 10 seconden n tijdsintervaal tussen de vverschillende e stalen) W Wacht exact t 10 minuten n V Voeg 2mL st op oplossingg toe en vorttex (terug me et 10 second den tijdsinterrval) Meet de abssorbantie bij 420nm


38


3.8.Beschikb baar lysin ne 3.8.1. Prin ncipe Lysine wordt w fluoro ometrisch bepaald. De excitatiegolflengte van lysine bedraagt 340nm m en de bijhoren nde emissiegolflengte bedraagt 450n nm. De lysine e‐inhoud wo ordt gekwanttificeerd aan de hand van een standaardcu urve en omgeerekend naaar mg lysine p per gram eiw wit.

‐ ‐ ‐ ‐

‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐

3.8.2. Materiaal 12% SDS O reagens (vers te beereiden: 40m OPA mg OPA, 1m mL ethanol, 25mL 2 0.1M boraatbuffer pH 9.3, mercapto‐eth hanol aanlen ngen tot 50m mL) 2.5mL 20% SSDS, 0.1mL m S Standaardre eeks van caseeïne in boraaatbuffer (0.06 6 – 0.3mg/m mL) Fluorometerr (Spectramaax Gemini XS, Molecular Devices, Caliifornia, USA)) 3.8.3. Prottocol Meng 50µL eeiwitextract met 50µL 12 2% SDS en incubeer overrnacht bij 4°C C stalen 15 miinuten bij 30 S Soniceer de 0°C V Voor de met ting: meng 25µL staal meet 750µL OPA A reagens V Vortex exact t 30 secondeen Incubeer 90 seconden in n het donker V Vortex opnie euw 15 seconden Meet de relaatieve fluoreescentie intensiteit binne en de 15 seco onden met aals excitatieggolflengte 3 340nm en em missiegolflen ngte 450nm

3.9.Bepaling g van carb bonylgroe epen via flluoromettrie 3.9.1. Prin ncipe De carbonylgroepen n die door oxidatie o worrden gevorm md, worden met spectrofotometrie bepaald volgens 3.5. In deze studie wo ordt nagegaan of de caarbonylgroep pen eveneens met fluo orometrie kunnen worden gem meten. Indieen dit mogeelijk is, is de e minder om mslachtige p procedure een groot hode. voordeeel ten opzichtte van de speectrofotomeetrische meth

‐ ‐

3.9.2. Materiaal Z Zwarte micro otiterplaten (Greiner Bio o‐one, Frickenhausen, Du uitsland) Fluorometerr (Spectramaax Gemini XS, Molecular Devices, Caliifornia, USA))

‐ ‐ ‐

3.9.3. Prottocol Doe 50µL van de emulsiee in een welll van een zwaarte microtitterplaat V Verdun met 250µL PBS b buffer 360nm en meet de emisssie tussen 30 00 en 400nm m met stapgro ootte van 5n nm Exciteer bij 3


3.10.

39


Bep paling van n de gecon njugeerde e diënen e en triënen n

Naar Esttévez et al. (2 2008) en Nieelsen (2003) 3.10.1. Prin ncipe Door oxxidatie word den dubbele bindingen n in vetten n veranderd van niet geconjugeerrde naar geconjuggeerde verbindingen. Geeconjugeerde diënen ku unnen spectrrofotometrissch gemeten n worden bij 232n nm, geconjuggeerde triën nen worden bij 270nm gemeten. De D methode is nuttig om m vroege oxidatie in vetten op p te sporen.

‐ ‐ ‐ ‐

‐

‐ ‐

3.10.2. Materiaal Iso‐octaan:issopropanol (3:1) Q Quartz cuvet tten S Spectrofotom meter (Variaan Cary 50 Bio, Palo Alto, USA) C Centrifuge (S Sigma 4K15, Buckingham mshire, UK) 3.10.3. Prottocol Extraheer dee vetten uit 2 2mL emulsie o Voegg aan 2mL em mulsie 10mLL iso‐octaan:isopropanol toe o Vorttex drie maal gedurende 10 seconden n o Centtrifugeer 10 minuten op 9000g o Neem de bovensste laag af en n voer hierop p de metingeen uit Meet de gecconjugeerde diënen bij 232nm in een n quartz cuveet en verdun indien nodigg Meet de gecconjugeerde triënen bij 2 270nm in een n quartz cuveet en verdun n indien nodiig

3.11.

Bep paling van n het pan nisidinege etal

Naar de officiële metthode van heet AOCS (Am merican Oil Chemists’ Socciety) Cd 18‐9 90 3.11.1. Prin ncipe den, reagereen met p‐aniisidine. Dit rresulteert Secundaaire producteen van vetoxxidatie, namelijk aldehyd in de vorrming van eeen gekleurd ccomponent d dat spectrofotometrisch wordt bepaald bij 350nm m.

‐ ‐ ‐

3.11.2. Materiaal G Glazen cuvet tten P‐anisidine (0.25g in 100 0mL azijnzuur) S Spectrofotom meter (Variaan Cary 50 Bio, Palo Alto, USA) 3.11.3. Prottocol

‐ ‐ ‐ ‐

3.11.3.1 1. Bepaling g op emulsiies Meet de abssorbantie van n het vetextrract bekome en volgens 3.11.1.3 bij 35 50nm Breng 2.5mLL van het vettextract in eeen proefbuis V Voeg 0.5mL p‐anisidine ttoe en vortexx W Wacht exact t 10 minuten n en meet op pnieuw de ab bsorbantie biij 350nm

‐ ‐ ‐

3.11.3.2 2. Bepaling g op verse o oliën W Weeg ongev veer 1g olie aaf in een 25m mL kolf Leng aan tott de maatstreeep met iso‐octaan Meet de abssorbantie bij 350nm


‐ ‐ ‐ ‐

40


Breng 5mL vvan de iso‐occtaanoplossin ng in een pro oefbuis V Voeg 1mL p‐ ‐anisidine toe en vortex W Wacht exact t 10 minuten n en meet op pnieuw de ab bsorbantie biij 350nm Bereken het p‐anisidineggetal aan de hand van ve ergelijking 3‐3 .

25 met:

3.12.

vergeelijking 3‐3

A1: aabsorbantie vvoor het toevvoegen van het p‐anisidiine reagens A2: aabsorbantie n na het toevo oegen van he et p‐anisidinee reagens W: m massa van dee olie

Bep paling van n het vetzuurprofie el van de oliën

Naar de officiële metthode van heet AOCS (Am merican Oil Chemists’ Socciety) Ce 1b‐8 89 3.12.1. Prin ncipe De triglyyceriden wo orden verzeeept met eeen methano olische natriumhydroxid de‐oplossing. Daarna worden de vetzureen veresterrd met boo orfluoride‐m methanol‐reaggens in dee aanwezigh heid van hydroxide als a katalysator. De methylesters worden door middel van n gaschromatografie natriumh gescheid den op basis van ketenlengte en aanttal dubbele b bindingen.

‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐

‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐

3.12.2. Materiaal Interne standaardoplosssing (5mg nonadecaanzuur/mL iso‐occtaan) V Verzadigde N NaCl‐oplossing in water BF3/MeOH‐rreagens 0 0.5N NaOH i n methanol Iso‐octaan Droog natriu umsulfaat N2‐gas 3.12.3. Prottocol Breng 1mL in nterne stand daardoplossing in een pro oefbuis (die goed afgeslo oten kan worrden) Damp droogg onder stiksttof W Weeg ongev veer 50mg olie analytisch h af in de pro oefbuis V Voeg 2mL 0. plossing toe en begas 1 m minuut met N N2 5N NaOH‐op S Sluit de proe efbuis en verrwarm 7 minuten in een kokend wateerbad Koel af in koud water V Voeg 2mL BF F3/MeOH‐reaagens toe en n begas 1 min nuut met N2 S Sluit de proe efbuis en vorrtex 30 secon nden V Verwarm 5 m minuten in een kokend w waterbad V Voeg 3mL iso o‐octaan toee en begas 15 5 seconden m met N2 S Sluit de proeefbuis en vo ortex 30 seco onden en laat rusten to otdat zich eeen twee‐fase ensyteem heeft gevorm md Pipetteer dee iso‐octaanlaaag in een tw weede proefbuis V Voeg nogma aals 3mL iso‐octaan toe aaan de eerste e proefbuis een begas 15 sseconden met N2 S Sluit de proe efbuis en vorrtex 30 secon nden en laat rusten Pipetteer dee iso‐octaanlaaag toen aan n de tweede proefbuis


‐ ‐ ‐

41


Voeg een bo V odem droog natriumsulfaaat toe aan d de iso‐octaan nfase en vorttex 15 seconden Laat het natriumsulfaatt bezinken en e breng ee en deel van n de iso‐octaaanfase ove er in een monsterflesjje voor GC V Verdun met hylesters perr mL iso‐octaan tot een conceentratie van 200µg meth

3.13.

Am minozuura analyse

3.13.1. Prin ncipe De amin nozuren uit d de monsters worden doo or zure hydro olyse vrijgestteld, gebond den tryptofaan wordt door bassische hydro olyse vrijgestteld. Na neuttralisatie kun nnen de amiinozuren ged derivatiseerd d worden met OPA A, voor de p primaire aminozuren, of FMOC, voorr de secundaaire aminozu uren. Daarnaa worden de comp ponenten gesscheiden op een C18‐kollom en kunnen ze fluorometrisch bep paald worde en.

‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐

3.13.2. Materiaal voor standaaardcurve O Oplossingen Interne standaardoplosssing (norvalin ne en sarcosiine) O OPA‐oplossi ng: 250mg O OPA en 250m mg 3‐mercapttopropionzuur in 25mL 0 0.4M boraatb buffer mL acetonitriil FMOC‐oplosssing: 25mg FFMOC in 10m 0 0.1M HCl 6 6M HCl 12M HCl meet 0.1% fenol en 0.1% Na2SO3 Ba(OH)2 10M NaOH Mobiele fasee C: fosfaatbuffer op pH 7.8 Mobiele fasee D: acetonittril/methano ol/water in 45 5/45/10 verh houding Membraanfiilters van 0.4 45 µm (Alltecch associatess, Lokeren, B België) HPLC toestel met fluoresscentiedetecctor (Agilent 1100 series, Santa Clara,, USA)

3.13.3. Prottocol drolyse: Zure hyd ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐

Breng 2mL eemulsie in eeen proefbuis met schroeffdop V Voeg 2mL 12 2M HCl‐oplossing toe Plaats in een n oven op 10 05 – 110°C geedurende 1h met halfopeen dop Draai de dop p vast en schud en plaatss voor 23h in n de oven Laat afkoelen tot kamerttemperatuurr Breng de inh houd kwantittatief over in n een 50mL b beker en plaats met een roervlo in een ijsbad in de trekkasst Neutraliseerr met 2.4mL 10M NaOH Breng op pH H 2.2 Breng dit hydrolysaat kw wantitatief ovver in een 25 5mL kolf en leng aan mett water Filtreer doorr een membrraanfilter Breng 500µLL filtraat mett 50µL intern ne standaard en 450µL 0..1M HCl in eeen vial


42


Basischee hydrolyse: ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐

Breng 2mL eemulsie in eeen proefbuis met schroeffdop V Voeg 3.36g B Ba(OH)2 en 2 2mL water to oe Plaats in een n oven op 10 05 – 110°C geedurende 1h met halfopeen dop Draai de dop p vast en schud en plaatss voor 23h te erug in de ovven Laat afkoelen tot kamerttemperatuurr Breng de inh houd kwantittatief over in n een 50mL b beker en plaats met een roervlo in een ijsbad in de trekkasst Neutraliseerr met 1.7mL 6M HCl Breng op pH H 4.25 Breng dit hydrolysaat kw wantitatief ovver in een 25 5mL kolf en leng aan mett water Filtreer doorr een membrraanfilter Breng 950µLL filtraat mett 50µL intern ne standaard in een vial

HPLC‐pro ocedure: ‐ ‐

‐

De stalen wo orden in de injector van het HPLC‐toe estel gederivvatiseerd meet OPA en FM MOC De componeenten wordeen met behulp van een n gradiënt van de RP C18‐kolom ge eëlueerd, w waarbij het percentage aan mobielee fase D stijggt in functie van de loop ptijd, die 23 minuten bedraagt nenten worrden met een e fluoresscentie‐detecctor gedeteecteerd, waaarbij de De compon e excitatiegolf flengte de eeerste 15 min nuten 340nm m en na de 15e minuut 266nm bedraagt, de respectievelijke emissieggolflengten zzijn 450 en 30 05nm

3.14.

Miccrobiële u uitplating

3.14.1. Prin ncipe Nagaan of de emulsies microb bieel stabiel blijven ged durende de testperiodee door de groei g van n bacteriën op 22°C tee controleren

‐ ‐ ‐ ‐ ‐

‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐

3.14.2. Materiaal V Voedingsbod dem: Plate C Count Agar (P PCA) S Steriele petr riplaten S Steriele 1mL L pipetten Pipetboy Incubator 3.14.3. Meth hode Breng in de llaminaire flo owkast wat eemulsie op stteriele wijze over in een ffalconbuis O Over de falco onbuis bij dee bunsenbran nder en bren ng 1mL emullsie op een p petriplaat V Voeg een bo odem PCA toe t (houdt de d bodem vloeibaar v doo or in een w waterbad van n 48°C te plaatsen) Draai enkelee malen mett de petriplaaat in de tw wee richtingeen om de em mulsie en de e bodem g goed te verm mengen Incubeer ged durende 3 daagen in een iincubator op p 22°C Lees de plateen af na 3 daagen


43

Ressultaten en d discussie

4. Ressultaten en discusssie Onder dit d hoofdstuk worden de resultaaten van de d verschilleende studiees weergegeven en bediscusssieerd. Eersst worden dee resultaten van de bep paling van tryyptofaan en N‐formylkynurenine (NFK) in n eiwitoplosssingen weeergegeven. In deze stu udie werden n geen emu ulsies, maarr zuivere eiwitoplossingen gettest. De metthode voor d de fluoromettrische bepaaling van tryp ptofaan en N NFK werd d. met dezee studie geoptimaliseerd Vervolgeens staat dee resultaten van de eerste bewaarsstudie weerggegeven. In deze studie e werden oxidatie‐‐effecten van licht en eeen fotosensitizer riboflavvine bestudeeerd in emu ulsies met so ojaolie en visolie. Aan de em mulsies werd d een antim microbieel agens a dimetthyldicarbonaat toegevo oegd. De d hand van n enkele parrameters, die hieronder afzonderlijkk worden effecten werden gemeten aan de orde stemt overeen o mett de volgord de waarin dee methoden beschreven staan in besprokeen. De volgo het hooffdstuk ‘Mateeriaal en metthoden’. Als laatsste worden d de resultaten n van de tweeede bewaarrstudie getoo ond en besproken. In deze studie werd op pnieuw met eemulsies meet riboflavinee gewerkt, m maar de emu ulsies bevatteen voor deze e tweede studie geen antimicrobieel agen ns. Ook werden meer oliën o onderzo ocht. Er werrden emulsie es bereid met olijffolie, sojaoliee, algenolie een een anderre visolie dan n in de eerste studie.

4.1.Bepaling g van tryp ptofaan en n Nformy ylkynuren nine in eiw witoplossingen 4.1.1. Keuze van de o 4 optimale ex xcitatiegolfllengten Als eerstte werd naggegaan bij welke w golflenggte tryptofaan en NFK het h beste beepaald worden. In de literatuu ur werd meeermaals 280 of 283 en 330nm 3 terugggevonden als a de respeectievelijke excitatie– e golflengtte voor tryp ptofaan en NFK. N Rond deeze waarden n werden en nkele excitattiegolflengten getest. Voor tryyptofaan werd gemeten bij een excitatiegolflengte van 280 0, 283, 286, 289, 292 en n 295nm, waarbij d de emissie teelkens werd gemeten tusssen 300 en 400nm, mett stapgroottee van 10nm. De beste emissiesspectra werd den bekomen bij 280nm, waarbij geen knikken iin het spectrum voorkw wamen en de hooggste maximaa werden bereikt b (zie bijvoorbeeld d figuur 4‐2 2). Voor NFK werden metingen m uitgevoeerd bij excittatiegolflenggten van 31 10, 325, 330, 335, 340 0, 345 en 350nm, waaarbij het emissiesspectrum weerd gemeten n tussen 400 en 500nm, terug met sstapgrootte vvan 10nm. H Het beste resultaatt werd bekkomen bij 330nm, 3 waaar de hoogsste maximumwaarden werden berreikt (zie bijvoorb beeld figuur 4 4‐4). 4.1.2. Optiimalisatie v 4 van de stan ndaardcurve voor tryp ptofaan Om de h hoeveelheid tryptofaan tte kunnen kw wantificeren n, dient gebruikt te word den gemaaktt van een standaarrdcurve. Inittieel werd vaanuit een sto ockoplossingg van 5µg trryptofaan peer mL PBS‐bu uffer een standaarrdreeks aanggemaakt tusssen de 100 een 1500µg trryptofaan peer well van d de microtiterrplaat. De standaarrdcurve werd d geëxciteerrd bij 280nm m en de emissie werd gem meten tussen 300 en 400nm met stapgroo otte van 5n nm. In tegeenstelling to ot wat verw wacht was, werd een omgekeerd verband vastgesteld tussen de d fluoresceentie‐intensitteit en de trryptofaanconcentratie. O Omdat dit volkomen v HPLC. niet aan de verwachtingen voldeeed, werd ditt fenomeen vverder onderzocht met H Van tryp ptofaanoplosssingen van 10, 100 en 1 1000µg/µL in n PBS‐buffer werd 3µL in ngespoten in n een RP‐ HPLC syssteem (Agileent 1100 series, Santa Cllara, USA). H Het tryptofaaan werd van de kolom ggeëlueerd


44 4


met een solventmen ngsel van 5% acetonitril een 95% ultrapuur water een een debieet van 1.0mLL/min. De 80nm en de e emissie fluoresceentie van trryptofaan werd gemeten bij een exxcitatiegolfleengte van 28 werd geregistreerd ttussen 310 een 400nm meet stapgroottte van 15nm m. Voor de oplossingen vvan 10 en µL (figuur 4‐1 1, links) werd den goede ccurven bekom men. De oplossing van 1 1000µg/µL le evert een 100µg/µ slechte ccurve op meet afvlakking van het sign naal (figuur 4 4‐1, rechts). Bij een te ho oge concenttratie aan tryptofaan raakt de fluorescenttiecurve dus verzadigd. Bijgevolg moet de stand daardcurve in lagere worden aanggemaakt. ranges w 100µg/µL

1000µg/µLL

Figuu ur 4‐1: Emissiesspectrum van tryptofaan in ee en concentratie e van 100µg/µLL en 1000µg/µLL gemeten mett HPLC

Daarna w werd voor d de fluorescen ntiemetingen n een trypto ofaan‐standaardreeks gaaande van 0.1 1 tot 3µg aangeleggd, met behulp van een stockoplosssing van 0.01 1µg/µL. In d deze regio is de concentratie nog recht evenredig mett de fluoresccentie. In dit gebied kan aan de puntten een rech hte worden ggefit voor ntificeren vaan het trypto ofaan‐gehaltee. het kwan 4 4.1.3. Metiingen bij he et beginpun nt 4.1.3.1. Tryptofa faan De verschillende eiw witoplossinggen werden op de eersste dag van n het bewaaarexperimen nt in een microtiteerplaat gebrracht en zes maal verdu und met PBSS‐buffer. Als excitatiegollflengte werd 280nm genomen en de emissie werd geemeten tusseen de 300 en 400nm in stappen van n 5nm. Het m maximum oor wei‐eiwit en voor caseïnes iets verder, nam melijk bij van het emissiespecctrum ligt bij 330nm vo 335nm ((figuur 4‐2). In de grafiekk van de caseeïnes is duide elijk te zien d dat de hoeveeelheid tryp ptofaan al is gedaaald in de belichte b eiwitoplossingen met ribofflavine, ten opzichte vvan de niet belichte eiwitoplossingen en die zonder rriboflavine.

(B) 280nm m excitatie vaan caseïne (d dag 0)

14000

14 4000

12000

12 2000

10000

10 0000 Fluorescentie

Fluorescentie

( (A) 280nm ex xcitatie van w wei (dag 0)

45



8000 6000 4000

8000 8 6000 6 4000 4

2000

2000 2

0

0 300

320

340 360 emissie (nm m)

380

400

300

320

340 360 emissiie (nm)

niet belichtt zonder riboflavine

belicht zonder ribo oflavine

niet belichtt met 1,8µg/mL rib boflavine

belicht met 1,8µg//mL riboflavine



3 380

400

PBS buffer

Figuur 4 4‐2: Fluorescen ntie van tryptoffaan bij excitatiegolflengte va an 280nm en em missie tussen 3 300 en 400nm o op dag 0, voor eiwitoplossinggen met (A) weii‐eiwit en (B) caaseïne

De eiwittoplossingen n werden parallel ook zees keer verdund met 6M M ureum in PBS‐buffer. Door het ureum werden w de eiwitten on ntplooid en werd ook het tryptoffaan binnenin de eiwitsstructuur gemeten n. De toevoeeging van ureeum heeft eeen verschuiviing van het m maximum in het emissiesspectrum voor gevvolg (figuur 4 4‐3). Het maaximum voor de wei‐eiw witten stijgt van 330 naaar 345nm en n voor de caseïness stijgt het m maximum van n 335 naar 3 355nm. Naasst een versch huiving van h het emissiem maximum is er ookk een verho oging van dee fluorescenttie‐intensiteiit zichtbaar voor wei. Dit komt doo ordat niet enkel heet trp aan het h eiwitopp pervlak, maar ook het trrp binnenin het eiwit w wordt gemetten. Voor caseïne is geen verh hoogde, maaar zelf een veerlaagde inte ensiteit waargenomen. D De reden daaarvoor is niet duid delijk. (A A) 280nm exccitatie van w wei met ureum (dag 0)

(B) 280nm excitatie van n caseïne me et ureum (dagg 0)

10000

100 000

8000

80 000

Fluorescentie

120 000

Fluorescentie

12000

6000 4000 2000

60 000 40 000 20 000

0

0 3 300

320

340 36 60 emissie (nm m)

380

400

300

320

340 360 emissie (nm)







38 80

400

PBS buffer

Figuur 4 4‐3: Fluorescen ntie van tryptoffaan bij excitatiegolflengte va an 280nm en em missie tussen 3 300 en 400nm o op dag 0, voor eiwito oplossingen me et ureum voor ((A) wei‐eiwit en n (B) caseïne

46



Daarnaaast werden de eiwitoplosssingen ook vverdund mett 6M guanidine chloride,, wat de eiwitten ook denatureeert. Guanid dine chloridee heeft dezelfde verschuiivingen in heet emissiemaaximum en vverhoging van de flluorescentie‐intensiteit ttot gevolg. 4.1.3.2. Nformyylkynurenin ne De eiwittoplossingen n die zes maaal verdund werden mett PBS‐bufferr, werden evveneens gem meten bij een exciitatiegolflenggte van 330nm om de vorming v van n afbraakpro oducten van tryptofaan, namelijk NFK, te controleren.. Het emissieespectrum w werd opgeno omen tussen 400 en 500nm met stap ppen van 10nm. H Het maximum m voor zoweel wei als casseïne ligt bij 420nm (figu uur 4‐4). In d de grafieken is te zien dat voorr zowel wei aals caseïne eer afbraakpro oducten gevo ormd werden in de belicchte eiwitopllossingen met ribo oflavine. Enkele eiwitoplo ossingen verrtonen een sstijging in em missie tussen 480 en 500nm. Daar de stijging enkel voo orkomt in de eiwitoplosssingen met riboflavine, werd vermoed dat hett hier om r zeelf gaat. Ditt werd getesst door de fluorescentie f e van enkele e zuivere interfereentie door riboflavine riboflavineoplossingeen bij dezelfde meetco ondities te bepaling b en het vermoeden werd hierdoor bevestiggd. (B) 330nm m excitatie vaan caseïne (d dag 0) 40 00

350

35 50

300

30 00 Fluorescentie

Fluorescentie

( (A) 330nm ex xcitatie van w wei (dag 0) 400

250 200 150

25 50 20 00 15 50

100

10 00

50

5 50

0

0 40 00

420

440 46 60 emissie (nm m)

480

500

400

42 20

440 460 emisssie (nm)







48 80

500

Figuur 4‐4 4: Fluorescentiie van N‐formyylkynurenine bij excitatiegolfle engte van 330n nm en emissie ttussen 400 en 500nm op dag 0, vo oor eiwitoplosssingen met (A) wei‐eiwit en (B B) caseïne

4.1.4. Metiingen in fun 4 nctie van d de tijd De metingen beschrreven in 4.1.3 werden meerdere m maalen herhaald in functiee van de tijd, om het v lichtoxid datie na te gaan. Tryp ptofaan worrdt onder in nvloed van licht en rib boflavine effect van afgebrokken, zijn afbrraakproduct NFK wordt ggevormd. Tryptofa 4.1.4.1. faan De fluorrescentiewaaarden bekom men bij een excitatiegolfflengte van 280nm en eemissiegolfle engte van 330nm werden uitggezet in functie van de d tijd, maaar werden omgezet aaan de hand van de standaarrdcurve in µ µg tryptofaan n per mg eiw wit. In functie van de tijd d is een duid delijke dalingg van het tryptofaan‐gehalte te zien in de belichte eiw witoplossinge en met riboflavine. De steerkte van de e daling is ook duid delijk afhankkelijk van de concentratiee aan riboflaavine. In de eeiwitoplossin ngen met he et meeste riboflavine, daalt dee hoeveelheid trp het steerkst. Op he et oppervlak van caseïnee zit initieel meer trp o daalt dee hoeveelheiid trp veel sterker s in caaseïne dan in n wei. In de e belichte dan op wei. Maar ook

47



eiwitoplossing met 3 3.6µg/mL rib boflavine zakkt de trp‐inho oud voor weei van ongeveer 8µg per mg eiwit wit. Voor de eeiwitoplossin ng met caseïn ne is er een d daling van ongeveer 11µ µg per mg naar 4µgg per mg eiw eiwit tott 1µg per mgg eiwit. Caseïïne is dus gevvoeliger aan lichtoxidatiee dan wei. (A) tryptofaaan concentrratie van weii

(B) tryptofaan concentratie van caaseïne 1 12 µg tryptofaan / mg eiwit

µg tryptofaan / mg eiwit

12 10 8 6 4

1 10 8 6 4

2

2

0

0 0

10 20 Bewaartijd in dagen

0

30

10 20 Bewaarttijd in dagen







30

Figuurr 4‐5: µg tryptoffaan per mg eiw wit in functie vvan de tijd voorr eiwitoplossinggen met (A) weei‐eiwit en (B) ccaseïne

Door het verschil te maken van de fluorescentiewaarde en bekomen door verdunning met u ureum en door verrdunning meet PBS, wordtt bepaald ho oeveel trypto ofaan zich bin nnenin de eiw witstructuurr bevindt. Aan de hand van dit d verschil kunnen k ook conformationele veran nderingen vaan het eiwitt worden oord. In figuu ur 4‐6 is hett verschil in fluorescentie met en zo onder ureum m gemaakt. V Voor wei‐ opgespo eiwit is ggeen trend tte detectereen in de graffiek, dit wijst aan dat heet trp binnen nin de eiwitsstructuur onveranderd is gebleeven. In de ggrafiek voor ccaseïne is ee en stijging te zien van de trp‐inhoud iin functie van de tijd voor de b belichte caseeïne‐oplossin ngen met riboflavine. De stijging is grroter met ee en hogere concentrratie aan riboflavine. (B) trypto ofaan fluoresscentie van caseïne

2000 0

2000

1000 0

1000

0

0

‐1000 0

0

10

20

30

‐2000 0

Fluorescentie

Fluorescentie

( (A) tryptofaa an fluorescen ntie van wei

‐1000

0

10

20

30

‐2000 ‐3000

‐3000 0 ‐4000 0

‐4000 Bewaartijd in dagen

Bewaarttijd in dagen







Figuur 4‐‐6: Verschil in ffluorescentie vaan tryptofaan ttussen eiwitoplossingen met ureum en zond der ureum in fu unctie van de tijd voor (A) wei‐eiwit e en (B) caseïne

48



4.1.4.2. Nformyylkynurenin ne Parallel met de verm mindering in tryptofaan wordt er NFFK gevormd. NFK wordt gedetecteerrd bij een v 330nm en uitgezett in functie van de tijd d voor de emissiegolflengte van excitatieegolflengte van 420nm. De hoeveeelheid NFK kan niet gekwantifice eerd wordeen en staat dus als relatieve met riboflavine is een fluoresceentiewaardeen uitgedrukt in figuur 4‐‐7. In de belichte eiwitoplossingen m duidelijkke stijging van v de hoeeveelheid NFK N waar te t nemen. De stijging is groter voor de eiwitoplossingen meet de hoogstee concentrattie aan riboflavine en is o ook groter voor caseïne dan voor wei. De vvorming van NFK is duideelijk een gevvolg van de afbraak van tryptofaan. (B) NFFK fluorescentie van case eïne 800

700

700

600

600

500

500

Fluorescentie

Fluorescentie

(A) NFK flu uorescentie van wei 800

400 300 200

400 300 200

100

100

0

0 0


30

0

10 20 d in dagen Bewaartijd







30

Figuur 4‐‐7: Fluorescentie van N‐formyylkynurenine biij excitatiegolfllengte van 330n nm en emissieggolflengte van 420nm in f functie van de tijd voor eiwitoplossingen met (A) wei‐eiwiit en (B) caseïne


49


4.2.Bewaarsstudie 1: e emulsies m met dimethyldicarrbonaat 4 4.2.1. Bere eiden van e emulsies Door de waterige eiiwitoplossingg en de olieffase te mixe en werd een emulsie bekomen. De sstabiliteit ulsies, die en nkel gemixt w werden met een Ultraturrrax, werd geeëvalueerd. Kleine hoeve eelheden van emu vet, tot 0.5%, gaven n aanleidingg tot emulsiees die stabie el bleven naa een overnacht bewariing in de mer. Bij meeer dan 0.5% % vetfractie vertoonden n zij vetdruppels aan h het oppervlak. Het koelkam homogeniseren onder verhoogd de druk van 300bar, verkkleint de partikelgroottee van de vetfractie in die matte dat de emulsie e langgere tijd staabiel blijft. De D stabiliteit van emulsies met en n zonder emulgator werd visu ueel geëvalu ueerd, waarb bij DATEM als emulgatorr werd gebruikt. Het we ei‐eiwit is de amfifiel om een em mulgerende werking te verkrijgen. Toevoegen van een op zich al voldoend dig. De toevo oeging van het h antimicrrobieel agens DMDC, bijkomende emulgattor is bijgevvolg overbod op de stabiliteit van de em mulsies. heeft geen invloed o De emullsie met viso olie en riboflavine, die in n deze studie werd gebrruikt, vertoo onde onstabiiliteit. De oorzaak hiervan is niet met zeekerheid gekkend, maar microbiële contaminatie c e kan hierin n een rol spelen. D Dit heeft mogelijk gevolggen voor de rrepresentativviteit van dee bekomen reesultaten. 4 4.2.2. Extrraheren van n eiwitten u uit emulsies en Kjelda ahlbepaling g Het doeel van de exxtractie is dee vetten uitt de emulsie es te verwijd deren en daaardoor een n heldere eiwitoplossing te beekomen, diee spectrofoto ometrisch kaan worden geanalyseerd. Met de extractie‐ e procedure, weergeggeven in 3.2 2, is het mo ogelijk zeer heldere eiw witextracten te bekome en. Maar hiertoe is nauwkeurrigheid vereist bij het op pzuigen van het extract doorheen de gellaag, want w deze stap is crruciaal voor het bekomen van een heelder extractt. Op dezee eiwitextractten werd tellkens een Kjeldahlbepaling uitgevoerd om het exxacte eiwitgehalte te kennen. Uit de resultaten van v die beepaling blee ek dat de extractieprrocedure vo oldoende w telkens ongeveer tw wee gram eeiwit per lite er extract reproduceerbaar is. In de eiwitextracten werd teruggevvonden. De emulsies bevatten b oorrspronkelijk zes gram per p liter weei‐eiwit, maaar bij de extractiee werden zee één op tw wee verdund,, dus één derde van dee eiwitten ziijn door de extractie verloren n gegaan. Dee Kjeldahlresultaten werd den verder ggebruikt voor de bereken ning van parrameters, uitgevoeerd op de eiw witextracten,, zoals de carrbonylgroepen en de thiolgroepen. 4 4.2.3. Ribo oflavinebep paling Riboflavine wordt on nder invloed van licht om mgezet in een n actieve vorrm en deze zzet tripletzuu urstof om boflavine op pgebruikt. in het acctieve singlettzuurstof. Biij veelvuldig doorgaan vaan deze reacctie wordt rib De hoevveelheid ribo oflavine die na verschillende dagen belichting nog in de eemulsies aan nwezig is, werd naagegaan mett een HPLC m methode. Met behulp vaan een stand daardcurve ggaande van 0 tot 0.6 µg/mL werd w het geedetecteerdee riboflavine gekwantificceerd. Zoals te zien is in figuur 4‐8 8, zijn de bekomen resultaten n zeer variaabel en meeestal lager dan de con ncentratie riiboflavine, die d werd D kan worden verklaard doordat aanvankelijkk geen claradiastase‐ toegevoerd, namelijjk 2µg/mL. Dit mengsel werd d toegevoegd d, zoals verm meld in het p protocol 3.3.3. Het doel vvan de claradiastase‐ enzymm oplossing is riboflavine los te maken van dee eiwitten en n van fosfor. In melk is het vitamine e immers e en moet riboflavine door zure en enzzymatische hydrolyse h verbonden met de aanwezige eiwitten ngenomen dat in de emulsies het rib boflavine nieet zou gebon nden zijn worden vrijgesteld. Er werd aan

50



met de eiwitten, du us dat het geebruik van claradiastase c e overbodig zou zijn. Heet bekomen resultaat doet verrmoeden datt riboflavine in de emulsies toch interrageert met de eiwitfractie.

Riboflavin negehalte in emulsies in functie vvan de tijd 3,5

µg riboflavine / mL emulsie

3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Bewaartijd in dagen B vissolie: belicht m met riboflavine

sojaolie: belicht met riboflavine

vissolie: niet belicht met riboflavine

sojaolie: niett belicht met rriboflavine

Figuur 4‐8: µg ribo oflavine per mL emulsie in functie van de tijjd voor emulsie es met (z) sojaaolie en (▲) vissolie

Hoewel de resultaaten analytisch niet correct c zijn,, kan wel een belich htingseffect worden nomen. Het ggehalte aan riboflavine b bij de belichtte emulsies ligt duidelijk lager dan de eze bij de waargen niet beliichte emulsies. Reeds naa twee dageen belichtingg is de hoeveeelheid riboflavine bijnaa volledig weggereeageerd. 4.2.4. Fluo 4 orescentiem meting van tryptofaan n en Nformylkynureniine De oxidaatieve afbraaak van trypttofaan (trp) door singlettzuurstof weerd fluoromeetrisch nagegaan. De excitatieegolflengte vvan trp is 280nm en de eemissie werd d gemeten ttussen 300 een 400nm in n stappen van 5nm m. De maximale fluoresceentiewaarden werd terug geregistreeerd bij een eemissiegolfle engte van 330nm, zoals bij de eiwitoplossiingen het geeval was (figuur 4‐2). Dee fluorescenttiewaarden b bekomen w dan ook gebruikkt voor het opstellen o van de grafiekken in functie van de bij deze golflengte werden bewaarttijd. De metin ngen werden n zowel op d de emulsie ze elf, als op dee eiwitextractten uitgevoe erd, maar de metin ng op de extrracten bleekk het meest ggeschikt om o oxidatie‐effeecten waar tee nemen. In figuu ur 4‐9 staatt de concen ntratie in µg µ tryptofaaan per mL eiwitextract, gemeten bij een excitatieegolflengte een emissiegolflengte van respectievelijk 280 en 330nm, uitgezet in functie e van het aantal dagen d bewarring. Voor het h bekomen n van deze grafieken werden w de fluorescentie ewaarden gelinkt aan a de standaardcurve, bekomen met m standaarden met trrp‐gehaltes ttussen 0 en 3µg. De oorspron nkelijke hoeveelheid tryyptofaan in de d extracten n bedraagt ongeveer o 25µg/mL. Na 25 2 dagen belichtin ng zakt die hoeveelheid d voor de sojaolie‐emu s lsie met rib boflavine tott 10µg/mL. Voor de belichte visolie‐emulsies is de daaling nog sterrker, namelijjk tot bijna n nul.


51


In de lin nkse grafiek, voor de em mulsies met sojaolie, is de daling vaan de hoeveeelheid trypttofaan in functie van v de tijd te t zien voor de belichte emulsie me et riboflavinee. De onbeliichte emulsies en de belichte emulsie zon nder riboflavvine vertonen n geen daling in functie vvan de tijd. In de rechtse e grafiek, mulsies met vvisolie, is eveeneens een vvermindering van de trp p‐inhoud te zzien voor de e belichte voor em emulsie met fotosensitizer, maar bij de beelichte emulsie zonder riboflavine zakt de hoe eveelheid tryptofaan eveneenss. Bij de onb belichte visollie‐emulsies is, zoals verrwacht, geen n dalende tre end waar te nemen. (B B) emulsies me et visolie

30

µg tryptofaan / mL eiwitextract


(A) emu ulsies met sojaaolie

25 20 15 10 5 0 0

5

10 1 15 20 Bewaartijd in dagen

25

30

30 0 25 5 20 0 15 5 10 0 5 0 0

5

10 15 20 Bewaartijd in dagen

2 25

30

Figuur 4‐9: µg trypttofaan per mL eiwitextract in functie van de e tijd voor emulsies met (A) so ojaolie en (B) vvisolie

De dalen nde trend vo oor de belichte emulsiess met riboflaavine is het gevolg van de oxidatievve aanval 1 van O2 op tryptofaaan, wat ook aangehaald wordt in 2..2.3.2.1. De verklaring vvoor de verm mindering van de trp‐inhoud t in n belichte viisolie‐emulsies zonder riiboflavine kaan mogelijk gevonden worden w in de sameenstelling vaan de gebruikte visoliee. Vermoede elijk ligt de aanwezigheeid van een n andere fotosenssitizer dan riboflavine in de visolie uit de pillen aaan de oorsp prong van dee oxidatieve effecten in de beelichte visoliee‐emulsie zo onder riboflavine. Een tw weede vaststtelling die hieeraan gekop ppeld kan worden is dat de oxxidatiereactiee in emulsiees met visolie trager op gang komt dan in emulsies met sojaolie. Dit fenomeen kan mogeelijk verklaarrd worden door de aanw wezigheid van een anti‐o oxidans in de visoliie. Het etikeet vermeldt de d aanweziggheid van tocoferol, watt in 2.2.5.2 aals anti‐oxidaans werd beschrevven. De afbrraak van tryptofaan resulteert r in n de vorm ming van affbraakprodu ucten. Één van die afbraakp producten is i N‐formylkynurenine (NFK). NFFK kan eveeneens fluo orometrisch worden geanalysseerd. Zijn excitatiegolf e 30nm en de e maximale emissie wordt geregistreerd bij lengte is 33 420nm, net zoals biij de eiwitop plossingen (ffiguur 4‐4). Figuur F 4‐10 toont een vverhoging aaan NFK in dezelfdee emulsies waarbij oo ok een verrminderde trp‐inhoud werd waargenomen. Dit zijn meerbep paald de belichte sojaolie‐emulsie m met riboflavin ne en de belichte visolie‐‐emulsies, zo owel met als zonder riboflavin ne. In de emu ulsies met visolie komt d de vorming vvan NFK tragger op gang, net zoals melijk pas na de elfde daag belichtingg. De vormin ng van NFK staat s dus de afbraaak van tryptofaan, nam duidelijkk in verband met de afbraaak van tryptofaan.


(B B) emulsies me et visolie

1200

Fluorescentie N‐formylkynurenine

Fluorescentie N‐formylkynurenine


1000 800 600 400 200 0 0


52


30

1 1200 1 1000 800 600 400 200 0 0

10 20 Bewaartijd d in dagen

30

Figuur 4‐‐10: Fluorescen ntie van N‐form mylkynurenine b bij excitatiegolfflengte 330nm en emissiegolfflengte 420nm in functie van d de tijd voor emu ulsies met (A) ssojaolie en (B) vvisolie

De relatiieve hoeveelheid NFK diee teruggevonden wordt is groter bij de sojaolie‐eemulsies dan n voor de emulsiess met visoliee. De aanwezzigheid van eeen anti‐oxid dans in de viisolie kan oo ok hier een vverklaring zijn, maaar ook mogelijk is dat de onstabiliteitt van deze em mulsies de oorzaak is. 4.2.5. Bepaling van ca 4 arbonylgro oepen via sp pectrofotom metrie 1 De carb bonylgroepen n die door oxidatie vaan eiwitten met O2 worden w gevo ormd, worde en in de eiwitextracten gekw wantificeerd volgens de DNPH‐metho ode van Levvine et al. (1 1992). In de originele methodee wordt verm meld om te w werken met 10mM 2,4‐d dinitrofenylh hydrazine (DNPH), maar dit bleek hier geen resultaat o op te leveren n. De meetw waarden bleve en opmerkelijk laag. Een n mogelijke vverklaring bonylgroepen, aanwezig in het antim microbieel middel m DMD DC, reageren met het kan zijn dat de carb waarbij dan eeen kleurloo os complex ggevormd wo ordt. Als dezee reactie preeferentieel d doorgaat, DNPH, w kunnen de carbonyylgroepen afkomstig a uit het eiwitextract niett met het DNPH reage eren. Dit m werd opgeelost door een hogere co oncentratie DNPH te geb bruiken voorr de reactie, namelijk probleem 15mM. Figuur 4‐11 4 toont de d carbonylggroepen voo or de versch hillende emu ulsies in fun nctie van de e tijd. De hoeveelh heid carbon nylgroepen die oorspro onkelijk in de emulsiees aanwezigg is, ligt tegen de detectielimiet aan. In de belichtte sojaolie‐emulsie met rriboflavine iss de carbonyylinhoud na 2 23 dagen ng gestegen naar 18µmo ol carbonylgrroepen per ggram eiwit. De belichte visolie‐emulsies met belichtin en zondeer riboflavine vertonen n na 23 dagen eveneens e een stijging. M Maar die is llager dan bij sojaolie, namelijkk tot ongeveeer 8µmol per gram eiwitt. Bovendien komt ook h hier de oxidatie trager op p gang bij visolie. D Deze resultaten bevestiggen de resultaten van de e tryptofaan nbepaling en n het vermoe eden van de aanw wezigheid van n een fotosensitizer in dee visolie uit d de pillen.

(B B) emulsies me et visolie

20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0

µmol carbonylgroepen / g eiwit

µmol carbonylgroepen / g eiwit


0

5

10 15 5 Bewaartijd in daagen

53



20

25

20 0 18 8 16 6 4 14 12 10 0 8 6 4 2 0 0

5


20 0

25

Figuur 4 4‐11: µmol carbonylgroepen per gram eiwitt in functie van de tijd voor em mulsies met (A) sojaolie en (B B) visolie

4 4.2.6. Bepaling van d de vrije en d de totale thiolgroepen n via spectro ofotometrie Thiolgroepen, aanweezig op het aaminozuren ccysteïne, wo orden door siingletzuursto of geoxideerd. Om de o te volgen worden de vrij voo orkomende thiolgroepen n en de oxidatie van dit aminozuur op thiolgroeepen die alss cystine geb bonden zijn,, gemeten met m een speectrofotomettrische meth hode. De metingen worden uitgevoerd u o de eiwiteextracten. De op D resultaten n van de bepaling van de vrije de methode van Ellman zzijn zeer variabel. Dit is tte wijten aan n de lage thiolgroeepen (figuur 4‐12) met d aantallen n vrije thiollgroepen diee voorkomen in het we ei‐eiwit. De meetwaarden leunen tegen t de detectielimiet aan, w waardoor diee erg fluctuerren. Ondankss de variabiliteit is te zien z dat hett vrije thiolggehalte in de d belichte ssojaolie‐emu ulsie met riboflavine na 23 daagen nul bedraagt, maaar ook bij de e belichte emulsie zond der riboflavin ne en de hte emulsie met riboflavvine is een lichte dalingg te zien. In n de onbelicchte sojaolie e‐emulsie onbelich zonder ffotosensitizeer is geen daling waar te nemen. Voo or de emulsies met visollie is een dalling in de thiolinho oud te bemeerken in beide belichte emulsies, zo owel met als zonder sensitizer. De waarden dalen oo ok hier tot h het nulpunt, maar ook in n de niet belichte emulssie zonder riboflavine is naar het einde toe een dalingg te zien. De niet belichtee emulsie me et riboflavinee vertoont geeen dalende trend.

(A) em mulsies met sojaolie

(B B) emulsies met visolie

30

30 3 µmol thiolgroepen / g eiwit

µmol thiolgroepen / g eiwit

54 4



25 20 15 10 5 0

25 2 20 2 15 1 10 1 5 0

0

5

10 1 15 Bewaartijd in d dagen

20

25

0


5

2 20

25

Figuur 4 4‐12: µmol vrije e thiolgroepen per gram eiwitt in functie van n de tijd voor emulsies met (A A) sojaolie en (B B) visolie

Het gehalte aan tottale thiolgroepen (figuurr 4‐13) is be eduidend ho oger. De meeetwaarden vertonen bijgevolgg niet dezelffde variabilitteit. Oorspro onkelijk bevaatten de emu ulsies tussen n de 200 en 250µmol thiolgroeepen per graam eiwit. Deeze waarde zakt tot bijn na 50µmol voor v de belicchte sojaolie e‐emulsie met ribo oflavine. Ookk de waarden n voor de beelichte visolie e‐emulsies zzakken tot on ngeveer 75µ µmol. Alle overige eemulsies bettonen ook eeen dalende trend, maar d die is minderr uitgesprokeen. (A) em mulsies met sojaolie

(B B) emulsies met visolie 300 3 µmol thiolgroepen / g eiwit


300 250 200 150 100 50 0

250 2 200 2 150 1 100 1 50 0

0

5

10 15 Bewaartijd in d dagen

20

25

0

5

10 15 Bewaartijjd in dagen

20

25

Figuur 4‐13: µmol totale thiolgroepen n per gram eiw wit in functie van de tijd voor e emulsies met (A A) sojaolie en ((B) visolie

Deze reesultaten beevestigen evveneens de resultaten van de tryp ptofaanbepaaling en die e van de carbonylbepaling. Dee dalende trend in de nieet belichte e emulsies en d de emulsies zonder fotossensitizer het autoxidaatieproces, dat naast de llicht‐geïnducceerde oxidaatie plaatsgrijjpt. is te verkklaren door h


55


4.3.Bewaarsstudie 2: e emulsies m met vier v verschille ende oliën n 4 4.3.1. Bere eiden van e emulsies In een tweede bew waarstudie werden w emulsies met vier verschiillende oliën n gemaakt, namelijk nolie. Er werrd een anderre visolie gebruikt in dezze tweede sttudie dan olijfolie, sojaolie, visolie en algen in de eeerste studie. De emulsies met de verschillende oliën blevven stabiel ggedurende de d ganse periode van de stud die, namelijk drie wekeen. Daar gee en antimicro obieel agenss aan de em mulsies is nstelling tot de eerste beewaarstudie,, diende de m microbiële sttabiliteit eve eneens te toegevoegd, in tegen worden nagegaan. De vorming van zuurrvormende bacteriën werd w nagegaaan door de pH te d zuurtegraaad van de PBS‐buffer. P O Op het einde van de controleeren. De pH bleef stabieel rond 6.8, de studie w werd een microbiële uitplating uitgevo oerd, zie hiervoor 4.3.14 4. 4.3.2. Extrraheren van 4 n eiwitten u uit emulsies en Kjelda ahlbepaling g Door exttractie van d de eiwitten in n de emulsiees werden he eldere eiwito oplossingen b bekomen. Het exacte eiwitgeh halte in de extracten werd w terug via Kjeldahl bepaald. De D reproducceerbaarheid d van de methodee blijkt bij deeze bewaarsstudie mindeer groot te zijn dan bij de eerste studie. Maar ge emiddeld werd opnieuw ongevveer twee grram eiwit per liter geëxtrraheerd. 4.3.3. Ribo 4 oflavinebep paling In deze studie werd d de hoeveeelheid riboflaavine, die no og aanwezigg is in de em mulsies na belichting, ns nagegaan met de HPLLC‐methode.. Daar waar in de studiee met DMDC C geen claradiastase‐ eveneen enzymen n werden geebruikt, zie hiervoor 4.2.3 3, was dit in deze studiee wel het gevval. De meettwaarden vertoond den een minder grote vaariabiliteit. In figuurr 4‐14 wordtt het riboflavvinegehalte iin functie vaan de tijd weeergegeven vvoor de verschillende emulsiess. Bij de on nbelichte em mulsies bleef de hoeveelheid consttant in funcctie van de tijd. De meetpun nten op dagen twee en zeven zijn in de grafiekk weggelaten n omdat ze n niet in de lijn van de resultateen van dag veertien laggen. De meeetwaarden waren w nameelijk lager daan op het eindpunt. e Riboflavine is zeer lichtgevoelig. De minste blootstellling aan liccht tijdens d de voorbehandeling, resulteert in een veerlaagd meeetresultaat. Vermoedelij V k is dit ookk de oorzaakk van de affwijkende meetresultaten op d dag twee en zzeven. De riboflavineconcen ntratie in de belichte em mulsies vertoo ont een expo onentieel verval in functie van de tijd, zoalls aangegeveen door de trrendlijn. Na twee dagen is de concen ntratie al geh halveerd en na zeven dagen zo o goed als volledig v wegggereageerd.. Aan de me eetwaarden van dag tweee is te zien n dat het riboflavine het snelsste verdwijn nt in de emu ulsie met vissolie, gevolggd door algeenolie en so ojaolie. In combinaatie met olijfolie reageertt het riboflavvine het minst snel weg. Aan de eemulsies werd 2.0 µg rib boflavine perr mL emulsie e toegevoegd d, maar met de methode e werden hogere sstartwaarden n teruggevonden, namelijk tot 3.5 µ µg/mL. De oorzaak van d deze oversch hatting is nog onduidelijk en m moet in de to oekomst nog worden wegggewerkt.

56



riboflavin negehalte in n emulsies in functie vvan de tijd 4,0

µg riboflavine / mL emulsie

3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 R² = 0,,9048

0,0 0

2

4

6

8

10

12

14

16

Bewaartijd iin dagen olijfolie belich ht sojaolie belich ht visolie belicht algenolie beliccht

olijfolie niet b belicht sojaolie niet b belicht visolie niet beelicht algenolie niett belicht

Figuur 4‐‐14: µg riboflavvine per mL em mulsie in functie e van de tijd voor emulsies me et () olijfolie, (▲) sojaolie, (z) visolie e en () algenoli ie

4.3.4. Fluo 4 orescentiem meting van tryptofaan n en Nformylkynureniine Met fluo orescentiemeetingen op d de eiwitextracten werd de oxidatie vaan tryptofaan nagegaan. In figuur 4‐15 werden de abso olute fluoresscentiewaard den gelinkt aaan de stand daardcurve o om de waard den uit te drukken als µg tryptofaan per m mL eiwitextract. Bij de belichte emulsies met riboflavine is telkens een daling waar w te nem men in functtie van de tijd. t De daling is sterkeer voor emu ulsies met visolie v en algenoliee dan voor ssojaolie en o olijfolie. Net zoals in de sstudie met D DMDC, waarin een andere visolie werd gebruikt, daalt hier ook hett trp‐gehaltee voor de belichte visolie‐emulsie zon nder riboflavvine. De emullsies bevatteen bij de starrt van het beewaarexperim ment ongeveeer 25µg trp p per mL eiw witextract, wat overeenkomt m met het resultaat van de eerste studiie. Voor olijffolie zakt hett gehalte na veertien dagen to ot 17µg/mL, voor sojaolie tot 14µg//mL en voor visolie en algenolie a is d de daling het sterkst, namelijkk tot nul. Op pmerkelijk is de stijging van v het trp‐‐gehalte bij het h laatste m meetpunt op p dag 21. Microbiëële contaminatie naar het h einde van de studiie toe, kan hiervoor eeen verklaringg zijn. In overeenstemming met m de resu ultaten van de riboflavvinebepaling, waar na zeven dagen al het n dat de steerkste dalinggen na zeve en dagen riboflavine blijkt te zijn weggerreageerd, is hier te zien ne. voorbij zzijn. De oxidaatiereactie iss dus duidelijjk een gevolgg van de aanwezigheid vaan riboflavin Deze ressultaten beveestigen de m metingen van n de eerste sttudie, namellijk dat emulsies met viso olie meer oxideren n dan met so ojaolie. Maarr in tegensteelling tot de e eerste studiee komt de oxxidatie van visolie‐ en sojaolie‐‐emulsies hier even sneel op gang. De visolie die d in deze studie werd d gebruikt bevat b dus mogelijkk ook een fottosensitizer, waardoor o ook zonder riboflavine oxxidatie plaattsvindt, maar geen of minder aanti‐oxidans,, waardoor d de reactie evven snel gaat als bij sojao olie‐emulsies.

(C C) emulsies me et visolie

35



(A) em mulsies met ollijfolie

30 25 20 15 10 5 0 0

5

10 1 15 Bewaartijd in dagen

20

35 5 30 0 25 5 20 0 15 5 10 0 5 0 0

25

35 30 25 20 15 10 5 0 5


5


20 2

25

20 2

25

(D)) emulsies mett algenolie µg tryptofaan / mL eiwitextract


(B) em mulsies met sojjaolie

0

57



20

25

35 5 30 0 25 5 20 0 15 5 10 0 5 0 0

5


Figuur 4‐1 15: µg tryptofaaan per mL eiwittextract in funcctie van de tijd voor emulsiess met (A) olijfolie, (B) sojaolie,, (C) visolie e en (D) algenoli e

Voor hett bekomen vvan figuur 4‐16 werd de ffluorescentie ewaarde van n de eiwitexttracten, verd dund met ureum, verminderd met de waaarde bekom men voor de e eiwitextraccten die mett PBS‐bufferr werden meten. Bij verdund. Ureum denatureert heet eiwit, waaardoor het trp over gans het eiwitt wordt gem d tryptofaaan residu’s op o het eiwittoppervlak gemeten. g verdunnen met PBSS‐buffer worrden enkel de maken, wordt de hoeveelheid trp bin nnenin de eiw witmolecule bepaald. Door hett verschil van beide te m In functie van de tijd d is een dalin ng in de hoevveelheid trp binnenin het eiwit op tee merken, die e voor de m riboflavine iets sterker is dan voor v de and dere emulsiees. Dit geldt voor de belichte emulsies met emulsiess met olijfolie, sojaolie en visolie. Bij de emulsiess met algeno olie is eveneeens een dalin ng te zien voor de belichte em mulsie met rib boflavine, teerwijl de niett belichte em mulsies en d die zonder rib boflavine geen dalling, zelfs een stijging gevven.

58




(A) emulsies met olijfo olie 50 000 Fluorescentie tryptofaan

Fluorescentie tryptofaan

5000 4000 3000 2000 1000 0

40 000 30 000 20 000 10 000 0

0

5


20

25

0

(B) emulsies met sojaolie


20 0

25

20

25

(D) emulsies mett algenolie 50 000 Fluorescentie tryptofaan

5000 Fluorescentie tryptofaan

5

4000 3000 2000 1000

40 000 30 000 20 000 10 000 0

0 0

5


20

25

0

5


Figuur 4‐‐16: Verschil tussen de fluoresscentiewaarden van het staall met ureum en n het staal zond der ureum in fu unctie van de e tijd voor emu ulsies met (A) o olijfolie, (B) soja aolie, (C) visolie e en (D) algeno olie

De hoevveelheid aan NFK, weergegeven in figguur 4‐17 stijgt in evenrredigheid meet de afbraakk van het aminozu uur tryptofaaan. De snelheid waarmee NFK wordtt gevormd iss voor alle b belichte emulsies met fotosenssitizer gelijk.. In emulsiees met visolie en met algenolie a wo ordt meer N NFK gevormd dan in emulsiess met sojaolie en olijfolie. Dit staat in overeensttemming meet de afbraak van trypto ofaan. Na zeven dagen, al hett riboflavinee is opgebru uikt, blijft de e hoeveelheeid afbraakp product min of meer constantt.


1000 900 800 700 600 500 400 300 200 100 0

Fluorescentie NFK

Fluorescentie NFK

(A) emulsies met olijjfolie

0

5


20

1000 900 800 700 600 500 400 300 200 100 0 0

25

(B) emulsies met sojaolie

5


20 2

25

2 20

25

(D) emulsies mett algenolie 100 00 90 00 80 00 70 00 60 00 50 00 40 00 30 00 20 00 10 00 0

1000 900 800 700 600 500 400 300 200 100 0

Fluorescentie NFK

Fluorescentie NFK

59



0

5


20

25

0

5


Figuur 4‐‐17: Fluorescen ntie van N‐form mylkynurenine b bij excitatiegolfflengte 330nm en emissiegolfflengte 420nm in functie van de tijd voor em mulsies met (A)) olijfolie, (B) so ojaolie, (C) viso olie en (D) algenolie

4 4.3.5. Bepaling van ca arbonylgro oepen via sp pectrofotom metrie De hoevveelheid carbonylgroepeen die gevormd werden n door licht‐‐oxidatie, staan weerge egeven in figuur 4‐‐18. Voor alle belichte emulsies e meet fotosensittizer is een duidelijke d stijging van het aantal carbonylgroepen waaar te nemen, in vergelijjking met de e controles, namelijk dee onbelichte emulsies en de beelichte emulsies zonder fotosensitizeer. De toename van de ccarbonylgroeepen is het ggrootst in de emulsies met visolie, gevolggd door sojaaolie en alggenolie, die gelijkende rresultaten ge even. De b olijfolie‐emulsies. Ook hier blijveen de conceentraties con nstant na stijging is het minstt duidelijk bij zeven dagen, d als het h riboflavine is uitgeewerkt. De emulsies met m visolie vormen hie erop een uitzondeering, waarbij er na zeven n dagen nog een stijging is waar te nemen. Bij de staart van de sttudie bevatteen alle emulsies ongevee er één µmol carbonylgro oepen per graam eiwit. Bij de beelichte olijfo olie‐emulsiess is er een lichte stijgingg tot 3µmol per gram eiwit, voor so ojaolie en algenoliee stijgt de co oncentratie ttot 8µmol en n voor de vissolie‐emulsiees tot 13µmo ol per gram eiwit. Op figuur 4‐18(C) 4 staan n foutenvlagggen weergeegeven. Die tonen aan dat de methode meesstal goed reproduceerbare ressultaten opleevert.

60



Het oxid datie‐effect in de sojao olie‐emulsies is minderr groot dan n in de DM MDC‐studie, waar de carbonylinhoud steeeg tot 18µmol per gram eiwit. De m microbiële gro oei naar hett einde van d de studie toe, heeeft mogelijk eeen impact o op dit versch hil. (A) em mulsies met olijjfolie

(C C) emulsies meet visolie µmol carbonylgroepen/ g eiwit

µmol carbonylgroepen/ g eiwit

14 12 10 8 6 4 2 0 5

0

10

155

20

4 14 12 10 8 6 4 2 0

25

0

5

bewaartijd in dagen

14 12 10 8 6 4 2 0 0

5

10

1 15

bewaartijd in daagen

20 2

25

2 20

25

(D)) emulsies mett algenolie µmol carbonylgroepen/ g eiwit

µmol carbonylgroepen/ g eiwit

(B) emulsies met sojjaolie

10 15 bewaartijd in dagen

20

25

14 4 12 2 10 0 8 6 4 2 0 0

5

10 15 d in dagen bewaartijd

Figuur 4‐‐18: µmol carbonylgroepen per gram eiwit in functie van d de tijd voor emulsies met (A) o olijfolie, (B) sojjaolie, (C) viso olie en (D) algen nolie

4.3.6. Bepaling van d 4 de vrije en d de totale thiolgroepen n via spectro ofotometrie In deze studie werd den opnieuw w de vrije th hiolgroepen bepaald, waaarbij dezelffde variabilitteit werd nomen als in n de studie met m DMDC. De hoeveelh heid vrije th hiolgroepen aaanwezig in het wei‐ waargen eiwit lagg te laag om precieze meetresultateen te bekomen. Door dee grote variaties kan moeilijk een trend waaargenomen n worden. Ho oewel de varriabiliteit gro oot is, zijn de foutenmargges klein (zie figuur 4‐ 19(C)). D De methode is dus wel go oed reproducceerbaar. Uit figuu ur 4‐19 kan w worden afgeleid dat, geeen rekening h houdend meet de variabilliteit, de hoe eveelheid vrije thio olgroepen vo oor alle oliën n lager ligt in n belichte em mulsies met riboflavine. V Voor de sojaa‐, vis‐ en algenoliee‐emulsies zakken z de waarden w zelffs naar nul µmol vrije thiolgroepen t n per gram eiwit. In grafieken (C) en (D), voor visoliee en algenoliee, is duidelijkk op te merkken dat de vrije thiolgroe epen ook dalen in afwezigheid d van een sensitizer en o ook zonder belichting. Dee oxidatie griijpt weliswaaar sneller plaats in n aanwezigheeid van licht en een fotossensitizer.

(A) em mulsies met oliijfolie

(C C) emulsies me et visolie 20 2 µmol thiolgroepen / g eiwit


50 40 30 20 10 0

10 1

0 0

5

10

1 15

20

0

25

5

bewaartijd in dagen

15

20 0

25

20 0

25

(D) emulsies met algenolie

40

3 30

30 20 10 0 0

5

10

15

bewaartijd in daagen

20

25



10

bewaartijd in dagen


‐10

61



2 20

1 10

0 0

5

10

15

bewaartijd in dagen

Figuur 4‐‐19: µmol vrije thiolgroepen p per gram eiwit in functie van d de tijd voor em mulsies met (A) olijfolie, (B) so ojaolie, (C) viso olie en (D) algen nolie

De hoevveelheid totaale thiolgroeepen (figuur 4‐20) ligt beduidend b hoger, en verrtoont bijgevvolg veel minder variabiliteit.. Ook de reproduceer r baarheid vaan deze meethode, die te zien is aan de Bij de start vvan het expeeriment bevaatten de eiwitten 200 foutenvlaggen op grrafiek (C), is vvoldoende. B µmol totale tthiolgroepen n per gram eeiwit, wat verrgelijkbaar iss met de starrtwaarde in d de eerste tot 250 µ studie. D De daling van n het aantal totale thiolggroepen is he et grootst vo oor algenoliee‐ en visolie‐e emulsies. Zoals oo ok het geval w was voor de afbraak van n tryptofaan, vermindert het aantal totale thiolgrroepen in deze stu udie ook voor de belich hte visolie‐eemulsie zond der riboflavine. Dit kan terug wijze en op de aanwezigheid van een andere fotosensitize f er in de visolie. Voor sojjaolie‐ en ollijfolie‐emulssies is de d. daling vaan de thiolgrroepen minder opvallend Bij de vissolie‐emulsiees is ook een n duidelijke d daling van het aantal tottale thiolgroepen merkb baar in de niet belichte emulsiees. Ook bij de emulsies m met algenolie e ligt het laatste meetpu unt van de on nbelichte n de anderee punten. Terug is de stalen en het belichte staal zonder riboflavine beduidend lager dan oorzaak hier het autoxidatieprocces. mulsies met ssojaolie is dee oxidatieve impact terug minder uittgesproken in vergelijking met de In de em DMDC‐studie. De waarneming bij b de carbonylgroepen, een anderee parameter die de eiwiitoxidatie mee bevestiggd. opvolgt, wordt hierm


(C C) emulsies me et visolie 300 3 µmol thiolgroepen / g eiwit


300 250 200 150 100 50 0

250 2 200 2 150 1 100 1 50 0

0

5

10 1 15 bewaartijd in dagen

20

25

0


5

10 15 bewaartijjd in dagen

2 20

25

20

25

(D D) emulsies me et algenolie 3 300 µmol thiolgroepen / g eiwit

300 µmol thiolgroepen / g eiwit

62



250 200 150 100 50

2 250 2 200 1 150 1 100 50 0

0 0

5

10 15 5 bewaartijd in daagen

20

25

0

5


Figuur 4‐2 20: µmol totale e thiolgroepen per gram eiwitt in functie van de tijd voor em mulsies met (A)) olijfolie, (B) so ojaolie, (C) viso olie en (D) algen nolie

4.3.7. Bepaling van d 4 de vrije amiinogroepen n Vanaf hiier volgen de d resultaten n van enkelee parameterrs die alleen op de emu ulsies van de e tweede bewaarsstudie werdeen bepaald. Er kan dus ggeen vergelijjking met dee resultaten van de DMD DC‐studie worden gemaakt. Het gehalte aan vrijje aminogroepen in het wei‐eiwit werd w bepaald d met een sspectrofotom metrische methodee met TNBS.. In figuur 4‐‐21 is te zien n dat de hoeveelheid vrijje aminogroeepen in alle emulsies daalt, onafhankelijk o k of de em mulsies beliccht of niet belicht werden, en onafhankelijk van de aanwezigheid van eeen sensitizerr. De emulsiees met visoliie en algenolie vertonen het sterkste e verschil tussen h het begin‐ en n het eindpu unt. Bij de em mulsies met olijfolie en sojaolie is ggeen duidelijke daling aan vrijee aminogroeepen waar tee nemen. Dee spreiding in de meetw waarden bij h het beginpunt zijn te wijten aaan een fout in de experimentele uitvvoering van d de bepaling. TNBS werd niet kwantittatief aan het staal toegevoegd d. Uit de resultaten r bllijkt dat dezze methode niet geschikkt is om de eiwitoxidatie in emulsiies op te volgen. D De methode wordt wel ggebruikt op zzuivere eiwitoplossingen.


63



(C) emulsies m met visolie 14 40 µmol aminogroepen / g eiwit

µmol aminogroepen / g eiwit

140 120 100 80 60 40 20 0

120 10 00 80 8 60 40 4 20 0

0

5 10 dagen bewaartijd in d

15

0

(B) em mulsies met so ojaolie

15

(D) emulsies me et algenolie 14 40 µmol aminogroepen / g eiwit

140 µmol aminogroepen / g eiwit


120 100 80 60 40 20

12 20 10 00 8 80 6 60 4 40 2 20 0

0 0

5 10 dagen bewaartijd in d

15

0


15

Figuur 4‐2 21: µmol vrije aaminogroepen per gram eiwitt in functie van de tijd voor em mulsies met (A) olijfolie, (B) so ojaolie, (C) viso olie en (D) algen nolie

4.3.8. Bepaling van h 4 het beschikb bare lysine e Het beschikbare lyssine werd met m fluoromeetrie gemete en en met behulp b van een standaaardcurve, gaande van 0.06 tot 0.3mg lysine per mL, gekwaantificeerd. De bekomeen resultate en staan weergeggeven in figguur 4‐22. In functie van v de tijd daalt het beschikbaar b lysine onge eacht de aanwezigheid van een e sensitizeer en ongeaacht de beliichting. In de d emulsies met visolie e en met men in de belichte emulsies met algenoliee is wel een iets snelleree afname vaan het lysine waar te nem riboflavine. Ook dezee methode iss niet geschikt om eiwito oxidatie in em mulsies op tee volgen.


64 4



10

10 0

8

8

mg lysine / g eiwit

mg lysine / g eiwit


6 4 2

6 4 2 0

0 5 10 bewaartijd in daagen

0

0

15

15

(D)) emulsies mett algenolie

10

10 0

8

8

mg lysine / g eiwit

mg lysine / g eiwit


5 10 bewaartijd d in dagen

6 4 2 0

6 4 2 0

5 10 bewaartijd in daagen

0

15

0


15

Figuur 4 4‐22: mg beschiikbaar lysine pe er gram eiwit in n functie van d de tijd voor emu ulsies met (A) o olijfolie, (B) sojaolie, (C) viso olie en (D) algen nolie

4.3.9. Fluo 4 orescentiem meting van carbonylgrroepen Naast de carbonylm meting met spectrofoto ometrie (4.3 3.5) werden de carbon nylgroepen eveneens e n met fluorometrie. De o optimale exccitatiegolflengte werd gezocht door tte meten bij 350, 360 gemeten en 370nm. Bij een go olflengte van n 360nm werrden de bestte resultaten n bekomen. H Het emissiem maximum 55nm. In fiiguur 4‐23 worden dee fluorescentiewaarden n bij de bij die golflengte ligt bij 45 respectieevelijke excittatie‐ en emissiegolflenggten van 360 en 455nm u uitgezet in fu unctie van de e tijd. Het beeld is sterk vergeelijkbaar met figuur 4‐18, waarin de carbonylgroepen, bep paald met de DNPH‐ s De sttijging in dee emulsies met m visolie is i hier mind der uitgespro oken ten methodee, vermeld staan. opzichtee van de emulsies met sojaolie s of algenolie, in vergelijking v met de DNP PH‐methode, waar in visolie‐emulsies bed duidend meeer carbonyylgroepen werden w gemeten dan in de emulssies met algenoliee en sojaoliee. De meth hode is dus ggeschikt om trends in oxxidatieve verrmeerderingg van het aan ntal carbonyylgroepen vast te stellen, maar m de carbonylgroe c epen kunne en met deeze fluoresccentiemetho ode niet gekwanttificeerd worrden.

65



(C C) emulsies meet visolie

1200

1200

1000

10 000

Fluorescentie carbonyl


(A) emu ulsies met olijffolie

800 600 400 200 0

800 8 600 400 4 200 0

0

5


20

0

25


2 20

25

2 20

25

(D) emulsies mett algenolie

1200

1200 1

1000

1000 1



(B) emu ulsies met sojaaolie

5

800 600 400 200 0

800 600 400 200 0

0

5

10 15 5 Bewaartijd in daagen

20

25

0

5


Figuur 4‐2 23: Fluorescenttie van carbonyylgroepen bij e excitatiegolflengte 360nm en e emissiegolflenggte 455nm in fu unctie van de e tijd voor emu ulsies met (A) o olijfolie, (B) soja aolie, (C) visolie e en (D) algeno olie

4.3.10. Bepaling van d 4 de geconjug geerde diën nen en triën nen Door oxiidatie van veetten worden n in de vetzu uren niet geconjugeerde diënen en trriënen geoxid deerd tot geconjuggeerde vorm men. De bep paling hiervaan gebeurt met m een speectrofotomettrische meth hode. De hoeveelh heid geconju ugeerde diën nen en triëneen werd vooreerst bepaaald op de verse oliën die zich niet in een emulsie bevin nden (tabel 4 4‐1). Als dezee waarden vergeleken w worden met d de startwaarrden voor 25, is te bemerken dat dee bepaling op p zuivere olië ën lagere de oliën uit de emulssies in figuurr 4‐24 en 4‐2 wijten zijn aaan de onvolledige extracctie van de vvetten uit de e emulsie resultateen oplevert. Dit kan te w en de aaanwezigheid van storende elementen n in het vetexxtract.


66


Tabel 4 4‐1: Geconjuge eerde diënen en n triënen en he et p‐anisidinege etal van de versse oliën

Olie Olijfolie Sojaolie Visolie A Algenolie

Geconjugeerrde Geconjjugeerde G diënen triënen mmol / g ve et µmoll / g vet 0,5 134 1 0,8 245 2 1,8 175 1 6,6 4850

PAV 6 3 20 3

In alle belichte b emu ulsies met rib boflavine wo orden in de vetfractie geconjugeerd de diënen be epaald in functie van de tijd (figuur 4‐2 24). Om de gemeten absorbantiew waarden om te zetten in mmol m vet, werd ggebruik gemaaakt van hett molaire exttinctiecoëfficciënt van geconjuggeerde diëneen per gram ‐1 ‐1 29500 M M cm (Poirier et al., 2001). Voor heet berekenen n van de resu ultaten werd d ervan uitge egaan dat al het veet uit emulssie geëxtraheerd werd en e dat de exxtractieprocedure over de ganse be ewaartijd even efficiënt bleef. Maar hoogsstwaarschijnllijk werd niett al het vet ggeëxtraheerd d en hebben zich met mplexen gevvormd die minder m efficciënt werdeen geëxtrahe eerd. De verloop van tijd eiwit‐vet‐com resultateen weergegeeven in de grafieken g zijn n dus slechtss relatieve waarden. w Desondanks ku unnen uit de metin ngen bepaald de trends wo orden waarggenomen. Visolie een algenolie bevatten uitt zichzelf al eeen hoger ge ehalte aan geeconjugeerde diënen dan n olijfolie en sojao olie, wat te zzien is aan de hogere meeetwaarden voor de onb belichte emu ulsies en de emulsies zonder fotosensitize f er. In olijfoliee is slechts een e kleine ve erhoging aan geconjugeeerde diënen n waar te nemen. In sojaolie blijft de hoeeveelheid stijgen in functie van de tijd, na 21 dagen bevat de olie ongeveeer 30mmol geconjugeer de diënen per g p gram ve et. Voor de emulsies m met visolie sttijgen de geconjuggeerde diënen sneller dan d bij sojaolie, waarnaa een plateaau wordt beereikt. Ook stijgt de hoeveelh heid geconju ugeerde diënen in de belichte b visollie‐emulsies zonder ribo oflavine, zelffs sterker dan in de belichte emulsie met ssensitizer maar de reacttie komt tragger op gang. Ook de niett belichte njugeerde visolie‐emulsies verttonen na verrloop van tijd een lichte verhoging in de hoeveeelheid gecon eveelheid diënen. De algenoliee in de belichte emulsiee met ribofllavine vertoont een verrhoogde hoe mol per gram m vet. Het maximum is veergelijkbaar met dat van n sojaolie, geconjuggeerde diëneen, tot 30mm maar dee geconjugeeerde diënen n worden in algenolie sneller gevorrmd, waarnaa een plateaau wordt bereikt. Naar het ein nde van de sttudie toe is vvoor visolie e en algenolie een daling o op te merken n.

67



(C C) emulsies meet visolie

35

35

30

30 mmol diënen / g vet

mmol diënen / g vet

(A) em mulsies met olijjfolie

25 20 15 10 5

25 20 15 10 5

0

0 0

5

10 1 15 bewaartijd in d dagen

20

25

0


20

25

20 0

25

(D) emulsies met algenolie

35

35

30

30 mmol diënen / g vet

mmol diënen / g vet


5

25 20 15 10 5

25 20 15 10 5

0

0 0

5

10 1 15 bewaartijd in d dagen

20

25

0

5

10 15 bewaartijd in dagen

Figuur 4‐‐24: mmol geco onjugeerde diënen per gram vvet in functie va an de tijd voor emulsies met (A) olijfolie, (B) sojaolie, (C) vissolie en (D) alggenolie

De hoevveelheid gecconjugeerde triënen (figguur 4‐25) werd w bepaalld aan de h hand van de e molaire ‐1 ‐1 extinctieecoëfficiënt van 40000 M cm (Bu utovic et al.,, 2005) en uitgezet u als µmol gecon njugeerde triënen per gram vet. v Voor de d interprettatie van de e grafieken dient gelett te worden op de udingen op d de verticale aas. Terug zijn n de resultateen relatief. verschillende verhou In de beelichte emullsies met fotosensitizer stijgt de ho oeveelheid geconjugeerd g de triënen snel s voor zowel olijfolie, sojao olie als visoliee. Na de sneelle stijging w wordt min off meer een p plateau beko omen. De i het duidelijkst voor viisolie, waarn na sojaolie en e dan olijfolie volgen. In n de belichte visolie‐ stijging is emulsie zonder ribo oflavine is terug een stijgging waar te e nemen, diee trager op ggang komt dan d in de emulsie met sensitizer. In de emulsies met algenolie stijggt de concentratie aan geeconjugeerde triënen niet, inteegendeel, dee hoeveelheid daalt zeer snel. Er is ook een daling in de nieet belichte aalgenolie‐ emulsiess en de emulsies zondeer sensitizer, maar ze in n minder stterk. Wel beevat de alge enolie uit zichzelf aal heel veel ggeconjugeerd de triënen.

68




( (C) emulsies m met visolie

500

µmol triënen / g vet


600

400 300 200 100 0 0

5

10 15 dagen Bewaartijd in d

20

4500 4 4 4000 3 3500 3 3000 2 2500 2 2000 1 1500 1 1000 500 0 0

25

5

20

25

20

25

(D)) emulsies mett algenolie

1600

1 16000

1400

1 14000 µmol triënen / g vet



10 15 Bewaartiijd in dagen

1200 1000 800 600 400 200

1 12000 1 10000 8000 6000 4000 2000

0

0 0

5


20

25

0

5

10 15 Bewaarttijd in dagen

Figuur 4‐‐25: µmol geconjugeerde triën nen per gram vvet in functie va an de tijd voor emulsies met (A) olijfolie, (B) sojaolie, (C) vissolie en (D) alggenolie

4.3.11. Bepaling van h 4 het panisid dinegetal Het paraa‐anisidinegeetal (PAV) beepaalt de vorrming van se ecundaire producten van n vetoxidatie e. In tabel 4‐1 is heet PAV van d de verse oliëën, bepaald volgens prottocol 3.11.3..2, weergegeeven. De PAV van de oliën uitt de emulsiees werd bep paald op eeen vetextractt van de em mulsies, bekomen door protocol 3.11.3.1 en zijn weergegeven in figuur 4‐26. De waarden n bekomen m met de oliën zelf zijn lage er dan als op de vetexttracten van d de emulsies. De PAV weeergegeven in n figuur 4‐26 6 zijn dus, ze bepaaald worden o zoals bij de geconjuggeerde diëneen en triëneen, slechts re elatieve waarden. Deson ndanks kunnen uit de grafieken zekere tren nds worden afgeleid. Het PAV V stijgt voor vvisolie het m meeste in fun nctie van de tijd, gevolgd d door algenolie. Voor ollijfolie en sojaolie is de stijgingg minder gro oot, maar de waarden ligggen toch du uidelijk boven de PAV van de niet e de belich hte emulsie zonder ribo oflavine. Voo or visolie is er ook een n stijging belichte emulsies en merkbaaar in de belichte emulsiee zonder sen nsitizer, maaar net zoals bij de geconjugeerde diënen en triënen kkomt de reacctie minder ssnel op gangg.

69



( (C) emulsies m met visolie

800

8 800

700

7 700

Absoluut p‐anisidinegetal


(A) em mulsies met olijfolie

600 500 400 300 200 100 0

6 600 5 500 4 400 3 300 2 200 1 100 0

0

5


20

0

25


20 2

25

2 20

25

(D D) emulsies me et algenolie

800

8 800

700

7 700




5

600 500 400 300 200 100 0

6 600 500 4 400 300 2 200 1 100 0

0

5

10 15 dagen Bewaartijd in d

20

25

0

5


Figuur 4 4‐26: Absoluut p‐anisidinegettal in functie vaan de tijd voor vvetten uit emu ulsies met (A) o olijfolie, (B) soja aolie, (C) viso olie en (D) algen nolie

4.3.12. Bepaling van h 4 het vetzuurp profiel Het vetzzuurprofiel van een vet o of olie bepaaalt uit welke vetzuren eeen olie bestaaat en hoevee el de olie van elkee soort bevaat. Het vetzu uurprofiel, van v de verscchillende oliiën die in beide studiess werden gebruiktt, werd gean nalyseerd meet gaschromatografie. De resultaten staan weerrgegeven in tabel 4‐2 en de beelangrijkste w waarden staaan vet gedrukt. Alle oliën bevatten vveel palmitin nezuur (C16:0). Visolie en algenolie b bevatten veeel omega‐3‐vvetzuren, PA, C20:5) en docosahexxaeenzuur (D DHA, C22:6),, die typisch zijn voor namelijkk eicosapentaaeenzuur (EP deze soo orten oliën. O Olijfolie en ssojaolie bevaatten meer o oliezuur (C18 8:1) en linolzzuur (C18:2),, wat ook kenmerkkend is voor deze oliën.


70


Taabel 4‐2: Vetzuurprofiel van d de gebruikte oliiën

Olijfolie

Sojaolie

C7:0 C12:0 0 C12:1 1 C13:0 0 C14:0 0 C15:0 0 C16:0 0 C16:1 1 C17:0 0 C17:1 1t C18:0 0 C18:1 1 C18:2 2 C18:3 3 C18:4 4 n‐3 C20:0 0 C20:1 1 C20:2 2 C20:3 3 C20:4 4 n‐6 C20:5 5 n‐3 (EPA) C22:1 1 C22:5 5 n‐3 C22:6 6 n‐3 (DHA) C24:0 0 C24:1 1

0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 1 12,6 1,0 0,2 0,0 2,5 5 59,7 9,0 0,6 0,0 0,4 0,3 0,0 0,2 0,0 0,1 0,0 0,1 0,1 0,1 0,1

Visolie Algenoliee Visoliepillen g vetzuur / 100g o olie 0,0 0,0 0 0,0 0,0 0,0 0,1 0 0,2 0,1 0,0 0,0 0 0,0 0,0 0,0 0,0 0 0,0 0,0 0,1 5,6 6 6,2 4,8 0,0 0,4 0 0,3 0,6 11,4 11,4 15 5,2 10,8 0,1 6,3 0 0,3 5,2 0,1 0,4 0 0,0 0,6 0,0 0,2 0 0,0 0,2 2,9 2,2 0 0,5 2,3 21,1 11,8 2 2,2 10,1 49,0 3,8 0 0,4 3,2 5,5 0,6 0 0,2 0,9 0,1 1,5 0 0,3 1,9 0,3 0,1 0 0,1 0,3 0,1 0,6 0 0,0 1,0 0,1 0,3 0 0,0 0,2 0,3 0,2 1 1,1 0,3 0,0 0,7 0 0,6 0,8 0,2 13,3 1 1,2 12,9 0,0 0,5 0 0,0 1,0 0,0 1,7 0 0,4 1,8 0,0 4,6 27 7,2 8,9 0,1 0,1 0 0,1 0,1 0,1 0,3 0 0,1 0,4

som

8 86,8

91,4

66,8

56 6,5

68,4

De grotee hoeveelheid aan poly‐o onverzadigdee vetzuren in n visolie en algenolie vorm mt de oorzaaak van de grotere effecten van lichtoxidattie in de em mulsies met deze oliën. Namelijk, vverzadigde en e mono‐ digde vetzu uren hebben n slecht eeen klein efffect op de eiwitoxidattie, terwijl de poly‐ onverzad onverzad digde vetzurren meer eiw witoxidatie veeroorzaken. Hoe meer poly‐onverzad digd de vetzu uren zijn, hoe meeer oxidatievee effecten zee veroorzaken (Refsgaard d et al., 2000 0). Hieruit kaan dus gecon ncludeerd worden dat olijfolie het minst oxxidatie veroo orzaakt, gevo olgd door sojjaolie. En dat visolie en aalgenolie, door de aanwezigheeid van de om mega‐3‐vetzu uren, het me eest effect oplevert. Dezze trends werden ook in beide bewaarstud dies teruggevvonden.


71


4.3.13. Amiinozuurana 4 alyse In bijlagee II zijn de resultaten vaan de aminozuuranalyse weergegeveen. De analyyse betreft een HPLC‐ gradiëntt methode op o een RP‐C C18‐kolom. De D stalen werden vooraaf gehydrolyyseerd. Alle emulsies werden bij het begin npunt en na vveertien daggen belichting geanalyseeerd. De cursiief gedrukte waarden weer dat er een ondersch hatting is opggetreden en de resultateen dus niet reepresentatie ef zijn. De geven w Vet gedrrukte waardeen tonen dee verschillen aan. Er is ee en daling te zien in de trryptofaan‐inh houd van de belicchte visolie‐ en algenollie‐emulsies met riboflaavine ten op pzichte van hun beginp punt. De methion nine‐inhoud daalt in de belichte viso olie‐emulsie zonder ribo oflavine en d de belichte algenolie‐ a emulsie met riboflavine ten op pzichte van het h beginpunt. Verder zijn z weinig d duidelijke ve erschillen oeger bespro oken detectiiemethoden voor tryptofaan (4.3.4) en lysine waar te nemen. Daaar met de vro wel duidelijkee verschillen n werden waaargenomen,, kan worden gesteld daat deze meth hode niet (4.3.8) w geschikt is om lichtoxidatie op tee sporen. 4 4.3.14. Micrrobiologiscche uitplating Om de microbiële m c contaminatie e van de em mulsies na te gaan werdeen microbiologische uitp platingen uitgevoeerd. Alle platten, met enkele uitzond deringen die waarschijnlijk aan het toeval te wiijten zijn, waren overgroeid met mesofielee bacteriën. De microbio ologie dient d dus in de toeekomst nauw wkeuriger e hierdoor beeïnvloed kun nnen worden n. Enkele opgevolggd te wordeen, daar de rresultaten vaan de studie pasteurisatiebehand delingen werrden reeds uitgetest en n deze lijken n in eerste instantie ee en goede maatreggel te zijn om m de microbiëële stabiliteitt van de emu ulsies in de to oekomst te ggaranderen.


72

Besluit

5. Bessluit In een optimalisatieestudie voor tryptofaan nbepaling en n de bepaliing van zijn afbraakpro oduct, N‐ formylkyynurenine (N NFK), op eiwitoplossingen n, bleken 280 0nm en 330n nm de idealee excitatiego olflengten voor de fluorescentiemeting te zzijn, bij een bijhorende e emissiegolfleengte van 33 30nm en 420 0nm voor respectieevelijk trypttofaan en NFK. N In functie van de e tijd is een daling waaarneembaaar in het tryptofaan‐gehalte een daarmee gepaard gaaand een stijgging in het NFK‐gehalte. De verminde ering van oter voor caseïne dan voo or wei‐eiwit. de hoeveeelheid trypttofaan is gro Een eerrste bewaarrstudie besttudeerde dee oxidatieve e effecten ten gevolgee van licht en een fotosenssitizer, ribofllavine, in em mulsies van wei‐eiwit w me et sojaolie of o visolie. Veerschillende emulsies werden onder belichting en in het donker bewaard en n zowel emu ulsies met als zonder riboflavine naat als antim microbieel agens toegevvoegd. De werden bereid. Aan de emulsiess werd dimetthyldicarbon oxidatie werd aan dee hand van vverschillendee parameterss nagegaan. De hoevveelheid ribo oflavine in de emulsies werd w in funcctie van de tijd opgevollgd. Reeds na n enkele dagen bleek het ribo oflavine te ziijn weggereaageerd. In de e belichte em mulsies met riboflavine w werd een v de trypttofaan‐inhou ud waargeno omen in functie van de tijd en parallel daarm mee een daling van verhogin ng van de hoeveelheid h NFK. Ook daalt d in dezze emulsies de hoeveelheid vrije en e totale thiolgroeepen door oxidatie o van n de cysteïn ne residu’s. Door oxidattie van het aminozuur histidine worden carbonylgro oepen gevorrmd in de belichte b emu ulsies met riboflavine. r H Het effect iss telkens v de emulsies met visolie, v daarr de olie meer dubbelee bindingen bevat dan sojaolie. groter voor Opmerkelijk is dat er ook oxidattie optrad in de belichte visolie‐emu ulsies zonderr riboflavine. Dit doet vermoed den dat de vvisolie uit zicchzelf al een fotosensitizzer bevat. Eeen tweede o opmerkelijk ffeit is dat de oxidaatie in de emulsies mett visolie, hoewel ze inte ensiever is, trager op gang komt dan d in de emulsiess met sojaolie. Een verklaring hiervo oor is mogellijk de aanwezigheid van n tocoferol, een anti‐ oxidans, in de visoliee. Daaropvvolgend werrd een tweeede bewaarrstudie opge ezet met geebruik van emulsies met m meer verschillende oliën, n namelijk olijffolie, sojaoliee, algenolie e en een andeere visolie dan in de eerstte studie. De bewaaarcondities en de sameenstelling vaan de emulsies is gelijkaaardig aan d de eerste stu udie, met enig verrschil dat geeen antimicrrobieel agen ns werd toegevoegd, om m eventuelee interferenttie uit te schakeleen. Dezelfde oxidatieparaameters als iin de eerste studie werdeen gecontroleerd en enkkele extra parametters werden uitgetest. Alle belichte emulsiees met ribofflavine verto oonden terugg een dalingg van de hoeeveelheid tryyptofaan, n totale th hiolgroepen en een stijgende s ho oeveelheid NFK en caarbonylgroepen. De vrije en waarnem mingen in dee eerste stud die werden h hiermee bevvestigd. Ribofflavine‐analyyse heeft uittgewezen dat al naa zeven dagen al het rib boflavine waas weggereaggeerd. Dit was w ook te ziien aan het oxidatie‐ effect bij alle parameters, waar na zeven daggen een platteau werd beereikt. Ook m met gebruik van deze hte emulsie e zonder andere visolie werrd terug eeen oxidatie‐‐effect waarrgenomen in de belich toegevoegde fotosensitizer. Ookk deze visoliie bevat duss mogelijk eeen sensitizerr. Het effectt was het n de emulsiees met olijfo olie, gevolgd door de sojaolie‐emulsiies. In de em mulsies met algenolie kleinst in en visollie was het effect het grootst. Deeze bevinding werd beevestigd aan n de hand van een vetzuurp profiel, waarrbij algenoliee en visolie meer m poly‐o onverzadigdee bindingen bleek te heb bben dan sojaolie en dan olijfo olie.


73

Besluit

Naast dee gebruikelijjke spectrofotometrische methode voor het meten van caarbonylgroep pen werd een fluorometrischee methode geetest. De ressultaten die hiermee bekkomen werd den, lagen in dezelfde lijn van de spectroffotometrisch he methode.. De fluorescentiemetho ode is dus eeen goed altternatief, maar heet nadeel ervvan is dat de carbonylgrroepen niet kunnen worden gekwantificeerd. Daarnaast D zijn de ffluorescentieemeting op lysine, de sp pectrofotome etrische bep paling van vrije aminogro oepen en de aminozuuranalyse met HPLC geen goedee methoden gebleken om m lichtoxidatie in emulssies op te doordat wein nig verschil te bemerken valt tussen d de belichte een onbelichtee emulsies. sporen d Daarnaaast werd de hoeveelheid d geconjugeerde diënen n en triënen n en het p‐aanisidinegetaal van de oliën in de emulsies opgevolgd in functie vaan de tijd. Vo oor alle belicchte emulsiees met riboflavine en de belich hte visolie‐emulsie zonder riboflavin ne werd een sterk verhoo ogde hoeveeelheid gecon njugeerde diënen aangetroffen a n. Terug waas het effectt hoger voo or algenolie en visolie d dan voor sojaolie en olijfolie. Bij de geco onjugeerde triënen t was hetzelfde be eeld te zien,, met algeno olie als uitzo ondering, heid niet stteeg, maar zelfs daalde omwillee van de hoge hoeve eelheden waar de hoeveelh deerde triënen in de algeenolie zelf. O Ook het p‐an nisidinegetal steeg voor aalle belichte emulsies geconjud met ribo oflavine in fu unctie van de tijd. Een b belangrijke vaaststelling bij deze drie parameters is dat de vetextractie uit de emulsies waaarschijnlijk niet volledigg is en dat de efficiënttie in functie e van de men resultaten slechts reelatief, maar kunnen bewaarttijd niet hetzzelfde blijft. Daardoor zijn de bekom toch een n trend aanto onen. Tot slot werd in dezze tweede bewaarstudie b e de microbiiologische sttabiliteit van n de emulsie es zonder mulsies ware en bacterieeel gecontamineerd na tie en dagen antimicrrobieel agens gecontroleeerd. Alle em bewaring, wat de reesultaten van n de studie zzou kunnen beïnvloed h hebben. Enkeele pasteurissatietests werden reeds uitgevoerd en lijken in eerste e instan ntie een affdoende maaatregel te zijn om bewaarsstudies op em mulsies op ssteriele wijzee te kunnen voeren voor een period de van ongeveer drie weken. In de toeekomst moeeten nog enkkele methodeen worden ggeoptimaliseerd. Zo is er een oversch hatting in de bepaaling van riboflavine, waaarvoor nog geen verklaaring is. Daarnaast geeftt de bepaling van de vrije thio olgroepen zeeer variabelee meetresultaaten en verlo oopt de veteextractie voo or het bepale en van de geconjuggeerde diënen en triënen en het p‐anisidinegetal nog on nvolledig. Eeen laatste maar m zeer belangrijjk aspect is de microbiiële contaminatie, waarrvoor ook nog een oplo ossing moett worden gezocht..


74 4

Biblliografie

6. Bib bliografie e ALLEN, C C. & PARKS, O O.W. (1979).. Photodegraadation of rib boflavin in m milks exposed d to fluoresce ent light. Journal o of Dairy Scien nce, Nr. 62 (p. 1377 – 13 379) ASTWOO OD, J.D., LEACH, J.N. & FU UCHS, R.L. (1 1996). Stabiliity of food allergens to digestion in vitro. Nature B Biotechnolog gy, Vol. 14, N Nr. 10 (p. 126 69 – 1273) ps in some fo BEVERID DGE, T., TOM MA, S.J. & NAK KAI, S. (1974 4). Determinaation of SH‐ and SS‐group ood proteinss using Ellman’s reagent. Journal of Fo ood Science, Nr. 39 (p. 49 9 – 51) BORLE, FF., SIEBER, R.. & BOSSET, JJ. (2001). Photo‐oxidatio on and photo oprotection o of foods, with particulaar reference to dairy products. An up pdate of a revview article ((1993 – 2000 0). Sciences d des alimentss, Nr. 21 (p. 5 571 – 590) BOSSET, J.O., GALLM MANN, P.U. & & SIEBER, R. ((1994). Influe ence of lightt transmittan nce of packagging materials on the sheelf‐life of milkk and dairy p products – a review. In M M. Mathlouth hi (Ed.), Food d packagin ng and Preseervation (p. 2 222 – 268) Glasgow: Blacckie Academiic & Professional BUTOVIC C, I.A., HAMB BERG, M. & RADMARK, O O. (2005). Novel oxylipin ns formed from docosah hexaenoic acid by potato lip poxygenase— —10(S)‐hydro oxydocosahe exaenoic accid and 10,,20‐dihydroxxydocosa‐ hexaeno oic acid. Lipid ds, Vol. 40, N Nr. 3 (p. 249 –– 257) CHOE, E. E & MIN, D.B. (2006). Chemistry C an nd reactions of reactive oxygen speccies in foodss. Critical Reviews in Food Scieence and Nuttrition, Nr. 46 6 (p. 1 – 22) CHOE, E., HUANG, R.. & MIN, D.B B. (2005). Cheemical reactiions and stab bility of ribofflavin in food ds. Journal o of food scien nce, Vol. 70, N Nr. 1 (p. 28 –– 36) DALSGAA ARD, T.K., OTTZEN, D., NIEELSEN, J.H. & & LARSEN, L.B B. (2007). Ch hanges in structure of milk proteinss upon photo o‐oxidation. JJournal of Ag gricultural an nd Food Chem mistry, Nr. 55 (p. 10968 – – 10976) ESTÉVEZZ, M., KYLLI, P P., PUOLANN NE, E. & KIVIK KARI, R. (200 08). Fluorescence Spectro oscopy as a n novel approach for the asssessment of myofibrillar protein oxidation in oil‐in‐water emu ulsions. Mea at Science, Nr. 80 (p. 12 290 – 1296) FENAILLE, F., PARISO OD, V., TABETT, J‐C. & GUYY, P.A. (2005)). Carbonylattion of milk p powder protteins as a consequ uence of proccessing cond ditions. Proteeomics, Nr. 5 (p. 3097 – 3 3104) FIELDS, R R. (1971). Meeasurement of amino groups in proteins and pep ptides. Bioch hemical Journ nal, Vol. 124, Nr. 3 (p. 581 – 5 590) HONG‐FANG, J. & LIA ANG, S. (2008). A DFT stu udy on deacttivation of triplet excited d state riboflaavin by polyphenols. Interna ational Journal of Molecu ular Sciences,, Nr. 9 (p. 19 908 – 1914) HUANG, R., CHOE, E.. & MIN D.B. (2004). Kineetics for singlet oxygen fo ormation by riboflavin photosensitization and the reacttion between n riboflavin aand singlet oxygen. Journ nal of food sccience, Vol. 69, Nr. 9 (p. 726 6 ‐732)


75

Biblliografie

IUPAC: Gold Book [weebpagina], 2005 – 2007, Internationaal Union of P Pure and App plied Chemistry IUPAC G URL: http://goldbook.iupac.org/index.html Gezien d d.d. 21 mei 2 2009 JUNG, M.Y., M YOON, S.H., LEE, H.O. & MIN, D.B. (1998). Singlet oxyggen and asccorbic acid effects on dimethyyl disulfide an nd off‐flavorr in skim milk exposed to o light. Journ nal of food sscience, Vol. 63, Nr. 3 (p. 408 –– 412) KANNER R, J.D. & FENN NEMA O. (19 987). Photoo oxidation of ttryptophan in n the presen nce of riboflaavin. Journal o of Agriculturral Food Chem mistry, Nr. 35 5 (p. 71 – 76 6) KONINGS, W.N., Oveer en door dee grenzen van n het leven [pdf], 18 juni 2002, Rijksu universiteit Groningeen. URL: http://redes.eld doc.ub.rug.n nl/FILES/roott/2002/w.n.kkonings/koniings.pdf Gezien d d.d. 21 mei 2 2009 MALACA ARNE, M., MA ARTUZZI, F., SUMMER, A A. & MARIAN NI, P. (2002). Protein and fat composition of mare’s m milk: some nutritional rem marks with rreference to human and cow’s milk. IInternationa al Dairy Journal, Nr. 12 (p. 86 69 – 877) MESTDA AGH, F., DE M MEULENAER, B., DE CLIPP PELEER, J. & DEVLIEGHER RE, F. (2005). Protective influence of severaal packaging materials on n light oxidattion in milk. Journal of D Dairy Science,, Nr. 88 (p. 499 – 510) MIN, D.B B. & BOFF, J.M. (2002). C Chemistry and reaction off singlet oxyggen in foods. Comprehen nsive reviews in food scien nce and food d safety, Vol. 1 (p. 58 – 72 2) Molecular Devices: Gemini X XPS [webpaggina], 2008, M Molecular Deevices URL: http://www.mo oleculardevicces.com/pagges/instrume ents/gemini.html Gezien d d.d. 18 maartt 2009 MORTEN NSEN, G., BERTELSEN, G.,, MORTENSEEN, K. & STAP PELFELDT, H.. (2004). Ligh ht‐induced ch hanges in packaged cheesess – a review. Internationa al Dairy Journ nal, Nr. 14 (p p. 85 – 102) NIELSEN, S.S. (2003),, Food analyssis,3e druk, SSpringer (p. 237 – 244) PHADUN NGATH, C. (2005). Casein n micelle stru ucture: a concise review. Journal of Sccience Techn nology, Nr. 27 (p p. 201 – 212)) POIRIER,, B., MICJELL, O., BAZIN N, R. & BAR RIÉTY, J. (20 001). Conjuggated dienees: a criticall trait of lipoproteein oxidizabiility in renal ffibrosis. Nep phrology Diallysis Transpla antation, Nr. 16 (p. 1598 8 – 1606) REFSGAA ARD, H.H.F., TSAI, L. & STTADTMAN, E.R. (2000). M Modificationss of proteins by polyunsaaturated fatty acid d peroxidatio on products.. Proceedings of the Natiional Academ my of Sciencees, Vol. 97, N Nr. 2 (p. 611 – 61 16)


76

Biblliografie

REUBSAET, J.L.E., BEIJNEN, J.H., B BULT, A. & V VAN MAANEN N, R.J. (1998)). Analytical techniques u used to on of protein ns and peptid des: chemicaal instability. Journal of P Pharmaceuticcal and study the degradatio Biomedical Analysis, Nr. 17 (p. 95 55 – 978) SALMINEEN, H. & HEINONEN, M. (2008). Plantt phenolics aaffect oxidation of trypto ophan. Journal of Agricultu ural Food Chemistry, Vol. 56, Nr. 16 (p 7472 – 748 81) SIEBER, R. (2005). Oxxidised choleesterol in millk and dairy p products. Intternational D Dairy Journall, Nr. 15 (p. 191 –– 206) Universitty of Guelph h: Dairy Ch hemistry and Physics [webpagina], Un niversity of G Guelph URL: http://www.foo odsci.uoguellph.ca/dairyeedu/chem.httml Gezien d d.d. 16 maartt 2009 VAN CAM MP, J., DEMEEYER, D. & HUYGHEBAER RT, A. (1998).. Biologisch aactieve peptiide: een extrra maatstaff voor de nutritionele waaarde van eiw witten. Nutriinews, oktob ber 1998 (p. 1 – 7) VILJANEN, K., HALMO OS, A.L., SINC CLAIR, A. & H HEINONEN, M M. (2005). Efffects of blacckberry and whey protein emulsion staability. Europ pean Food Reesearch and Technology,, Nr. 221 raspberrry juice on w (p. 602 –– 609) Voedingscentrum: met vitaminen n en minerallen [pdf], Voedingscentru um Wijzer m URL:http p://www.voeedingscentru um.nl/NR/rdo onlyres/A5D DB37C0‐5D28 8‐4CBB‐87EEE‐8D3B68C95 557A /0/vitam minewijz_10__10104.pdf Gezien d d.d. 28 april 2 2009 Wagenin ngen Universsity: Maillard d reactie [webpagina], 24 4 februari 200 09, Wagenin ngen Universsity URL: http://www.foo od‐info.net/n nl/colour/maaillard.htm Gezien d d.d. 21 mei 2 2009 WAL, J‐M M. (2003). Th hermal proceessing and allergenicity o of foods. Alleergy, Nr. 58 (p. 727 – 729 9) Wikipedia: Riboflaviine [webpaggina], Wikimeedia Foundattions, Inc., 20 009 URL: http://nl.wikipeedia.org/wikki/Riboflavinee Gezien d d.d. 28 april 2 2009


77

Bijlag gen Bijlage e I: Gebru uikte prod ducten me et leveran ncier en vestigingsp plaats Product Acetonittril Algenoliie Azijnzuu ur Boorzuu ur Caseïne Caseïne standaard Claradiaastase Dimethyyldicarbonaaat DNPH DTNB EDTA Ethanol Ethylace etaat Glycine H2SO4 HCl Hexaan Iso‐octaan Iso‐prop panol KCl KH2PO4 KH2PO4 Kjeltabs CX Minsh in ndicator Na2B4O7 7 Na2HPO4 4 NaAc NaCl NaOH Nonadeccaanzuur Olijfolie OPA Riboflavvine SDS Sojaolie TCA Ultrapuu ur water Ureum Visolie Visoliepillen Wei‐poe eder β‐mercaapto‐ethanoll

Leverancie er Rathburn Desmet Baallestra Chemlab VWR Arla Sigma Fluka Fluka Biocchemika Aldrich Sigma Chemlab Chemlab Chemlab Chemlab Chemlab VWR Chemlab Chemlab Chemlab Chemlab Acros Orgaanics Chemlab Thompson n & Capper LLtd. Merck Acros Orgaanics Chemlab Chemlab Chemlab Chemlab Fluka Bertolli Claassico Sigma Fluka BioC Chemika Acros Orgaanics Lesieur Acros Orgaanics Chemlab Chemlab Desmet Baallestra Céréal Arla Acros Orgaanics

Vestigingsplaats Walkerburn n, Schotland Zaventem, B België Zedelgem, B België Amsterdam, Nederland Viby, Denem marken St. Louis, USSA St. Louis, USSA St. Louis, USSA St. Louis, USSA St. Louis, USSA Zedelgem, B België Zedelgem, B België Zedelgem, B België Zedelgem, B België Zedelgem, B België Amsterdam, Nederland Zedelgem, B België Zedelgem, B België Zedelgem, B België Zedelgem, B België Geel, Belgiëë Zedelgem, B België Cheshire, UK New Jersey,, USA Geel, Belgiëë Zedelgem, B België Zedelgem, B België Zedelgem, B België Zedelgem, B België St. Louis, USSA Brussel, Belggië St. Louis, USSA St. Louis, USSA Geel, Belgiëë Asnières‐sur‐Seine, Fran nkrijk Geel, Belgiëë Zedelgem, B België Zedelgem, B België Zaventem, B België Brussel, Belggië Viby, Denem marken Geel, Belgiëë


78

Bijlage e II: Resulltaten am minozuura analyse

Olijjfolie

zonder rib boflavine

zonder riboflavine belicht

zonder riboflavine e niet belichtt

met riboflavin ne

met riboflavine beliccht

dag 0

dag 14

dag 14

dag 0

dag 1 14

met m ribofflavine niet b belicht dag 14

Histidiine

1,62

1,64

1,53 3

0,,95

1,41

1,61

Tyrosine

2,88

2,97

2,84 4

1,,71

2,69

3,00

Methio onine

2,67

2,13

2,18 8

1,,62

2,45

2,60

Trypto ofaan

1,16

Lysine

9,32

Sojaaolie

1,92 9,08

8,87 7

5,,32

8,59




met riboflavin ne

met ribofla avine beliccht

dag 0

dag 14

dag 14

dag 0

dag 1 14

9,12 met m ribofflavine niet b belicht dag 14

Histidiine

1,91

1,28

1,70 0

1,,61

1,26

1,66

Tyrosine

3,37

2,39

3,02 2

2,,84

2,34

3,06

Methio onine

2,82

1,95

2,46 6

2,,60

1,77

2,73

Trypto ofaan

1,37

Lysine

1,02

10,68

Vissolie

7,08

9,40 0

9,,01

7,72




met riboflavin ne


dag 0

dag 14

dag 14

dag 0

dag 1 14


Histidiine

1,71

1,45

1,68 8

2,,15

2,01

1,59

Tyrosine

3,10

2,96

3,17 7

3,,84

3,74

2,96

Methio onine

2,61

1,80

2,51 1

2,,74

2,62

2,69

Trypto ofaan

1,43

Lysine

0,96

10,03

Alge enolie

9,25

10,07 7

12,,26

1 11,38



zonder riboflavinee niet belichtt

met riboflavin ne


dag 0

dag 14

dag 14

dag 0

dag 1 14


Histidiine

1,60

1,88

0,97 7

1,,42

1,24

1,70

Tyrosine

2,81

3,41

1,77 7

2,,55

2,42

3,08

Methio onine

2,20

2,37

1,42 2

2,,42

2,03

2,74

Trypto ofaan

1,45

Lysine

8,97

1,10 10,62

5,40 0

8,,35

8,30

9,80


79

Colofo on Dit eindw werk ‘Studiee van licht‐geeïnduceerde eiwitoxidatiie in olie‐in‐w water emulsies’ werd op pgemaakt met behulp van: ‐ ‐ ‐

Pc Intel® Cen ntrino® Insid de™ T Tekstverwer rkingsprogramma Word 2 2007 Rekenblad Excel 2007

De lopen nde tekst is uitgewerkt in Calibri 11 1pts. De eerrste koptekstt staat in Caambria Vet 14pts, 1 de tweede koptekst in Cambria Vett 13pts, de d derde koptekkst staat in C Cambria Vet 11pts, de vierde kop de vijfde kop p in Cambria 11pts. in Cambria Vet Cursief 11pts en d


80

Voor a akkoord verklaring Datum vvan voltooiing: 5 juni 200 09. Voor akkkoord verklaard Dr. Ir. Frédéric Mestd dagh Stagemeentor

Apr. Bartt Quartier Stagebeggeleider Dit eindw werk is een eexamen. Eveentuele fouteen die worden vastgestelld tijdens de eindwerkverrdediging of erna worden niiet gecorrigeeerd. Het gebruik g als referentie in i publicatiees is toegelaten na goedkeu uring van de sstagebegeleider.

Studie van licht geïnduceerde eiwitoxidatie in olie in water emulsies

Recommend Documents