Stamtyperingen Dr. Thierry De Baere

H.-Hartziekenhuis Roeselare - Menen vzw Wilgenstraat 2 - 8800 Roeselare

Stamtyperingen

Dr. Thierry De Baere

Bacteriële stam-typering : wat ?

= opsporen van verschillen op stam-niveau tussen verschillende isolaten van éénzelfde species. Waarom: 1. uitbraak-controle 2. surveillance / epidemiologische studies (referentiecentra)

Thierry De Baere

Knokke – WKB WV

2011-10-11

Bacteriële stam-typering : waarom ?

Voor de inventarisatie van de verspreiding van infectieuze agentia is typering van deze microorganismen van essentieel belang. Bedoeling is om te karakteriseren op subspecies en isolaatniveau om epidemiologische (of uitbraak) isolaten te onderscheiden van niet met elkaar verband houdende isolaten. Ziekenhuishygiëne.

Thierry De Baere

Knokke – WKB WV

2011-10-11

Bacteriële stam : wat ? “Stam” is - Een subset van een bacteriëel species, die verschillen van andere bacteriën binnen hetzelfde species in kleine maar identificeerbare verschillen. - een populatie van organismen die afstammen van één enkel isolaat of reincultuur. - Verschillen tussen stammen onstaan door mutaties. Mutaties kunnen spontaan gebeuren, onder druk van de omgeving (chemicaliën, antibiotica), contact met andere organismen of door humane toevoeging (genetische manipulatie) Thierry De Baere

Knokke – WKB WV

2011-10-11

Bacteriële stam typering: waarom ?

Eénzelfde bacteriëel species meerdere malen geïsoleerd …

K601, K602 en K603

K202 en K209 Hospital

K105 Thierry De Baere

Knokke – WKB WV

2011-10-11


Eénzelfde bacteriëel species meerdere malen geïsoleerd … Toevallige naast elkaar staande infecties K601, K602 en K603 Overdracht van patiënt naar patiënt K202 en K209 Allen gelinkt aan éénzelfde kamer, apparaat, dokter, verpleegster ??? Hospital

K105 Thierry De Baere

Knokke – WKB WV

2011-10-11


• Is er een link ? • Hoe is de overdracht van de ene patiënt naar de andere gebeurd ? • Wie moet er bijkomend gescreend worden ? • Hoe kan dit voorkomen worden ?

Thierry De Baere

Knokke – WKB WV

2011-10-11


• Is er een link ? • Hoe is de overdracht van de ene patiënt naar de andere gebeurd ? • Wie moet er bijkomend gescreend worden ? • Hoe kan dit voorkomen worden ?

Thierry De Baere

Knokke – WKB WV

2011-10-11

Bacteriële stam typering: hoe ?

Twee technologieën :  Fenotypische technieken  Genomische technieken

Thierry De Baere

Knokke – WKB WV

2011-10-11


 Fenotypische (morfologische) methodes  Antibiotica resistentie patronen

Thierry De Baere

Knokke – WKB WV

2011-10-11


 Fenotypische (morfologische) methodes  Antibiotica resistentie patronen  Principe: door een panel van antibiotica te gebruiken krijgt men mogelijke combinaties van resistenties.  Wanneer stammen eenzelfde antibioticaresistentiepatroon hebben zijn ze mogelijks verwant.

Thierry De Baere

Knokke – WKB WV

2011-10-11


 Titel - niveau 1  Niveau 2  Niveau 3  Niveau 4  Niveau 5

Echter : Horizontale transfer van resistentie genen.

Thierry De Baere

Knokke – WKB WV

2011-10-11


 Fenotypische (morfologische) methoden  Serotypering

Thierry De Baere

Knokke – WKB WV

2011-10-11

Bacteriële stam typering: wat ?

 Fenotypische (morfologische) technieken  Serotypering  Principe: Het bepalen van een bacterietype door de bacterie te laten reageren met bekende antistoffen. Wanneer er antigenen aanwezig zijn op het oppervlak van de bacterie ontstaat er reactie met agglutinatie tot gevolg.  Opdeling slechts in serotypes en niet tot op stamniveau.

Thierry De Baere

Knokke – WKB WV

2011-10-11


 Fenotypische (morfologische) methoden  Serotypering  Salmonella Salmonella enterica serotypes Kauffman-White shema  E. coli E. coli O157H7


 Salmonella Salmonella enterica serotypes Kauffman-White shema

Thierry De Baere

Knokke – WKB WV

2011-10-11


 Fenotypische (morfologische) technieken  Deel 1: antibiotica gevoeligheid en serologie  Bruikbaar om mogelijke uitbraken te detecteren.

Thierry De Baere

Knokke – WKB WV

2011-10-11


 Fenotypische (morfologische) technieken  Faagtypering

Thierry De Baere

Knokke – WKB WV

2011-10-11


 Fenotypische (morfologische) technieken  Faagtypering  Principe: (bacterio)fagen zijn virussen die bacteriën kunnen infecteren. Na replicatie barst de cel. Fagen zijn echter niet specifiek voor een bepaald species, maar strikter tot op stam-niveau of groep van verwanten (maar toch verschillend) stammen

Thierry De Baere

Knokke – WKB WV

2011-10-11


Bacteriofaag lysis

Thierry De Baere

Knokke – WKB WV

2011-10-11


 Fenotypische (morfologische) technieken  Faagtypering  Door gebruik te maken van een panel van selectieve fagen kunnen stammen met elkaar vergelijken worden inzake faaggevoeligheid van de stam. Faag-typering is gevoelig tot op “quasi”-niveau, Echter steunend op verouderde technologie.

Thierry De Baere

Knokke – WKB WV

2011-10-11


 Typering op basis van celwand-eiwitsamenstelling  SDS-PAGE protein scheiding van totaal eiwit bacterie.  Principe: via een scheiding worden de zware celwand eiwitten gescheiden op een gel, na kleuring bekomt men een bandenpatroon wat vergeleken kan worden.

Thierry De Baere

Knokke – WKB WV

2011-10-11


Interpretatie…moeilijk

Thierry De Baere

Knokke – WKB WV

2011-10-11


 Fenotypische (morfologische) technieken  Multilocus enzym electroforese  Principe: door mutaties wijzigen intracellulaire enzymes van samenstelling in hun aminozuren. Door de relatieve mobiliteit van een groot aantal intracellulaire enzymes te bestuderen kunnen verschillen tussen isolaten opgemerkt worden.

Thierry De Baere

Knokke – WKB WV

2011-10-11


Omslachtig Discriminatief ??

Thierry De Baere

Knokke – WKB WV

2011-10-11


 Fenotypische technieken deel 2  Discriminatief tot op zeker niveau  Problemen : niet bruikbaar voor routine  Technische eisen (eiwitlabo faciliteiten) Echter … misschien in de toekomst: MALDI-TOF

Thierry De Baere

Knokke – WKB WV

2011-10-11


 Genotypische methoden (genotypering)  Gaan de verschillen in het genoom opsporen  Sporen de mutaties zelf op  Meer discriminatief  DNA-technologie meer toegankelijk voor klinische moleculaire laboratoria.

Thierry De Baere

Knokke – WKB WV

2011-10-11


Thierry De Baere

Knokke – WKB WV

2011-10-11


 Genotypische methoden (genotypering)  Sterk geëvolueerd door de jaren heen…  DNA-technologie meer toegankelijk binnen een klinisch moleculair labo  Automatisatie …

Thierry De Baere

Knokke – WKB WV

2011-10-11


 Genotypische methoden (genotypering)  Plasmide electroforese  Principe: stammen bevatten verschillende plasmides die ze opnemen of verliezen door evolutie. Door de plasmides tussen verschillende isolaten te evalueren kan men stammen typeren.

Thierry De Baere

Knokke – WKB WV

2011-10-11


Chromosoom

Plasmides

Thierry De Baere

Knokke – WKB WV

2011-10-11


 Genotypische methoden (genotypering)  Plasmide electroforese  Later: ging men selectief plasmides extaheren (zonder genomische DNA) en dit knippen met een restrictie enzyme, en evalueren via gelelectroforese.  Echter kunnen plasmides overgaan van de ene bacterie naar de andere (horizontale transfer) en dit is niet meer evolutief.  Momenteel wordt deze techniek gebruikt om onderzoek te doen naar antibiotica resistentie gen dragende plasmides. Thierry De Baere

Knokke – WKB WV

2011-10-11


 Genotypische methoden (genotypering)  Enige mogelijkheid: analyse van het volledige genoom van een isolaat.  Echter:  Grootte: 1e bacteriëel genoom gesequenced E. coli K-12 : 4.6 106 baseparen.  Waar zitten belangrijkste mutaties (evolutief)  Hoe controleren ?  Bruikbaarheid in routine ?

Thierry De Baere

Knokke – WKB WV

2011-10-11


 Genotypische methoden (genotypering)  Restrictie analyse van het totale genoom.  REA  Principe : DNA-extractie van de bacterie, digestie van DNA door een restrictie-enzyme gevolgd door gel-electroforese.

Thierry De Baere

Knokke – WKB WV

2011-10-11

Restrictie enzyme: wat ?

• Enzyme dat DNA herkent en knipt • Herkenningsplaats is meestel een palindroom sequentie van 4,6,8 nucleotiden lang • Bacteriëel mechanisme om vreemd DNA te knippen. Thierry De Baere

Knokke – WKB WV

2011-10-11


 Genotypische methoden (genotypering)  REA

Hééééél veel banden Niet duidelijke scheiding Hoe interpreteren?

Thierry De Baere

Knokke – WKB WV

2011-10-11


 Genotypische methoden (genotypering)  Pulsed Field Gel Electroforese  Principe: het geïsoleerde DNA wordt geknipt met een infrequente knipper (8 nucleotiden).  Bekomen DNA fragmenten zijn verscheiden van grootte, dus een aangepaste electroforese waarbij zowel bij de grote als de kleine fragmenten een goede scheiding mogelijk is.

Thierry De Baere

Knokke – WKB WV

2011-10-11


celmembraan

Voorzichtige lysis in agar plugs: vrijzetten genomisch DNA

Restrictie (‘infrequent cutter’) PFGE

+

Thierry De Baere

Stam 1

Stam 2

Knokke – WKB WV

2011-10-11


Thierry De Baere

Knokke – WKB WV

2011-10-11


Thierry De Baere

Knokke – WKB WV

2011-10-11


Door combinatie van verschillende enzymes (meestal 2) krijgt men een hogere discriminatie. Thierry De Baere

Knokke – WKB WV

2011-10-11


 Genotypische methoden (genotypering)  Pulsed Field Gel Electroforese  Conclusie:  heel discriminatief  Echter specifieke apparatuur en technologie  Werk, tijd..

 Door invloeden van PulseNet USA en PulseNet Europe uniformisatie van het protocol, vooral voor voedselpathogenen (Listeria, Salmonella, E. coli ..) echter een taak voor referentielaboratoria. Thierry De Baere

Knokke – WKB WV

2011-10-11


 Genotypische methoden (genotypering)  Ribotyping  Principe: isolatie van genomisch DNA van de bacterie. Verknippen (REA). Blotten van de gel en hybridisatie met specifieke rRNA probes.  Door enkel de banden op te lichten waar rDNA zit, wordt het overzichtelijk en toch bruikbaar.

Thierry De Baere

Knokke – WKB WV

2011-10-11


Thierry De Baere

Knokke – WKB WV

2011-10-11


 Genotypische methoden (genotypering)  Ribotyping  Automatisatie: Riboprinter

Thierry De Baere

Knokke – WKB WV

2011-10-11


 Genotypische methoden (genotypering)  Amplification based  AFLP (amplified fragment length polymorphism)  Principe: chromosomaal DNA wordt geknipt met restrictieenzymes (2), vervolgens worden adapters toegevoegd (die de uitstekende restrictieuiteindjes herkennen) en geligeerd, met daaropvolgend een amplificatie-reactie (al dan niet met selectieve primers)

Thierry De Baere

Knokke – WKB WV

2011-10-11


Thierry De Baere

Knokke – WKB WV

2011-10-11


 Genotypische methoden (genotypering)  Amplification based  De PCR techniek laat toe een overzicht te bekomen van het volledige genoom maar toch maar met PCR-fragment lengtes die scheidbaar zijn op gel-electroforese of caplillaire electroforese (door fluorescente probes)

Thierry De Baere

Knokke – WKB WV

2011-10-11


 Genotypische methoden (genotypering)  Amplification based  AFLP

Thierry De Baere

Knokke – WKB WV

2011-10-11


 Genotypische methoden (genotypering)  Tandem repeat amplification  Principe: primers gericht aan de buitenzijde van een zone het genoom waar korte stukjes DNA enkele malen na elkaar voorkomen.  Aantal maal het voorkomt is typisch voor de stam en evolueert verder.  Vb. Spoligotyping (specifieke techniek voor Mycobacterium tuberculosis)  Principe volgt nog in MLVA.

Thierry De Baere

Knokke – WKB WV

2011-10-11


 Genotypische methoden (genotypering)  Arbitrary primer PCR (AP-PCR) ofwel randomly amplified polymorphic DNA-analysis (RAPD)  Principe: één (of twee) primer(s) gaat bij lage annealingtemperatuur een beetje ad-random binden op het genoom, door de PCR hierbij worden fragmenten geamplificeerd van de ene bindsite naar de andere.  Gel-electroforese levert een fingerprint op.

Thierry De Baere

Knokke – WKB WV

2011-10-11


Thierry De Baere

Knokke – WKB WV

2011-10-11


 Genotypische methoden (genotypering)  AP-PCR of RAPD  Voordelen: snel, efficient voor uitbraak controle  Nadelen: geen gel-gel vergelijking mogelijk, geen databank opbouw mogelijk.

Thierry De Baere

Knokke – WKB WV

2011-10-11


 Genotypische methoden (genotypering)  Interrepeat spacer length polymorphism analysis.  Primers richten op stukje DNA dat meerdere malen voorkomt in het genoom, maar naar buiten richten zodat gebied tussen die genen ligt geamplificeerd wordt.  Resultaat: fingerprint die specifiek is voor de stam  Vb. ERIC, BOX en REP-PCR.

Thierry De Baere

Knokke – WKB WV

2011-10-11


Thierry De Baere

Knokke – WKB WV

2011-10-11


 Genotypische methoden (genotypering)  Rep-PCR  Voordelen:  Stabiele fingerprints (reproduceerbaar)  Commercieel beschikbaar  Kit-systeem: stabiliteit (reagentia)  Automatisatie analyse (Agilent) lab-on-chip  Databank opbouw

Thierry De Baere

Knokke – WKB WV

2011-10-11

DiversiLab systeem

Thierry De Baere

Knokke – WKB WV

2011-10-11


 Genotypische methoden (genotypering)  Sequence based typing  MLST: multi-locus sequence typing  Principe: De genen van 7 huishoudgenen worden gesequenced. Door evolutie zijn er mutaties opgetreden in deze huishoudgenen die verder verticaal meegaan in de evolutie.  Per sequentie wordt een allel-type aangeduid door vergelijking van de bekomen sequentie met een database (MLST.net – Institut Pasteur). Combinaties van allel-types levert een ST (sequence type) op voor die bepaalde stam. Thierry De Baere

Knokke – WKB WV

2011-10-11


Thierry De Baere

Knokke – WKB WV

2011-10-11


Verschillende regio’s, verwerking via externe websites (MLST.net) Nadelen: veel sequenties, databases beperkt tot bepaalde species. Thierry De Baere

Knokke – WKB WV

2011-10-11


 Genotypische methoden (genotypering)  MLVA (multiple loci VNTR analysis)  Principe: analyse van meerdere variable number tandem repeats.  Regio’s waar gekende tandem-repeats zitten worden geamplificeerd. De bekomen amplificatieproducten worden gescheiden via een capillaire electroforese. Combinatie van de verschillende tandemrepeats numbers levert een cijfer-combinatie op die stam-specifiek is.

Thierry De Baere

Knokke – WKB WV

2011-10-11


Verschillende regio’s Verwerking via externe websites MLVA.net Nadelen: Standardisatie moeilijk Databases slechts voor beperkt aantal species (voedingspathogenen) Thierry De Baere

Knokke – WKB WV

2011-10-11

Stamtyperingen Dr. Thierry De Baere

Recommend Documents